Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61863
Automatic Translation
1,3, 1, 2, 1, 3
1Facultad de CC Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology, University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

Summary

Nöral yaralanmadan sonra koku alma glia (OEG) nörojeneratif kapasitesini değerlendirmek için bir in vitro model sunuyoruz. RGN aksonal ve somatodendritik belirteçleri analiz ederek, OEG monolayerleri üzerinde axotomized adult retinal ganglion nöronlarının (RGN) bir kokülatürüne ve daha sonra aksonal rejenerasyon çalışmasına dayanmaktadır.

Abstract

Koku alma ensheathing glia (OEG) hücreleri koku mukozasından koku alma ampulün koku sinir tabakasına (ONL) kadar lokalize edilir. Yetişkin yaşamı boyunca, lamina propria'dan ONL'ye kadar yeni üretilen koku nöronlarının aksonal büyümesi için anahtardırlar. Pro-rejeneratif özellikleri nedeniyle, bu hücreler omurilik veya optik sinir yaralanması modellerinde aksonal yenilenmeyi teşvik etmek için kullanılmıştır.

Nöral yaralanmadan sonra OEG nörojeneratif kapasitesini test etmek ve ölçmek için bir in vitro model sunuyoruz. Bu modelde, geri dönüşümlü olarak ölümsüzleştirilmiş insan OEG 'i (ihOEG) monolayer olarak kültürlenir, retinalar yetişkin sıçanlardan çıkarılır ve retina ganglion nöronları (RGN) OEG monolayer üzerine kokültüre edilir. 96 saat sonra RGN'lerdeki aksonal ve somatodendritik belirteçler immünofluoresans ile analiz edilir ve aksonlu RGN sayısı ve ortalama aksonal uzunluk/nöron ölçülür.

Bu protokol, embriyonik veya postnatal nöronlara dayanan diğer in vitro testlere göre avantaja sahiptir, yetişkin dokusundaki OEG nörorejeneratif özelliklerini değerlendirir. Ayrıca, sadece ihOEG'nin nörorejeneratif potansiyelini değerlendirmek için yararlı değildir, aynı zamanda farklı OEG kaynaklarına veya diğer glial hücrelere de genişletilebilir.

Introduction

Erişkin merkezi sinir sistemi (CNS) nöronları yaralanma veya hastalıktan sonra sınırlı rejeneratif kapasiteye sahiptir. CNS rejenerasyonunu teşvik etmek için yaygın bir strateji, yaralanma bölgesinde, kök hücreler, Schwann hücreleri, astrositler veya koku ensheathing glia (OEG) hücreleri 1,2 ,3,4,5gibi aksonal büyümeye nedenolanhücre türlerininnaklidir.

OEG, nöral kret6'dan türemiştir ve koku mukozasında ve koku ampulünde bulunur. Erişkinlerde koku duyusal nöronlar çevresel maruziyet sonucu düzenli olarak ölürler ve yeni farklılaşmış nöronlarla değiştirilirler. OEG, bu yeni koku aksonlarını koku ampulüne girmek ve CNS7'dekihedefleriyle yeni sinapslar oluşturmak için çevreler veyönlendirir. Bu fizyolojik özellikler nedeniyle, OEG omurilik veya optik sinir hasarı gibi CNS yaralanma modellerinde kullanılmıştır ve nörorejeneratif ve nöroprotektif özellikleri kanıtlanmış hale gelmiştir8,9,10,11. Nörotrofik ve aksonal büyüme faktörlerinin hücre dışı matris proteaz üretimi veya salgılanması da dahil olmak üzere bu hücrelerin pro-rejeneratif özelliklerinden sorumlu olarak çeşitli faktörler tanımlanmıştır12,13,14.

Birincil OEG hücrelerini genişletmek için teknik sınırlamalar göz önüne alındığında, daha önce sınırsız homojen OEG kaynağı sağlayan geri dönüşümlü ölümsüzleştirilmiş insan OEG (ihOEG) klonal hatlarını kurduk ve karakterize ettik. Bu ihOEG hücreleri, otopsilerde elde edilen koku ampullerinden hazırlanan birincil kültürlerden türemiştir. Telomeraz katalitik alt ünlem (TERT) ve onkogen Bmi-1'in transdüksiyonu ile ölümsüzleştirildiler ve SV40 virüs büyük T antijeni15 , 16,17,18ile değiştirildiler. Bu ihOEG hücre çizgilerinden ikisi, orijinal kültürlerin rejeneratif kapasitesini koruyan Ts14 ve bu deneylerde düşük rejenerasyon kontrolü olarak kullanılan düşük rejeneratif bir çizgi olanTs12 18.

Nöral yaralanmadan sonra aksonal yenilenmeyi teşvik etmek için OEG kapasitesini değerlendirmek için çeşitli in vitro modeller uygulanmıştır. Bu modellerde, OEG farklı nöronal kökenli kültürlere uygulanır ve glial kokültüre yanıt olarak neurit oluşumu ve uzaması test edilir. Bu tür nöronal kaynaklara örnek olarak yenidoğan sıçan kortikal nöronları19, kortikal dokudan sıçan embriyonik nöronlarına yapılan çizik yaraları20, sıçan retina eksplantları21, sıçan hipotalamik veya hipokampal postnatal nöronlar22 , 2223, postnatal sıçan dorsal kök ganglion nöronları24, postnatal fare kortikospinal sistem nöronları25, insan NT2 nöronları26veya reaktif astrosit skar benzeri kültürler üzerinde postnatal serebral kortikal nöronlar27.

Bununla birlikte, bu modellerde, rejenerasyon testi, yaralı yetişkin nöronlarında bulunmayan içsel bir plastisiteye sahip embriyonik veya postnatal nöronlara dayanır. Bu dezavantajın üstesinden gelmek için, başlangıçta Wigley ve arkadaşları tarafından geliştirilene dayanan yetişkin retinal ganglion nöronları (RGN' ler) ile OEG çizgilerinin kokültürlerinde yetişkin aksonal rejenerasyon modelini sunuyoruz.28,29,30,31 ve modifiye ve grubumuz tarafından kullanılan12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kısaca, retina dokusu yetişkin sıçanlardan çıkarılır ve papain ile sindirilir. Retina hücre süspansiyonu daha sonra polilizin işlem görmüş kapak altlıklarına veya Ts14 ve Ts12 monolayerlere kaplanır. Kültürler sabitlenmeden önce 96 saat korunur ve daha sonra aksonal (MAP1B ve NF-H proteinleri)34 ve somatodendritik (MAP2A ve B)35 belirteçler için immünofluoresans yapılır. Aksonal rejenerasyon, RGN'lerin toplam popülasyonu ile ilgili olarak aksonlu nöronların yüzdesi olarak ölçülür ve aksonal rejenerasyon indeksi nöron başına ortalama aksonal uzunluk olarak hesaplanır. Bu protokol sadece ihOEG'nin nörorejeneratif potansiyelini değerlendirmek için yararlı olmakla kalmaz, aynı zamanda farklı OEG kaynaklarına veya diğer glial hücrelere de genişletilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Hayvan deneyleri ulusal ve kurumsal biyoetik komiteleri tarafından onaylanmıştır.

1. ihOEG (Ts12 ve Ts14) kültürü

NOT: Bu işlem doku kültürü biyogüvenlik kabininde steril koşullarda yapılır.

  1. Tablo 1'de belirtildiği gibi 50 mL ME10 OEG kültür ortamı hazırlayın.
  2. Tablo 1'de belirtildiği gibi 15 mL konik tüpte 5mL DMEM/F12-FBS hazırlayın.
  3. Her iki ortamı da 37 °C'de temiz bir su banyosunda 15 dakika ısıtın.
  4. Temiz bir su banyosunda 37 °C'de Ts12 ve Ts14 hücre şişelerini çözün.
  5. Adım 2'de hazırlanan DMEM/F12-FBS kültür ortamına hücreleri yeniden biriktirin ve ekleyin.
  6. 200 x g'da5 dakika santrifüj.
  7. Süpernatant'ı arzula.
  8. 500 μL ME10 orta ekleyin ve peletin yeniden kullanılabilir.
  9. 3 mL ME10 ile bir p60 hücre kültürü yemeği hazırlayın ve hücresel süspansiyonu damla yönünde ekleyin.
  10. Hücreleri plaka boyunca eşit olarak dağıtmak için hareket edin.
  11. %5 CO2'de37 °C'de kültür hücreleri.
    NOT: Birliğe ulaştıktan sonra, kokültür için hücreleri optimize etmek için en az başka bir geçit yapılmalıdır. Kolikültür için kapaklara tohumlamadan önce% 90 izdihama ihtiyaç vardır. Bir konfluent p-60, Ts14 için ortalama 7 x 105 ve Ts12 hücre hatları için 2,5 x10 6 ortalama hücre numarasınasahiptir. Ts12 ve Ts14 hücre hatları her 2-3 günde bir geçilmelidir.

2. Test için ihOEG (Ts12 ve Ts14) hazırlanması

NOT: Bu adım RGN diseksiyonu ve kokültürden önce 24 saat yapılmalıdır.

  1. 12 mm Ø kapakları 1 saat boyunca 10 μg/mL poli-L-lizin (PLL) ile tedavi edin.
    NOT: Kapaklar PLL çözeltisinde bir gecede bırakılabilir.
  2. Kapakları 1x fosfat tampon salin (PBS) ile üç kez yıkayın.
  3. Ts12 ve Ts14 ihOEG hücrelerini p60 hücre kültürü çanaktan ayır.
    1. 15 mL konik tüpe 4 mL DMEM/F12-FBS kültür ortamı (Tablo1 ) ekleyin. Temiz bir su banyosunda 37 °C'de ısıtın.
    2. Ortamı plakalardan çıkarın ve hücreleri bir kez 1 mL 1x PBS-EDTA ile yıkayın.
    3. OEG hücrelerine 1 mL tripsin-EDTA ekleyin ve 37 °C,% 5 CO2'de3-5 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. P1000 pipetli hücreleri toplayın ve adım 3.1'de hazırlanan ortama aktarın.
    5. 200 x g'da5 dakika santrifüj.
    6. Süpernatant'ı arzula.
    7. 1 mL ME10 orta ekleyin ve peletin yeniden kullanılabilir.
    8. Hemositometredeki hücre numarasını say.
  4. 500 μL ME10 ortamında 24 kuyulu plakalarda kapaklara tohum 80.000 Ts14 hücre veya 100.000 Ts12 hücre/kuyu.
  5. Kültür hücreleri 37 °C'de% 5 CO2, 24 saat boyunca.

3. Retina dokusu diseksiyonu

NOT: RGN kaynağı olarak 2 aylık erkek Wistar sıçanları kullanılmaktadır. 24 kuyulu bir hücre kabının 20 kuyusu için iki retina (bir sıçan). Kullanmadan önce cerrahi malzemeyi otoklav. Papain ayrıştırma kiti ticari olarak satın alındı (Malzeme Masası). Yeniden yapılandırı için sağlayıcının talimatlarını izleyin. D,L-2-amino-5-fosfonovaleric asitini (APV) 5 mM stokta yeniden inşa edin ve aliquotları hazırlayın.

  1. Tahlil günü aşağıdaki medyayı hazırlayın.
    1. 5 mL soğuk EBSS (papain ayrıştırma kitinin şişesi 1) ile bir p60 hücre kültürü yemeği hazırlayın.
    2. Papain ayrıştırma kitinin 2 (papain) yeniden inşa edilmiş şişesi ve 50 μL APV ile bir p60 hücre kültürü yemeği hazırlayın.  Ardından, 250 μL'lik bir şişe 3 (DNase artı 5 μL APV) ekleyin.
    3. Steril bir tüpte 2.7 mL şişe 1'i 300 μL şişe 4 (albümin-ovomucoid proteaz inhibitörü) ile karıştırın. 150 μL şişe 3 (DNase) artı 30 μL APV ekleyin.
    4. Tablo 1'de belirtildiği gibi 20 mL Nörobakal-B27 ortamı (NB-B27) hazırlayın.
  2. Co2ile boğulma ile bir sıçan kurban .
  3. Giyotin ile kafa keserek başı çıkarın; 100 mm Petri kabına yerleştirin ve laminer bir akış başlığına yerleştirmeden önce kafaya% 70 etanol püskürtün.
  4. Farenin bıyıklarını makasla kesin, böylece göz manipülasyonuna müdahale etmezler.
  5. Göz küresini neşterle göz boyunca kesi yapabilecek kadar çekmek için optik siniri ön ayaklarla tutun.
  6. Lensi ve vitreus mizahı çıkarın ve retinayı (turuncu benzeri doku) çıkarın, gözün kalan katmanları içeride kalırken (pigment epitel tabakası dahil).
  7. Retinayı adım 3.1.1'de hazırlanan p60 hücre kültürü kabına yerleştirin.
  8. Retinayı 3.1.2 adımda hazırlanan p60 hücre kültürü kabına aktarın ve neşterle birlikte yaklaşık < 1 mm büyüklüğünde küçük parçalar halinde kesin.
  9. 15 mL plastik tüpe aktarın.
  10. Dokuyu 30 dakika boyunca, 37 °C'de% 5 CO2altında nemlendirilmiş bir inkübatörde, her 10 dakikada bir ajitasyonla kuluçkaya yatırın.
  11. Bir cam Pasteur pipet ile yukarı ve aşağı pipetleme ile hücre kümelerini ayrıştır.
  12. Hücre süspansiyonu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj.
  13. Süpernatantı atın ve papaini devre dışı bırakmak için, hücre peletini adım 3.1.3'te hazırlanan çözeltiye yeniden atın. (2 göz için 1,5 mL).
  14. Bu hücre süspansiyonu dikkatlice 5 mL yeniden inşa edilmiş şişe 4 içine boru.
  15. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj.
  16. Santrifüjleme sırasında, ME-10 ortamını OEG 24 kuyu hücre plakasından (daha önce 2. adımda hazırlanmış) tamamen çıkarın ve kuyu başına 500 μL NB-B27 ortamı ile değiştirin.
  17. Süpernatant atın ve hücreleri 2 mL NB-B27 ortamında yeniden biriktirin.
  18. Plaka 100 μL retina hücre süspansiyonu, m24 plakasının kuyusu başına, PLL ile işlenmiş veya OEG monolayers-coverlips üzerine.
  19. NB-B27 ortamında 96 saat boyunca%5 CO 2 ile kültürleri 37 °C'de koruyun.

4. İmmünasyon

  1. 96 saat sonra, kültür ortamına (600 μL) (PFA son konsantrasyonu% 2) 1x PBS'de aynı hacimde% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyerek hücreleri 10 dakika sabitleyin.
  2. Ortamı ve PFA'yı 24 multiwell plakadan çıkarın ve bir kez daha 1x PBS'de 500 μL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
  3. Düzelticiyi atın ve 1x PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  4. PBS'de (PBS-TS) %0,1 Triton X-100/1 FBS ile 30-40 dk blok.
  5. PBS-TS tamponunda primer antikorları aşağıdaki gibi hazırlayın: SMI31 (MAP1B ve NF-H proteinlerine karşı) monoklonal antikor (1:500). 514 (MAP2A ve B proteinlerini tanır) tavşan poliklonal antiserum (1:400).
  6. Kokültürlere primer antikorlar ekleyin ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  7. Ertesi gün, antikorları atın ve kapak kapaklarını 1x PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın.
  8. PBS-TS tamponunda ikincil antikorları aşağıdaki gibi hazırlayın: SMI-31 için, anti-fare Alexa Fluor 488 (1:500). 514 için, anti-tavşan Alexa-594 (1:500).
  9. Rt'de, karanlıkta 1 saat boyunca karşılık gelen floresan ikincil antikorlarla hücreleri kuluçkaya yatırın.
  10. Kapakları 1x PBS ile 3 kez, 5 dakika boyunca karanlıkta yıkayın.
  11. Son olarak, kapak örtülerini montaj ortamıyla (Malzeme Masası) monte edin ve 4 °C'de tutun.
    NOT: Gerektiğinde DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindole) ile floresan çekirdek boyama yapılabilir. Montajdan önce, hücreleri DAPI (1x PBS'de 10 μg/mL) ile karanlıkta 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kapakları 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve son olarak kapakları montaj ortamına monte edin.

5. Aksonal rejenerasyon nicelemesi

NOT: Numuneler epifluoresans mikroskopunun 40x hedefi altında ölçülür. Her tedavi için ölçülmek üzere en az 200 nöronlu rastgele alanlarda en az 30 fotoğraf çekilmelidir. Her deney en az üç kez tekrarlanmalıdır.

  1. RGN'lerin toplam popülasyonu (MAP2A/B 514 nöronal vücut ve dendritlerin pozitif immünostaining ile tanımlanır) ile axon (SMI31 pozitif neurite) ile nöronların yüzdesini ölçün.
  2. Aksonal rejenerasyon indeksini veya ortalama aksonal uzunluğu (μm/nöron) ölçün. Bu parametre, bir akson sunup sunmadıkları, sayılan nöronların toplam sayısına bölünen, tanımlanan tüm aksonların uzunluklarının (μm olarak) toplamı olarak tanımlanır. Aksonal uzunluk, ImageJ (NIH-USA) görüntü yazılımının eklentiSi NeuronJ kullanılarak belirlenir.
  3. Uygun yazılımı kullanarak ortalama, standart sapma ve istatistiksel önemi hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokolde nöronal yaralanma sonrası OEG nörojeneratif kapasitesini test etmek için bir in vitro model sunuyoruz. Şekil 1'degösterildiği gibi, OEG kaynağı, otopsilerde elde edilen koku ampullerinden hazırlanan birincil kültürlerden türeyen -Ts14 ve Ts12- ters çevrilebilir ölümsüzleştirilmiş bir insan OEG klonal hücre hattıdır15,17,18. Retina dokusu yetişkin sıçanlardan çıkarılır, sindirilir ve retinal ganglion nöronları (RGN) süspansiyonu PLL ile tedavi edilen kapaklara veya ihOEG monolayers, Ts14 veya Ts12 üzerine kaplanır. Aksonal ve somatodendritik belirteçler immünofluoresans ile analiz edilir ve aksonal rejenerasyon ölçülür.

Ts14 OEG kimliği, S100 β (Şekil 2A) ve vimentin ( Şekil2B) gibi ensheathing glia (Şekil 2) ile ifade edildiği açıklanan belirteçlerle immünostaining ile değerlendirilir; Astrosit kontaminasyonünü atmak için GFAP ekspresyasyonu da analiz edildi (Şekil 2C). Gösterildiği gibi, Ts14 S100'ü β ve vimentin olarak ifade etti, ancak GFAP'ı ifade etmedi.

Aksonal rejenerasyon testinde, Ts14 rejeneratif kapasitesi, PLL substratı negatif kontrol olarak kullanılarak RGN-OEG kokültürlerinde Ts12 ile karşılaştırılır (Şekil 3). Hem aksonlu hücrelerin yüzdesi hem de yenilenen aksonların ortalama uzunluğu, Ts14 monolayerlerinde birleştirilmiş nöronlarda, Ts12 hücreleri veya PLL(Şekil 3D,E)üzerine kaplanmış nöronlara kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti. Temsili görüntüler, RGN'nin aksonlarını PLL veya Ts12 hücreleri üzerinde yenileme kapasitesi eksikliğini göstermektedir (Şekil 3A,B), Ts14 ise RGN'deki (3C) aksonların büyümesini uyarır.

Figure 1
Şekil 1: Yetişkin aksonal rejenerasyon modeli olarak koku alma ensheathing glia hücreleri kokültürlü sıçan retinal ganglion nöronlarının şeması. Ölümsüzleştirilmiş insan OEG (ihOEG) klonal hücre hatları -Ts12 ve Ts14- koku ampullerinden birincil kültürlerden türetilmiştir. Yetişkin sıçanlardan retinal ganglion nöronları PLL ile tedavi edilen kapaklar (negatif kontrol) veya Ts14 veya Ts12 monolayerler üzerine kaplanır. Kültürler sabitlenmeden önce 96 saat korunur ve aksonal ve somatodendritik belirteçler immünofluoresans ile analiz edilir. Aksonlu ve ortalama aksonal uzunlukta/nöronlu nöronların yüzdesi RGN aksonal rejenerasyon olarak ölçülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: IhOEG hücre hattı Ts14'ün kimliği. Kültürde Ts14'ün anti-S100 β (panel A, yeşil) ve vimentin (panel B, kırmızı) ile etiketlenmiş immünoresans görüntüleri. Astrosit kontaminasyonini atmak için GFAP ekspresyasyonu (panel C, kırmızı) da analiz edildi. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Erişkin retinal ganglion nöronları (RGN' ler) ile OEG çizgilerinin kokültürlerinde aksonal rejenerasyon için tahlil. (A–C) Mikrotübül ilişkili protein MAP2A ve B'yi kırmızı ile tanıyan 514 antikor ve yeşilde axon spesifik SMI31 antikoru ile MAP1B ve NF-H proteinlerine karşı somatodendritik etiketleme gösteren immünoresans görüntüleri. Yeşil oklar RGN aksonlarını (SMI31-pozitif: yeşil) ve sarı okları nöronal gövdeleri ve dendritleri (514 pozitif: kırmızı ve sarı) gösterir. (D,E) Grafikler, akson sergileyen nöronların yüzdesinin ortalama ve standart sapması ve aksonal rejenerasyon indeksinin, nöron başına ortalama aksonal uzunluğunu (μm) yansıtan bir parametre olduğunu göstermektedir. Rastgele alanlarda en az 30 resim (40x) çekildi ve her hücre örneği için ölçülebilir. Deneyler üç farklı sıçandan (N = 3), her iki gözden de birikmiş retina dokusundan, her deneysel durum için kopyalarla (her glia popülasyonu test edildi) üç taraflı olarak gerçekleştirildi. Yıldız işaretleri istatistiksel önemi gösterir: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, NS: önemli değildir (ANOVA ve geçici Tukey sonrası test karşılaştırmaları Ts14 vs Ts12, Ts14 vs PLL ve Ts12 vs PLL için ölçülen parametreler arasında. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CNS yaralanma bölgelerinde OEG transplantasyonu,7,8,9konstive pro-nörorejeneratif özellikleri nedeniyle CNS yaralanması için umut verici bir tedavi olarak kabul edilir. Bununla birlikte, doku kaynağına (koku mukozası (OM-OEG) ve koku ampulü (OB-OEG) veya donörün yaşına bağlı olarak,26, 31,33,36kapasitede önemli farklılıklar vardır. Bu nedenle, in vivo çalışmalara başlamadan önce, belirli bir OEG örneğinin nörorejeneratif kapasitesini test etmek için kolay ve tekrarlanabilir bir in vitro modele sahip olmak önemlidir. Bu protokolde, yetişkin sıçanların aksiotomize RGN'si, test etmek için OEG'nin bir monolayerine eşleştirilmiştir. RGN aksonal ve somatodendritik belirteçlerin immünofluoresans ile daha sonraki analizi RGN aksonal rejenerasyonunu değerlendirmek için gerçekleştirilir.

Tahlilin ilk zorluğu OEG'nin kaynağıdır. Bu çalışmada, daha önce kurulan ve sınırsız homojen OEG kaynağı sağlayan15, 16 , 17,18grubumuz tarafından oluşturulan ve karakterize edilen geri dönüşümlü ölümsüzleştirilmiş insan OEG (ihOEG) klonal hatlarını kullanıyoruz. Bu ihOEG hücre hatlarından ikisi Ts14, orijinal kültürlerin rejeneratif kapasitesini koruyan ve bu deneylerde düşük rejenerasyon kontrolü olarak kullanılan düşük rejeneratif bir çizgi olanTs12 18 Bununla birlikte, insan birincil OEG hücrelerini genişletmek için teknik sınırlamalar olsa da, burun endoskopik biyopsilerinden -OM- veya OB-OEG durumunda kadavra donörlerinden de elde edilebilirler.

Monolayer OEG kültürlerinin hazırlanması çok önemli bir prosedürdür, çünkü çok fazla hücre kokültürün plakadan kopmasına neden olabilir. Bu nedenle, test için OEG hazırlığından önce, kullanıcının boyutlarına ve bölünme oranlarına bağlı olarak kaplanacak en uygun hücre sayısını belirlemesi önerilir.

Bir diğer kritik konu retina diseksiyonu sonrası retina dokusu ayrışmasıdır. Ayrışma karışımındaki inkübasyonu takiben doku parçalarını parçalamak gerekir. Çok kuvvetli yapılırsa, hücreler yok edilir, ancak çok zayıf yapılırsa doku parçaları bozulmadan bırakılır. Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için, köpürmeyi önlerken, orta çaplı bir ucu olan bir Pasteur pipeti 10-15 kez doldurmanızı ve boşaltmanızı öneririz. Geniş uçlu pastör pipetler Bunsen brülör kullanılarak daraltılabilir.

Farklı glial popülasyonların yetişkin nöronların aksonal yenilenmesini teşvik etme kapasitesini değerlendirmek için, 96 saatin amaca en uygun zaman aralığı olduğunu belirledik, çünkü: 1) OEG monolayerini rahatsız etmeden kültürü canlı tutmak için en uzun zaman; ve 2) nöronların farklı OEG popülasyonlarının veya diğer rejeneratif olmayan hücrelerin (yani, fibroblastlar 12 , 13 ,14 , 15 , 16 , 17 ,18,32,33)rejeneratif kapasiteleri arasındaki farklılıkları ortaya çıkaracak kadar uzun süre akson yetiştirmesi için gerekenzamandır. Farklı glial popülasyonların diferansiyel rejeneratif özellikleri hakkında, ortak kültürün daha kısa zamanlarında bilgi sağlayabileceğinden, rejenerasyon sürecinin zaman seyrini belirlemek kesinlikle ilginç olacaktır. Elimizde, rejeneratif glia için, 72-96 saat arasındaki zaman dilimi tüm hücre hatları için oldukça benzerdir, ancak aksonlar 72 saatte daha kısadır (yayınlanmamış veriler). Ayrıca, 96 h ortak kültür, yetişkin aksonal rejenerasyon OEG bağımlı mekanizmaları incelemek için izin12,14.

Aksonal rejenerasyon nicelemesi sırasında, kapak kapağının farklı rastgele bölgelerinde, ancak fotoğraflanan nöronların tam aksonlarını takip ederek, 400 büyütmede (40x amaç) en az 30 fotoğraf çekmek önemlidir. Bu nedenle, deneycinin gerçek aksonal uzunlukları ölçmek için seçilen alanlarda seri resimler çekmesi gerekir.

OEG rejeneratif fonksiyonlarını değerlendirmek için başka in vitro yaklaşımlar da geliştirilmiştir. Bu modellerde, OEG farklı nöronal kökenli kültürlere uygulanır ve glial kokültüre yanıt olarak, neurit oluşumu ve uzaması 19,20 ,21,22,23,24,25,26,27olarak test edilir. Bununla birlikte, rejenerasyon tahlilleri, yaralı yetişkin nöronlarında bulunmayan içsel bir plastisiteye sahip embriyonik veya postnatal nöronlara dayanır. Yetişkin retinal ganglion nöronları (RGN' ler) ile OEG hatlarının kokültürlerinde erişkin aksonal yenilenmeden oluşan bu model bu dezavantajın üstesinden gelmektedir. Ek olarak, yetişkin retinalarını inceliyoruz ve diseksiyon sürecinde optik siniri ve aksonları geri çektiğimiz için, kokültürü gerçekleştirmek için miyelinden temiz nöronal cisimler elde ediyoruz. Bu, miyelin kokültür için temiz nöronlar elde etmek için diseksiyon ile çok engelleyebileceği yetişkin CNS'nin diğer bölümleriyle olan farktır.

Başlangıçta Wigley ve ark.28 , 29,30,31tarafından geliştirilene dayanarak, protokolde aşağıdaki iyileştirmeleri vurguluyoruz. İlk olarak, B27 ile desteklenmiş nörobakal ortamın, nöronal hücrelerin büyümesine izin veren ve deneyin tekrarlanabilirliğini olumlu yönde etkileyen OEG-RGN kokültür ortamı olarak kullanılması. İkinci olarak, aksonal bölmenin belirli bir işaretleyicisini kullanarak aksonal rejenerasyonu karakterize ediyor ve ölçüp ölçütüyorsun; ve üçüncüsü, OEG'nin aksonal büyüme rejeneratif potansiyelini değerlendiren ek bir doğrudan parametre, ortalama aksonal uzunluk / nöron kullanıyoruz.

Özetle, bunun basit, tekrarlanabilir, zaman kazandıran ve orta maliyetli bir tahlil olduğunu düşünüyoruz, sadece ihOEG'nin nörorejeneratif potansiyelini değerlendirmek için değil, aynı zamanda farklı OEG veya diğer glial hücrelere genişletilebildiği için de yararlıdır. Ayrıca, in vivo veya klinik çalışmalara çeviriden önce, bir OEG veya glial örneğin nörorejeneratif potansiyelinin değerli bir kavram kanıtı olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Bakanio de Ciencia e Innovación'dan MTM-F'ye ve Fundación Universidad Francisco de Vitoria'dan JS'ye SAF2017-82736-C2-1-R projesi tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
  2. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
  3. Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
  4. Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
  5. Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
  6. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
  7. Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
  8. Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
  9. Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
  10. Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
  11. Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
  12. Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
  13. Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
  14. Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
  15. Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
  16. García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
  17. García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
  18. Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
  19. Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
  20. Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
  21. Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
  22. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
  23. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
  24. Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
  25. Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
  26. Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
  27. Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
  28. Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
  29. Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
  30. Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
  31. Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
  32. Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
  33. García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
  34. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  35. Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
  36. Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).

Tags

Nörobilim Sayı 165 koku alma ensheathing glia (OEG) yetişkin aksonal rejenerasyon in vitro tahlil retina ganglion nöronları (RGN) kokültür akstomatomi
Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Portela-Lomba, M., Simón, D.,… More

Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter