Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Кокультура аксотомизированных Крысиных Нейронов Сетчатки Ganglion с обонятельной Энситинг Глиа, как в пробирке Модель регенерации взрослых аксональных

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61863
Automatic Translation
1,3, 1, 2, 1, 3
1Facultad de CC Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology, University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

Summary

Мы представляем модель in vitro для оценки обонятельной энглии (OEG) нейрорегенеративной способности, после нервной травмы. Он основан на кокультуре аксотомизированных взрослых нейронов ганглия сетчатки (RGN) на монослойных OEG и последующем изучении аксональной регенерации, путем анализа RGN аксональных и соматодендритических маркеров.

Abstract

Обонятельные клетки оболочки глии (OEG) локализованы на всем пути от обонятельной слизистой оболочки до обонятельного нервного слоя (ONL) обонятельной луковицы. На протяжении всей взрослой жизни, они являются ключевыми для аксонального выращивания вновь созданных обонятельных нейронов, от ламины проприии в ONL. Из-за их про-регенеративных свойств, эти клетки были использованы для содействия аксональной регенерации в спинном мозге или оптических моделей травмы нерва.

Мы представляем модель in vitro для анализа и измерения нейрорегенеративной способности OEG после повреждения нервной системы. В этой модели, обратимо увековечены человека OEG (ihOEG) культурируется как монослой, сетчатки извлекаются из взрослых крыс и сетчатки ганглия нейронов (RGN) являются совместной культурой на OEG монослой. После 96 ч, аксональные и соматодендритические маркеры в RGNs анализируются иммунофлюоресценции и количество RGNs с аксоном и средняя длина аксональной / нейрон количественно.

Этот протокол имеет преимущество перед другими анализами in vitro, которые полагаются на эмбриональные или постнатальные нейроны, что он оценивает нейрорегенеративные свойства OEG во взрослой ткани. Кроме того, он не только полезен для оценки нейрорегенеративного потенциала ihOEG, но может быть распространен на различные источники OEG или других глиальных клеток.

Introduction

Взрослые нейроны центральной нервной системы (ЦНС) имеют ограниченную регенеративную способность после травмы или заболевания. Общей стратегией для содействия регенерации ЦНС является трансплантация, в месте травмы, типов клеток, которые вызывают аксональный рост,такиекак стволовые клетки, клетки Шванн, астроциты или обонятельные оболочки клеток глии (OEG) 1,2,3,4,5.

OEG происходит от нервного гребня6 и находится в обонятельной слизистой оболочке и в обонятельной лампе. У взрослых, обонятельные сенсорные нейроны умирают регулярно в результате воздействия окружающей среды, и они заменяются вновь дифференцированных нейронов. OEG окружает и направляет эти новые обонятельные аксоны, чтобы войти в обонятельную лампу и установить новые синапсы со своими целями в ЦНС7. Из-за этих физиологических атрибутов, OEG был использован в моделях травмы ЦНС, таких как повреждение спинного мозга или зрительного нерва и его нейрорегенеративных и нейропротекторныхсвойств стало доказано 8,9,10,11. Несколько факторов были определены как ответственные за про-регенеративные характеристики этих клеток, в том числе внеклеточной матрицы протеаз производства или секреции нейротрофических и аксональныхфакторов роста 12,13,14.

Учитывая технические ограничения на расширение первичных клеток OEG, мы ранее установили и охарактеризовали обратимые увековеченные человеческие клональные линии OEG (ihOEG), которые обеспечивают неограниченное количество однородных OEG. Эти клетки ihOEG происходят из первичных культур, приготовленных из обонятельных луковиц, полученных в результате аутопсии. Они были увековечены путем трансдукции теломеразы каталитического подразделения (TERT) и онкогена Имт-1 и модифицированы с вирусом SV40 большойантиген T 15,16,17,18. Две из этих линий клеток ihOEG являются Ts14, который поддерживает регенеративную способность оригинальных культур и Ts12, низкая регенеративная линия, которая используется в качестве низкого контроля регенерации в этихэкспериментах 18.

Для оценки способности OEG способствовать аксональной регенерации после повреждения нервной системы было реализовано несколько моделей in vitro. В этих моделях, OEG применяется к культурам различного нейронного происхождения и формирования нейрита и удлинения в ответ на глиальной кокультуры- являются анализ. Примерами таких нейронных источников являются неонатальные крысиные корковыенейроны 19, царапинные раны, выполняемые на крысиных эмбриональных нейронахиз корковой ткани 20,крысиныесетчатки explants 21, крыса гипоталамическая или гиппокампа послеродовыенейроны 22,23, послеродовой крысы спинной корень ганглиянейронов 24, послеродовой мыши кортикоспинальных нейроновтракта 25, человека NT2нейронов 26, или послеродовой мозговой корковых нейронов на реактивных астроцитов шрам-каккультуры 27.

В этих моделях, однако, анализ регенерации опирается на эмбриональные или постнатальные нейроны, которые имеют внутреннюю пластичность, которая отсутствует в поврежденных взрослых нейронов. Чтобы преодолеть этот недостаток, мы представляем модель регенерации взрослых аксональных в кокультурах линий OEG со взрослыми нейронами ганглия сетчатки (RGNs), на основе того, который первоначально разработан Wigley et al.28,29,30,31 и изменен и использованнашей группой 12,13,14,15,16,17,18,32,33. Кратко, ткань сетчатки извлекается от взрослых крыс и усваивается с papain. Подвеска сетчатки клетки после этого покрывается на или polylysine-обработанных coverslips или на Ts14 и Ts12 monolayers. Культуры поддерживаются в течение 96 ч, прежде чем они фиксируются, а затем иммунофлуоресценции для аксональных (MAP1B и NF-Hбелков) 34 и соматодендритных (MAP2A и B)35 маркеров выполняется. Аксональная регенерация измеряется в процентах от нейронов с аксоном, по отношению к общей популяции RGNs и аксональный индекс регенерации рассчитывается как средняя аксональная длина на нейрон. Этот протокол не только полезен для оценки нейрорегенеративного потенциала ihOEG, но может быть распространен на различные источники OEG или других глиальных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты на животных были одобрены национальными и институциональными комитетами по биоэтике.

1. ihOEG (Ts12 и Ts14) культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура проводится в стерильных условиях в шкафу биобезопасности культуры тканей.

  1. Подготовка 50 мл ME10 OEG культуры среды, как это предусмотрено в таблице 1.
  2. Приготовьте 5 мл DMEM/F12-FBS, как это предусмотрено в таблице 1,в конической трубке 15 мл.
  3. Разогреть оба средства при 37 градусов по Цельсию в чистой водяной бане, в течение 15 мин.
  4. Оттепель Ts12 и Ts14 клетки флаконы при 37 градусов по Цельсию в чистой водяной бане.
  5. Повторное добавление ячеек в культурную среду DMEM/F12-FBS, подготовленную в шаге 2.
  6. Центрифуга в течение 5 мин при 200 x g.
  7. Стремитесь к супернатанту.
  8. Добавьте 500 мкл среды ME10 и перерасходуйте гранулы.
  9. Приготовьте блюдо культуры клеток p60 с 3 мл ME10 и добавьте клеточной подвески, dropwise.
  10. Перемещение для равномерного распределения ячеек по всей тарелке.
  11. Культурные клетки при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После достижения слияния, по крайней мере еще один проход должен быть сделан для оптимизации клеток для совместной культуры. 90% слияния необходимо, прежде чем сеять их на обложках для совместной культуры. Слияние р-60 имеет среднее число клеток 7 х 105 для Ts14 и 2,5 х 106 для линий клеток Ts12. Линии сотовой связи Ts12 и Ts14 должны проходить каждые 2-3 дня.

2. Подготовка ihOEG (Ts12 и Ts14) к анализу

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть сделан за 24 ч до вскрытия RGN и совместной культуры.

  1. Обработать 12 мм крышками с 10 мкг/мл поли-Л-лизина (PLL) в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крышки можно оставить на ночь в решении PLL.
  2. Вымойте крышки с 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS), три раза.
  3. Отсоедините клетки Ts12 и Ts14 ihOEG от блюда культуры клеток p60.
    1. Добавьте 4 мл среды культуры DMEM/F12-FBS(таблица 1) в коническую трубку 15 мл. Тепло при 37 градусов по Цельсию на чистой водяной бане.
    2. Удалите среду из пластин и мыть клетки с 1 мл 1x PBS-EDTA, один раз.
    3. Добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА в клетки OEG и инкубировать в течение 3-5 мин при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
    4. Соберите ячейки с p1000 пипеткой и перенесите их в средние подготовленные в шаге 3.1.
    5. Центрифуга в течение 5 мин при 200 x g.
    6. Стремитесь к супернатанту.
    7. Добавьте 1 мл среды ME10 и перерасходуйте гранулы.
    8. Подсчитайте номер клетки в гемоцитометре.
  4. Семя 80000 Ts14 клеток или 100000 Ts12 клеток / хорошо на крышки в 24-хорошо пластин в 500 йл ME10 среды.
  5. Культурные клетки при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2, для 24 ч.

3. Вскрытие тканей сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: 2-месячный мужчина Wistar крысы используются в качестве источника RGN. Две сетчатки (одна крыса) на 20 колодцев 24-хорошо клеточного блюда. Автоклав хирургического материала перед использованием. Papain диссоциации комплект коммерчески приобрели (Таблица материалов). Следуйте инструкциям поставщика для восстановления. Восстановить D,L-2-амино-5-фосфоновалеровой кислоты (APV) в 5 мМ запасов и подготовить aliquots.

  1. В день анализа подготовь следующие средства массовой информации.
    1. Приготовьте блюдо из клеточной культуры p60 с 5 мл холодного ЭБСС (флакон 1 комплекта диссоциации папаина).
    2. Приготовьте блюдо культуры клеток p60 с восстановленным флаконом 2 (папаин) комплекта диссоциации папаина плюс 50 МКЛ APV.  Затем добавьте 250 МКЛ изреконировать флакон 3 (DNase плюс 5 МКЛ APV).
    3. В стерильной трубке смешайте 2,7 мл флакона 1 с 300 МКЛ флакона 4 (ингибитор протеазы альбумин-овомукоид). Добавьте 150 мкл флакона 3 (DNase) плюс 30 МКЛ APV.
    4. Подготовка 20 мл нейробасал-B27 среды (NB-B27), как это предусмотрено в таблице 1.
  2. Пожертвовать крысы удушья с CO2.
  3. Удалить голову путем обезглавливания с гильотиной; поместите его в 100 мм чашку Петри и распылите голову этанолом 70%, прежде чем поместить его в капюшон ламинарного потока.
  4. Вырезать усы крысы с ножницами, чтобы они не мешают манипуляции с глазами.
  5. Grip зрительного нерва с типсами, чтобы вытащить глазное яблоко достаточно, чтобы иметь возможность сделать разрез через глаз скальпелем.
  6. Удалите хрусталик и стекловидного юмора и вытащить сетчатки (оранжевый, как ткани), в то время как остальные слои глаза остаются внутри (в том числе пигмент эпителиальный слой).
  7. Поместите сетчатку в блюдо культуры клеток p60, приготовленное в шаге 3.1.1.
  8. Перенесите сетчатку на блюдо культуры клеток p60, приготовленное в шаге 3.1.2, и разрежьте его скальпелем небольшими кусочками приблизительного размера Lt; 1 мм.
  9. Переход на пластиковую трубку 15 мл.
  10. Инкубировать ткани в течение 30 минут, во влажном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию под 5% CO2, с возбуждением каждые 10 минут.
  11. Разобщить клетки сгустки, трубя вверх и вниз со стеклянной пипеткой Пастера.
  12. Центрифуга клеточной суспензии при 200 x g в течение 5 мин.
  13. Откажитесь от супернатанта и инактивировать папаин, повторно поместью клеточной гранулы в растворе, подготовленном в шаге 3.1.3. (1,5 мл для 2 глаз).
  14. Тщательно трубы этой ячейки подвески в 5 мл восстановленного флакона 4.
  15. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин.
  16. В то время как центрифугирование, полностью удалить ME-10 среды из OEG 24 хорошо клеточной пластины (ранее подготовленные в шаге 2) и заменить его на 500 йл NB-B27 среды на колодец.
  17. Откажитесь от супернатанта и будем повторно помекать клетки в 2 мл среды NB-B27.
  18. Плита 100 МКЛ подвески клеток сетчатки, на колодец пластины m24, на PLL-обработанные или OEG монослойные крышки.
  19. Поддерживать культуры при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 для 96 ч в среде NB-B27.

4. Иммуностимулятор

  1. После 96 ч, исправить клетки в течение 10 мин, добавив тот же объем 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS в среде культуры (600 йл) (PFA конечной концентрации 2%).
  2. Удалите средства массовой информации и PFA из 24-многовеллудней пластины и еще раз добавить 500 йл 4% параформалдегида (PFA) в 1x PBS. Инкубировать в течение 10 мин.
  3. Отбросьте фиксатор и мыть 3 раза с 1x PBS в течение 5 минут.
  4. Блок с 0,1% Тритон X-100/1% FBS в PBS (PBS-TS) в течение 30-40 мин.
  5. Подготовь основные антитела в буфере PBS-TS следующим образом: SMI31 (против белков MAP1B и NF-H) моноклональные антитела (1:500). 514 (распознает MAP2A и B белки) кролик поликлональный антисерум (1:400).
  6. Добавляйте первичные антитела в кокультуры и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
  7. На следующий день, отказаться от антител и мыть крышки с 1x PBS, 3 раза, в течение 5 минут.
  8. Подготовь вторичные антитела в буфере PBS-TS следующим образом: для SMI-31, анти-мышь Alexa Fluor 488 (1:500). Для 514, анти-кролик Alexa-594 (1:500).
  9. Инкубировать клетки с соответствующими флуоресцентными вторичными антителами в течение 1 ч, в RT, в темноте.
  10. Вымойте крышки с 1x PBS, 3 раза, в течение 5 минут, в темноте.
  11. Наконец, крепление крышки с монтажнойсредой ( Таблица материалов) и держать на 4 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости может быть выполнено флуоресцентное окрашивание ядер DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол). Перед монтажом инкубировать клетки в течение 10 минут в темноте с DAPI (10 мкг / мл в 1x PBS). Вымойте крышки 3 раза с 1x PBS и, наконец, смонтировать крышки с монтажной среды.

5. Квантификация регенерации аксонала

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы количественно под 40x цель эпифлюоресценции микроскопа. Минимум 30 фотографий должны быть сделаны на случайных полях, по крайней мере 200 нейронов, которые будут количественно для каждого лечения. Каждый эксперимент должен повторяться не менее трех раз.

  1. Количественная оценка доли нейронов с аксоном (SMI31 положительный нейрит) по отношению к общей популяции RGNs (идентифицированы с MAP2A/B 514 положительный иммуностимунирование нейронного тела и дендритов).
  2. Количественная оценка индекса аксональной регенерации или средняя аксональная длина (мкм/нейрон). Этот параметр определяется как сумма длины (в мкм) всех идентифицированных аксонов, разделенных на общее количество подсчитанных нейронов, независимо от того, представили они аксон или нет. Длина Axonal определяется с помощью плагина NeuronJ программного обеспечения изображения ImageJ (NIH-США).
  3. Рассчитайте среднее, стандартное отклонение и статистическую значимость с помощью соответствующего программного обеспечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом протоколе мы представляем модель in vitro для анализа нейрорегенеративной способности OEG после повреждения нейронов. Как показано на рисунке 1, источник OEG является обратимым увековечены человека OEG клональной клеточной линии -Ts14 и Ts12-, которая происходит от основных культур, подготовленных из обонятельных луковиц, полученных в вскрытие15,17,18. Ткань сетчатки извлекается из взрослых крыс, переваривается, и сетчатки ганглия нейронов (RGN) подвеска покрывается либо PLL-обработанных coverslips или на ihOEG монослойных, Ts14 или Ts12. Культуры поддерживаются в течение 96 ч, прежде чем они будут исправлены. Аксональные и соматодендритические маркеры анализируются с помощью иммунофторесценции и количественной оценки аксональной регенерации.

Ts14 OEG идентичность оценивается иммуностентом с маркерами, описанными, чтобы быть выражены в ensheathing glia (Рисунок 2), таких как S100 β (Рисунок 2A) и vimentin (Рисунок 2B); Выражение GFAP также было проанализировано, чтобы отбросить загрязнение астроцитов(рисунок 2C). Как показано, Ts14 выразил S100 β vimentin, но не GFAP.

В анализе аксональной регенерации регенеративная способность Ts14 сравнивается с Ts12 в кокультурах RGN-OEG, используя субстрат PLL в качестве отрицательного контроля(рисунок 3). Процент клеток с аксонами, а также средняя длина регенерированных аксонов были значительно выше в нейронах, совместно культурных на монослойных Ts14, по сравнению с нейронами, потрохаными на клетках Ts12 или PLL(рисунок 3D,E). Репрезентативные изображения показывают отсутствие способности RGN регенерировать свои аксоны над клетками PLL или Ts12(рисунок 3A,B),в то время как Ts14 стимулирует рост аксонов в RGN (3C).

Figure 1
Рисунок 1: Диаграмма крыс сетчатки ганглия нейронов с обонятельной оболочки глии клетки кокультуры, как модель взрослых аксональной регенерации. Увековеченные человеческие линии клональных клеток OEG (ihOEG) -Ts12 и Ts14 - полученные из основных культур из обонятельных луковиц. Нейроны ганглия сетчатки от взрослых крыс покрываются либо PLL-обработанными крышками (негативным контролем), либо на монослойных Ts14 или Ts12. Культуры поддерживаются в течение 96 ч, прежде чем они фиксируются и аксональные и соматодендритические маркеры анализируются иммунофлуоресценции. Процент нейронов с аксоном и среднего аксональной длины / нейрона количественно прорицать RGN аксональной регенерации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Идентификация линии ячейки ihOEG Ts14. Иммунофлуоресценции изображения Ts14 в культуре, помечены анти-S100 β (панель А, зеленый) и виментин (панель B, красный). Выражение GFAP (панель C, красный) также было проанализировано, чтобы отбросить загрязнение астроцитов. Ядра окрашены DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Анализ аксональной регенерации в кокультурах линий OEG со взрослыми нейронами ганглия сетчатки (RGNs). (A-C) Иммунофлюоресценции изображения, показывающие соматодендритной маркировки с 514 антител, который признает микротрубочек связанных белка MAP2A и B, в красном, и с аксон-специфических SMI31 антитела в зеленом, против MAP1B и NF-H белков. Зеленые стрелки указывают rgN аксоны (SMI31-положительный: зеленый) и желтые стрелки указывают на нейронные тела и дендриты (514 положительных: красный и желтый). (D,E) Графики показывают среднее и стандартное отклонение процента нейронов, выставляли аксоны, и аксональный индекс регенерации, параметр, отражающий средняя аксональная длина (мкм) аксонов на нейрон. Минимум 30 снимков (40x) были сделаны на случайных полях и количественно для каждой выборки клеток. Эксперименты проводились в тройном, от трех различных крыс (N No 3), ткани сетчатки, слились с обоих глаз, с дубликатами для каждого экспериментального состояния (каждая популяция глии испытания). Звездочки указывают на статистическую значимость: 0,05, 0,05, 0,01, 0,001, NS: не имеет значения (ANOVA и post hoc Tukey test сравнения между параметрами, количественно для Ts14 против Ts12, Ts14 против PLL, и Ts12 против PLL). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OEG трансплантации в ЦНС травмы сайтов считается перспективным терапии травмы ЦНС из-за его составных про-нейрорегенеративныхсвойств 7,8,9. Однако, в зависимости от источника ткани – обонятельной слизистой оболочки (OM-OEG) по сравнению с обонятельной лампой (OB-OEG) – или возрастом донора, значительные различиясуществуют в такой емкости 26,31,33,36. Таким образом, важно иметь легкую и воспроизводимую модель in vitro для анализа нейрорегенеративной способности данного образца OEG, прежде чем инициировать исследования in vivo. В этом протоколе, аксотомизированные RGN взрослых крыс кокультурированы на монослой OEG для анализа. Для оценки аксональной регенерации RGN проводится последующий анализ аксональных и соматодендритических маркеров с помощью иммунофторесценции.

Первоначальная трудность анализа является источником OEG. В этой работе мы используем обратимые увековеченные человеческие клональные линии OEG (ihOEG), ранее установленные ихарактеризующиеся нашей группой 15,16,17,18,которые обеспечивают неограниченный запас однородного OEG. Две из этих линий клеток ihOEG являются Ts14, который поддерживает регенеративную способность оригинальных культур и Ts12, низкая регенеративная линия, которая используется в качестве низкогоконтроля регенерации в этих экспериментах 18 Тем не менее, хотя технические ограничения существуют для расширения человеческих первичных клеток OEG, они также могут быть получены из носовой эндоскопической биопсии-OM-или, в случае OB-OEG, от доноров трупа.

Подготовка монослойных культур OEG является важнейшей процедурой, так как слишком много клеток может привести к тому, что кокультура отсоединится от пластины. Поэтому перед подготовкой OEG к анализу рекомендуется, чтобы пользователь определяет оптимальное количество ячеек, которые должны быть поцарились, в зависимости от их размера и скорости деления.

Другой важной проблемой является диссоциация тканей сетчатки после вскрытия сетчатки. Необходимо разбить фрагменты тканей, после инкубации в диссоциальной смеси. Если сделать слишком энергично, клетки будут уничтожены, но фрагменты тканей будут оставлены нетронутыми, если сделать слишком слабо. Для того, чтобы получить однородную подвеску клеток, мы предлагаем заполнить и опорожнить трубу Pasteur 10-15 раз, с кончиком промежуточного диаметра, избегая при этом восходящей. Пастер пипетки с широкими наконечниками могут быть сужены с помощью горелки Bunsen.

Для оценки способности различных глиальных популяций способствовать регенерации аксональных взрослых нейронов, мы определили, что 96 ч является временным интервалом, который лучше всего подходит для цели, потому что: 1) это самое длинное время для поддержания культуры живой, не нарушая OEG однослойный; и 2) это время, необходимое для нейронов расти аксоны достаточно долго, чтобы выявить различия между регенеративными возможностями различных популяций OEG или других не-регенеративных клеток (т.е.фибробласты 12,13,14,15,16,17,18,32,33). Конечно, было бы интересно определить время процесса регенерации, поскольку он мог бы предоставить информацию о дифференциальных регенеративных свойствах различных глиальных популяций в более короткие сроки совместной культуры. В наших руках, для регенеративной глии, время курс между 72-96 ч очень похож для всех клеточных линий, хотя аксоны короче на 72 ч (неопубликованные данные). Кроме того, 96 ч совместной культуры, позволяет изучать OEG-зависимых механизмов взрослой аксональнойрегенерации 12,14.

Во время количественной оценки аксональной регенерации важно сделать как минимум 30 снимков при 400 дополнениях (40x цель), в разных случайных областях крышки, но после полного аксонов сфотографированных нейронов. Поэтому экспериментатор должен делать серийные снимки в выбранных областях для измерения реальной аксональной длины.

Были также разработаны другие подходы in vitro для оценки регенеративных функций OEG. В этих моделях OEG применяется к культурам различного нейронного происхождения и, в ответ на глиальное кокультуру, формирование нейрита и удлинениеанализированы 19,20,21,22,23,24,25,26,27. Тем не менее, анализ регенерации опирается на эмбриональные или послеродовые нейроны, которые имеют внутреннюю пластичность отсутствует у раненых взрослых нейронов. Эта модель, состоящая из взрослых аксональной регенерации в кокультурах линий OEG со взрослыми нейронами ганглия сетчатки (RGNs) преодолевает этот недостаток. Кроме того, мы рассекаем взрослую сетчатку, и поскольку мы разрезаем зрительный нерв и аксоны втягиваемся в процессе вскрытия, мы получаем нейрональные тела чистыми от миелина, чтобы выполнить кокультуру. Это разница с другими частями взрослого ЦНС, где миелин может очень сильно препятствовать с вскрытием, чтобы получить чистые нейроны для кокультуры.

Основываясь на одном первоначально разработанный Wigley и др.28,29,30,31, мы подчеркиваем следующие улучшения в протоколе. Во-первых, использование нейробазальной среды, дополненной B27 в качестве среды кокультуры OEG-RGN, которая позволяет рост нейрональных клеток и положительно влияет на воспроизводимость эксперимента. Во-вторых, мы характеризуем и количественно аксональной регенерации с помощью конкретного маркера аксонального отсека; и в-третьих, мы используем дополнительный прямой параметр, средняя длина аксонального/нейрона, который оценивает аксональный рост регенеративного потенциала OEG.

Таким образом, мы считаем, что это простой, воспроизводимый, экономия времени, и средней стоимости анализа, не только полезно для оценки нейрорегенеративного потенциала ihOEG, но и потому, что она может быть распространена на различные источники OEG или других глиальных клеток. Кроме того, он может быть использован в качестве ценного доказательства концепции нейрорегенеративного потенциала OEG или глиальный образец, до перевода на in vivo или клинических исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была финансово поддержана проектом SAF2017-82736-C2-1-R от Ministerio de Ciencia e Innovaci'n до MTM-F и Фондом Франсиско де Витория до JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
  2. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
  3. Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
  4. Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
  5. Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
  6. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
  7. Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
  8. Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
  9. Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
  10. Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
  11. Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
  12. Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
  13. Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
  14. Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
  15. Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
  16. García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
  17. García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
  18. Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
  19. Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
  20. Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
  21. Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
  22. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
  23. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
  24. Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
  25. Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
  26. Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
  27. Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
  28. Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
  29. Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
  30. Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
  31. Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
  32. Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
  33. García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
  34. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  35. Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
  36. Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).

Tags

Неврология Выпуск 165 обонятельные энсигритные глии (OEG) регенерация взрослых аксональных анализ в пробирке нейроны ганглия сетчатки (RGN) кокультура аксотомия
Кокультура аксотомизированных Крысиных Нейронов Сетчатки Ganglion с обонятельной Энситинг Глиа, как в пробирке Модель регенерации взрослых аксональных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Portela-Lomba, M., Simón, D.,… More

Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter