Summary
神経損傷後の嗅覚神経再生能力(OEG)の神経再生能力を評価するインビトロモデルを発表する。これは、OEG単層上のアキソトマイズ化された直上神経節ニューロン(RGN)の共培養と、RGN軸索およびソマト樹状マーカーを分析することによって、軸索再生のその後の研究に基づいています。
Abstract
嗅覚エンシアシンググリア(OEG)細胞は、嗅粘膜から嗅球の嗅覚神経層(ONL)までずっと局在化している。成人の生涯を通じて、彼らは新たに生成された嗅覚ニューロンの軸索成長のための鍵です, ラミナプロパリアからONLに.その再生特性のために、これらの細胞は脊髄または視神経損傷モデルにおける軸索再生を促進するために使用されてきた。
神経損傷後のOEG神経再生能力をアッセイし測定するためのインビトロモデルを発表する。このモデルでは、可逆的に不死化したヒトOEG(ihOEG)は単層として培養され、レチナは成体ラットから抽出され、Retinaは、OEG単層上に共培養される。96時間後、RGNの軸索およびソマト樹状マーカーを免疫蛍光によって分析し、軸索および平均軸索長/ニューロンを有するRGNの数を定量化する。
このプロトコルは、胚性ニューロンまたは出生後ニューロンに依存する他のインビトロアッセイよりも、成人組織におけるOEG神経再生特性を評価する利点がある。また、ihOEGの神経再生電位を評価するのに有用であるだけでなく、OEGまたは他のグリア細胞の異なる供給源に拡張することができる。
Introduction
成人中枢神経系(CNS)ニューロンは、傷害または疾患後の再生能力が限られている。CNS再生を促進するための一般的な戦略は、移植、傷害部位において、幹細胞、シュワン細胞、アストロサイトまたは嗅覚グリア(OEG)細胞などの軸索成長を誘導する細胞型の1、2、3、4、5である。
OEGは神経堤6に由来し、嗅粘膜および嗅球中に位置する。成人では、嗅覚感覚ニューロンは環境暴露の結果として定期的に死に、新たに分化されたニューロンに置き換えられる。OEGは、これらの新しい嗅覚軸索を取り囲んで導き、嗅球に入り、CNS 7の目標を持つ新しいシナプスを確立します。これらの生理学的属性のために、OEGは、脊髄または視神経損傷などのCNS傷害のモデルに使用されており、その神経再生および神経保護特性が証明される8、9、10、11になる。これらの細胞の再生促進特性の原因としていくつかの因子が同定されているが、神経栄養および軸索成長因子12、13、14の細胞外マトリックスプロテアーゼ産生または分泌を含む。
主要OEG細胞を拡張するための技術的な制限を考えると、我々は以前に均質なOEGの無制限の供給を提供する可逆的不死化ヒトOEG(ihOEG)クローンラインを確立し、特徴づけた。これらのihOEG細胞は、検死で得られた嗅球から調製された一次培養物に由来する。それらは、テロメラーゼ触媒サブユニット(TERT)とオンコジーンBmi−1の導入によって不死化し、SV40ウイルス大T抗原15、16、17、18で修飾した。これらのihOEG細胞株のうちの2つはTs14であり、これは元の培養物とTs12の再生能力を維持し、これらの実験18において低再生制御として使用される低再生線である。
神経損傷後に軸索再生を促進するOEG能力を評価するために、いくつかのin vitroモデルが実装されている。これらのモデルでは、OEGは、グリアの共培養に応答して、異なるニューロン起源および神経突起の形成と伸びの培養物に適用される。このようなニューロン源の例は、新生児ラット皮質ニューロン19、皮質組織20からラット胚性ニューロンに行われた傷創傷、ラットの眼窩外植物21、ラット視床下部または海馬後のニューロン22、23、出生後ラット背側根神経節ニューロン24、出生後マウスコルチコナルトラクトニューロン25、ヒトNT2ニューロン26、または、反応性アストロサイト瘢痕様培養27上の出生後大脳皮質ニューロン。
しかし、これらのモデルでは、再生アッセイは、負傷した成体ニューロンに存在しない本質的な可塑性を有する胚性または出生後ニューロンに依存している。この欠点を克服するために、私たちは、もともとウィグリーら、28、29、30、31によって開発されたものに基づいて、成人のretinal神経節ニューロン(RG)を有するOEGラインの共存培養における成人軸索再生のモデルを提示し、我々のグループ12、13、14、15、16、17、18、32、33.簡単に言えば、レチン組織は成虫ラットから抽出され、パパインで消化される。その後、レチナル細胞懸濁液は、ポリリジン処理カバーリップまたはTs14およびTs12単層のいずれかにメッキされます。培養物は、固定される前に96時間維持され、次いで軸索(MAP1BおよびNF−Hタンパク質)34およびソマト樹状(MAP2AおよびB)35マーカーに対する免疫蛍光が行われる。軸索再生は軸索を有するニューロンの割合として定量化され、RGNおよび軸索再生指数の総集団に関しては、ニューロン当たりの平均軸索長として計算される。このプロトコルは、ihOEGの神経再生ポテンシャルを評価するのに有用であるだけでなく、OEGまたは他のグリア細胞の異なる供給源に拡張することができる。
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Protocol
注:動物実験は、国家および機関の生命倫理委員会によって承認されました。
1. ihOEG (Ts12 および Ts14) 文化
注:この手順は、組織培養バイオセーフティキャビネットの無菌条件下で行われます。
- 表1に示すように50 mL ME10 OEG培養培地を準備する。
- 表1に示すように、DMEM/F12-FBSの5 mLを15 mLの円錐形チューブで準備します。
- 37°Cの清浄な水浴で、両方の媒体を15分間温めます。
- Ts12およびTs14細胞バイアルを37°Cのきれいな水浴で解凍する。
- ステップ 2 で調製した DMEM/F12-FBS 培地に細胞を再中断して追加します。
- 200 x gで 5 分間の遠心分離機 。
- 上清を熱望する。
- ME10培地500μLを加え、ペレットを再懸濁します。
- 3 mLのME10でp60細胞培養皿を準備し、細胞懸濁液を滴下して加えます。
- プレート全体にセルを均一に分配するために移動します。
- 培養細胞は5%CO2で37°Cで培養する。
注: 合流に達した後、少なくとも別の通路を行って、細胞を共培養に最適化する必要があります。90%合流は、コカルチャーのためのカバーリップにそれらを播種する前に必要とされる。コンフルエント p-60 は、Ts14 の平均セル番号が 7 x 10 5、Ts12 細胞株の場合は 2.5 x 106 です。 Ts12およびTs14細胞株は2~3日ごとに通過する必要があります。
2. アッセイのためのihOEG(Ts12およびTs14)の調製
注: このステップは、RGN 解剖と共培養の 24 時間前に行う必要があります。
- 12 mm Ø カバーリップを 10 μg/mL ポリ L リジン (PLL) で 1 時間処理します。
注:カバーリップはPLLソリューションで一晩放置することができます。 - 1xリン酸緩衝液生理食塩分(PBS)でカバーリップを3回洗います。
- P60細胞培養皿からTs12およびTs14 ihOEG細胞を取り外す。
- DMEM/F12-FBS培地(表1)を4mLの円錐チューブに加えます。清潔な水浴で37°Cで温めます。
- プレートから培地を取り出し、1mLのPBS-EDTAで細胞を1回洗浄します。
- OEG細胞に1mLのトリプシン-EDTAを加え、37°C、5%CO2で3〜5分間インキュベートします。
- p1000ピペットを用いて細胞を収集し、ステップ3.1で調製した培地に移します。
- 200 x gで 5 分間の遠心分離機 。
- 上清を熱望する。
- 1 mLのME10培地を加え、ペレットを再懸濁します。
- ヘモサイトメーターの細胞数を数える。
- 80,000 個の Ts14 細胞または 100,000 個の Ts12 細胞/ウェルを ME10 培地 500 μL の 24 ウェルプレートのカバーリップにシードします。
- 培養細胞は5%CO2で37°Cで、24時間培養する。
3. レチン組織解剖
注:2ヶ月齢の雄のウィスターラットは、RGNソースとして使用されています。24ウェルセル皿の20の井戸のための2つのレチナ(1匹のラット)。使用前にオートクレーブ外科材料。パパイン解離キットは商業的に購入されています (資料表)。プロバイダーの再構成の指示に従います。D,L-2-アミノ5-ホスホノソウレン酸(APV)を5mMストックに再構成し、アリコートを調製した。
- アッセイの日に、以下の培地を準備する。
- 5 mLの冷たい EBSS (パパイン解離キットのバイアル 1)を用いて p60 細胞培養皿を準備します。
- P60細胞培養皿を、パパイン解離キットの再構成バイアル2(パパイン)とAPVの50 μLを用意します。 その後、250 μLの再構成バイアル3(DNaseプラス5 μLのAPV)を加えます。
- 滅菌チューブでは、バイアル1の2.7mLをバイアル4(アルブミン・オボムコードプロテアーゼ阻害剤)の300μLと混合する。バイアル3(DNase)の150 μLと30 μLのAPVを加えます。
- 表1に示すように、ニューロバサル-B27培地(NB-B27)の20mLを調製する。
- CO2で窒息してラットを犠牲にする。
- ギロチンで首を切ることによって頭を取り除く;100 mm のペトリ皿に入れ、ヘッドにエタノールを 70% スプレーしてから、ラミナー フロー フードに入れます。
- 目の操作を妨げないように、ネズミのヒゲをはさみで切ります。
- 鉗子で視神経をつかみ、メスで眼を切開するのに十分な眼球を引き出します。
- レンズとバイトリスユーモアを取り除き、網膜(オレンジ状の組織)を引き出し、眼の残りの層は内部にとどまります(顔料上皮層を含む)。
- ステップ3.1.1で作製したp60細胞培養皿にレチナを入れます。
- ステップ3.1.2で調製したp60細胞培養皿にレチナを移し、メスを小さくして小さく切り、おおよそのサイズ<1mmにします。
- 15 mLプラスチックチューブに移します。
- 組織を30分間インキュベートし、37°C下5%CO2で加湿インキュベーターに入れ、10分ごとに撹拌します。
- ガラスパスツールピペットで上下にピペットを入れ、細胞の塊を解化します。
- 細胞懸濁液を200xgで5分間遠心分離する。
- 上清を捨ててパパインを不活性化させ、ステップ3.1.3で調製した溶液中の細胞ペレットを再懸濁させる。(2つの目のための1.5 mL)。
- この細胞懸濁液を5mLの再構成バイアル4に慎重にピレットする。
- 200 x g で 5 分間遠心分離機。
- 遠心分離機をしながら、Me-10培地をOEG 24ウェルセルプレート(ステップ2で以前に作成)から完全に取り除き、1ウェルあたり500μLのNB-B27培地に交換します。
- 上清を捨て、細胞を2mLのNB-B27培地で再懸濁します。
- レチナルセル懸濁液のプレート100 μLは、m24プレートのウェルあたり、PLL処理またはOEGモノレイヤーカバーリップ上に。
- NB-B27培地での培養液を5%CO2 で96時間維持します。
4. 免疫染色
- 96時間後、1xPBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)の同量を培地(600μL)(PFA最終濃度2%)に加えて10分間細胞を固定します。
- 24-マルチウェルプレートからメディアとPFAを取り出し、1x PBSで再び4%パラホルムアルデヒド(PFA)の500 μLを追加します。10分間インキュベートします。
- フィクサーを捨て、1x PBSで3回5分間洗います。
- PBS(PBS-TS)で0.1%のトリトンX-100/1%FBSを30〜40分間ブロックします。
- 次のようにPBS-TSバッファーに一次抗体を調製する:SMI31(MAP1BおよびNF-Hタンパク質に対して)モノクローナル抗体(1:500)。514(MAP2AおよびBタンパク質を認識する)ウサギポリクローナル抗血清(1:400)。
- 一次抗体を共培養に加え、4°Cで一晩インキュベートする。
- 翌日、抗体を捨て、カバーリップを1x PBSで3回5分間洗います。
- 次のようにPBS-TSバッファーに二次抗体を調製します: SMI-31,抗マウスアレクサフルーオール488(1:500)。514の場合、抗ウサギのAlexa-594(1:500)。
- 対応する蛍光二次抗体を1時間、RTで、暗い中でインキュベートする。
- カバーリップを1x PBSで3回、5分間、暗闇の中で洗います。
- 最後に、取り付け媒体(材料表)を取り付けたカバースリップを取り付け、4°Cに保ちます。
注:必要に応じて、DAPI(4,6-ジミジノ-2-フェニリンドール)による蛍光核染色が行われ得ます。取り付ける前に、DAPI(1x PBSで10 μg/mL)で暗闇の中で10分間細胞をインキュベートします。1x PBSでカバーリップを3回洗い、最後に取り付け媒体でカバーリップを取り付けます。
5. 軸索再生定量
注:サンプルは、蛍光顕微鏡の40x目的で定量化されます。治療ごとに定量化するために、少なくとも200個のニューロンを持つランダムなフィールドで最低30枚の写真を撮影する必要があります。各実験は最低3回繰り返す必要があります。
- RGNの総集団に対する軸索(SMI31陽性神経突起)を有するニューロンの割合を定量化する(MAP2A/B 514ニューロン体および樹状突起の陽性免疫染色で同定)。
- 軸索再生指数または平均軸索長(μm/ニューロン)を定量化します。このパラメータは、同定されたすべての軸索の長さの合計(μm)として定義され、軸索を提示したかどうかにかかわらず、カウントされたニューロンの総数で割ります。軸索の長さは、イメージソフトウェアImageJ(NIH-USA)のプラグインニューロンJを使用して決定されます。
- 適切なソフトウェアを使用して、平均、標準偏差、統計的有意性を計算します。
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Representative Results
このプロトコルでは、ニューロン損傷後のOEG神経再生能力をアッセイするインビトロモデルを提示する。図1に示すように、OEG源は、一次培養物に由来する可逆的不死化ヒトOEGクローナル細胞株−Ts14及びTs12−を、検死15、17、18で得られた嗅球から調製する。レチナル組織は、成人ラットから抽出され、消化され、およびレチナル神経節ニューロン(RGN)懸濁液は、PLL処理されたカバーリップまたはihOEG単層、Ts14またはTs12のいずれかにメッキされ、培養物は固定される前に96時間維持される。軸索および体性腺標識は免疫蛍光によって分析され、軸索再生は定量化される。
Ts14 OEGの同一性は、S100 β(図2A)およびビメンチン(図2B)のような、エンシーシンググリア(図2)で発現するように記載されたマーカーを用いて免疫染色することによって評価される。GFAP発現も分析し、アストロサイト汚染を廃棄した(図2C)。図示のように、Ts14はS100 βおよびvimentinを発現したがGFAPは発現しなかった。
軸索再生アッセイでは、Ts14回再生能力がRGN-OEGコカルチャーにおけるTs12と比較され、PLL基質を負の対照として用いる(図3)。Ts12細胞またはPLL上でメッキされたニューロンと比較して、軸索を有する細胞の割合と再生軸索の平均長さの両方が、Ts14単層で共培養されたニューロンにおいて有意に高かった(図3D,E)。代表的な画像は、PLLまたはTs12細胞(図3A,B)上で軸索を再生するRGNの能力の欠如を示し、Ts14はRGN(3C)の軸索の成長を刺激する。
図1:成人軸索再生のモデルとして、嗅覚神経膠細胞を共培養したラットの神経節ニューロンの図。不死化ヒトOEG(ihOEG)クローン細胞株-Ts12およびTs14-嗅球から一次培養物に由来する。成人ラットのレチナル神経節ニューロンは、PLL処理されたカバーリップ(陰性対照)またはTs14またはTs12単層のいずれかにメッキされます。培養物は固定される前に96時間維持され、軸索およびソマト樹状マーカーは免疫蛍光によって分析される。軸索と平均軸索長/ニューロンを有するニューロンの割合は、RGN軸索再生をアッセイするために定量化される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ihOEG細胞株Ts14の同一性。Ts14の培養中の免疫蛍光画像は、抗S100 β(パネルA、緑色)およびビメンチン(パネルB、赤)で標識した。GFAP発現(パネルC、赤)も分析し、アストロサイト汚染を廃棄した。核はDAPI(青)で染色されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:成人性神経節ニューロン(RG)を有するOEGラインのコカルチャーにおける軸索再生のアッセイ。(A –C)微小管関連タンパク質MAP2AおよびBを赤色で認識し、軸索特異的SMI31抗体を緑色で、MAP1BおよびNF-Hタンパク質に対して認識する514抗体によるソマト樹状標識を示す免疫蛍光画像。緑色の矢印はRGN軸索(SMI31陽性:緑)を示し、黄色の矢印は神経細胞と樹状突起を示す(514陽性:赤と黄色)。(D,E)グラフは、軸索を示すニューロンの割合と軸索再生指数の平均と標準偏差を示し、ニューロンあたりの軸索の平均軸索長(μm)を反映したパラメータである。ランダムフィールドで最低30枚(40倍)を撮影し、各細胞サンプルについて定量化しました。実験は三重で行い、3つの異なるラット(N=3)から、両眼から離れたレチナル組織を、各実験条件(各グリア集団が試験)について重複して行った。アスタリスクは、統計的有意性を示します: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, NS: 非有意性 (Ts14 対 Ts12、Ts14 対 PLL、および Ts12 対 PLL に対して定量化されたパラメーター間の ANOVA およびポストホック Tukey テスト比較)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
CNS傷害部位でのOEG移植は、その構成的な前神経再生特性7、8、9によるCNS傷害に対する有望な治療法と考えられている。しかし、組織源(嗅覚粘膜(OM-OEG)対嗅球(OB-OEG)、またはドナーの年齢に応じて、そのような容量26、31、33、36にかなりの変動が存在する。したがって、インビボ試験を開始する前に、所定のOEGサンプルの神経再生能力をアッセイする簡単で再現性のあるインビトロモデルを有することが重要である。このプロトコルでは、成体ラットのアキソトマイズ化RGNは、OEGの単層に共培養され、アッセイされる。免疫蛍光によるRGN軸索およびソマト樹状マーカーのその後の分析は、RGN軸索再生を評価するために行われる。
アッセイの初期の難易度はOEGの源である。本研究では、従来のグループ15、16、17、18によって確立され、同種OEGの無制限供給を提供する可逆的不死化ヒトOEG(ihOEG)クローナルラインを使用します。これらのihOEG細胞株のうちの2つは、元の培養物の再生能力を維持するTs14であり、Ts12は、これらの実験で低再生制御として使用される低再生線である18のにもかかわらず、ヒトの原発OEG細胞を拡張するための技術的限界は存在するが、それらはまた、鼻内視鏡的生検から得ることができる。
単層OEG培養の調製は、あまりにも多くの細胞がプレートから分離するコカルチャーを引き起こす可能性があるとして、重要な手順です。したがって、OEGのアッセイの準備に先立ち、ユーザーは、そのサイズおよび分割率に応じて、メッキされる細胞の最適な数を決定することが推奨される。
もう一つの重大な問題は、レチナ解離後の、レチナル組織解離である。解離ミックス中のインキュベーションに続いて、組織断片を分割する必要があります。あまりにも激しく行われると、細胞は破壊されますが、組織断片はあまりにも弱く行われた場合はそのまま残されます。均質な細胞懸濁液を得るために、泡立ちを避けながら、パスツールピペットを中間直径の先端で10~15回充填して空にすることをお勧めします。広い先端のパスツールピペットは、ブンゼンバーナーを使用して絞り込むことができます。
成人ニューロンの軸索再生を促進するための異なるグリア集団の能力を評価するために、我々は96時間が最も目的に適した時間間隔であると判断した: 1)OEG単層を乱すことなく生きている文化を維持する最も長い時間である。2)それは、異なるOEG集団または他の非再生細胞(すなわち、線維芽細胞12、13、14、15、16、17、18、32、33)の再生能力の違いを明らかにするのに十分な長さの軸索を成長させるために必要な時間です。それは、コカルチャーの短い時間で、異なるグリア集団の差反再生特性に関する情報を提供することができるので、再生プロセスの時間経過を決定することは確かに興味深いでしょう。私たちの手では、再生グリアでは、72-96時間の間の時間経過は、軸索が72時間(未発表データ)で短いが、すべての細胞株のために非常に似ています。また、96時間の共培養は、成人軸索再生12,14のOEG依存的メカニズムを研究することを許可する。
軸索再生定量の間、カバースリップの異なるランダムな領域で、400の増強物(40xの目的)で最低30枚の写真を撮ることが重要ですが、撮影されたニューロンの完全な軸索に従ってください。したがって、実験者は、実際の軸索の長さを測定するために選択された領域で連続写真を撮る必要があります。
他のインビトロアプローチもOEG再生機能を評価するために開発されています。これらのモデルでは、OEGは異なる神経起源の培養物に適用され、グリア共培養に応答して、神経突起形成および伸びは、19、20、21、22、23、24、25、26、27とアッセイされる。しかし、再生アッセイは、負傷した成人ニューロンから欠けている本質的な可塑性を有する胚性または出生後ニューロンに依存している。このモデルは、OEGラインの共存培養における成人軸索再生と、成人の神経節ニューロン(RG)を伴うこの欠点を克服する。また、成人の眼窩を解剖しており、解剖の過程で視神経や軸索を切断するため、ミエリンの清潔な神経細胞を得て、共培養を行います。これは、ミエリンが共培養のためのきれいなニューロンを得るために解剖で非常に妨げることができる成人CNSの他の部分との違いです。
もともとウィグリーらによって開発されたものに基づいて28,29,30,31,我々 はプロトコルの次の改善を強調.まず、OEG-RGNコカルチャー培地としてB27を添加した神経基底培地を用い、神経細胞の増殖を可能にし、実験の再現性にプラスの影響を与える。第二に、軸索コンパートメントの特定のマーカーを使用して軸索再生を特徴付け、定量化します。第3に、OEGの軸索成長再生ポテンシャルを評価する追加の直接パラメータである平均軸索長/ニューロンを使用します。
要約すると、これは単純で再現性の高い、時間節約、中コストのアッセイであり、ihOEGの神経再生ポテンシャルを評価するのに有用であるだけでなく、OEGまたは他のグリア細胞の異なる供給源に拡張することができるためであると考えています。さらに、インビボまたは臨床試験に翻訳する前に、OEGまたはグリアサンプルの神経再生可能性の概念の貴重な証明として使用することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作業は、シエンシア・エ・イノバシオン大臣からMTM-F、フンダシオン・ウニバーシダード・フランシスコ・デ・ビトリアからJSへのプロジェクトSAF2017-82736-C2-1-Rによって財政的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
References
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