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Neuroscience

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

Published: November 2, 2020 doi: 10.3791/61863
Automatic Translation
1,3, 1, 2, 1, 3
1Facultad de CC Experimentales, Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology, University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid

Summary

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neurorregenerativa de glia ensheathing glia (OEG), após lesão neural. Baseia-se em uma cocultura de neurônios gânglios de retina adulto axotomizados (RGN) em monocamadas OEG e estudo subsequente de regeneração axonal, analisando marcadores axonal e somatodendritic RGN.

Abstract

As células de glia ensheathing olfativas (OEG) são localizadas desde a mucosa olfativa até e para a camada nervosa olfativa (ONL) da lâmpada olfativa. Ao longo da vida adulta, eles são fundamentais para o crescimento axonal de neurônios olfativos recém-gerados, da lamina propria ao ONL. Devido às suas propriedades pró-regenerativas, essas células têm sido usadas para promover a regeneração axonal em modelos de lesão medular ou nervo óptico.

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar e medir a capacidade neurorregenerativa do OEG após lesão neural. Neste modelo, o OEG humano reversivelmente imortalizado (ihOEG) é cultivado como uma monocamada, as retinas são extraídas de ratos adultos e neurônios de gânglios retinais (RGN) são coculturados na monocamada OEG. Após 96 h, marcadores axonais e somatodendritic em RGNs são analisados por imunofluorescência e o número de RGNs com axônio e o comprimento/neurônio axonal médio são quantificados.

Este protocolo tem a vantagem sobre outros ensaios in vitro que dependem de neurônios embrionários ou pós-natais, que avaliam propriedades neuroregenerativas OEG no tecido adulto. Além disso, não é apenas útil para avaliar o potencial neuroregenera do ihOEG, mas pode ser estendido para diferentes fontes de OEG ou outras células gliais.

Introduction

Os neurônios do sistema nervoso central adulto (SNC) têm capacidade regenerativa limitada após lesão ou doença. Uma estratégia comum para promover a regeneração do SNC é o transplante, no local da lesão, de tipos celulares que induzem o crescimento axonal, como células-tronco, células schwann, astrócitos ou células ensheathing glia (OEG)1,2,3,4,5.

OEG deriva da crista neural6 e se localiza na mucosa olfativa e na lâmpada olfativa. No adulto, neurônios sensoriais olfativos morrem regularmente como resultado da exposição ambiental e são substituídos por neurônios recém-diferenciados. O OEG circunda e guia esses novos axônios olfativos para entrar na lâmpada olfativa e estabelecer novas sinapses com seus alvos no CNS7. Devido a esses atributos fisiológicos, o OEG tem sido utilizado em modelos de lesão de SNC, como lesão medular ou nervo óptico e suas propriedades neurorregenerativas e neuroprotetoras se tornamcomprovadas 8,9,10,11. Vários fatores foram identificados como responsáveis pelas características pró-regenerativas dessas células, incluindo a produção ou secreção de proteases de matriz extracelular ou secreção dos fatores de crescimento neurotrófico e axonal12,13,14.

Dadas as limitações técnicas para expandir as células primárias de OEG, estabelecemos e caracterizamos linhas clonais de OEG humano igênitas reversíveis (ihOEG), que fornecem um fornecimento ilimitado de OEG homogêneo. Estas células ihOEG derivam de culturas primárias, preparadas a partir de lâmpadas olfativas obtidas em autópsias. Eles foram imortalizados pela transdução da subunidade catalítica telomerase (TERT) e do oncogene Bmi-1 e modificados com o vírus SV40 grande antígeno T15,16,17,18. Duas dessas linhas celulares ihOEG são Ts14, que mantém a capacidade regenerativa das culturas originais e Ts12, uma linha regenerativa baixa que é usada como baixo controle de regeneração nesses experimentos18.

Para avaliar a capacidade de OEG para promover a regeneração axonal após lesão neural, vários modelos in vitro foram implementados. Nesses modelos, o OEG é aplicado a culturas de diferentes origens neuronais e formação de neurita e alongamento — em resposta à cocultura gliana — são avaliados. Exemplos dessas fontes neuronais são neurônios corticais neonatais de ratos19, feridas de arranhão realizadas em neurônios embrionários de ratos de tecido cortical20, explanações de retina de rato21,neurônios hipotalâmicos ou hipocampais22,23, neurônios gânglios de raiz dorsal de rato pós-natal24, neurônios do trato corticospinal do camundongo pós-natal25, neurônios NT2 humanos26, ou neurônios corticais cerebrais pós-natal em culturas de cicatriz de astrócito reativas27.

Nesses modelos, no entanto, o ensaio de regeneração conta com neurônios embrionários ou pós-natais, que têm uma plasticidade intrínseca que está ausente em neurônios adultos feridos. Para superar essa desvantagem, apresentamos um modelo de regeneração axonal adulta em coculturas de linhas de OEG com neurônios gânglios de retina adulta (RGNs), baseado no originalmente desenvolvido por Wigley et al.28,29,30,31 e modificados e usados pelo nosso grupo12,13,14,15,16,17,18,32,33. Resumidamente, o tecido retiniano é extraído de ratos adultos e digerido com papain. A suspensão das células de retina é então banhada em deslizamentos tratados com polilise ou em monocamadas Ts14 e Ts12. As culturas são mantidas por 96 h antes de serem fixadas e, em seguida, a imunofluorescência para proteínas axona (MAP1B e NF-H)34 e somatodendritic (MAP2A e B)35 marcadores são realizados. A regeneração axonal é quantificada como uma porcentagem de neurônios com axônio, em relação à população total de RGNs e o índice de regeneração axonal é calculado como o comprimento axonal médio por neurônio. Este protocolo não é apenas útil para avaliar o potencial neuroregenerativo do IhOEG, mas pode ser estendido a diferentes fontes de OEG ou outras células gliais.

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Protocol

NOTA: A experimentação animal foi aprovada pelos comitês nacionais e institucionais de bioética.

1. ihOEG (Ts12 e Ts14) cultura

NOTA: Este procedimento é feito em condições estéreis em um armário de biossegurança da cultura tecidual.

  1. Prepare o meio de cultura OEG ME10 de 50 mL conforme previsto na Tabela 1.
  2. Prepare 5 mL de DMEM/F12-FBS, conforme fornecido na Tabela 1, em tubo cônico de 15 mL.
  3. Aqueça ambas as mídias a 37 °C em um banho de água limpa, por 15 minutos.
  4. Descongele os frascos de células Ts12 e Ts14 a 37 °C em um banho de água limpa.
  5. Resuspend e adicione células ao meio de cultura DMEM/F12-FBS preparado na etapa 2.
  6. Centrífuga por 5 min a 200 x g.
  7. Aspire o supernatante.
  8. Adicione 500 μL de me10 médio e resuspense a pelota.
  9. Prepare um prato de cultura celular p60 com 3 mL de ME10 e adicione a suspensão celular, dropwise.
  10. Mova-se para distribuir as células uniformemente através da placa.
  11. Células de cultura a 37 °C em 5% DE CO2.
    NOTA: Depois de atingir a confluência, pelo menos outra passagem deve ser feita para otimizar as células para a cocultura. 90% de confluência é necessária antes de semeá-las nas tampas para cocultura. Um p-60 confluente tem um número celular médio de 7 x 105 para Ts14 e 2,5 x 106 para linhas celulares Ts12. As linhas de celular Ts12 e Ts14 devem ser passagem a cada 2-3 dias.

2. Preparação do ihOEG (Ts12 e Ts14) para o ensaio

NOTA: Esta etapa deve ser feita 24 horas antes da dissecção e cocultura da RGN.

  1. Trate as tampas de 12 mm Ø com 10 μg/mL de poli-l-lisina (PLL) por 1 h.
    NOTA: Os deslizamentos podem ser deixados durante a noite na solução PLL.
  2. Lave as tampas com 1x de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS), três vezes.
  3. Despete células Ts12 e Ts14 ihOEG do prato de cultura celular p60.
    1. Adicione 4 mL de meio de cultura DMEM/F12-FBS(Tabela 1) a um tubo cônico de 15 mL. Aqueça a 37 °C em um banho de água limpa.
    2. Remova o meio das placas e lave as células com 1 mL de 1x PBS-EDTA, uma vez.
    3. Adicione 1 mL de trypsin-EDTA às células OEG e incubar por 3-5 min a 37 °C, 5% CO2.
    4. Colete células com uma pipeta p1000 e transfira-as para o meio preparado na etapa 3.1.
    5. Centrífuga por 5 min a 200 x g.
    6. Aspire o supernatante.
    7. Adicione 1 mL de média ME10 e resuspense a pelota.
    8. Conte o número da célula em um hemócito.
  4. Semente 80.000 células Ts14 ou 100.000 células Ts12/bem nas tampas em placas de 24 poços em 500 μL de me10 médio.
  5. Células de cultura a 37 °C em 5% de CO2, por 24 h.

3. Dissecção do tecido retiniano

NOTA: Ratos Wistar machos de 2 meses de idade são usados como fonte RGN. Duas retinas (um rato) para 20 poços de um prato de célula de 24 poços. Material cirúrgico autoclave antes do uso. O kit de dissociação papain é comprado comercialmente(Tabela de Materiais). Siga as instruções do provedor para a reconstituição. Reconstituir D,L-2-amino-5-ácido fosfosfosfonovalerico (APV) em estoque de 5 mM e preparar as alíquotas.

  1. No dia do ensaio, prepare a seguinte mídia.
    1. Prepare um prato de cultura celular p60 com 5 mL de EBSS frio (frasco 1 do kit de dissociação papain).
    2. Prepare um prato de cultura celular p60 com frasco reconstituído 2 (papain) do kit de dissociação papain mais 50 μL de APV.  Em seguida, adicione 250 μL de frasco desprointitulado 3 (DNase mais 5 μL de APV).
    3. Em uma mistura de tubo estéril de 2,7 mL de frasco 1 com 300 μL de frasco 4 (inibidor de protease albumina-ovomucoid). Adicione 150 μL de frasco 3 (DNase) mais 30 μL de APV.
    4. Prepare 20 mL de neurobasal-B27 médio (NB-B27) conforme previsto na Tabela 1.
  2. Sacrifique um rato por asfixia com CO2.
  3. Remova a cabeça por decapitação com guilhotina; colocá-lo em uma placa de Petri de 100 mm e pulverizar a cabeça com etanol 70% antes de colocá-lo em um capô de fluxo laminar.
  4. Corte os bigodes do rato com uma tesoura para que não interfiram com a manipulação dos olhos.
  5. Segure o nervo óptico com fórceps para puxar o globo ocular o suficiente para ser capaz de fazer uma incisão através do olho com um bisturi.
  6. Remova a lente e o humor vítreo e puxe a retina (tecido laranja), enquanto as camadas restantes do olho ficam dentro (incluindo a camada epitelial do pigmento).
  7. Coloque a retina no prato de cultura celular p60 preparado na etapa 3.1.1.
  8. Transfira a retina para o prato de cultura celular p60 preparado na etapa 3.1.2 e corte-a com o bisturi em pequenos pedaços de tamanho aproximado < 1 mm.
  9. Transfira para um tubo de plástico de 15 mL.
  10. Incubar o tecido por 30 minutos, em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2,com agitação a cada 10 minutos.
  11. Dissociar aglomerados de células por pipetting para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur de vidro.
  12. Centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min.
  13. Descarte o supernaente e inativar o papain, resuspenque a pelota celular na solução preparada na etapa 3.1.3. (1,5 mL para 2 olhos).
  14. Encolé-lo cuidadosamente em 5 mL de frasco reconstituído 4.
  15. Centrifugar a 200 x g por 5 min.
  16. Enquanto centrifuga, remova completamente o meio ME-10 da placa de célula de poço OEG 24 (previamente preparado na etapa 2) e substitua-o por 500 μL de meio NB-B27 por poço.
  17. Descarte o supernasce e resuspenque as células em 2 mL de meio NB-B27.
  18. Placa 100 μL de suspensão celular de retina, por poço da placa m24, em deslizamentos de monocamadas tratados com PLL ou OEG.
  19. Mantenha as culturas a 37 °C com 5% de CO2 para 96 h no meio NB-B27.

4. Imunostaining

  1. Após 96 h, fixar as células por 10 min adicionando o mesmo volume de 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS ao meio de cultura (600 μL) (concentração final pfa 2%).
  2. Remova a mídia e o PFA da placa de 24-multiwell e adicione mais uma vez 500 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS. Incubar por 10 minutos.
  3. Descarte o fixador e lave 3 vezes com 1x PBS por 5 minutos.
  4. Bloco com 0,1% Triton X-100/1% FBS em PBS (PBS-TS) por 30-40 min.
  5. Prepare os anticorpos primários no tampão PBS-TS da seguinte forma: Anticorpo monoclonal SMI31 (contra proteínas MAP1B e NF-H) (1:500). 514 (reconhece proteínas MAP2A e B) antiserum policlonal de coelho (1:400).
  6. Adicione anticorpos primários às coculturas e incubar durante a noite a 4 °C.
  7. No dia seguinte, descarte os anticorpos e lave as tampas com 1x PBS, 3 vezes, por 5 minutos.
  8. Prepare os anticorpos secundários no buffer PBS-TS da seguinte forma: Para SMI-31, anti-mouse Alexa Fluor 488 (1:500). Para 514, anti-coelho Alexa-594 (1:500).
  9. Incubar células com os anticorpos secundários fluorescentes correspondentes por 1h, em RT, no escuro.
  10. Lave as tampas com 1x PBS, 3 vezes, por 5 min, no escuro.
  11. Por fim, monte as tampas com meio de montagem(Tabela de Materiais) e mantenha a 4 °C.
    NOTA: Sempre que necessário, pode ser realizada a coloração de núcleos fluorescentes com DAPI (4,6-diamidino-2-fenilôndole). Antes de montar, incubar as células por 10 minutos no escuro com DAPI (10 μg/mL em 1x PBS). Lave as tampas 3 vezes com 1x PBS e, finalmente, monte as tampas com o meio de montagem.

5. Quantificação da regeneração axonal

NOTA: As amostras são quantificadas sob o objetivo de 40x de um microscópio de epifluorescência. Um mínimo de 30 fotos devem ser tiradas em campos aleatórios, com pelo menos 200 neurônios, a serem quantificadas para cada tratamento. Cada experimento deve ser repetido um mínimo de três vezes.

  1. Quantifique a porcentagem de neurônios com axônio (neurite positivo SMI31) em relação à população total de RGNs (identificada com map2A/B 514 imunostaining positivo do corpo neuronal e dendritos).
  2. Quantifique o índice de regeneração axonal ou o comprimento axonal médio (μm/neurônio). Este parâmetro é definido como a soma dos comprimentos (em μm) de todos os axônios identificados, divididos pelo número total de neurônios contados, apresentando um axônio ou não. O comprimento axonal é determinado usando o neuronj plugin do software de imagem ImageJ (NIH-USA).
  3. Calcule a média, o desvio padrão e a significância estatística usando o software apropriado.

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Representative Results

Neste protocolo, apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neuroregenerativa de OEG após lesão neuronal. Como mostrado na Figura 1, a fonte OEG é uma linha de células clonal oeg humana imortalizada reversível -Ts14 e Ts12-, que deriva de culturas primárias, preparadas a partir de lâmpadas olfativas obtidas nas autópsias15,17,18. O tecido retiniano é extraído de ratos adultos, digeridos e os neurônios gânglios da retina (RGN) são banhados em deslizamentos tratados com PLL ou em monocamadas ihOEG, Ts14 ou Ts12. As culturas são mantidas por 96 h antes de serem fixadas. Marcadores axonais e somatodendriticos são analisados por imunofluorescência e a regeneração axonal é quantificada.

A identidade OEG Ts14 é avaliada por imunosmunhagem com marcadores descritos em ensheathing glia(Figura 2),como S100 β (Figura 2A) e vimentina(Figura 2B); A expressão GFAP também foi analisada para descartar contaminação por astrócitos (Figura 2C). Como mostrado, Ts14 expressou S100 β e vimentin, mas não GFAP.

No ensaio de regeneração axonal, a capacidade regenerativa de Ts14 é comparada com ts12 nas coculturas RGN-OEG, utilizando substrato PLL como controle negativo(Figura 3). Tanto a porcentagem de células com axônios quanto o comprimento médio dos axônios regenerados foram significativamente maiores em neurônios coculturados em monocamadas Ts14, em comparação com neurônios banhados em células Ts12 ou PLL(Figura 3D,E). Imagens representativas mostram falta de capacidade do RGN para regenerar seus axônios sobre células PLL ou Ts12(Figura 3A,B),enquanto Ts14 estimula o crescimento de axônios em RGN (3C).

Figure 1
Figura 1: Diagrama de neurônios gânglios de retina de rato com cocultura de células glia ensheathing olfativas, como modelo de regeneração axonal adulta. Linhas de células clonais oEG (ihOEG) deSarmados humanos imortalizados -Ts12 e Ts14 - derivadas de culturas primárias de lâmpadas olfativas. Os neurônios de gânglios de retina de ratos adultos são banhados em deslizamentos tratados com PLL (controle negativo) ou em monocamadas Ts14 ou Ts12. As culturas são mantidas por 96 h antes de serem fixadas e marcadores axonais e somatodendriticos são analisados por imunofluorescência. A porcentagem de neurônios com axônio e comprimento/neurônio axonal médio são quantificados para avaliar a regeneração axonal RGN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Identidade da linha de células IhOEG Ts14. Imagens de imunofluorescência de Ts14 na cultura, rotuladas com anti-S100 β (painel A, verde) e vimentina (painel B, vermelho). A expressão GFAP (painel C, vermelho) também foi analisada para descartar contaminação por astrócitos. Os núcleos estão manchados com DAPI (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Ensaio para a regeneração axonal em coculturas de linhas de OEG com neurônios gânglios de retina adulta (RGNs). (A-C) Imagens de imunofluorescência mostrando rotulagem somatodendritica com 514 anticorpos, que reconhece proteínas associadas a microtúbulos MAP2A e B, em vermelho, e com anticorpo SMI31 específico do axônio em verde, contra proteínas MAP1B e NF-H. As setas verdes indicam axônios RGN (SMI31 positivo: verde) e setas amarelas indicam corpos neuronais e dendritos (514 positivos: vermelho e amarelo). (D,E) Os gráficos mostram desvio médio e padrão da porcentagem de neurônios que exibem axônios e o índice de regeneração axonal, um parâmetro que reflete o comprimento axonal médio (μm) de axônios por neurônio. Um mínimo de 30 fotos (40x) foram tiradas em campos aleatórios e quantificadas para cada amostra celular. Os experimentos foram realizados em triplicado, de três ratos diferentes (N = 3), tecido retiniano agrupado de ambos os olhos, com duplicatas para cada condição experimental (cada população de glia testada). Asteriscos indicam a significância estatística: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, NS: non signific significância (comparações de teste ANOVA e pós-hoc Tukey entre parâmetros quantificados para Ts14 vs Ts12, Ts14 vs PLL e Ts12 vs PLL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O transplante de OEG em locais de lesão do CNS é considerado uma terapia promissora para lesão do CNS devido às suas propriedades pró-neuroregenerativas constitutivas7,8,9. No entanto, dependendo da fonte de tecido — mucosa olfativa (OM-OEG) versus lâmpada olfativa (OB-OEG)— ou a idade do doador, existe uma variação considerável nessa capacidade26,31,33,36. Por isso, é importante ter um modelo in vitro fácil e reprodutível para avaliar a capacidade neuroregenerativa de uma determinada amostra de OEG, antes de iniciar estudos in vivo. Neste protocolo, o RGN axotomizado de ratos adultos são coculturados em uma monocamada do OEG para avaliar. A análise subsequente dos marcadores axonal e somatodendritic RGN por imunofluorescência é realizada para avaliar a regeneração axonal RGN.

Uma dificuldade inicial do ensaio é a fonte do OEG. Neste trabalho, utilizamos linhas clonais de OEG humano imortalizados reversíveis (ihOEG), previamente estabelecidas e caracterizadas pelo nosso grupo15,16,17,18, que fornecem um fornecimento ilimitado de OEG homogêneo. Duas dessas linhas celulares ihOEG são Ts14, que mantém a capacidade regenerativa das culturas originais e Ts12, uma linha regenerativa baixa que é usada como baixo controle de regeneração nesses experimentos18 No entanto, embora existam limitações técnicas para expandir células OEG primárias humanas, elas também podem ser obtidas a partir de biópsias endoscópicas nasais — OM — ou, no caso de OB-OEG, de doadores de cadáveres.

A preparação de culturas de OEG de monocamadas é um procedimento crucial, pois muitas células poderiam fazer com que a cocultura se desprendesse da placa. Portanto, antes da preparação do OEG para o ensaio, recomenda-se que o usuário determine o número ideal de células a serem emplacados, dependendo do seu tamanho e taxa de divisão.

Outra questão crítica é a dissociação do tecido retiniano, após dissecção da retina. É necessário quebrar os fragmentos teciduais, após a incubação na mistura de dissociação. Se feito com muita vigor, as células serão destruídas, mas fragmentos de tecido serão deixados intactos se forem feitos com muita fraqueza. Para obter uma suspensão celular homogênea, sugerimos o enchimento e esvaziamento de uma pipeta Pasteur 10-15 vezes, com uma ponta de diâmetro intermediário, evitando borbulhar. Pipetas pasteur com pontas largas podem ser estreitadas usando um queimador Bunsen.

Para avaliar a capacidade de diferentes populações gliais para promover a regeneração axonal dos neurônios adultos, determinamos que 96 h é o intervalo de tempo que melhor se adequa ao objetivo porque: 1) é o maior tempo para manter a cultura viva sem perturbar a monocamada OEG; e 2) é o tempo necessário para que os neurônios cresçam axônios tempo suficiente para revelar diferenças entre as capacidades regenerativas de diferentes populações de OEG ou outras células não regenerativas (ou seja, fibroblastos12,13,14,15,16,17,18,32,33). Seria certamente interessante determinar o curso temporal do processo de regeneração, pois poderia fornecer informações sobre as propriedades regenerativas diferenciais de diferentes populações gliais, em tempos mais curtos da co-cultura. Em nossas mãos, para glia regenerativa, o curso de tempo entre 72-96 h é bastante semelhante para todas as linhas celulares, embora os axônios sejam mais curtos em 72 h (dados inéditos). Além disso, 96 h de cocultura, permite estudar mecanismos dependentes de OEG de regeneração axonal adulta12,14.

Durante a quantificação da regeneração axonal, é importante tirar um mínimo de 30 fotos a 400 aumentos (objetivo de 40x), em diferentes áreas aleatórias do deslizamento de cobertura, mas seguindo os axônios completos dos neurônios fotografados. Portanto, o experimentador deve tirar fotos em série nas áreas escolhidas para medir os comprimentos axonais reais.

Outras abordagens in vitro também foram desenvolvidas para avaliar funções regenerativas de OEG. Nesses modelos, o OEG é aplicado a culturas de diferentes origens neuronais e, em resposta à cocultura gliana, a formação de neurita e o alongamento são avaliados19,20,21,22,23,24,25,26,27. No entanto, o ensaio de regeneração depende de neurônios embrionários ou pós-natais, que têm uma plasticidade intrínseca ausente dos neurônios adultos feridos. Este modelo consistindo de regeneração axonal adulta em coculturas de linhas de OEG com neurônios gânglios de retina adultas (RGNs) supera essa desvantagem. Além disso, estamos dissecando retinas adultas, e como cortamos o nervo óptico e os axônios se retraem no processo de dissecção, obtemos corpos neuronais limpos da mielina, para realizar a cocultura. Esta é a diferença com outras partes do CNS adulto, onde a mielina pode dificultar muito com a dissecção para obter neurônios limpos para a cocultura.

Com base na originalmente desenvolvida por Wigley et al.28,29,30,31, destacamos as seguintes melhorias no protocolo. Primeiro, o uso do meio neurobásal suplementado com B27 como meio de cocultura OEG-RGN, que permite o crescimento de células neuronais e afeta positivamente a reprodutibilidade do experimento. Em segundo lugar, caracterizamos e quantificamos a regeneração axonal utilizando um marcador específico do compartimento axonal; e terceiro, utilizamos um parâmetro direto adicional, o comprimento/neurônio axonal médio, que avalia o potencial regenerativo de crescimento axonal do OEG.

Em resumo, consideramos que este é um ensaio simples, reprodutível, de economia de tempo e de custo médio, não apenas útil para avaliar o potencial neuroregenerativo do IhOEG, mas também porque pode ser estendido a diferentes fontes de OEG ou outras células gliais. Além disso, poderia ser usado como uma valiosa prova de conceito do potencial neuroregenerativo de uma amostra OEG ou glial, antes da tradução para estudos in vivo ou clínicos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projeto SAF2017-82736-C2-1-R do Ministerio de Ciencia e Innovación para o MTM-F e pela Fundación Universidad Francisco de Vitória ao JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurociência Edição 165 glia ensheathing olfativo (OEG) regeneração axonal adulta ensaio in vitro neurônios de gânglios retinais (RGN) cocultura axotomia
Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta
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Portela-Lomba, M., Simón, D.,… More

Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).

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