Summary
Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.
Abstract
Las células olfativas ensheathing glia (OEG) se localizan desde la mucosa olfativa hasta la capa nerviosa olfativa (ONL) de la bombilla olfativa. A lo largo de la vida adulta, son clave para el cultivo axonal de neuronas olfativas recién generadas, desde la lamina propria hasta la ONL. Debido a sus propiedades pro-regenerativas, estas células se han utilizado para fomentar la regeneración axonal en modelos de lesión de la médula espinal o del nervio óptico.
Presentamos un modelo in vitro para adormecer y medir la capacidad neurorregenerativa de OEG después de una lesión neuronal. En este modelo, el OEG humano increíblemente inmortalizado (ihOEG) se cultiva como una monocapa, las retinas se extraen de ratas adultas y las neuronas ganglionas retinianas (RGN) se coculan en la monocapa OEG. Después de las 96 h, los marcadores axonal y somatodendritico en RGNs son analizados por inmunofluorescencia y se cuantifica el número de RGNs con axón y la longitud/neurona axonal media.
Este protocolo tiene la ventaja sobre otros ensayos in vitro que se basan en neuronas embrionarias o postnatal, que evalúa las propiedades neurorregenerativas OEG en el tejido adulto. Además, no sólo es útil para evaluar el potencial neurorregenerativo de ihOEG, pero se puede extender a diferentes fuentes de OEG u otras células gliales.
Introduction
Las neuronas del sistema nervioso central adulto (SNC) tienen una capacidad regenerativa limitada después de una lesión o enfermedad. Una estrategia común para promover la regeneración del SNC es el trasplante, en el sitio de lesiones, de tipos celulares que inducen el crecimiento axonal como células madre, células Schwann, astrocitos o células olfativas de glia (OEG)1,2,3,4,5.
OEG deriva de la cresta neural6 y se encuentra en la mucosa olfativa y en la bombilla olfativa. En el adulto, las neuronas sensoriales olfativas mueren regularmente como resultado de la exposición ambiental y son reemplazadas por neuronas recientemente diferenciadas. OEG rodea y guía estos nuevos axones olfativos para entrar en la bombilla olfativa y establecer nuevas sinapsis con sus objetivos en el CNS7. Debido a estos atributos fisiológicos, OEG se ha utilizado en modelos de lesión del SNC como lesión de la médula espinal o del nervio óptico y sus propiedades neurorregenerativas y neuroprotectoras se convierten en probadas8,9,10,11. Varios factores han sido identificados como responsables de las características pro-regenerativas de estas células, incluyendo la producción de proteasas de matriz extracelular o la secreción de factores de crecimiento neurotróficos y axoales12,13,14.
Dadas las limitaciones técnicas para ampliar las células OEG primarias, previamente establecimos y caracterizamos líneas clonales OEG humanas inmortalizadas reversibles (ihOEG), que proporcionan un suministro ilimitado de OEG homogéneo. Estas células ihOEG derivan de cultivos primarios, preparados a partir de bombillas olfativas obtenidas en autopsias. Fueron inmortalizados por la transducción de la subunidad catalítica de telomerasa (TERT) y el oncogeno Bmi-1 y modificados con el antígeno T grande del virus SV4015,16,17,18. Dos de estas líneas celulares ihOEG son Ts14, que mantiene la capacidad regenerativa de las culturas originales y Ts12, una línea regenerativa baja que se utiliza como un control de baja regeneración en estos experimentos18.
Para evaluar la capacidad de OEG para fomentar la regeneración axonal después de una lesión neuronal, se han implementado varios modelos in vitro. En estos modelos, la OEG se aplica a cultivos de diferente origen neuronal y se afirma la formación y elongación de neuritas, en respuesta a la cocultura glial. Ejemplos de tales fuentes neuronales son las neuronas corticales de rata neonatal19,heridas de arañazos realizadas en neuronas embrionarias de rata del tejido cortical20,explantas retinianas de rata21,neuronas posnatales hipotalales o hipocampales de rata22,23, post Rata dorsal raíz dorsal neuronas24,corticospoinal ratón postnatal neuronas del tracto corticospinal25,neuronas NT2 humanas26,o neuronas corticales cerebrales postnatal en cultivos reactivos similares a cicatrices de astrocitos27.
En estos modelos, sin embargo, el ensayo de regeneración se basa en neuronas embrionarias o postnatales, que tienen una plasticidad intrínsefica que está ausente en las neuronas adultas lesionadas. Para superar este inconveniente, presentamos un modelo de regeneración axonal adulta en coculturas de líneas OEG con neuronas ganglionas retinales adultas (RGNs), basada en la desarrollada originalmente por Wigley et al.28,29,30,31 y modificada y utilizada por nuestro grupo12,13,14,15,16,17,18,32,33. Brevemente, el tejido retiniano se extrae de ratas adultas y se digiere con papaína. A continuación, la suspensión de células retinianas se coloca en los cubrecochetas tratados con poli lisina o en las monocapas Ts14 y Ts12. Los cultivos se mantienen durante 96 h antes de que se arreglen y luego se realiza inmunofluorescencia para las proteínas axonal (MAP1B y NF-H)34 y somatodendritica (MAP2A y B)35 marcadores. La regeneración axonal se cuantifica como un porcentaje de neuronas con axón, con respecto a la población total de RGNs y el índice de regeneración axonal se calcula como la longitud axonal media por neurona. Este protocolo no sólo es útil para evaluar el potencial neurorregenerativo de ihOEG, sino que se puede extender a diferentes fuentes de OEG u otras células gliales.
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Protocol
NOTA: La experimentación con animales fue aprobada por comités nacionales e institucionales de bioética.
1. ihOEG (Ts12 y Ts14) cultura
NOTA: Este procedimiento se realiza en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad de cultivo de tejidos.
- Preparar 50 mL ME10 Medio de cultivo OEG según lo dispuesto en el Cuadro 1.
- Preparar 5 ml de DMEM/F12-FBS, según lo dispuesto en el Cuadro 1,en un tubo cónico de 15 ml.
- Caliente ambos medios a 37 °C en un baño de agua limpia, durante 15 minutos.
- Descongelar viales de células Ts12 y Ts14 a 37 °C en un baño de agua limpia.
- Resuspend y agregue células al medio de cultivo DMEM/F12-FBS preparado en el paso 2.
- Centrífuga durante 5 min a 200 x g.
- Aspira al sobrenadante.
- Añadir 500 μL de ME10 medio y resuspend el pellet.
- Prepare un plato de cultivo celular p60 con 3 ml de ME10 y agregue la suspensión celular, en sentido dropwise.
- Muévase para distribuir las celdas uniformemente a través de la placa.
- Células de cultivo a 37 °C en 5% CO2.
NOTA: Después de alcanzar la confluencia, se debe hacer al menos otro pasaje para optimizar las células para la cocultura. Se necesita un 90% de confluencia antes de sembrarlas en las portadas de la cocultura. Un p-60 confluente tiene un número de celda medio de 7 x 105 para Ts14 y 2,5 x 106 para las líneas de celda Ts12. Las líneas celulares Ts12 y Ts14 deben pasarse cada 2-3 días.
2. Preparación de ihOEG (Ts12 y Ts14) para el ensayo
NOTA: Este paso debe hacerse 24 h antes de la disección y cocultura de RGN.
- Tratar 12 mm Ø coverslips con 10 μg / mL poli-L-lisina (PLL) para 1 h.
NOTA: Los cubrebotas se pueden dejar durante la noche en la solución PLL. - Lave las tapas con solución salina de tampón de fosfato (PBS) 1x, tres veces.
- Retire las células Ts12 y Ts14 ihOEG del plato de cultivo celular p60.
- Añadir 4 ml de medio de cultivo DMEM/F12-FBS(Tabla 1)a un tubo cónico de 15 ml. Caliente a 37 °C en un baño de agua limpia.
- Retire el medio de las placas y las células de lavado con 1 ml de 1x PBS-EDTA, una vez.
- Añadir 1 ml de trypsin-EDTA a las células OEG e incubar durante 3-5 min a 37 °C, 5% CO2.
- Recoger celdas con una pipeta p1000 y transferirlas a medio preparado en el paso 3.1.
- Centrífuga durante 5 min a 200 x g.
- Aspira al sobrenadante.
- Añadir 1 ml de me10 medio y resuspend el pellet.
- Cuente el número de celda en un hemociclo.
- Semillas 80.000 células Ts14 o 100.000 células Ts12/pozo en las cubiertas en placas de 24 pozos en 500 μL de medio ME10.
- Células de cultivo a 37 °C en 5% CO2,para 24 h.
3. Disección del tejido retiniano
NOTA: Las ratas Wistar macho de 2 meses de edad se utilizan como fuente RGN. Dos retinas (una rata) para 20 pozos de un plato de 24 bien celulares. Autoclave material quirúrgico antes de su uso. Papain kit de disociación se compra comercialmente (Tabla de Materiales). Siga las instrucciones del proveedor para la reconstitución. Reconstituir D,L-2-amino-5-ácido fosfonovalerico (APV) en stock de 5 mM y preparar las alícuotas.
- El día del ensayo, prepare los siguientes medios.
- Prepare un plato de cultivo celular p60 con 5 ml de EBSS frío (vial 1 del kit de disociación de papaína).
- Prepare un plato de cultivo celular p60 con el vial reconstituido 2 (papaína) del kit de disociación de papaína más 50 μL de APV. A continuación, añadir 250 μL de vial 3 (DNase más 5 μL de APV).
- En una mezcla de tubo estéril 2,7 ml del vial 1 con 300 μL del vial 4 (inhibidor de la proteasa albúmina-ovomucoide). Añadir 150 μL del vial 3 (DNase) más 30 μL de APV.
- Preparar 20 ml de medio Neurobasal-B27 (NB-B27) según lo dispuesto en el Cuadro 1.
- Sacrificar una rata por asfixia con CO2.
- Retire la cabeza por decapitación con guillotina; colocarlo en una placa Petri de 100 mm y rociar la cabeza con etanol al 70% antes de colocarla en una campana de flujo laminar.
- Corta los bigotes de la rata con tijeras para que no interfieran con la manipulación ocular.
- Sujete el nervio óptico con fórceps para extraer el globo ocular lo suficiente como para poder hacer una incisión a través del ojo con un bisturí.
- Retire la lente y el humor vítreo y extraiga la retina (tejido anaranjado), mientras que las capas restantes del ojo permanecen dentro (incluida la capa epitelial pigmentaria).
- Coloque la retina en el plato de cultivo celular p60 preparado en el paso 3.1.1.
- Transfiera la retina al plato de cultivo celular p60 preparado en el paso 3.1.2 y córtalo con el bisturí en trozos pequeños de un tamaño aproximado < 1 mm.
- Transferir a un tubo de plástico de 15 ml.
- Incubar el tejido durante 30 min, en una incubadora humidificada a 37 °C bajo 5% CO2,con agitación cada 10 min.
- Disociar los grupos celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta pasteur de vidrio.
- Centrífuga la suspensión celular a 200 x g durante 5 minutos.
- Deseche el sobrenadante e inactive la papaína, resuspend el pellet celular en la solución preparada en el paso 3.1.3. (1,5 ml para 2 ojos).
- Entuba cuidadosamente esta suspensión celular en 5 ml de vial reconstituido 4.
- Centrífuga a 200 x g durante 5 min.
- Mientras centrifuga, retire completamente el medio ME-10 de la placa de células de pozo OEG 24 (previamente preparado en el paso 2) y reemplácelo por 500 μL de medio NB-B27 por pozo.
- Deseche el sobrenadante y resuspend las células en 2 ml de medio NB-B27.
- Placa 100 μL de suspensión de células retinianas, por pozo de la placa m24, sobre monocapas-coverslips PLL o OEG.
- Mantenga los cultivos a 37 °C con un 5% de CO2 para 96 h en el medio NB-B27.
4. Inmunodetención
- Después de 96 h, fije las células durante 10 minutos añadiendo el mismo volumen de 4% paraformaldehído (PFA) en 1x PBS al medio de cultivo (600 μL) (concentración final de PFA 2%).
- Retire el soporte y el PFA de la placa de 24 multipopos y agregue una vez más 500 μL de paraformaldehído (PFA) del 4% en 1x PBS. Incubar durante 10 minutos.
- Deseche el fijador y lave 3 veces con 1x PBS durante 5 minutos.
- Bloquee con 0.1% Tritón X-100/1% FBS en PBS (PBS-TS) durante 30-40 min.
- Prepare los anticuerpos primarios en el búfer PBS-TS de la siguiente manera: SMI31 (contra proteínas MAP1B y NF-H) anticuerpo monoclonal (1:500). 514 (reconoce las proteínas MAP2A y B) antísero policlonal del conejo (1:400).
- Agregue anticuerpos primarios a las coculturas e incuba durante la noche a 4 °C.
- Al día siguiente, deseche los anticuerpos y lave las tapas con 1x PBS, 3 veces, durante 5 min.
- Prepare los anticuerpos secundarios en el búfer PBS-TS de la siguiente manera: Para SMI-31, Alexa Fluor 488 anti-ratón (1:500). Para 514, alexa-594 anti-conejo (1:500).
- Incubar células con los anticuerpos secundarios fluorescentes correspondientes durante 1 h, en RT, en la oscuridad.
- Lave las tapas con 1x PBS, 3 veces, durante 5 minutos, en la oscuridad.
- Por último, monte las cubiertas con medio de montaje(Tabla de materiales)y manténgalas a 4 °C.
NOTA: Siempre que sea necesario, se pueden realizar manchas de núcleos fluorescentes con DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Antes de montar, incubar las células durante 10 minutos en la oscuridad con DAPI (10 μg/mL en 1x PBS). Lave las cubiertas 3 veces con 1x PBS y, finalmente, monte las tapas con el medio de montaje.
5. Cuantificación de la regeneración axonal
NOTA: Las muestras se cuantifican bajo el objetivo 40x de un microscopio de epifluorescencia. Un mínimo de 30 imágenes deben tomarse en campos aleatorios, con al menos 200 neuronas, que se cuantificarán para cada tratamiento. Cada experimento debe repetirse un mínimo de tres veces.
- Cuantificar el porcentaje de neuronas con axón (neurite positivo SMI31) en relación con la población total de RGNs (identificado con MAP2A/B 514 inmunodetención positiva del cuerpo neuronal y dendritas).
- Cuantificar el índice de regeneración axonal o la longitud axonal media (μm/neurona). Este parámetro se define como la suma de las longitudes (en μm) de todos los axones identificados, divididos por el número total de neuronas contadas, presenten o no un axón. La longitud axonal se determina utilizando el plugin NeuronJ del software de imagen ImageJ (NIH-USA).
- Calcule la media, la desviación estándar y la significación estadística utilizando el software adecuado.
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Representative Results
En este protocolo, presentamos un modelo in vitro para augur la capacidad neurorregenerativa OEG después de una lesión neuronal. Como se muestra en la Figura 1,la fuente OEG es una línea celular clonal OEG humana inmortalizada reversible -Ts14 y Ts12-, que deriva de cultivos primarios, preparados a partir de bombillas olfativas obtenidas en autopsias15,17,18. El tejido retiniano se extrae de ratas adultas, digeridas y la suspensión de las neuronas ganglionas retinianas (RGN) está chapada en cubrecoches tratadas con PLL o en monocapas ihOEG, Ts14 o Ts12. Los marcadores axonal y somatodendritico se analizan mediante inmunofluorescencia y se cuantifica la regeneración axonal.
La identidad Ts14 OEG se evalúa mediante inmunodetención con marcadores descritos como expresados en ensheathing glia (Figura 2), como S100 β (Figura 2A) y vimentina (Figura 2B); También se analizó la expresión GFAP para descartar la contaminación por astrocitos(Figura 2C). Como se muestra, Ts14 expresó S100 β y vimentina, pero no GFAP.
En el ensayo de regeneración axonal, la capacidad regenerativa Ts14 se compara con Ts12 en coculturas RGN-OEG, utilizando el sustrato PLL como control negativo (Figura 3). Tanto el porcentaje de células con axones como la longitud media de los axones regenerados fueron significativamente más altos en las neuronas coculadas en monocapas Ts14, en comparación con las neuronas chapadas en células Ts12 o PLL(Figura 3D,E). Las imágenes representativas muestran una falta de capacidad de RGN para regenerar sus axones sobre células PLL o Ts12(Figura 3A,B),mientras que Ts14 estimula el crecimiento de axones en RGN (3C).
Figura 1: Diagrama de las neuronas ganglionas retinianas de ratas con cocultura de células de glia ensheathing olfativa, como un modelo de regeneración axonal adulta. Líneas celulares clonales inmortalizadas de OEG humano (ihOEG) -Ts12 y Ts14- derivadas de cultivos primarios de bombillas olfativas. Las neuronas ganglionas retinianas de ratas adultas están chapadas en coverslips tratados con PLL (control negativo) o en monocapas Ts14 o Ts12. Los cultivos se mantienen durante 96 h antes de que se fije y los marcadores axonal y somatodendritico se analizan mediante inmunofluorescencia. Porcentaje de neuronas con axón y longitud axonal media /neurona se cuantifican para adivino regeneración axonal RGN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Identidad de la línea de celda ihOEG Ts14. Imágenes de inmunofluorescencia de Ts14 en cultivo, etiquetadas con β anti-S100 (panel A, verde) y vimentina (panel B, rojo). También se analizó la expresión GFAP (panel C, rojo) para descartar la contaminación por astrocitos. Los núcleos están manchados con DAPI (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ensayo para la regeneración axonal en coculturas de líneas OEG con neuronas ganglionas retinianas adultas (RGNs). (A–C) Imágenes de inmunofluorescencia que muestran el etiquetado somatodendritico con 514 anticuerpos, que reconoce la proteína asociada a los microtúbulos MAP2A y B, en rojo, y con anticuerpos SMI31 específicos de axón en verde, contra proteínas MAP1B y NF-H. Las flechas verdes indican axones RGN (SMI31 positivo: verde) y las flechas amarillas indican cuerpos neuronales y dendritas (514 positivos: rojo y amarillo). (D,E) Los gráficos muestran una desviación media y estándar del porcentaje de neuronas que exhiben axones y el índice de regeneración axonal, un parámetro que refleja la longitud axonal media (μm) de los axones por neurona. Un mínimo de 30 imágenes (40x) fueron tomadas en campos aleatorios y cuantificadas para cada muestra celular. Se realizaron experimentos en triplicato, a partir de tres ratas diferentes (N = 3), tejido retiniano agrupado de ambos ojos, con duplicados para cada condición experimental (cada población de glia probada). Los asteriscos indican la importancia estadística: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, NS: no significación (ANOVA y las comparaciones de pruebas tukey post hoc entre parámetros cuantificados para Ts14 vs Ts12, Ts14 vs PLL y Ts12 vs PLL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El trasplante de OEG en los sitios de lesiones del SNC se considera una terapia prometedora para la lesión del SNC debido a sus propiedades pro-neurorregenerativas constitutivas7,8,9. Sin embargo, dependiendo de la fuente de tejido —mucosa olfativa (OM-OEG) frente a bulbo olfativo (OB-OEG)— o la edad del donante, existe una variación considerable en dicha capacidad26,31,33,36. Por lo tanto, es importante tener un modelo in vitro fácil y reproducible para probar la capacidad neurorregenerativa de una muestra de OEG dada, antes de iniciar estudios in vivo. En este protocolo, el RGN axotomizado de ratas adultas se coculpa en una monocapa del OEG para su ensayo. Se realiza un análisis posterior de los marcadores axonal y somatodendritico RGN por inmunofluorescencia para evaluar la regeneración axonal RGN.
Una dificultad inicial del ensayo es la fuente de OEG. En esta obra, utilizamos líneas clonales OEG humanas inmortalizadas reversibles (ihOEG), previamente establecidas y caracterizadas por nuestro grupo15,16,17,18,que proporcionan un suministro ilimitado de OEG homogéneo. Dos de estas líneas celulares ihOEG son Ts14, que mantiene la capacidad regenerativa de los cultivos originales y Ts12, una línea regenerativa baja que se utiliza como un control de baja regeneración en estos experimentos18 Sin embargo, aunque existen limitaciones técnicas para ampliar las células OEG primarias humanas, también se pueden obtener de biopsias endoscópicas nasales -OM- o, en el caso de OB-OEG, de donantes de cadáveres.
La preparación de cultivos OEG monocapa es un procedimiento crucial, ya que demasiadas células podrían hacer que el cocultivo se desvincula de la placa. Por lo tanto, antes de la preparación de OEG para el ensayo, se recomienda que el usuario determine el número óptimo de células a chapar, dependiendo de su tamaño y tasa de división.
Otro problema crítico es la disociación del tejido retiniano, después de la disección de la retina. Es necesario romper los fragmentos de tejido, después de la incubación en la mezcla de disociación. Si se hacen con demasiada fuerza, las células serán destruidas, pero los fragmentos de tejido se dejarán intactos si se hacen demasiado débilmente. Con el fin de obtener una suspensión celular homogénea, sugerimos llenar y vaciar una pipeta Pasteur 10-15 veces, con una punta de diámetro intermedio, evitando al mismo tiempo la propagación. Las pipetas pasteur con puntas anchas se pueden estrechar con un quemador Bunsen.
Para evaluar la capacidad de diferentes poblaciones gliales para fomentar la regeneración axonal de las neuronas adultas, hemos determinado que 96 h es el intervalo de tiempo que mejor se adapte al objetivo porque: 1) es el tiempo más largo para mantener viva la cultura sin perturbar la monocapa OEG; y 2) es el tiempo necesario para que las neuronas crezcan axones el tiempo suficiente para revelar diferencias entre las capacidades regenerativas de diferentes poblaciones de OEG u otras células no regenerativas (es decir, fibroblastos12,13,14,15,16,17,18,32,33). Sin duda sería interesante determinar el curso de tiempo del proceso de regeneración, ya que podría proporcionar información sobre las propiedades regenerativas diferenciales de diferentes poblaciones gliales, en tiempos más cortos de la cocultura. En nuestras manos, para la glia regenerativa, el curso de tiempo entre 72-96 h es bastante similar para todas las líneas celulares, aunque los axones son más cortos a las 72 h (datos inéditos). Además, 96 h de cocultura, permite estudiar mecanismos dependientes de OEG de regeneración axonal adulta12,14.
Durante la cuantificación de la regeneración axonal, es importante tomar un mínimo de 30 imágenes a 400 aumentos (objetivo 40x), en diferentes áreas aleatorias de la mancha, pero siguiendo los axones completos de las neuronas fotografiadas. Por lo tanto, el experimentador debe tomar imágenes en serie en las áreas elegidas para medir las longitudes axoales reales.
También se han desarrollado otros enfoques in vitro para evaluar las funciones regenerativas de OEG. En estos modelos, OEG se aplica a cultivos de diferente origen neuronal y, en respuesta a la cocultura glial, la formación de neuritos y elongation se aditivan19,20,21,22,23,24,25,26,27. Sin embargo, el ensayo de regeneración se basa en neuronas embrionarias o posnatales, que tienen una plasticidad intrínsica ausente de las neuronas adultas lesionadas. Este modelo consistente en regeneración axonal adulta en coculturas de líneas OEG con neuronas ganglionas retinales adultas (RGNs) supera este inconveniente. Además, estamos diseccionando retinas adultas, y debido a que cortamos el nervio óptico y los axones se retraen en el proceso de disección, obtenemos cuerpos neuronales limpios de mielina, para realizar la cocultura. Esta es la diferencia con otras partes del SNC adulto, donde la mielina puede obstaculizar mucho con la disección para obtener neuronas limpias para la cocultura.
Basado en el desarrollado originalmente por Wigley et al.28,29,30,31,destacamos las siguientes mejoras en el protocolo. En primer lugar, el uso de medio neurobasal complementado con B27 como medio de cocultura OEG-RGN, que permite el crecimiento de células neuronales y afecta positivamente la reproducibilidad del experimento. En segundo lugar, caracterizamos y cuantificamos la regeneración axonal mediante el uso de un marcador específico del compartimento axonal; y en tercer lugar, utilizamos un parámetro directo adicional, la longitud/neurona axonal media, que evalúa el potencial regenerativo de crecimiento axonal de OEG.
En resumen, consideramos que se trata de un ensayo simple, reproducible, de ahorro de tiempo y de coste medio, no sólo útil para evaluar el potencial neurorregenerativo del ihOEG, sino también porque se puede extender a diferentes fuentes de OEG u otras células gliales. Además, podría utilizarse como una valiosa prueba de concepto del potencial neurorregenerativo de una muestra de OEG o glial, antes de la traducción a estudios in vivo o clínicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo financiero del proyecto SAF2017-82736-C2-1-R del Ministerio de Ciencia e Innovación a MTM-F y de la Fundación Universidad Francisco de Vitoria a JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
References
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