Summary
Vi presenterar en in vitro-modell för att bedöma lukt ensheathing glia (OEG) neuroregenerative kapacitet, efter neurala skada. Det är baserat på en kokultur av axotomized vuxna retinal ganglion nervceller (RGN) på OEG monolayers och efterföljande studie av axonal regenerering, genom att analysera RGN axonal och somatodendritic markörer.
Abstract
Lukt ensheathing glia (OEG) celler lokaliseras hela vägen från luktslemhinnan till och in i luktnervskiktet (ONL) i luktlampan. Under hela vuxenlivet är de nyckeln till axonal odling av nyproducerade luktneuroner, från lamina propria till ONL. På grund av deras pro-regenerativa egenskaper, dessa celler har använts för att främja axonal regenerering i ryggmärg eller optik nerv skada modeller.
Vi presenterar en in vitro modell att analysera och mäta OEG neuroregenerative kapacitet efter neurala skada. I denna modell odlas reversibelt odödliga mänskliga OEG (ihOEG) som en monolayer, näthinnor extraheras från vuxna råttor och retinala ganglion nervceller (RGN) kokuleras på OEG monolayer. Efter 96 h analyseras axonal och somatodendritic markörer i RGNs av immunofluorescence och antalet RGNs med axon och den genomsnittliga axonal längd/neuron kvantifieras.
Detta protokoll har fördelen jämfört med andra in vitro-analyser som förlitar sig på embryonala eller postnatala nervceller, att det utvärderar OEG neuroregenerativa egenskaper i vuxenvävnad. Det är också inte bara användbart för att bedöma den neuroregenerativa potentialen hos ihOEG men kan utvidgas till olika källor till OEG eller andra gliaceller.
Introduction
Vuxna centrala nervsystemet (CNS) nervceller har begränsad regenerativ kapacitet efter skada eller sjukdom. En vanlig strategi för att främja CNS-regenerering är transplantation, på skadestället, av celltyper som inducerar axonal tillväxt som stamceller, Schwann-celler, astrocyter eller lukt ensheathing glia (OEG) celler1,2,3,4,5.
OEG härstammar från neurala vapen6 och lokaliserar i luktslemhinnan och i luktlampan. Hos vuxna dör luktsensoriska nervceller regelbundet som ett resultat av miljöexponering och de ersätts av nyligen differentierade nervceller. OEG omger och vägleder dessa nya luktaxoner för att komma in i luktlampan och för att upprätta nya synapser med sina mål i CNS7. På grund av dessa fysiologiska egenskaper har OEG använts i modeller av CNS-skada som ryggmärg eller optisk nervskada och dess neuroregenerativa och neuroprotektiva egenskaper blir bevisade8,9,10,11. Flera faktorer har identifierats som ansvariga för de pro-regenerativa egenskaperna hos dessa celler, inklusive extracellulära matris proteaser produktion eller utsöndring av neurotrofisk och axonaltillväxtfaktorer 12,13,14.
Med tanke på de tekniska begränsningarna för att expandera primära OEG-celler, etablerade och karakteriserade vi tidigare reversibla förevigade mänskliga OEG (ihOEG) klonina linjer, som ger en obegränsad tillgång på homogen OEG. Dessa ihOEG-celler härrör från primära kulturer, beredda från luktlampor som erhållits i obduktioner. De förevigades genom transduktion av telomeras katalytisk underavdelning (TERT) och oncogene Bmi-1 och modifierades med SV40 virus stora T antigen15,16,17,18. Två av dessa ihOEG-cellinjer är Ts14, som upprätthåller den regenerativa kapaciteten hos de ursprungliga kulturerna och Ts12, en låg regenerativ linje som används som en låg regenereringskontroll i dessa experiment18.
För att bedöma OEG kapacitet att främja axonal regenerering efter neurala skada, flera in vitro modeller har genomförts. I dessa modeller tillämpas OEG på kulturer av olika neuronalt ursprung och neuritbildning och förlängning - som svar på gliakokultur - analyseras. Exempel på sådana neuronala källor är neonatal råtta när nervceller19,skrapsår utförs på råtta embryonala nervceller från närvävnad 20,råtta retinal explanter21,råtta hypotalamus eller hippocampal postnatala nervceller22,23, postnatala råtta dorsala rot ganglion nervceller24, postnatala mus kortikospinal tract nervceller25,mänskliga NT2 nervceller26, eller postnatala cerebrala när nervceller på reaktiva astrocyt ärr-liknande kulturer27.
I dessa modeller förlitar sig dock regenereringstestet på embryonala eller postnatala nervceller, som har en inneboende plasticitet som saknas i skadade vuxna nervceller. För att övervinna denna nackdel, Vi presenterar en modell av vuxna axonal regenerering i kokulturer av OEG linjer med vuxna retinal ganglion nervceller (RGNs), baserat på den som ursprungligen utvecklats av Wigley et al.28,29,30,31 och modifierade och används av vår grupp12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kort, retinal vävnad extraheras från vuxna råttor och smälts med papain. Retinalcellsupphängning pläterar sedan på antingen polylysinbehandlade täcken eller på Ts14- och Ts12-monoskikt. Kulturer upprätthålls i 96 h innan de är fasta och sedan immunofluorescens för axonal (MAP1B och NF-H proteiner)34 och somatodendritic (MAP2A och B)35 markörer utförs. Axonal regenerering kvantifieras som en procentandel av nervceller med axon, med avseende på den totala populationen av RGNs och axonal regenerering index beräknas som den genomsnittliga axonal längd per neuron. Detta protokoll är inte bara användbart för att bedöma neuroregenerative potentialen ihOEG men kan utvidgas till olika källor till OEG eller andra gliaceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Djurförsök godkändes av nationella och institutionella bioetikkommittéer.
1. ihOEG (Ts12 och Ts14) kultur
OBS: Denna procedur görs under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp för vävnadskultur.
- Förbered 50 ml ME10 OEG-odlingsmedium enligt tabell 1.
- Förbered 5 ml DMEM/F12-FBS, enligt tabell 1,i ett koniskt rör på 15 ml.
- Värm båda medierna vid 37 °C i ett rent vattenbad i 15 minuter.
- Tina Ts12 och Ts14 celler injektionsflaska vid 37 °C i ett rent vattenbad.
- Återanvänd och lägg till celler i DMEM/F12-FBS odlingsmedium som bereds i steg 2.
- Centrifugera i 5 min vid 200 x g.
- Aspirera supernaten.
- Tillsätt 500 μL ME10 medium och återanvänd pelleten.
- Förbered en p60-cellkulturrätt med 3 ml ME10 och tillsätt cellfjädringen, droppvis.
- Flytta för att fördela cellerna jämnt över plattan.
- Odlingsceller vid 37 °C i 5% CO2.
OBS: När du har nått sammanflöde måste minst en annan passage göras för att optimera cellerna för kokultur. 90% sammanflöde behövs innan du sår dem på täcklipsen för kokultur. En sammanflödes-p-60 har ett genomsnittligt cellnummer på 7 x 105 för Ts14 och 2,5 x 106 för Ts12-cellinjer. Ts12 och Ts14 cellinjer bör passeras var 2-3 dagar.
2. Beredning av ihOEG (Ts12 och Ts14) för analysen
OBS: Detta steg måste göras 24 timmar före RGN dissekering och kokultur.
- Behandla 12 mm Ø täcken med 10 μg/ml poly-L-lysin (PLL) i 1 timme.
OBS: Täckglasen kan lämnas över natten i PLL-lösning. - Tvätta täckglasen med 1x fosfatbuffert saltlösning (PBS), tre gånger.
- Lossa Ts12- och Ts14 ihOEG-celler från p60-cellkulturrätten.
- Tillsätt 4 ml DMEM/F12-FBS odlingsmedium (tabell 1) till ett koniskt rör på 15 ml. Värm vid 37 °C i ett rent vattenbad.
- Ta bort mediet från tallrikar och tvätta celler med 1 ml 1x PBS-EDTA en gång.
- Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA till OEG-cellerna och inkubera i 3–5 min vid 37 °C, 5 % CO2.
- Samla celler med en p1000 pipett och överför dem till medium beredda i steg 3.1.
- Centrifugera i 5 min vid 200 x g.
- Aspirera supernaten.
- Tillsätt 1 ml ME10 medium och sätt tillbaka pelleten.
- Räkna cellnumret i en hemocytometer.
- Kärna ur 80 000 Ts14-celler eller 100 000 Ts12-celler/brunn på täckplattorna i 24-brunnsplattor i 500 μL ME10-medium.
- Kulturceller vid 37 °C i 5% CO2, för 24 h.
3. Retinal vävnad dissekering
OBS: 2 månader gamla manliga Wistar råttor används som RGN källa. Två näthinner (en råtta) för 20 brunnar av en 24-brunns cellrätt. Autoklav kirurgiskt material före användning. Papain dissociation kit köps kommersiellt(Table of Materials). Följ leverantörens instruktioner för beredning. Reconstitute D,L-2-amino-5-fosfonovalersyra (APV) i 5 mM lager och förbereda alikvoterna.
- På testdagen, förbered följande media.
- Förbered en p60-cellkulturrätt med 5 ml kall EBSS (injektionsflaska 1 av papain dissociation kit).
- Förbered en p60-cellkulturrätt med rekonstituerad flaska 2 (papain) av papaindissociationssatsen plus 50 μL APV. Tillsätt sedan 250 μL avrekonstituerad flaska 3 (DNase plus 5 μL APV).
- I en steril rörblandning 2,7 ml injektionsflaska 1 med 300 μL injektionsflaska 4 (albumin-ovomucoid proteashämmare). Tillsätt 150 μL injektionsflaska 3 (DNase) plus 30 μL APV.
- Bered 20 ml Neurobasal-B27 medium (NB-B27) enligt tabell 1.
- Offra en råtta genom kvävning med CO2.
- Ta bort huvudet genom halshuggning med giljotin; placera den i en 100 mm Petri-skål och spraya huvudet med etanol 70% innan du placerar den i en laminär flödeshuv.
- Skär råttans morrhår med sax så att de inte stör ögonmanipulationen.
- Greppa synnerven med tång för att dra ut ögongloben tillräckligt för att kunna göra ett snitt över ögat med en skalpell.
- Ta bort linsen och glaskroppshumorn och dra ut näthinnan (orangeliknande vävnad), medan de återstående lagren av ögat stannar inuti (inklusive pigmentepitela skiktet).
- Placera näthinnan i p60-cellkulturrätten i steg 3.1.1.
- Överför näthinnan till p60-cellkulturrätten som bereds i steg 3.1.2 och skär den med skalpellen i små bitar av ungefärlig storlek < 1 mm.
- Överför till ett 15 ml plaströr.
- Inkubera vävnaden i 30 min, i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5% CO2, med agitation var 10: e minut.
- Dissociera cellklumpar genom att pipettera upp och ner med en glas pastörpipett.
- Centrifugera cellfjädringen vid 200 x g i 5 min.
- Kassera supernatant och för att inaktivera papain, återanvänd cellpelleten i lösningen som bereds i steg 3.1.3. (1,5 ml för 2 ögon).
- Rör försiktigt denna cellupphängning i 5 ml rekonstituerad injektionsflaska 4.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min.
- Medan centrifugering, ta helt bort ME-10-mediet från OEG 24 brunnscellplattan (tidigare beredd i steg 2) och ersätt den med 500 μL NB-B27 medium per brunn.
- Kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 2 ml NB-B27 medium.
- Platta 100 μL näthinnecellsupphängning, per m24-platta, på PLL- behandlade eller OEG-monoskiktslock.
- Håll kulturer vid 37 °C med 5% CO2 i 96 h i NB-B27 medium.
4. Immunostaining
- Efter 96 timmar, fixera cellerna i 10 minuter genom att tillsätta samma volym på 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS till odlingsmediet (600 μL) (PFA slutlig koncentration 2%).
- Ta bort mediet och PFA från 24-multiwellplattan och tillsätt återigen 500 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS. Inkubera i 10 min.
- Kassera fixaren och tvätta 3 gånger med 1x PBS i 5 min.
- Blockera med 0,1% Triton X-100/1% FBS i PBS (PBS-TS) i 30-40 min.
- Bered de primära antikropparna i PBS-TS-bufferten enligt följande: SMI31 (mot MAP1B- och NF-H-proteiner) monoklonala antikroppar (1:500). 514 (känner igen MAP2A- och B-proteiner) kaninpolyklonal antiserum (1:400).
- Tillsätt primära antikroppar till kokulturer och inkubera över natten vid 4 °C.
- Kassera antikropparna nästa dag och tvätta täckena med 1x PBS, 3 gånger, i 5 minuter.
- Förbered de sekundära antikropparna i PBS-TS-bufferten enligt följande: För SMI-31, antimus Alexa Fluor 488 (1:500). För 514, anti-kanin Alexa-594 (1:500).
- Inkubera celler med motsvarande fluorescerande sekundära antikroppar i 1 timme, vid RT, i mörkret.
- Tvätta täckena med 1x PBS, 3 gånger, i 5 minuter, i mörkret.
- Slutligen montera täcken med monteringsmedium (Materialförteckning) och håll vid 4 °C.
OBS: Vid behov kan fluorescerande nukleifärgning med DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol) utföras. Innan du monterar, inkubera cellerna i 10 minuter i mörker med DAPI (10 μg/ml i 1x PBS). Tvätta täckena 3 gånger med 1x PBS och montera slutligen täckena med monteringsmediet.
5. Kvantifiering av axonal regenerering
OBS: Proverna kvantifieras enligt 40x-målet med ett epifluorescensmikroskop. Minst 30 bilder bör tas på slumpmässiga fält, med minst 200 nervceller, som ska kvantifieras för varje behandling. Varje experiment bör upprepas minst tre gånger.
- Kvantifiera andelen nervceller med axon (SMI31 positiv neurit) i förhållande till den totala populationen av RGNs (identifieras med MAP2A/B 514 positiv immunostaining av neuronal kropp och dendriter).
- Kvantifiera axonal regenerering index eller genomsnittlig axonal längd (μm/neuron). Denna parameter definieras som summan av längderna (i μm) för alla identifierade axoner, dividerat med det totala antalet räknade nervceller, oavsett om de uppvisat en axon eller inte. Axonal längd bestäms med hjälp av plugin NeuronJ av bildprogramvaran ImageJ (NIH-USA).
- Beräkna medelvärdet, standardavvikelsen och den statistiska signifikansen med hjälp av lämplig programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll presenterar vi en in vitro-modell för att analysera OEG neuroregenerativ kapacitet efter neuronal skada. Som visas i figur 1är OEG-källan en reversibel odödlig mänsklig OEG kloncellslinje -Ts14 och Ts12-, som härrör från primära kulturer, beredda från luktlampor som erhållits iobduktioner 15,17,18. Retinal vävnad extraheras från vuxna råttor, smält och retinal ganglion nervceller (RGN) suspension pläteras på antingen PLL-behandlade coverlips eller på ihOEG monolayers, Ts14 eller Ts12. Kulturer upprätthålls i 96 h innan de fixas. Axonal och somatodendritic markörer analyseras av immunofluorescence och axonal regenerering kvantifieras.
Ts14 OEG-identiteten bedöms genom immunostaining med markörer som beskrivs uttryckas i ensheathing glia(figur 2),såsom S100 β (figur 2A) och vimentin (figur 2B). GFAP-uttryck analyserades också för att kassera astrocytförorening(figur 2C). Som visat uttryckte Ts14 S100 β och vimentin men inte GFAP.
I den axonal regenereringsanalysen jämförs Ts14 regenerativ kapacitet med Ts12 i RGN-OEG-kokulturer, med PLL-substrat som negativ kontroll (figur 3). Både andelen celler med axoner samt den genomsnittliga längden på de regenererade axonerna var betydligt högre i nervceller kokulerade på Ts14 monolayers, jämfört med nervceller pläterade på antingen Ts12-celler eller PLL (Figur 3D, E). Representativa bilder visar en brist på kapacitet hos RGN att regenerera sina axoner över PLL- eller TS12-celler(figur 3A,B),medan Ts14 stimulerar utväxten av axoner i RGN (3C).
Figur 1: Diagram över rots retinala ganglionneuroner med olfaktori som värmer gliaceller kokultur, som en modell av vuxna axonal regenerering. Odödliga mänskliga OEG (ihOEG) klonära cellinjer -Ts12 och Ts14- härledda från primära kulturer från luktlampor. Retinal ganglion nervceller från vuxna råttor pläterar på antingen PLL-behandlade coverlips (negativ kontroll) eller på Ts14 eller Ts12 monolayers. Kulturer upprätthålls i 96 h innan de är fasta och axonal och somatodendritic markörer analyseras av immunofluorescence. Procentandel av nervceller med axon och genomsnittlig axonal längd/nervceller kvantifieras för att analysera RGN axonal regenerering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Identiteten på ihOEG-cellinjen Ts14. Immunofluorescensbilder av Ts14 i kultur, märkta med anti-S100 β (panel A, grön) och vimentin (panel B, röd). GFAP uttryck (panel C, röd) analyserades också för att kassera astrocyt förorening. Atomkärnor är färgade med DAPI (blå). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Analys för axonal regenerering i kokulturer av OEG-linjer med vuxna retinala ganglionneuroner (RGNs). (A–C) Immunofluorescens bilder som visar somatodendritic märkning med 514 antikroppar, som känner igen microtubule-associerade protein MAP2A och B, i rött, och med axon-specifika SMI31 antikroppar i grönt, mot MAP1B och NF-H proteiner. Gröna pilar indikerar RGN-axoner (SMI31-positiva: gröna) och gula pilar indikerar neuronala kroppar och dendriter (514 positiva: röda och gula). (D,E) Diagram visar medelvärde och standardavvikelse av andelen neuroner som uppvisar axoner och axonal regenerering index, en parameter som återspeglar den genomsnittliga axonal längd (μm) axoner per neuron. Minst 30 bilder (40x) togs på slumpmässiga fält och kvantifierades för varje cellprov. Experiment utfördes i tre exemplar, från tre olika råttor (N = 3), näthinnevävnad poolad från båda ögonen, med dubbletter för varje experimentellt tillstånd (varje gliapopulation testad). Asterisker anger den statistiska signifikansen: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, NS: icke-signifikans (ANOVA och post hoc Tukey testjämförelser mellan parametrar kvantifierade för Ts14 vs Ts12, Ts14 vs PLL och Ts12 vs PLL). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OEG transplantation vid CNS skada platser anses vara en lovande terapi för CNS skada på grund av dess konstituerande pro-neuroregenerativa egenskaper7,8,9. Beroende på vävnadskällan — luktslemhinnan (OM-OEG) jämfört med luktlampan (OB-OEG) - eller donatorns ålder finns det dock betydande variationer i sådankapacitet 26,31,33,36. Därför är det viktigt att ha en enkel och reproducerbar in vitro-modell för att analysera neuroregenerativ kapacitet hos ett givet OEG-prov innan in vivo-studier påbörjas. I detta protokoll kokuleras vuxna råttors axotomiserade RGN på ett monolager av OEG för att analysera. Efterföljande analys av RGN axonal och somatodendritic markörer av immunofluorescence utförs för att bedöma RGN axonal regenerering.
En initial svårighet med analysen är källan till OEG. I detta arbete använder vi reversibla odödliga mänskliga OEG (ihOEG) klonina linjer, tidigare etablerade och kännetecknade av vår grupp15,16,17,18, som ger ett obegränsat utbud av homogen OEG. Två av dessa ihOEG-cellinjer är Ts14, som upprätthåller den regenerativa kapaciteten hos de ursprungliga kulturerna och Ts12, en låg regenerativ linje som används som en låg regenereringskontroll i dessa experiment18 Ändå, även om tekniska begränsningar finns för att expandera mänskliga primära OEG-celler, kan de också erhållas från nasala endoskopiska tarmbiopsier - OM - eller, i fallet med OB-OEG, från kadaverdonatorer.
Förberedelse av monolayer OEG kulturer är ett avgörande förfarande, eftersom alltför många celler kan orsaka kokulturen att lossna från plattan. Innan OEG förbereder sig för analysen rekommenderas därför att användaren bestämmer det optimala antalet celler som ska pläteras, beroende på deras storlek och delningshastighet.
En annan kritisk fråga är näthinnan vävnad dissociation, efter näthinnan dissekering. Det är nödvändigt att bryta upp vävnadsfragmenten, efter inkubation i dissociationsblandningen. Om det görs för kraftigt kommer cellerna att förstöras, men vävnadsfragment kommer att lämnas intakta om de görs för svagt. För att få en homogen cellupphängning föreslår vi att du fyller och tömmer en Pasteur-pipett 10-15 gånger, med en spets av mellandiameter, samtidigt som vi undviker bubblande. Pastörpipetter med breda spetsar kan smalnas av med en Bunsen-brännare.
För att bedöma kapaciteten hos olika gliapopulationer att främja vuxna neuroners axonal regenerering har vi fastställt att 96 h är det tidsintervall som bäst passar målet eftersom: 1) det är den längsta tiden att upprätthålla kulturen levande utan att störa OEG-monoskiktet; och 2) Det är den tid som behövs för neuroner att växa axoner tillräckligt länge för att avslöja skillnader mellan regenerativ kapacitet hos olika OEG-populationer eller andra icke-regenerativa celler (dvs. fibroblaster12,13,14,15,16,17,18,32,33). Det skulle verkligen vara intressant att bestämma regenereringsprocessens tidsföringsprocess, eftersom den skulle kunna ge information om de differentiella regenerativa egenskaperna hos olika gliapopulationer, vid kortare tider av samkulturen. I våra händer, för regenerativ glia, är tidskursen mellan 72-96 h ganska lika för alla cellinjer, även om axoner är kortare vid 72 h (opublicerade data). Dessutom tillåter 96 h samkultur att studera OEG-beroende mekanismer för vuxen axonal regenerering12,14.
Under axonal regenerering kvantifiering är det viktigt att ta minst 30 bilder vid 400 augments (40x mål), vid olika slumpmässiga områden av täckglaset, men efter de kompletta axonerna av de fotograferade nervcellerna. Därför måste experimenteraren ta seriella bilder i de valda områdena för att mäta de verkliga axonallängderna.
Andra in vitro-metoder har också utvecklats för att utvärdera OEG regenerativa funktioner. I dessa modeller appliceras OEG på kulturer av olika neuronalt ursprung och som svar på gliakokultur analyseras neuritbildning och förlängning19,20,21,22,23,24,25,26,27. Regenereringsanalysen förlitar sig dock på embryonala eller postnatala nervceller, som har en inneboende plasticitet frånvarande från skadade vuxna nervceller. Denna modell bestående av vuxna axonal regenerering i kokulturer av OEG linjer med vuxna retinal ganglion nervceller (RGNs) övervinner denna nackdel. Dessutom dissekerar vi vuxna näthinner, och eftersom vi skär optiknerv och axoner som dras tillbaka i dissekeringsprocessen får vi neuronala kroppar rena från myelin, för att utföra kokulturen. Detta är skillnaden med andra delar av den vuxna CNS, där myelin kan hindra mycket med dissekeringen för att få rena nervceller för kokulturen.
Baserat på den som ursprungligen utvecklades av Wigley et al.28,29,30,31, belyser vi följande förbättringar i protokollet. För det första, användningen av neurobasalt medium kompletterat med B27 som OEG-RGN kokultur medium, vilket möjliggör tillväxt av neuronala celler och positivt påverkar reproducerbarheten av experimentet. För det andra karakteriserar och kvantifierar vi axonal regenerering med hjälp av en specifik markör för axonalfacket; och för det tredje använder vi ytterligare en direkt parameter, den genomsnittliga axonal längd/neuron, som bedömer den axonal tillväxt regenerativa potentialen hos OEG.
Sammanfattningsvis anser vi att detta är en enkel, reproducerbar, tidsbesparande och medelkostnadsanalys, inte bara användbar för att bedöma den neuroregenerativa potentialen hos ihOEG, men också för att den kan utvidgas till olika källor till OEG eller andra gliaceller. Dessutom kan det användas som ett värdefullt bevis på begreppet neuroregenerativ potential hos ett OEG- eller gliaprov, före översättning till in vivo eller kliniska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes ekonomiskt av projektet SAF2017-82736-C2-1-R från Ministerio de Ciencia e Innovación till MTM-F och av Fundación Universidad Francisco de Vitoria till JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
References
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
- Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
- Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
- Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
- Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
- Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
- Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
- Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
- Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
- Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
- Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
- Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
- Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
- García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
- García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
- Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
- Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
- Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
- Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
- Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
- Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
- Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
- Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
- Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
- Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
- Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
- Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
- Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
- García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
- Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).
