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Biology

नासोनिया विट्रिपेनिस में आरएनएआई और CRISPR जीन संपादन के लिए पुपल और वयस्क इंजेक्शन

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61892
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2Department of Entomology, The Center for Infectious Disease Dynamics, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुलभ विकल्प के रूप में नासोनिया vitripennis में कुशल प्यूपल और वयस्क इंजेक्शन के लिए तरीकों का वर्णन करते हैं, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) या CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन के माध्यम से जीन नॉकआउट के माध्यम से या तो आरएनए-मुंह से बाहर का उपयोग कर ब्याज के जीन के कार्यात्मक विश्लेषण को सक्षम करते हैं ।

Abstract

गहना ततैया, नासोनिया विट्रीपेनिस,हैप्लो-डिप्लोइड सेक्स निर्धारण, बी-गुणसूत्र जीव विज्ञान, मेजबान-सहजीवी इंटरैक्शन, स्पेसाइजेशन और विष संश्लेषण के एपिजेनेटिक्स का अध्ययन करने के लिए एक कुशल मॉडल प्रणाली बन गया है। CRISPR/Cas9 सहित कई आणविक उपकरणों की उपलब्धता के बावजूद, कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययन अभी भी इस जीव में सीमित हैं । एन vitripennis में CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी लागू करने की प्रमुख सीमा भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन की चुनौतियों से उपजी है । भ्रूण के इंजेक्शन इस जीव में विशेष रूप से मुश्किल हैं और सामान्य रूप से कई परजीवी घास में, छोटे भ्रूण के आकार और भ्रूण विकास के लिए एक मेजबान पिल्ला की आवश्यकता के कारण। इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, भ्रूणीय माइक्रोइंजेक्शन के बजाय वयस्क इंजेक्शन द्वारा महिला अंडाशय में Cas9 रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन जटिल वितरण को अनुकूलित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप दैहिक और वंशानुगत जर्नलिन दोनों संपादन हुए । इंजेक्शन प्रक्रियाओं को रिमोट नियंत्रण (रिसेप्टर-मध्यस्थता अंडाशय के कार्गो) या बीएपीसी (ब्रांच्ड एम्फीफिलिक पेप्टाइड कैप्सूल) का उपयोग करके प्यूप और मादा घास में अनुकूलित किया गया था। इन तरीकों को भ्रूण इंजेक्शन के लिए प्रभावी विकल्प दिखाया गया है, साइट विशिष्ट और वंशानुबल जर्मलाइन म्यूटेशन को सक्षम करने के लिए ।

Introduction

CRISPR/Cas9 जीन संपादन कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, विशेष रूप से गहना ततैया, नासोनिया vitripennisजैसे कई बढ़ते मॉडल जीवों में । पालन की आसानी और एक पूर्ण जीनोम की उपलब्धता गहना ततैया विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक प्रणाली बनाता है। उदाहरण के लिए, एन विट्रीपेनिस का उपयोग हाल ही में हैपिडिप्लॉयड लिंग निर्धारण प्रणाली 1 ,2,बी-क्रोमोसोम 3 ,4,5,6 के जीव विज्ञान और सर्कैडियन और मौसमी विनियमन7,8के आनुवंशिक आधार के एपिजेनेटिक आधार को जानने के लिए किया गया है। एन विट्रिपेनिस को काम करने के लिए उत्तरदायी बनाने वाली कुछ विशेषताओं में कम पीढ़ी का समय (~ 2 सप्ताह 25 डिग्री सेल्सियस), उच्च प्रजनन दर, प्यूपल चरण में आसान सेक्स अलगाव, और 4 डिग्री सेल्सियस पर उपभेदों को डायपोज़ और स्टोर करने की क्षमता शामिल है। जीवन चक्र मादा घास के साथ शुरू होता है जो ब्लोफ्लाई, सरकोफागा बुलटाके पिल्ले को परजीवी करता है। अपने ओविपोसिटर के माध्यम से, मादाएं ब्लोफ्लाई के प्यूपल मामले में 50 अंडे तक डालती हैं। अंडे लार्वा में विकसित होते हैं जो एस बुलटा पिल्ला पर फ़ीड करते हैं, अगले कई दिनों में विकसित होते रहते हैं, और फिर प्यूपेट करते हैं, इसके बाद वयस्क एक्लेशन और मेजबान प्यूपरियम 9 से उद्भवहोताहै।

एन विट्रीपेनिसमें कार्यात्मक आनुवंशिक अध्ययन करने के लिए आणविक उपकरण, जैसे आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई)10 और CRISPR/Cas911,12,उपलब्ध हैं, लेकिन मुख्य रूप से भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन13प्रदर्शन में कठिनाइयों के कारण सीमित हैं । चूंकि एन विट्रिपेनिस अंडे को विकास के लिए एक प्यूपल होस्ट की आवश्यकता होती है, अंडे में हेरफेर बहुत चुनौतीपूर्ण है। प्री-ब्लास्टोडर्म चरण भ्रूण मेजबान ब्लोफ्लाई प्यूप से एकत्र किए जाने चाहिए, जल्दी से माइक्रोइंजेक्टेड, और तुरंत विकास13के लिए मेजबान को वापस स्थानांतरित कर दिया जाना चाहिए। इन कदमों के लिए सटीक और विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है ताकि सूक्ष्मजेक्टेड भ्रूणों को नुकसान पहुंचाया जा सके या प्यूपल13की मेजबानी कर सके । इसके अलावा, अंडे बहुत छोटे और नाजुक होते हैं, विशेष रूप से माइक्रोइंजेक्शन के बाद, एक बहुत ही चिपचिपा साइटोप्लाज्म के साथ इंजेक्शन सुई13का निरंतर क्लोजिंग होता है। ये विशेषताएं भ्रूणीय माइक्रोइंजेक्शन को असाधारण रूप से चुनौतीपूर्ण बनाती हैं, जिन्हें अत्यधिक प्रशिक्षित ऑपरेटरों और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है जो अधिकांश एन विट्रिपेनिस प्रयोगशालाओं में अनुपस्थित हैं।

CRISPR अभिकर्मकों के वितरण के लिए वैकल्पिक इंजेक्शन विधियों का अनुकूलन एक मॉडल जीव के रूप में एन विट्रिपेनिस के समेकन में योगदान देगा। Pupae और वयस्कों के हेरफेर भ्रूण हेरफेर की तुलना में कम चुनौतीपूर्ण है और एक बुनियादी इंजेक्शन सेटअप के साथ पूरा किया जा सकता है । यहां, पिल्ले और वयस्कों के इंजेक्शन के लिए दो प्रोटोकॉल वर्णित हैं: एक इंजेक्शन के लिए विशेष उपकरण शामिल है, और दूसरा एक एस्पिरेटर ट्यूब असेंबली का उपयोग शामिल है जो ग्लास केशिका सुई के साथ लगे हैं। एस्पिरेटर ट्यूब का उपयोग विशेष रूप से प्रयोगशालाओं के लिए अनुकूल है जिनके पास भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए विशेष उपकरण तक पहुंच नहीं है। सफेद या काले पिल्ले और वयस्क घास सहित एन वित्रिपेनिसके विभिन्न विकासात्मक चरणों के कुशल इंजेक्शन का प्रदर्शन किया जाता है। सफेद प्यूपल चरण में वासप्स विशेष रूप से आरएनएआई-मध्यस्थता नॉकडाउन प्रयोगों के लिए अनुकूल हैं। हालांकि नासोनिया में आरएनएआई को पहली बार 200610में लिंच और डेसप्लान द्वारा वर्णित किया गया था, लेकिन आरएनएआई इंजेक्शन कैसे किए जाते हैं, इसके लिए कोई दृश्य प्रक्रिया उपलब्ध नहीं है। आरएनएआई का उपयोग हाल ही में बी-क्रोमोसोम पीएसआर (पैतृक लिंग अनुपात)3 के हैप्लॉयाइजर जीन की खोज करने और एन विट्रीपेनिस जैविक लय7में घड़ी जीन, अवधिकी भागीदारी का अध्ययन करने के लिए किया गया था।

ब्लैक प्यूप और वयस्क घास का उपयोग रिमोट कंट्रोल (रिसेप्टर-मध्यस्थता अंडाशय के कार्गो) और बीएपीसी (ब्रांच्ड एम्फीफिलिक पेप्टाइड कैप्सूल) प्रोटोकॉल का उपयोग करके CRISPR/Cas9 जर्मलाइन जीन संपादन को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। इन दो अंडाशय वितरण विधियों को हाल ही में नासोनिया में लक्षित जीन, सिनाबार7,12में जर्मलाइन उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए प्रभावी बताया गया है । यहां, इंजेक्शन के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है जिसमें प्यूपल और वयस्क इंजेक्शन दोनों के लिए कदम-दर-कदम पद्धति की एक दृश्य प्रक्रिया शामिल है जिसका उपयोग नासोनिया में कार्यात्मक आनुवंशिकी अध्ययन उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है और अन्य परजीवी घास में होने की संभावना, विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना और भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन को दरकिनार किए बिना।

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Protocol

1. नासोनिया पालन

  1. कपास के साथ खामियों को दूर करने वाले छोटे ग्लास टेस्ट ट्यूबों में अकेले ~ 20 संभोग महिलाओं की स्थापना करें।
    नोट: पालन अंतरिक्ष को कम करने के लिए, 10 x 85 सेमी, 4 एमएल ट्यूब इष्टतम हैं। बड़े पंखों और ओविपोसिटर(चित्रा 1 ए)की उपस्थिति के कारण मादाओं को आसानी से पुरुषों से अलग किया जाता है। एन विट्रीपेनिस के पालन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल अन्य साहित्य13 , 14,15में भी पाया जा सकता है ।
    1. प्रति ट्यूब दो एस बुलटा होस्ट जोड़ें, और 2-3 दिनों के लिए 12:12 हल्के-अंधेरे चक्र के साथ 1 डिग्री सेल्सियस और 30% सापेक्ष आर्द्रता पर 25 ± घास बनाए रखें।
      नोट: Wasps कम तापमान या कमरे के तापमान पर बनाए रखा जा सकता है; हालांकि, विकास धीमा हो जाएगा ।
  2. 2-3 दिनों के बाद, एक ठीक टिप पेंट ब्रश की मदद से, संतान विकास में निरंतर अंडाशय और असिंक्रोन से बचने के लिए धीरे-धीरे मादाओं को हटा दें।
    नोट: हटाई गई महिलाओं को वैकल्पिक रूप से एक महीने तक 5 डिग्री सेल्सियस पर फिर से होस्ट या संग्रहीत किया जा सकता है।
    1. 25 डिग्री सेल्सियस और 30% सापेक्ष आर्द्रता पर परजीवी मेजबान बनाए रखें, 7 दिनों के लिए 12:12 प्रकाश-अंधेरे चक्र के साथ यदि वांछित इंजेक्शन चरण को सफेद पिल्ले की आवश्यकता होती है; 13 दिनों के लिए यदि आवश्यक विकासात्मक चरण काला पिल्ला है; या युवा, नए उभरा वयस्कों के लिए 14 दिन ।
      नोट: पीले और काले पिल्ले को एक सप्ताह तक 5 डिग्री सेल्सियस पर भी संग्रहीत किया जा सकता है। अब भंडारण अगली पीढ़ी के लिए लार्वा में डायपोज की आवृत्ति में वृद्धि करेगा, जिससे इंजेक्शन स्क्रीनिंग और उत्परिवर्ती लाइनों की स्थापना अधिक कठिन हो जाएगी।
    2. क्रैक वांछित चरण(चित्रा 1 ए)में एन वित्रिपेनिस पिल्ले और वयस्कों को ठीक करने के लिए एक विच्छेदन सुई के साथ मेजबान प्यूपरियम खोलें।
      नोट: किसी विशेष वयस्क उम्र में इंजेक्शन के लिए या कुंवारी महिलाओं को इकट्ठा करने के लिए, मेजबान से 13 दिन पर अंधेरे पिल्ले को हटाने, सेक्स से अलग, और उद्भव के बाद वयस्कों को इकट्ठा करने की सिफारिश की जाती है।

2. सफेद और काले पिल्ले का संरेखण

  1. केंद्र में स्कूल गोंद की एक लाइन लगाकर एक ग्लास स्लाइड तैयार करें। एक मोटी परत(चित्रा 1 बी)प्राप्त करने के लिए एक विच्छेदन सुई के साथ गोंद फैलाएं, जिसका उपयोग प्यूप को संरेखित करने के लिए किया जाएगा। प्यूप स्थानांतरित करने से पहले गोंद को ~ 2 मिनट के लिए सूखने दें।
    नोट: गोंद को अधिक न करें, अन्यथा पिल्ला स्लाइड से ठीक से जुड़ा नहीं होगा और इंजेक्शन के दौरान फिसल जाएगा।
  2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, विच्छेदन सुई का उपयोग करके, पिल्ला के सिर के पीछे गोंद लागू करें।
  3. अपने पेट का सामना करना पड़ के साथ स्लाइड पर गोंद परत के लिए पिल्ला संलग्न करें। स्लाइड(चित्रा 1C)पर साथ-साथ 20-30 पिल्ले को संरेखित रखें।
    नोट: गोंद के साथ पेट को छूने से बचें, और गोंद में पिल्ला डूबने से बचें; अन्यथा, वयस्क उभर नहीं पाएंगे।
  4. गोंद को ~ 10 मिनट के लिए सूखने देने के लिए पेट्री डिश में प्यूप के साथ स्लाइड रखें। इंजेक्शन शुरू करने से पहले, उन्हें विच्छेदन सुई के साथ धीरे धक्का देकर गोंद के लिए पिल्ला के पालन का परीक्षण करें। यदि अधिकांश प्यूप ढीला हो जाते हैं, तो एक नई स्लाइड तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, ढीले सभी पिल्ले को हटा दें, और उन लोगों को इंजेक्ट करने के लिए आगे बढ़ें जो स्लाइड से ठीक से जुड़े हुए हैं।

3. सुई की तैयारी

  1. एक सुई खींचने वाले में एक केशिका ग्लास ट्यूब लोड करें, और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सुई खींचें।
    नोट: इस प्रदर्शन में एक पी-१००० प्लेटिनम फिलामेंट सुई खींचने वाला और एल्यूमीनियम सिलिकेट ग्लास केशिकाओं का उपयोग किया जाता है । इस उपकरण के लिए ऑपरेशन मैनुअल (सामग्री की तालिकादेखें) बताता है कि कैसे ठीक से केशिका ग्लास ट्यूब लोड करने के लिए और इस उपकरण पर कार्यक्रम स्थापित करने के लिए। निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें(हीट: 536; पुल: 80; वेल: 100; देरी: 70)एल्यूमीनियम सिलिकेट ग्लास केशिकाओं पर पीले पिल्ले, काले पिल्ले और वयस्कों को इंजेक्ट करने के लिए।
    इसके अलावा, पी-2000 सुई खींचने के मापदंडों के बाद क्वार्ट्ज सुई तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था(गर्मी: 805; पुल: 145; वेल: 50; देरी: 145)। मैनुअल इस उपकरण में केशिका क्वार्ट्ज ट्यूब और कार्यक्रमों के सेटअप को लोड करने के लिए निर्देश प्रदान करता है। एक पुलर के अभाव में, अनुकूलन योग्य केशिका ग्लास उपलब्ध है।
  2. इंजेक्शन मिश्रण के 5 माइक्रोल के साथ सुई लोड (आरएनएआई10 या CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein12 (RNP) इंजेक्शन के लिए पिछले प्रोटोकॉल के बाद पहले से तैयार N vitripennisमें) माइक्रोलोडर पिपेट युक्तियों का उपयोग कर ।
    नोट: प्रदर्शन के दौरान, सुई डबल फंसे आरएनए (dsRNA) लाल डाई के साथ संयुक्त के साथ भरी हुई है (सामग्री की मेजदेखें) सफेद मंच pupae के इंजेक्शन के लिए और BAPC के साथ-Cas9-sgRNA काले पिल्ले wasps और वयस्कों के इंजेक्शन के लिए । ये रिएजेंट्स सिनाबार जीन को निशाना बना लेंगे। Wasps कि सफलतापूर्वक नीचे खटखटाया/बाहर जंगली प्रकार की भूरे रंग की आंखों के बजाय लाल आंखें दिखाएगा ।
  3. सुई खोलें, दो ओवरलैपिंग स्लाइड्स(चित्रा 1D)से बनी सतह पर टिप स्लाइडिंग करें। वैकल्पिक रूप से, एक तेज धार बनाने के लिए या धीरे-धीरे घास के छाती या पेट को छेदकर ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ सुई की नोक खोलें।

4. फेम्टोजेट के साथ पुपल इंजेक्शन

  1. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत गठबंधन पिल्ले के साथ स्लाइड रखें। फेटोजेट के इंजेक्शन ट्यूब में सुई डालें और ग्रिप हेड को कस लें।
  2. माइक्रोस्कोप के नीचे सुई को देखते हुए, फेम्टोजेट चालू करें और रोटरी नॉब्स को घुमाकर पीसी और पीआई इंजेक्शन पैरामीटर सेट करें।
    नोट: तरल के निरंतर प्रवाह के लिए 600 एचपीए के पीसी मूल्य की सिफारिश की जाती है। पीसी मूल्य सुई के उद्घाटन पर निर्भर करता है। पी-1000 सुई खींचने वाले में संकेतित मापदंडों का उपयोग करके तैयार सुई के लिए, 500 एचपीए और 700 एचपीए के बीच पीसी मान एक निरंतर प्रवाह का उत्पादन करते हैं। यदि पीसी के कम मूल्यों की आवश्यकता होती है, तो यह इंगित करता है कि उद्घाटन बहुत बड़ा हो सकता है और कीड़ों को नुकसान पहुंचा सकता है, जबकि उच्च मूल्यों से संकेत मिलता है कि सुई अभी भी बंद है, या कि उद्घाटन बहुत छोटा है।
  3. ध्यान से 2 और 3 दिखाई पेट खंडों के बीच सुई के बारे में 30 डिग्री(चित्रा 1E)के एक ऊर्ध्वाधर कोण के साथ डालें । सफेद चरण के पिल्ले के मामले में या जब तक पेट काले पिल्ले के मामले में आकार में बढ़ जाता है, तब तक पूरे पेट को गुलाबी होने तक निरंतर प्रवाह के साथ इंजेक्ट करें। इंजेक्शन लगाना बंद करें जब यह स्पष्ट हो कि पेट कोई और तरल नहीं ले सकता है, या जब तरल शरीर से बाहर बहने लगता है। अगले पिल्ला में सावधानी से ले जाएं और इन चरणों को दोहराएं।
    नोट: इंजेक्शन के दौरान सुई के साथ ओविपोसिटर को छूने और नुकसान पहुंचाने से बचें।
  4. एक पेट्री डिश में इंजेक्शन प्यूप के साथ स्लाइड स्थानांतरित करें जिसमें आर्द्रता बनाए रखने के लिए एक कागज तौलिया होता है जो डियोनाइज्ड पानी से लथपथ होता है। अपने ढक्कन के साथ पकवान को कवर करें, और ततैया उद्भव(चित्रा 1F)तक इसे 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

5. एस्पिरेटर ट्यूब के साथ पुपल इंजेक्शन

  1. कारक का उपयोग कर इंजेक्शन मिश्रण की मात्रा की गणना करें: 4 pupae इंजेक्शन/
    नोट: 20-30 पिल्ले के एक विशिष्ट इंजेक्शन के लिए बीएपीसी12के साथ राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन (आरएनपी) कॉम्प्लेक्स-सैपोनिन मिक्स या आरएनपी के ~ 5-8 माइक्रोन की आवश्यकता होती है।
  2. धारा 2 में सुझाए गए पिल्ले को संरेखित करें, और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप(चित्रा 1E)के तहत गठबंधन पिल्ले के साथ एक स्लाइड रखें।
  3. केशिका सुइयों में से एक लें और दो ग्लास स्लाइड के बीच टिप को तोड़ें, जैसा कि चरण 3.4(चित्रा 1D)में इंगित किया गया है। सुनिश्चित करें कि सुई टिप काफी खुला है इंजेक्शन समाधान मुंह के साथ हवा उड़ाने से बाहर जाने के लिए अनुमति देने के लिए, लेकिन तरल खोने और pupae(चित्रा 1E)को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए भी खुला नहीं है ।
    नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि उपयोगकर्ता इंजेक्शन मिश्रण को कीट हीमोलिम्फ में धकेलने के लिए मुंह से हवा का उपयोग करेगा। यह अभ्यास करने के लिए बेहतर है ताकि यह पता लगाया जा सके कि किसी विशेष समाधान मिश्रण की चिपचिपाहट के लिए किस प्रकार का सुई एपर्चर इष्टतम है। प्रति सेट 20 पिल्ले के इंजेक्शन के पांच सेट मुंह इंजेक्शन प्रणाली के लिए इस्तेमाल करने के लिए पर्याप्त हो सकता है ।
  4. माइक्रोलोडिंग टिप का उपयोग करके राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन समाधान12 के साथ एक सुई लोड करें, और सुई को एस्पिरेटर ट्यूब असेंबली के कनेक्टर पैक में डालें।
    नोट: प्रदर्शन के दौरान, सुई BAPC-Cas9-sgRNA के साथ भरी हुई है Nasonia cinnabar जीन12को लक्षित ।
  5. ध्यान से 2 और 3 दिखाई पेट खंडों के बीच सुई के बारे में 30 डिग्री(चित्रा 1E)के एक ऊर्ध्वाधर कोण के साथ डालें । सफेद चरण के पिल्ले के मामले में या जब तक पेट काले पिल्ले के मामले में आकार में बढ़ जाता है तब तक पूरे पेट को गुलाबी होने तक निरंतर प्रवाह के साथ इंजेक्ट करें। इंजेक्शन लगाना बंद करें जब यह स्पष्ट हो जाए कि पेट कोई और तरल नहीं ले सकता है या जब तरल शरीर से बाहर बहने लगता है। अगले पिल्ला के लिए ध्यान से ले जाएँ और इन चरणों को दोहराने
    नोट: इंजेक्शन के दौरान सुई के साथ ओविपोसिटर को छूने और नुकसान पहुंचाने से बचें।
  6. एक पेट्री डिश में इंजेक्शन प्यूप के साथ स्लाइड स्थानांतरित करें जिसमें आर्द्रता बनाए रखने के लिए एक कागज तौलिया होता है जो डियोनाइज्ड पानी से लथपथ होता है। अपने ढक्कन के साथ पकवान को कवर करें और ततैया उद्भव(चित्रा 1F)तक इसे 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

6. एस्पिरेटर ट्यूब के साथ वयस्क इंजेक्शन

  1. वयस्क तैयारी के लिए, एक साफ छोटी टेस्ट ट्यूब में 20 कुंवारी महिलाओं के अलग-अलग समूह एक ठीक तूलिका के साथ। ट्यूब को 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें जब तक कि मादाएं एनेस्थेटाइज्ड न हों। वैकल्पिक रूप से, महिलाओं को एनेस्थेटाइज्ड किया जा सकता है और सीओ2का उपयोग करके इंजेक्शन लगाया जा सकता है।
    नोट: बर्फ एक संवेदनाहारी के रूप में बेहतर है क्योंकि वयस्क घास ठंडे सहिष्णु होते हैं और इंजेक्शन के बाद आसानी से ठीक हो जाते हैं। महिलाएं पिल्ले की तुलना में अधिक इंजेक्शन तरल ले सकती हैं: समाधान का 1 माइक्रोन चार पिल्ले के बजाय तीन महिलाओं के लिए उपयोग किया जा सकता है। तदनुसार वॉल्यूम तैयार करें।
  2. बर्फ की बाल्टी तैयार करें, बर्फ के शीर्ष पर एक गिलास स्लाइड रखें। एक विच्छेदन गुंजाइश के तहत पेट(चित्रा 1E)के साथ ठंड स्लाइड पर साथ-साथ महिलाओं को संरेखित करें।
  3. माइक्रोलोडिंग टिप का उपयोग करके राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन समाधान12 के साथ एक सुई लोड करें, और सुई को एस्पिरेटर ट्यूब असेंबली के कनेक्टर पैक में डालें। दूसरी तरफ से पेट में धीरे-धीरे इंजेक्शन लगाते समय कुंद विच्छेदन सुइयों के साथ विपरीत दिशा से महिलाओं का समर्थन करें। ओविपोसिटर को छूने से बचें, इससे इस महत्वपूर्ण प्रजनन संरचना(चित्रा 1E)को गंभीर रूप से नुकसान होगा।
    नोट: ऑपरेटर वरीयता के आधार पर या तो अभिविन्यास स्वीकार्य है।
  4. ध्यान से 2 और 3 दिखाई पेट खंडों के बीच सुई के बारे में 30 डिग्री(चित्रा 1E)के एक ऊर्ध्वाधर कोण के साथ डालें । समाधान को मादा पेट में इंजेक्ट करें, जब कोई और तरल प्रवेश नहीं कर सकता है, या अधिशेष समाधान के लीक होने पर रोक नहीं है। अगले ततैया पर ध्यान से ले जाएं और इन चरणों को दोहराएं
    नोट: धीरे-धीरे इंजेक्ट करें, इसे बहुत धीरे-धीरे हटाने से पहले पेट के अंदर सुई को लगभग 3 एस तक छोड़ दें। यह आंतरिक तरल दबाव को समायोजित करने और सुई हटाने के बाद इंजेक्शन साइट से लीक समाधान से बचने में मदद करेगा।
  5. समाप्त होने पर, धीरे-धीरे एक इंजेक्शन वाली महिलाओं को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें एक होस्ट एक तूलिका का उपयोग करके है। लगभग 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ठीक होने के लिए छोड़ दें, अस्तित्व की पुष्टि, और फिर पालन इनक्यूबेटर के लिए ट्यूबों वापस ।
    नोट: प्रदर्शन के दौरान, सुई BAPC-Cas9-sgRNA के साथ भरी हुई है Nasonia cinnabar जीन12को लक्षित ।

7. इंजेक्शन के बाद देखभाल और उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग

  1. इंजेक्शन पिल्ले से वयस्क eclosion के बाद, एक गिलास ट्यूब में एक घास जगह कपास के साथ खामियों को दूर किया और एक एस बुलटा मेजबान(चित्रा 1G) डालें। इसके विपरीत, इंजेक्शन के तुरंत बाद मेजबानों के साथ व्यक्तिगत ट्यूबों में महिलाओं को इंजेक्शन दें।
  2. CRISPR/Cas9 नॉकआउट प्रयोगों के लिए, महिलाओं को एक दिन के लिए मेजबान परजीवी करने के लिए अनुमति देते हैं, और मेजबान की जगह लगातार तीन दिनों के लिए प्रत्येक दिन ।
    नोट: एन vitripennis16में हैप्लोडीप्लॉयड लिंग निर्धारण प्रणाली के कारण, कुंवारी महिलाओं हैप्लॉयड पुरुष ब्रूड का उत्पादन होगा, जो म्यूटेशन का पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है । पुरुष-विशिष्ट जीन के आरएनएआई के माध्यम से नॉकआउट के लिए, इंजेक्शन व्यक्तियों को अकेले जंगली प्रकार के व्यक्तियों के साथ संभोग किया जा सकता है और मेजबानों को परजीवी बनाने की अनुमति दी जा सकती है। प्रति दिन एक मेजबान का उपयोग करें, और प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर मेजबानों को बदलें।
  3. जी0 पुरुष संतान (~ 13-14 दिनों के लिए) के उद्भव तक परजीवी मेजबानों को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, उत्परिवर्तित फेनोटाइप के लिए जी0 पुरुषों को स्क्रीन करें। सिनाबार जीन आंखों के पिगमेंटेशन के लिए जिम्मेदार है12:भूरी आंखों के साथ घास जंगली प्रकार हैं, और चमकीली लाल आंखों या लाल और भूरे रंग की आंखों के बीच भिन्नता के साथ घास म्यूटेंट(चित्रा 1H)हैं।

8. पोस्ट इंजेक्शन पार और पालन

  1. सभी उत्परिवर्ती जी0 पुरुषों को लाल आंखों (फेनोटाइपिक रूप से बाधित सिनाबार12जीन) के साथ जंगली प्रकार की कुंवारी महिलाओं के साथ 1-2 दिनों(चित्रा 2 ए)के लिए रखें।
    नोट: यदि बाधित जीन एक दृश्यमान फेनोटाइप प्रदान नहीं करता है, तो उत्परिवर्ती जानवरों की पहचान करने के लिए लक्षित जीन के अनुक्रमण के बाद पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) की आवश्यकता होती है। पीसीआर के लिए G0 पुरुषों से डीएनए प्राप्त करने से पहले, यह जंगली प्रकार कुंवारी महिलाओं के साथ उन्हें दोस्त के लिए आदर्श होगा। वैकल्पिक रूप से, म्यूटेंट की पहचान करने के लिए G0 पुरुष के एक पैर से डीएनए निकालें, और केवल सत्यापित उत्परिवर्तन वाले लोगों को मिलाएं।
  2. प्रति महिला दो एस बुलटा मेजबान जोड़ें, और 12:12 प्रकाश-अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस और 30% सापेक्ष आर्द्रता पर ओविपोसिट करने की अनुमति दें। मेजबानों को हर 2-3 दिनों में बदलें।
    1. ~ 10 दिनों के लिए 12:12 प्रकाश-अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस और 30% सापेक्ष आर्द्रता पर परजीवी मेजबानों को स्टोर करें।
    2. ~ 10 दिनों के बाद, क्रैक एक विच्छेदन सुई के साथ परजीवी मेजबान खोलें, और मेजबान से प्रत्येक एन विट्रिपेनिस पिल्ला को हटा दें।
    3. एक ठीक टिप तूलिका की मदद से, महिला pupae(चित्रा 1A)का चयन करें ।
      नोट: महिलाओं को द्विपिंद और विषम हैं, और इस तरह आंखों का रंग जंगली प्रकार होगा।
  3. उभरने तक 25 डिग्री सेल्सियस पर कांच की ट्यूबों में 15-20 मादा प्यूप रखें। उद्भव के बाद, ~ 20 एस बुलटा मेजबान जोड़ें और कुंवारी जी 1 महिलाओं को 2-3 दिनों के लिए मेजबानों को परजीवी करने दें।
    नोट: इन महिलाओं को ५०% G2 उत्परिवर्ती पुरुषों का उत्पादन होगा ।
    1. G2 पुरुष वयस्क उद्भव तक 12:12 प्रकाश-अंधेरे चक्र के साथ, 25 डिग्री सेल्सियस और 30% सापेक्ष आर्द्रता पर परजीवी मेजबानों को स्टोर करें।
    2. शेष जी 1 प्यूप को 8-10 दिनों के लिए 5 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इस अवधि के बाद, उन्हें निकालें और उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस और 30% सापेक्ष आर्द्रता पर रखें, 12:12 प्रकाश-अंधेरे चक्र के साथ उद्भव तक(चित्रा 2 ए)।
  4. चरण 8.3.1 में G2 पुरुषों के उद्भव के बाद, लाल आंखों उत्परिवर्ती फेनोटाइप की उपस्थिति के लिए स्क्रीन। बारीक टिप तूलिका की मदद से जंगली किस्म के पुरुषों से अलग लाल आंखों वाले नर।
    नोट: इस पीढ़ी (G2, चित्रा 2A)में लाल आंखों वाले घास की उपस्थिति इंगित करती है कि जीन संपादन जर्मलाइन में हुआ, और उत्परिवर्तन वंशानुगत है।
  5. जी 1 महिलाओं के साथ लाल आंखों वाले पुरुषों को नए चरण 8.3.2(चित्रा 2A)में उभरा, और उन्हें 1-2 दिनों के लिए दोस्त होने दें। प्रति महिला 2 एस बुलटा होस्ट जोड़ें, और उन्हें 10-11 दिनों के लिए 12:12 प्रकाश-अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस और 30% सापेक्ष आर्द्रता पर रखें।
    1. 10-11 दिनों के बाद, क्रैक एक विच्छेदन सुई के साथ परजीवी मेजबान खोलें, और मेजबान(चित्रा 2 ए)से प्रत्येक एन विट्रिपेनिस पिल्ला को हटा दें।
    2. एक ठीक टिप तूलिका की मदद से, जंगली प्रकार(चित्रा 1H)से अलग लाल आंखों वाले घास (पुरुष और महिलाएं) । कांच की ट्यूबों में लाल आंखों वाले घासों का पालन जारी रखें, और जंगली प्रकार के घास के साथ मिश्रण न करें।
      नोट: इस स्तर पर (G3, चित्रा 2A),हैप्लॉयड पुरुषों और diploid महिलाओं को ले और सिनाबार म्यूटेशन के लिए फेनोटाइप दिखाते हैं । यदि प्रभावित जीन एक अदृश्य फेनोटाइप के लिए एन्कोड करता है, तो जी0 पुरुष को ~ 1 दिन के लिए एक जंगली प्रकार की महिला के साथ अकेले पार करें। फिर, पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा उत्परिवर्तन के आणविक लक्षण वर्णन के लिए पुरुष को हटा दें, और मादा को एक मेजबान परजीवी दें। केवल एक पुष्टि उत्परिवर्ती पुरुष(चित्रा 2B)की संतानों के साथ पार योजना जारी रखें। यदि लक्ष्य एक उम्मीदवार जीन के आरएनएआई द्वारा नॉकडाउन है, तो वांछित कार्यात्मक परख (जैसे घातकता, बंध्यता, या डायपोज़ प्रेरण परख3,7)सीधे डीएसआरएनए के साथ इंजेक्शन व्यक्तियों का उपयोग करके प्रदर्शन करें। चूंकि आरएनएआई क्षणिक है, इसलिए वांछित फेनोटाइप(चित्रा 2 सी)3, 7के साथ एक कॉलोनी उत्पन्न करना संभव नहीं है।

Figure 1
चित्रा 1:पुपल और वयस्क नासोनिया विट्रीपेनिस माइक्रोइंजेक्शन के लिएटाइमलाइन। (A)पुरुष और महिला सफेद (ऊपर) और काले (नीचे) pupae एकत्र कर रहे हैं,(बी-सी)गठबंधन और इंजेक्शन के लिए एक गिलास स्लाइड से चिपके । (घ)केशिका सुई तैयार की जाती है और खोली जाती है, इसे दो ओवरलैपिंग स्लाइड्स पर फिसलते हुए । (ई)सुई या तो फेम्टोजेट (ऊपर) या इंजेक्शन के लिए एस्पिरेटर ट्यूब (नीचे) से जुड़ी होती है। (च)स्लाइड पर इंजेक्ट किए गए प्यूप को आर्द्रता रखने के लिए नीचे गीले टिश्यू के साथ पेट्री डिश में ट्रांसफर किया जाता है । उद्भव होने पर,(जी)महिलाओं को छोटे कांच की ट्यूबों में अकेले रखा जाता है और सारकोफागा पिल्ला पर ओविपोसिट करने की अनुमति दी जाती है। (ज)म्यूटेंट का पता लगाने के लिए संतानों की स्क्रीनिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2-इंजेक्शन के बाद क्रॉसिंग स्कीम। CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीन संपादन के मामले में पार योजना प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जीन (ए) जो एक दृश्यमान फेनोटाइप और (बी) को प्रेरित करता है जो दृश्यमान फेनोटाइप प्रदान नहीं करता है । (ग) आरएनएआई स्क्रीनिंग प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । संक्षिप्त: सिन = सिनाबार; पीसीआर = पॉलीमरेज चेन रिएक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

यह पेपर प्यूपल और एडल्ट माइक्रोइंजेक्शन के लिए दो आसान तरीके प्रस्तुत करता है, या तो फेम्टोजेट या एस्पिरेटर ट्यूब का उपयोग करके। पहली विधि तरल के अधिक सटीक इंजेक्शन की अनुमति देती है, जो आरएनएआई स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि दूसरा नासोनिया पिल्ले या वयस्कों में तरल की बड़ी मात्रा के इंजेक्शन की अनुमति देता है।

तालिका 1 में प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम अच्छी जीवित रहने की दर दिखाते हैं (20% से 89%) और वांछित फेनोटाइप (या तो आरएनएआई के माध्यम से नॉकडाउन या CRISPR के माध्यम से जीन संपादन) प्राप्त करने की दक्षता श्रमसाध्य अंडे इंजेक्शन की आवश्यकता के बिना यहां वर्णित इंजेक्शन विधियों का उपयोग करके।

मंच अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता एनजी/μL (प्रोटीन/gRNA या dsRNA) एन इंजेक्शन एन सर्वाइवल (%) वंश बिछाने वाले व्यक्तियों को इंजेक्शन दिया फेनोटाइप के साथ संतान पैदा करने वाले व्यक्तियों को इंजेक्शन दिया वंश दिखा नॉकआउट/नॉकआउट फेनोटाइप
 एन % एन कुल इंजेक्शन में से % ओनलनों का उत्पादन करने वाले व्यक्तियों में से % एन म्यूटेंट/इंजेक्शन पिल्ला या वयस्क
सफेद पिल्ले डीएसआरएनए* 3000-4000 80 69 (86%) 69 100% 45 56% 65% 1263 ना
ब्लैक प्यूपे कैस9 2903/2741 39 34 (87%) 19 49% 2 5% 11% 2 0.05
P2C-CAS9-EGFP ** 454/227 40 6 (15%) 2 5% 1 3% 50% 3 0.08
P2C-Cas9 725/750 28 28 (100%) 16 57% 0 0% 0% 0 0.00
बापी 500/200 20 11 (55%) 9 45% 3 15% 33% 5 0.25
बापी 400/600 20 17 (85%) 10 50% 0 0% 0% 0 0.00
बापी 360/360 20 16 (80%) 16 80% 2 10% 13% 3 0.15
24 एच-48-एच-ओल्ड वयस्क कैस9 2769/3290 11 10 (90%) 1 9% 0 0% 0% 0 0.00
P2C-CAS9-EGFP 454/227 34 30 (89%) 12 35% 3 9% 25% 3 0.06
P2C-Cas9 2903/3076 36 36 (100%) 17 47% 4 11% 24% 4 0.05
* आरएनएआई प्रयोग पुरुषों पर किए गए थे जो तब गैर-इंजेक्शन वाले वाइल्डटाइप महिलाओं से मेल दिए गए थे। इसलिए संख्या पार है कि संतान का उत्पादन और जो फेनोटाइप का उत्पादन की संख्या reperesent ।
लेखकों द्वारा प्यूप पर बहुत पहले इंजेक्शन * *। संक्षिप्त: dsRNA = डबल फंसे आरएनए; EGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; BAPC = शाखाबद्ध एम्फीफिलिक पेप्टाइड कैप्सूल।

तालिका 1: पीयूपल और वयस्क इंजेक्शन के माध्यम से आरएनएआई और CRISPR/Cas9 की सर्वाइवल और दक्षता दर। आरएनएआई प्रयोगों में दक्षता ब्याज के जीन के नॉकडाउन में दक्षता का प्रतिनिधित्व करती है, जो लिंग अनुपात विरूपण3जैसे औसत दर्जे का प्रभाव प्रदान करती है। CRISPR/Cas9 के लिए, दक्षता उत्परिवर्ती संतान पैदा इंजेक्शन महिलाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । संक्षिप्त: dsRNA = डबल फंसे आरएनए; GRNA = गाइड आरएनए; EGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन; BAPC = शाखाबद्ध एम्फीफिलिक पेप्टाइड कैप्सूल।

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Discussion

विभिन्न जैविकप्रश्नों2, 3,7,17के लिए एक मॉडल जीव के रूप में नासोनिया विट्रीपेनिस के हालिया बढ़ते उपयोग के साथ, एन विट्रीपेनिस जीन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक सरलीकृत और कुशल प्रोटोकॉल को सक्षम करने के लिए इंजेक्शन विधियों को विकसित और अनुकूलित करने की आवश्यकता है। जीन संपादन अभिकर्णों के भ्रूणीय माइक्रोइंजेक्शन से जुड़े वर्तमान तरीके13को चुनौती दे रहे हैं, जिसमें विशेष उपकरण और उच्च प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है । इस प्रकार, जीन संपादन प्रौद्योगिकी को गैर-विशेष प्रयोगशालाओं के लिए अधिक सुलभ बनाने के लिए, CRISPR अभिकर् प के वैकल्पिक वितरण दृष्टिकोण विकसित करना महत्वपूर्ण है। इसलिए, यहां प्रदर्शित एक विस्तृत दृश्य तकनीक है जो कीट हीमोलिम्फ और अंडाशय में संपादन अभिकर्मकों (CRISPR/Cas9 या dsRNA) के वितरण की अनुमति देने के लिए दो वैकल्पिक इंजेक्शन प्रक्रियाओं का वर्णन करती है।

कीट हीमोकोल में डीएसआरएनए का इंजेक्शन आर्थ्रोपोड्स 18 , 19 , 20 ,21,22की विभिन्न प्रजातियों में डीएसआरएनए पहुंचाने के लिए एक आम दृष्टिकोण है। यह सफेद पिल्ले में उपयोग किए जाने पर एन विट्रीपेनिस में भी कुशल है, जैसा कि पहले3,7बताया गया था। अंकुरित कीट म्यूटेनेसिस के लिए CRISPR/Cas9 विधियां लगभग विशेष रूप से भ्रूणीय माइक्रोइंजेक्शन पर निर्भर करती हैं । 12 , 23 , 24 ,26,26 , 27 , 27 , 27 , 27,24,24,27में CRISPR अभिकरने वाले कुछ सफल प्रयोगों की सूचना मिली है . कुल मिलाकर, यहां वर्णित विधियां मौजूदा तरीकों के संबंध में कई महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती हैं13. सबसे पहले, वे एन विट्रीपेनिस घास के कई विकासात्मक चरणों के इंजेक्शन को सक्षम करते हैं: सफेद, काला पिल्ले और वयस्क। इसके अतिरिक्त, हीमोलिम्फ में इंजेक्शन या तो RNAi या CRISPR के माध्यम से अंकुरित जीन संपादन के माध्यम से नॉकडाउन की अनुमति देता है, भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन को दरकिनार ।

इस प्रोटोकॉल में पहला कदम ब्याज के कार्यात्मक परीक्षण (जैसे, जीनोम संपादन, आरएनएआई) के आधार पर सही विकासात्मक चरण के लिए नासोनिया घास का निर्धारण और स्क्रीन करना है। सफेद और अंधेरे पिल्ले और वयस्कों में दोनों लिंगों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाना महत्वपूर्ण है। एन विट्रीपेनिस मादाएं ब्लोफ्लाई, एस बुलटाके पुपल मामले में पचास अंडे तक डालती हैं, और सफेद चरण से शुरू होकर बड़ी संख्या में ततैया पिल्ले को आसानी से एकत्र और जांच की जा सकतीहै। इसके अतिरिक्त, 5 डिग्री सेल्सियस पर हफ्तों के लिए विकास दर को धीमा करने के लिए विभिन्न चरणों में पिल्ले के भंडारण की संभावना प्रणाली को समय और संगठन9के मामले में बहुत लचीला बनाती है।

इंजेक्शन के बाद प्यूप और वयस्कों का अस्तित्व एक पहलू है जिसे उपयोगकर्ताओं द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में, PUPae में CRISPR/Cas9 reagents के पहले इंजेक्शन अस्तित्व नाटकीय रूप से प्रभावित (15%) इंजेक्शन वयस्कों (90%) के अस्तित्व की तुलना में। हालांकि, दूसरे सत्र में, प्यूप जीवित रहने में 60% तक वृद्धि हुई। कई इंजेक्शन सत्रों के बाद, समान अस्तित्व को बनाए रखना संभव था (80%-100%) प्यूप या वयस्कों को इंजेक्शन लगाने के बाद। दरअसल, इंजेक्शन के बाद अस्तित्व में सुधार किया जा सकता है यदि घास को संरेखित करने से संबंधित मापदंडों, सुई के लिए सही एपर्चर का चयन करना, और सुई के साथ घास को भेदी या छुरा से बचना अनुकूलित किया जाता है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के आधार पर इंजेक्शन के लिए पिल्ले और महिलाओं को संरेखित और तैयार करना, मृत्यु दर को कम कर सकता है। इसके अलावा, उन्हें स्लाइड में चिपकाकर स्थिर पिल्ले को संरेखित करने के लिए प्रस्तुत विधि इंजेक्शन प्रक्रिया को कम कर सकती है, क्योंकि यह उन्हें इंजेक्शन के दौरान आगे बढ़ने से रोकती है। इस प्रकार, प्यूप को भ्रूणीय माइक्रोइंजेक्शन में शामिल चरणों की समय लेने वाली प्रकृति पर काबू पाने, बहुत तेजी से इंजेक्शन दिया जा सकता है। इसके अलावा, इंजेक्शन के रूप में एक मुंह एस्पिरेटर के साथ किया जा सकता है, जीन संपादन घटनाओं को पूरा करने के लिए कोई विशेष उपकरण की आवश्यकता है । हालांकि, इस तकनीक को गोंद पर समय पर रखे जाने वाले घास की आवश्यकता होती है; अन्यथा, वे ठीक से संलग्न नहीं होंगे और सुई प्रविष्टि के दौरान स्लाइड से फिसल जाएंगे। अलाइनमेंट के कई परीक्षणों के बाद इसे ठीक किया जा सकता है।

वयस्कों को इस विधि का उपयोग करके गठबंधन नहीं किया जा सकता है क्योंकि वे अपने पेट और पैरों को स्थानांतरित कर सकते हैं; इसलिए, उन्हें एनेस्थेटाइज्ड करने की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में पसंद की पसंदीदा विधि में बर्फ में घास युक्त ट्यूब को ~ 5 मिनट तक रखना शामिल है जब तक कि घास नीचे नहीं गिरा दिए जाते हैं, और फिर उन्हें समूहों में बर्फ पर पूर्व-ठंडा स्लाइड में स्थानांतरित कर देते हैं। यह विधि प्रत्येक नए इंजेक्शन समूह के लिए बर्फ युक्त एक नई पेट्री डिश के साथ, ऊपर की ओर सामना कर रहे 10-15 घास के समूहों में इंजेक्शन के लिए घास के संरेखण और तैयारी की अनुमति देती है। इंजेक्शन के दौरान बर्फ के पिघलने को रोकने में मदद मिलेगी स्लाइड स्थिर रखने के लिए और सुई तोड़ने या दुर्घटना से घास की हत्या के जोखिम को कम । यदि सुलभ हो तो एक हल्का टेबल का उपयोग करके इस कदम को सुधारा जा सकता है।

वैकल्पिक रूप से, सीओ2 पैड का उपयोग घास को एनेस्थेटाइज करने के लिए किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, इंजेक्शन के दौरान सीओ2 के संपर्क के समय को अनुकूलित करना और जीवित रहने और प्रजनन क्षमता पर सीओ2 एक्सपोजर के प्रभावों को निर्धारित करना आवश्यक होगा, जैसा कि अन्य प्रजातियों18के लिए पहले बताया गया था। एक अतिरिक्त बाधा जब इंजेक्शन वयस्कों इंजेक्शन के लिए एनेस्थेटाइज्ड ततैया पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया विधि पर निर्भर करता है । एक कुंद-नुकीली वस्तु जो भेदी या छुरा के जोखिम के बिना ततैया को पकड़ सकती है, यह सबसे उपयुक्त है। सामान्य तौर पर, विच्छेदन सुई या कुंद संदंश अच्छी तरह से काम करते हैं।

संरेखण और घास की उचित होल्डिंग में महारत हासिल होने के बाद, इंजेक्शन प्रक्रिया बहुत जल्दी आगे बढ़ सकती है। प्यूप और वयस्क इंजेक्शन को सैकड़ों नैनोलीटर की सीमा में समाधान की मात्रा के साथ इंजेक्ट किया जा सकता है, जो उपयोगकर्ता की वरीयता के आधार पर विभिन्न सांद्रता पर इसकी तैयारी को सुविधाजनक बनाता है। हालांकि, नुकसान पहुंचाने और ततैया को मारने के जोखिम के बिना तरल की सही मात्रा को इंजेक्ट करने के लिए उचित सुइयों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। सामान्य तौर पर, बहुत छोटे एपर्चर के साथ बहुत लंबी सुई बेहतर होती है क्योंकि वे प्यूप के पेट को कम शारीरिक नुकसान पहुंचाती हैं। इसके अलावा, तरल का प्रवाह धीमा है, दबाव में बड़े बदलावों से बचना और सबसे महत्वपूर्ण बात, सुई द्वारा बनाए गए छेद के माध्यम से समाधान के रिसाव को रोकना।

एक छोटे से एपर्चर के नुकसान यह हैं कि घास के कठोर एक्सोस्केलेटन को छूते समय सुई आसानी से टूट सकती है और पेट के अंदर से सामग्री के साथ भी भरा जा सकता है। इसलिए, छोटी एपर्चर सुई एक फेमटोजेट या नैनोजेक्ट का उपयोग करके बहुत अच्छी तरह से काम करती हैं, और उनके उपयोग को तोड़ने से बचने के लिए बहुत सावधानी की आवश्यकता होती है। ये सुई एक मुंह एस्पिरेटर के लिए अनुकूल नहीं हैं क्योंकि एक छोटे एपर्चर के माध्यम से मुंह के साथ तरल इंजेक्ट करना बहुत मुश्किल है। इस विधि के लिए, आदर्श सुई को न्यूनतम एपर्चर की आवश्यकता होती है जो एक बड़े एपर्चर सुई के साथ होने वाले नुकसान को रोकते हुए समाधान को सुचारू रूप से प्रवाहित करने की अनुमति देता है। फिर, इस पहलू को उपयोगकर्ताओं द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता है। किसी भी मामले में, सुई बदलने से अक्सर क्लोगिंग से बचने और टिप को नुकसान पहुंचाने में मदद मिलेगी जो अस्तित्व और दक्षता को कम कर देगी।

एन vitripennis में, पेट में किसी भी जगह हीमोलिम्फ में अभिकर्मित देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, ततैया के ओविपोसिटर को नुकसान से बचने के लिए अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि इसका उपयोग खिलाने और अंडे बिछाने के लिए किया जाता है। पिल्ला और वयस्कों दोनों के लिए, इस प्रोटोकॉल में स्थिरीकरण तकनीकों का सुझाव दिया गया है ताकि मुख्य रूप से पेट के पूर्वकाल के हिस्से की ओर वेंट्रल क्षेत्र में ओविपोसिटर से इंजेक्शन लगाने की अनुमति दी जा सके। इसके अतिरिक्त, वयस्कों में, इसे किनारों पर या पृष्ठीय क्षेत्र में इंजेक्शन देकर भी प्राप्त किया जा सकता है। यहां वर्णित पिल्ले के लिए संरेखण विधि साइड इंजेक्शन की सुविधा दे सकती है, लेकिन पृष्ठीय नहीं। किसी भी मामले में, शरीर के अन्य अंगों को भेदने या पेट को नुकसान पहुंचाने से रोकने के प्रयास प्राथमिकता हैं।

एक बार सुई डालने के बाद, तरल का प्रवाह धीमा और स्थिर होना चाहिए। फेम्टोजेट इसे आसानी से अनुमति देता है, हालांकि प्रत्येक सुई के लिए दबाव को समायोजित करना पड़ सकता है। मुंह के एस्पिरेटर का उपयोग करते समय, बड़ी मात्रा में तरल के इंजेक्शन से बचना चाहिए क्योंकि इससे इंजेक्शन के पोर के माध्यम से रिसाव हो सकता है। वास्तव में, तरल के साथ पेट में सूजन को देखने के अलावा, रिसाव एक इंजेक्शन को रोकने के लिए एक संकेत है। इंजेक्शन खत्म होने के बाद, वयस्क घास को स्लाइड पर छोड़ दिया जाना चाहिए जब तक कि वे ठीक न हो जाएं और फिर मेजबानों के साथ एक ट्यूब में स्थानांतरित न हो जाएं।

यहां प्रस्तुत प्रणालियों को आसानी से अन्य कीट प्रजातियों के अनुकूल किया जा सकता है जो अंडे के माइक्रोइंजेक्शन के लिए विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, कई परजीवी घास अंडे अन्य कीट लार्वा में डालते हैं। इसलिए अंडे तक पहुंचने और उन प्रजातियों में सुई असंभव हैं । अन्य कीट प्रजातियों के अंडे, जैसे एशियाई साइट्रस साइलिड डायफोरिना सिट्री, इंजेक्शन के लिए पहुंचना भी बहुत मुश्किल है क्योंकि वे उस पौधे से जुड़े होते हैं जहां उन्हें रखा जाता है। हाल ही में एक रिपोर्ट से पता चलता है कि BAPC का इस्तेमाल एशियन साइट्रस साइलिड, डी सिट्री27में CRISPR जीन एडिटिंग के लिए किया जा सकता है । इसी तरह, प्रोटीन, रीचेरी की P2C-मध्यस्थता वितरण, इस प्रजाति के अंडाशय में पूरा किया गयाथा,सुझाव है कि इन इंजेक्शन तकनीकों यहां वर्णित कीट कीट प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला में RNAI और CRISPR के कार्यान्वयन की सुविधा और नियंत्रण रणनीतियों है कि उनके साथ जुड़े फसल क्षति को रोकने में मदद डिजाइन करने में मदद कर सकता है ।

अन्य प्रजातियों में कार्यान्वयन के लिए ब्याज की प्रजातियों के जीवन चक्र के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, ब्याज के कार्यात्मक परीक्षण के आधार पर इंजेक्शन के सही चरण को स्थापित करना महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, ओलों में CRISPR/Cas9 के वितरण के लिए, यह जानना महत्वपूर्ण है कि जब विटेलोजेनेसिस24, 25, 26,27, 28, 28अंडाशय द्वारा जीन संपादन अभिकर्षकों के तेज की अनुमति देनेकेलिए सक्रिय है । इसके विपरीत, एक कुशल नॉकडाउन के लिए, यह जानना महत्वपूर्ण है कि जीन कब व्यक्त किया जाता है और कार्यात्मक होता है। उन इंजेक्शन तकनीकों के भविष्य के कार्यान्वयन में विभिन्न प्रकार के न्यूक्लिक एसिड, जैसे प्लाज्मिड डीएनए, कीट हीमोलिम्फ और अंडाशय में वितरण शामिल हो सकता है। इससे प्लाज्मिड डीएनए में मौजूद जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति को बढ़ावा देना संभव हो जाता है। इसके अलावा, एक टेम्पलेट डीएनए के साथ CRISPR/कैस अभिकर्षक के संयोजन से होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के माध्यम से ट्रांसजेनेसिस मध्यस्थता में मदद मिल सकती है या भ्रूणीय माइक्रोइंजेक्शन को दरकिनार करते हुए ट्रांसपोसन-मध्यस्थता ट्रांसजेनेसिस को प्रेरित किया जा सकता है । अंत में, इस उन्नत तकनीक का उपयोग कई प्रकार के कार्यात्मक विश्लेषण उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि आरएनएआई के माध्यम से नॉकडाउन, म्यूटेशन, विलोपन को शामिल करना, और संभवतः ट्रांसजेनिक एन वित्रिपेनिसउत्पन्न करने के लिए ट्रांसजीन सम्मिलन, ट्रांसपोसंस को बीएपीसी से जोड़ना, जिससे इस जीव में कार्यात्मक अनुसंधान में बहुत तेजी आनी चाहिए।

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Disclosures

जेएलआर और डीसीआर ने रेमोट कंट्रोल टेक्नोलॉजी पर प्रोविजनल पेटेंट प्रोटेक्शन के लिए फाइल किया है। O.S.A. Agragene, इंक के एक संस्थापक है, एक इक्विटी ब्याज है, और कंपनी के वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड पर कार्य करता है । अन्य सभी लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को यूसीएसडी स्टार्टअप फंड द्वारा समर्थन दिया गया था, जो जेएलआर को 1645331 O.S.A. और एनएसएफ/बायो ग्रांट को निर्देशित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile Sigma 960-97693-083
Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) Sutter Instruments BF100-58-10 Can also use Borosilicate or Quartz
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
BAPC phoreus biotech BAPtofect-25 0.5 mg Kit
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
Dissecting needle VWR 10806-330
DNase/RNase-Free distilled Water Invitrogen 10977-015
Femtojet Express programmable microinjector Eppendorf
Femtotips Microloader tips Fisher Scientific E5242956003
Fine-tip paintbrush ZEM 2595
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata Ward's Science 470180-392
Food colorant dye
Glass Test Tubes Fisher Scientific 982010
Glue Elmer's washable, no toxic school glue
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000 or P-2000
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-A3
Stereo Microscope Olympus SZ51

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References

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जीव विज्ञान अंक १६६ नासोनिया vitripennis,CRISPR/Cas9 ReMOT BAPC सहायता प्राप्त CRISPR वयस्क इंजेक्शन RNAAi
<em>नासोनिया विट्रिपेनिस</em> में आरएनएआई और CRISPR जीन संपादन के लिए पुपल और वयस्क इंजेक्शन
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Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J. Vis. Exp. (166), e61892, doi:10.3791/61892 (2020).

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