Summary
Her beskriver vi metoder til effektive pupal- og voksenindsprøjtninger i Nasonia vitripennis som tilgængelige alternativer til embryomikroinjektion, der muliggør funktionel analyse af gener af interesse ved hjælp af enten RNA-lyddæmpning via RNA-interferens (RNAi) eller gen knockout via CRISPR / Cas9 genomredigering.
Abstract
Juvelhvepsen, Nasonia vitripennis, er blevet et effektivt modelsystem til at studere epigenetik af haplo-diploid sexbestemmelse, B-kromosombiologi, værtssymiontinteraktioner, speciation og giftsyntese. På trods af tilgængeligheden af flere molekylære værktøjer, herunder CRISPR/Cas9, er funktionelle genetiske undersøgelser stadig begrænsede i denne organisme. Den største begrænsning ved at anvende CRISPR/Cas9-teknologi i N. vitripennis skyldes udfordringerne ved embryonale mikroinjektioner. Injektioner af embryoner er særligt vanskelige i denne organisme og generelt i mange parasitoide hveps på grund af lille embryostørrelse og kravet om en værtspuppe til embryonal udvikling. For at løse disse udfordringer blev Cas9 ribonucleoprotein kompleks levering til kvindelige æggestokke ved voksen injektion snarere end embryonal mikroinjection optimeret, hvilket resulterede i både somatiske og arvelige kønsceller. Injektionsprocedurerne blev optimeret i pupper og kvindelige hveps ved hjælp af enten ReMOT Control (Receptor-Medieret æggetransduktion af last) eller BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Disse metoder har vist sig at være effektive alternativer til embryon injektion, så sted-specifikke og arvelige kønsceller mutationer.
Introduction
CRISPR/Cas9 genredigering er en kraftfuld teknologi til funktionelle genetiske undersøgelser, især i mange stigende modelorganismer som juvel wasp, Nasonia vitripennis. Den lette opdræt og tilgængeligheden af et komplet genom gør juvel hvepsen til et vigtigt eksperimentelt system til belysning af de molekylære mekanismer i forskellige biologiske processer. For eksempel er N. vitripennis for nylig blevet brugt til at optrævle det epigenetiske grundlag for haplodiploid sexbestemmelsessystemet1,2, biologien i B-kromosomer3,4,5,6og det genetiske grundlag for døgnrytmen og sæsonregulering7,8. Nogle af de funktioner, der gør N. vitripennis modtagelig for arbejde med, omfatter kort generationstid (~2 uger ved 25 °C), høje reproduktionshastigheder, let kønsadskillelse på pupalstadiet og evnen til at diapause og gemme stammer ved 4 °C. Livscyklussen begynder med kvindelige hveps, der parasiterer blæserens pupper, Sarcophaga bullata. Gennem deres ovipositor lå kvinder op til 50 æg i puppekassen af blowfly. Æg udvikler sig til larver, der fodrer på S. bullata pupa, fortsætter med at udvikle sig i løbet af de næste par dage og derefter popper, efterfulgt af voksen eclosion og fremkomst fra værts puparium9.
Molekylære værktøjer til at udføre funktionelle genetiske undersøgelser i N. vitripennis, såsom RNA-interferens (RNAi)10 og CRISPR/Cas911,12, er tilgængelige, men er begrænsede, primært på grund af vanskeligheder med at udføre embryonale mikroinjections13. Som N. vitripennis æg kræver en pupal vært for udvikling, æg manipulation er meget udfordrende. Præ-blastoderm fase embryoner skal indsamles fra værten blowfly pupper, hurtigt microinjected, og straks overføres tilbage til værten for udvikling13. Disse trin kræver præcision og specialiseret træning for at undgå at beskadige de mikroindsprøjtede embryoner eller pupalværterne13. Desuden er æggene meget små og skrøbelige, især efter mikroinjections, med et meget tyktflydende cytoplasma, der forårsager en kontinuerlig tilstopning af injektionsnålen13. Disse funktioner gør embryonale mikroinjections usædvanligt udfordrende, der kræver højtuddannede operatører og specialiseret udstyr, der er fraværende i de fleste N. vitripennis laboratorier.
Optimering af alternative injektionsmetoder til levering af CRISPR-reagenser vil bidrage til konsolideringen af N. vitripennis som modelorganisme. Manipulation af pupper og voksne er mindre udfordrende end at manipulere embryoner og kan opnås med en grundlæggende injektion setup. Her beskrives to protokoller for injektion af pupper og voksne: den ene involverer specialiseret udstyr til injektioner, og den anden involverer brug af en aspiratorrørssamling udstyret med en glaskapillær nål. Brugen af et aspiratorrør er særligt velegnet til laboratorier, der ikke har adgang til specialiseret udstyr til embryomikroinjections. Effektive injektioner af forskellige udviklingsstadier af N. vitripennis, herunder hvide eller sorte pupper og voksne hveps, påvises. Hvepse på den hvide pupal fase er særligt velegnede til RNAi-medieret knockdown eksperimenter. Selvom RNAi i Nasonia først blev beskrevet af Lynch og Desplan i 200610, er der ingen visuel procedure tilgængelig for, hvordan RNAi-injektioner udføres. RNAi blev for nylig brugt til at opdage haploidizer genet af B-kromosom PSR (Paternal Sex Ratio)3 og til at studere inddragelsen af uret genet, periode, i N. vitripennis biologiske rytmer7.
Sort pupper og voksne hveps kan bruges til at fremkalde CRISPR/Cas9-genredigering ved hjælp af ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) og BAPC -protokoller (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Disse to æggestokke leveringsmetoder er for nylig blevet beskrevet som effektive i Nasonia til at generere kønsceller mutationer i målgenet, cinnabar7,12. Her er der fastsat en forenklet protokol for injektioner, herunder en visuel procedure for en trinvis metode til både pupal- og vokseninjektioner, der kan bruges til at generere funktionelle genetikundersøgelser i Nasonia og sandsynligvis i andre parasitoide hveps, uden at kræve specialiseret udstyr og omgå embryonale mikroinjektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opdræt af Nasonia
- Sæt ~ 20 parrede kvinder ental i små glas reagensglas tilsluttet bomuld.
BEMÆRK: For at reducere opdrætspladsen er 10 x 85 cm, 4 mL rør optimale. Kvinder skelnes let fra mænd på grund af de større vinger og tilstedeværelsen af ovipositoren (Figur 1A). Detaljerede protokoller for opdræt N. vitripennis kan også findes i anden litteratur13,14,15.- Tilsæt to S. bullata værter per rør, og opretholde hvepsene ved 25 ± 1 °C og 30% relativ luftfugtighed, med en 12:12 lys-mørk cyklus i 2-3 dage.
BEMÆRK: Hvepse kan opretholdes ved lavere temperatur eller stuetemperatur; udviklingen vil dog blive bremset.
- Tilsæt to S. bullata værter per rør, og opretholde hvepsene ved 25 ± 1 °C og 30% relativ luftfugtighed, med en 12:12 lys-mørk cyklus i 2-3 dage.
- Efter 2-3 dage, ved hjælp af en finspidspensel, skal du forsigtigt fjerne hunnerne for at undgå kontinuerlig oviposition og asynkron i afkomudvikling.
BEMÆRK: Fjernede hunner kan eventuelt genhostes eller opbevares ved 5 °C i op til en måned.- Den parasiterede vært skal være 25 °C og 30 % relativ luftfugtighed med en 12:12 lysmør cyklus i 7 dage, hvis den ønskede injektionsfase kræver hvid pupper. i 13 dage, hvis den krævede udviklingsstadie er sort pupper eller 14 dage for unge, nyopdukkede voksne.
BEMÆRK: Gul og sort pupper kan også opbevares ved 5 °C i op til en uge. Længere opbevaring vil øge hyppigheden af diapause i larver for den næste generation, hvilket gør screening efter injektion og etablering af mutantlinjer vanskeligere. - Knæk åbne værten puparium med en dissekering nål til at inddrive N. vitripennis pupper og voksne på det ønskede tidspunkt (Figur 1A).
BEMÆRK: For injektioner i en bestemt voksen alder eller til indsamling af jomfruhunner anbefales det at fjerne den mørke pupper på dag 13 fra værten, adskilt efter køn og samle voksne efter fremkomsten.
- Den parasiterede vært skal være 25 °C og 30 % relativ luftfugtighed med en 12:12 lysmør cyklus i 7 dage, hvis den ønskede injektionsfase kræver hvid pupper. i 13 dage, hvis den krævede udviklingsstadie er sort pupper eller 14 dage for unge, nyopdukkede voksne.
2. Justering af hvid og sort pupper
- Forbered en glasrutsjebane ved at anvende en linje skolelim i midten. Spred limen med en dissekering nål for at opnå et tykt lag (Figur 1B), som vil blive brugt til at justere pupperne. Lad limen tørre i ~ 2 minutter, før du overfører pupperne.
BEMÆRK: Limen må ikke oversyes, da pupperne ellers ikke er korrekt fastgjort til rutsjebanen og glider over under injektionerne. - Under et dissekerende mikroskop, ved hjælp af dissekere nålen, påføres lim på bagsiden af puppens hoved.
- Fastgør puppen til limlaget på diaset med maven vendt op. Juster 20-30 pupper side om side på diaset (Figur 1C).
BEMÆRK: Undgå at røre maven med limen, og undgå at nedsænke pupperne i limen; Ellers vil de voksne ikke være i stand til at dukke op. - Placer rutsjebanen med pupperne i en petriskål for at lade limen tørre i ~ 10 minutter. Før injektionerne påbegyndes, skal du teste puppernes klæben til limen ved at skubbe dem forsigtigt med dissekerepinden. Hvis de fleste af pupperne løsnes, skal du forberede et nyt dias. Alternativt kan du fjerne alle de pupper, der er løse, og fortsætte med at injicere dem, der er korrekt fastgjort til diaset.
3. Nåleforberedelse
- Læg et kapillærglasrør i en nåleskøjte og træk nåle efter producentens anvisninger.
BEMÆRK: En P-1000 platin filament nål puller og aluminium silikat glas kapillærer anvendes i denne demonstration. Betjeningsvejledningen til dette instrument (se Materialeoversigten)forklarer, hvordan kapillære glasrør læsses korrekt, og programmer på dette instrument opsættes. Brug følgende parametre (Varme: 536; Træk: 80; Vel: 100; Forsinkelse: 70) på aluminium silikat glas kapillærer til at injicere gule pupper, sort pupper, og voksne.
Desuden blev P-2000 nåletrækkeren brugt til at forberede kvartsnåle efter parametrene (Varme: 805; Træk: 145; Vel: 50; Forsinkelse: 145). Manualen indeholder instruktioner til pålæsning af kapillærkvartslanger og opsætning af programmer i dette instrument. I mangel af en puller er kapillærglas, der kan tilpasses, tilgængeligt. - Nålen fyldes med 5 μL af injektionsblandingen (tilberedt på forhånd efter tidligere protokoller for RNAi10 eller CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein12 (RNP) injektioner i N. vitripennis) ved hjælp af mikrolæsserpipettespidser.
BEMÆRK: Under demonstrationen er nålen fyldt med dobbeltstrenget RNA (dsRNA) kombineret med rødt farvestof (se Materialetabel)til injektion af hvid stadiepupper og med BAPC-Cas9-sgRNA til injektion af sorte pupper og voksne. Disse reagenser vil målrette cinnabar genet. Hvepse, der med succes bankes ned / ud, vil vise røde øjne i stedet for de vilde type brune øjne. - Åbn nålen, og skub spidsen på en overflade, der er lavet af to overlappende dias (Figur 1D). Alternativt kan du åbne nålespidsen med et par fine pincet for at skabe en skarp kant eller ved langsomt at gennembore hvepsens brystkasse eller underliv.
4. Pupal injektion med femtojet
- Placer diaset med den justerede pupper under et dissekerende mikroskop. Sæt nålen ind i femtojetens injektionsrør, og stram grebshovedet.
- Når man ser på nålen under mikroskopet, skal du tænde for femtojet og oprette pc- og pi-injektionsparametre ved at dreje dreje drejeknapperne.
BEMÆRK: En pc-værdi på 600 hPa anbefales til en kontinuerlig strøm af væsken. Pc-værdien afhænger af nålens åbning. For nåle, der er fremstillet ved hjælp af de angivne parametre i P-1000-nåletrækkeren, giver pc-værdier mellem 500 hPa og 700 hPa et konstant flow. Hvis der kræves lavere værdier af pc' en, indikerer dette, at åbningen kan være for stor og kan beskadige insekterne, mens højere værdier indikerer, at nålen stadig er lukket, eller at åbningen er for lille. - Sæt forsigtigt nålen mellem de 2 og 3 synlige abdominalsegmenter med en lodret vinkel på ca. 30°(Figur 1E). Injicere med en kontinuerlig strøm, indtil hele maven bliver lyserød i tilfælde af hvidfase pupper, eller indtil maven stiger i størrelse i tilfælde af sort pupper. Stop injektionen, når det er klart, at maven ikke kan tage mere væske, eller når væsken begynder at strømme ud af kroppen. Flyt forsigtigt til den næste puppe og gentag disse trin.
BEMÆRK: Undgå at røre ved og beskadige fårepositoren med nålen under injektionen. - Overfør rutsjebanen med den injicerede pupper til en petriskål, der indeholder et køkkenrulle gennemblødt med deioniseret vand for at opretholde fugtigheden. Skålen dækkes med låget, og den anbringes ved 25 °C, indtil der opstår hveps(Figur 1F).
5. Pupal injektion med aspiratorrør
- Mængden af injektionsblandingen beregnes ud fra faktoren: 4 pupper injiceret/1 μL opløsning.
BEMÆRK: En typisk injektion af 20-30 pupper kræver ~ 5-8 μL ribonukleoprotein (RNP) kompleks-saponin mix eller RNP med BAPC12. - Pupperne justeres som foreslået i afsnit 2, og der anbringes et dias med den justerede pupper under et dissekerende mikroskop (Figur 1E).
- Tag en af kapillærnålene, og bryd spidsen mellem to glasrutsjebaner som angivet i trin 3.4(Figur 1D). Sørg for, at nålespidsen er åben nok til, at injektionsopløsningen kan gå ud ved at blæse luft med munden, men ikke for åben til at undgå at miste væske og beskadige pupperne (Figur 1E).
BEMÆRK: Dette trin er kritisk, fordi brugeren vil bruge luft fra munden til at skubbe injektionsblandingen ind i insektets hæmolymph. Det er bedre at øve sig for at fastslå, hvilken type nåleåbning der er optimal for viskositeten af en bestemt opløsningsblanding. Fem sæt injektioner på 20 pupper pr. sæt kan være nok til at vænne sig til mundindsprøjtningssystemet. - Lad en nål med ribonucleoproteinopløsningen12 med en mikrobelastningsspids, og sæt nålen i stikpakken på aspiratorrørssamlingen.
BEMÆRK: Under demonstrationen er nålen fyldt med BAPC-Cas9-sgRNA rettet mod Nasonia cinnabar-genet 12. - Sæt forsigtigt nålen mellem de 2 og 3 synlige abdominalsegmenter med en lodret vinkel på ca. 30°(Figur 1E). Injicere med en kontinuerlig strøm, indtil hele maven bliver lyserød i tilfælde af hvid-trins pupper eller indtil maven stiger i størrelse i tilfælde af sort pupper. Stop injektionen, når det er klart, at maven ikke kan tage mere væske, eller når væsken begynder at strømme ud af kroppen. Flyt forsigtigt til den næste puppe og gentag disse trin
BEMÆRK: Undgå at røre ved og beskadige fårepositoren med nålen under injektionen. - Overfør rutsjebanen med den injicerede pupper til en petriskål, der indeholder et køkkenrulle gennemblødt med deioniseret vand for at opretholde fugtigheden. Skålen dækkes med låget, og den anbringes ved 25 °C, indtil der opstår hveps (Figur 1F).
6. Voksen injektion med aspiratorrør
- Til voksenforberedelse, separate grupper af 20 jomfruelige kvinder i et rent lille reagensglas med en fin pensel. Placer røret på is i 5 minutter, indtil hunnerne er bedøvet. Alternativt kan kvinder bedøves og injiceres ved hjælp af CO2.
BEMÆRK: Is er at foretrække som bedøvelsesmiddel, da voksne hveps er koldtolerante og let kommer sig efter injektionerne. Hunner kan optage mere injiceret væske end pupperne: 1 μL opløsning kan bruges til tre hunner i stedet for til fire pupper. Forbered diskenheder i overensstemmelse hermed. - Forbered en isspand, og placere en glasrutsjebane oven på isen. Juster hunnerne side om side på det kolde dias med maven vendt op (Figur 1E) under et dissekeringsomfang.
- Lad en nål med ribonucleoproteinopløsningen12 med en mikrobelastningsspids, og sæt nålen i stikpakken på aspiratorrørssamlingen. Støt hunnerne fra den modsatte side med afstumpede dissekerende nåle, mens de langsomt injiceres i maven fra den anden side. Undgå at røre ovipositoren, dette vil alvorligt skade denne kritiske reproduktive struktur (Figur 1E).
BEMÆRK: Begge retninger er acceptable, afhængigt af operatørpræferencen. - Sæt forsigtigt nålen mellem de 2 og 3 synlige abdominalsegmenter med en lodret vinkel på ca. 30°(Figur 1E). Injicere opløsningen i den kvindelige underliv, stoppe, når der ikke kan komme mere væske ind, eller når der observeres lækage af overskydende opløsning. Flyt forsigtigt til den næste hveps, og gentag disse trin
BEMÆRK: Injicere langsomt, forlader nålen inde i maven i ca 3 s, før du fjerner det meget langsomt. Dette vil bidrage til at justere det interne væsketryk og undgå, at opløsningen lækker fra injektionsstedet efter fjernelse af kanylen. - Når du er færdig, skal du forsigtigt overføre enkelt injicerede kvinder til et nyt rør med en vært ved hjælp af en pensel. Lad det komme sig ved stuetemperatur i ca. 1 time, bekræfte overlevelse og derefter returnere rørene til opdrætsinkubatoren.
BEMÆRK: Under demonstrationen er nålen fyldt med BAPC-Cas9-sgRNA rettet mod Nasonia cinnabar-genet 12.
7. Pleje efter injektion og mutantscreening
- Efter voksen eclosion fra den injicerede pupper, sted enkelt hveps i et glasrør tilsluttet bomuld og indsætte en S. bullata vært (Figur 1G). I modsætning hertil sted injiceres kvinder i individuelle rør med værter umiddelbart efter injektion.
- For CRISPR/Cas9 knockout eksperimenter, tillade kvinder at parasitere værterne for en dag, og erstatte værten hver dag i tre på hinanden følgende dage.
BEMÆRK: På grund af haplodiploid sexbestemmelsessystemet i N. vitripennis16vil jomfruhunner producere haploid mandlige brød, hvilket letter påvisning af mutationer. For knockdown via RNAi af mandlige-specifikke gener, de injicerede personer kan være ental parret med vilde type individer og lov til at parasitere værter. Brug en vært om dagen, og erstat værterne baseret på den eksperimentelle opsætning. - Placer de parasiterede værter ved 25 °C indtil fremkomsten af G0 mandlige afkom (i ~ 13-14 dage).
- Under et dissekerende mikroskop, skærm G0 hanner for muterede fænotyper. Cinnabar-genet er ansvarlig for øjenpigmentering12: hveps med brune øjne er vilde typer, og hveps med lyse røde øjne eller variationer mellem røde og brune øjne er mutanter (Figur 1H).
8. Kryds og opdræt efter injektion
- Placer alle mutant G0 hanner med røde øjne (det fænnotypisk forstyrrede cinnabar12gen) med vilde type jomfruhunner i 1-2 dage(Figur 2A).
BEMÆRK: Hvis det forstyrrede gen ikke giver en synlig fænotype, er polymerasekædereaktion (PCR) efterfulgt af sekventering af målgenet påkrævet for at identificere de mutante dyr. Før du får DNA fra G0 mænd til PCR, ville det være ideelt at parre dem med vilde type jomfruhunner. Alternativt kan du udtrække DNA fra et ben af en G0-mand for at identificere mutanter og kun parre dem med verificerede mutationer. - Tilføj to S. bullata værter per kvinde, og lad det oviposit ved 25 ° C og 30% relativ luftfugtighed med en 12:12 lys-mørk cyklus. Udskift værterne hver 2-3 dage.
- Opbevar parasiterede værter ved 25 °C og 30% relativ luftfugtighed med en 12:12 lysmørke cyklus i ~ 10 dage.
- Efter ~ 10 dage, knæk åbne parasiterede vært med en dissekerende nål, og fjern hver N. vitripennis puppe fra værten.
- Ved hjælp af en pensel med fin spids skal du vælge kvindelig pupper (Figur 1A).
BEMÆRK: Kvinder er diploid og heterozygos, og dermed vil øjenfarven være vild type.
- Placer 15-20 kvindelige pupper i glasrør ved 25 °C indtil fremkomsten. Efter fremkomsten skal du tilføje ~ 20 S. bullata værter og lad de jomfruelige G1-kvinder parasitere værterne i 2-3 dage.
BEMÆRK: Disse kvinder vil producere 50% G2 mutant hanner.- Opbevar parasitiserede værter ved 25 °C og 30% relativ luftfugtighed med en 12:12 lysmør cyklus indtil G2 mandlig voksen fremkomst.
- De resterende G1-pupper anbringes ved 5 °C i 8-10 dage . Efter denne periode fjernes dem, og de anbringes ved 25 °C og 30 % relativ luftfugtighed med en lysmørke cyklus på 12:12, indtil de opstår (Figur 2A).
- Efter fremkomsten af G2-hannerne i trin 8.3.1, skærm for tilstedeværelsen af rødøjet mutant fænotype. Ved hjælp af en fin spids pensel, adskille rødøjede mænd fra vilde type mænd.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af rødøjede hveps i denne generation (G2, Figur 2A) indikerer, at genredigering fandt sted i kønscellerne, og at mutationen er arvelig. - Placer rødøjede mænd med G1-hunnerne, der for nylig er opstået i trin 8.3.2(Figur 2A), og lad dem parre sig i 1-2 dage. Tilføj 2 S. bullata værter per kvinde, og læg dem ved 25 °C og 30% relativ luftfugtighed med en 12:12 lys-mørk cyklus i 10-11 dage.
- Efter 10-11 dage skal du åbne den parasiterede vært med en dissekerende nål og fjerne hver N. vitripennis-puppe fra værten (Figur 2A).
- Ved hjælp af en finspidspende pensel adskilles rødøjede hveps (mænd og kvinder) fra vild type (Figur 1H). Fortsæt opdræt af rødøjede hveps sammen i glasrør, og bland ikke med de vilde type hveps.
BEMÆRK: På dette stadium (G3, Figur 2A) bærer og udviser haploide hanner og diploidhunner fænotyper for cinnabarmutationerne. Hvis det berørte gen koder for en usynlig fænotype, kryds G0-mand ental med en vild type kvinde i ~ 1 dag. Fjern derefter hanen til molekylær karakterisering af mutationen ved PCR og sekventering, og lad kvinden parasitere en vært. Fortsætte krydsningsordningen kun med afkom af en bekræftet mutant han (Figur 2B). Hvis målet er knockdown af RNAi af en kandidat gen, udføre den ønskede funktionelle analyse (såsom dødelighed, sterilitet, eller diapause induktion assay3,7) direkte ved hjælp af personer injiceres med dsRNA. Da RNAi er forbigående, er det ikke muligt at generere en koloni med den ønskede fænotype (Figur 2C)3,7.
Figur 1: Tidslinje for pupal og voksen Nasonia vitripennis mikroinjection. (A) Der opsamles hvide (øverste) og sorte (nederste) pupper (B-C) justeret og limet fast til en glasrutsjebane til injektion. (D) Kapillær nål er forberedt og åbnet, skubbe det på to overlappende dias. (E) Nålen er fastgjort enten til Femtojet (øverst) eller til et aspiratorrør (nederst) til injektioner. (F) Den injicerede pupper på diaset overføres til en petriskål med et vådt væv på bunden for at holde luftfugtigheden. Ved fremkomsten (G) er hunner placeret ental i små glasrør og får lov til at oviposit på Sarcophaga pupper. (H) Screening af afkom til påvisning af mutanter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Krydsningsordning efter injektion. Skematisk repræsentation af krydsningsordningproceduren i tilfælde af CRISPR/Cas9-medieret genredigering af gener (A), der fremkalder en synlig fænotype og (B), som ikke giver synlig fænotype. C) Skematisk repræsentation af RNAi-screeningsproceduren. Forkortelser: cin = cinnabar; PCR = polymerase kædereaktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette papir præsenterer to nemme metoder til pupal og voksen mikroinjection, enten ved hjælp af en femtojet eller en aspirator rør. Den første metode giver mulighed for en mere præcis injektion af væske, hvilket er vigtigt for RNAi konsistens, mens den anden tillader injektion af større mængder væske i Nasonia pupper eller voksne.
De repræsentative resultater, der præsenteres i tabel 1, viser en god overlevelsesrate (fra 20 % til 89 %) og effektiviteten af at få den ønskede fænotype (enten knockdown via RNAi eller genredigering via CRISPR) ved hjælp af injektionsmetoderne beskrevet her uden at kræve besværlige ægindsprøjtninger.
| stadie | Reagens | Koncentration ng/μL (protein/gRNA eller dsRNA) | N injiceret | N Overlevelse (%) | Injicerede personer, der lægger afkom | Injicerede personer, der producerer afkom med fænotyper | Afkom, der viser knockdown/knockout-fænotyper | ||||
| nielsen | % | nielsen | % af det samlede injicerede | % af personer, der producerer afkom | nielsen | Mutanter/ injiceret pupper eller voksen | |||||
| Hvid pupper | dsRNA* | 3000-4000 | 80 | 69 (86%) | 69 | 100% | 45 | 56% | 65% | 1263 | Na |
| Sort pupper | Cas9 | 2903/2741 | 39 | 34 (87%) | 19 | 49% | 2 | 5% | 11% | 2 | 0.05 |
| P2C-CAS9-EGFP** | 454/227 | 40 | 6 (15%) | 2 | 5% | 1 | 3% | 50% | 3 | 0.08 | |
| P2C-Cas9 | 725/750 | 28 | 28 (100%) | 16 | 57% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 500/200 | 20 | 11 (55%) | 9 | 45% | 3 | 15% | 33% | 5 | 0.25 | |
| BAPC | 400/600 | 20 | 17 (85%) | 10 | 50% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 360/360 | 20 | 16 (80%) | 16 | 80% | 2 | 10% | 13% | 3 | 0.15 | |
| 24 h-48-h-gammel voksen | Cas9 | 2769/3290 | 11 | 10 (90%) | 1 | 9% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 |
| P2C-CAS9-EGFP | 454/227 | 34 | 30 (89%) | 12 | 35% | 3 | 9% | 25% | 3 | 0.06 | |
| P2C-Cas9 | 2903/3076 | 36 | 36 (100%) | 17 | 47% | 4 | 11% | 24% | 4 | 0.05 | |
| * RNAi eksperimenter blev udført på mænd, der derefter blev parret med ikke-injiceret wildtype hunner. Derfor reperesent antallet af kors, der producerede afkom, og dem, der producerede fænotyper. | |||||||||||
| ** Allerførste injektion på pupper af forfatterne. Forkortelser: dsRNA = dobbeltstrenget RNA; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; BAPC = forgrenede amfitetidkapsler. | |||||||||||
Tabel 1: Overlevelses- og effektivitetsgraden for RNAi og CRISPR/Cas9 via pupal- og voksenindsprøjtninger. Effektivitet i RNAi-eksperimenter repræsenterer effektivitet i afsmittende virkning af interessegenet, hvilketgiver en målbar effekt som f.eks. For CRISPR/Cas9 repræsenterer effektivitet antallet af injicerede hunner, der producerer mutantafkom. Forkortelser: dsRNA = dobbeltstrenget RNA; gRNA = vejledende RNA; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; BAPC = forgrenede amfitetidkapsler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den nylige øgede brug af Nasonia vitripennis som modelorganisme til forskellige biologiske spørgsmål2,3,7,17, er der behov for at udvikle og optimere injektionsmetoder for at muliggøre en forenklet og effektiv protokol til funktionel analyse af N. vitripennis gener. De nuværende metoder, der involverer embryonal mikroinjection af genredigering reagenser er udfordrende13, der kræver specialiseret udstyr og højt uddannet personale. For at gøre genredigeringsteknologi mere tilgængelig for ikke-specialiserede laboratorier er det derfor afgørende at udvikle alternative leveringsmetoder for CRISPR-reagenser. Derfor er demonstreret her en detaljeret visuel teknik, der beskriver to alternative injektionsprocedurer, der gør det muligt at levere redigeringsreagenser (CRISPR/ Cas9 eller dsRNA) til insektmolymph og æggestokke.
Injektion af dsRNA i insekt hæmoel er en fælles tilgang til levering af dsRNA i forskellige arter af leddyr18,19,20,21,22. Det er også effektivt i N. vitripennis, når det anvendes i hvid pupper, som rapporteret tidligere3,7. CRISPR/Cas9 metoder til kønsceller insekt mytterigenese er næsten udelukkende afhængige af embryonale mikroinjections. Få vellykkede forsøg med CRISPR-reagenser til nymfer eller voksne er blevet rapporteret12,23,24,25,26,27. Samlet set giver de her beskrevne metoder en række væsentlige fordele med hensyn til eksisterende metoder13. For det første muliggør de injektion af flere udviklingsstadier af N. vitripennis hveps: hvid, sort pupper og voksne. Derudover giver injektion i hæmolymphen mulighed for enten knockdown via RNAi eller kimcellegenredigering via CRISPR, uden om embryonale mikroinjections.
Det første skridt i denne protokol er at bestemme og screene Nasonia hveps til den rigtige udviklingsfase baseret på den funktionelle test af interesse (f.eks. genomredigering, RNAi). Det er vigtigt at vænne sig til at identificere begge køn i hvid og mørk pupper og voksne. N. vitripennis hunner lå op til halvtreds æg i puppekassen af blowfly, S. bullata, og hvepse pupper kan let indsamles og screenes i stort antal, startende fra den hvide scene. Desuden gør muligheden for at opbevare pupper på forskellige stadier for at bremse udviklingshastigheden i ugevis ved 5 °C systemet meget fleksibelt med hensyn til tid og organisation9.
Overlevelsen af pupper og voksne efter injektion er et aspekt, der skal optimeres af brugerne. I denne protokol påvirkede den første injektion af CRISPR/Cas9-reagenser i pupper f.eks. sammenlignet med overlevelsen af injicerede voksne (90%). Men i den anden session, steg pupper overlevelse op til 60%. Efter flere injektionssessioner var det muligt at opretholde en lignende overlevelse (80%-100%) efter injektion af pupper eller voksne. Faktisk kan overlevelse efter injektion forbedres, hvis parametre relateret til tilpasning af hvepsene, valg af den rigtige blænde til nålen og undgå piercing eller stikkende hvepsene med nålen er optimeret.
Tilpasning og forberedelse af pupper og kvinder til injektioner, baseret på den protokol, der præsenteres her, kan reducere dødeligheden. Desuden kan den metode, der præsenteres for at justere immobile pupper ved at lime dem til diaset, lette injektionsprocessen, fordi det forhindrer dem i at bevæge sig under injektionen. Således kan pupper injiceres meget hurtigt og overvinde den tidskrævende karakter af de trin, der er involveret i embryonale mikroinjektioner. Hertil kommer, som injektioner kan gøres med en mund aspirator, ingen specialiseret udstyr er nødvendig for at udføre genredigering begivenheder. Denne teknik kræver dog, at hvepsene placeres rettidigt på limen; Ellers vil de ikke være korrekt fastgjort og vil glide ud fra rutsjebanen under nåleindføringen. Dette kan korrigeres efter flere forsøg med tilpasning.
Voksne kan ikke justeres ved hjælp af denne metode, fordi de kan flytte deres mave og ben; derfor skal de bedøves. Den foretrukne metode til valg i denne protokol indebærer at placere røret, der indeholder hvepsene i is i ~ 5 minutter, indtil hvepsene er slået ned, og derefter overføre dem i grupper til en forkølet dias på is. Denne metode gør det muligt at tilpasse og forberede hvepsene til injektion i grupper på 10-15 hveps, der vender opad, med en ny petriskål, der indeholder is til hver ny injektionsgruppe. Forebyggelse af smeltning af isen under injektionen vil hjælpe med at holde rutsjebanen stabil og mindske risikoen for at bryde nålene eller dræbe hvepsene ved et uheld. Dette trin kan forbedres ved hjælp af et kølebord, hvis det er tilgængeligt.
Alternativt kan CO2 puder bruges til at bedøve hvepsene. For at gøre dette vil det være nødvendigt at optimere eksponeringstiden for CO 2 underinjektionen og at bestemme virkningerne af CO2-eksponering på overlevelse og frugtbarhed, som tidligere rapporteret for andre arter18. En ekstra forhindring ved injektion af voksne er afhængig af den metode, der bruges til at holde den bedøvede hveps til injektion. En stump-spidse objekt, der kan holde hveps uden risiko for piercing eller stikkende det er mest egnet. Generelt fungerer dissektionsnåle eller stumpe pincet godt.
Efter at justeringen og den korrekte opbevaring af hvepsene er mestret, kan injektionsprocessen fortsætte meget hurtigt. Pupper og voksne injektioner kan injiceres med opløsningsvolumener i området af hundreder af nanoliter, hvilket letter forberedelsen i forskellige koncentrationer baseret på brugerens præference. Det er dog vigtigt at bruge ordentlige nåle til at injicere den korrekte mængde væske uden risiko for at beskadige og dræbe hvepsen. Generelt er meget lange nåle med meget små åbninger bedre, fordi de forårsager mindre fysisk skade på puppernes underliv. Desuden er strømmen af væsken langsom, så man undgår store trykændringer og vigtigst af alt forhindrer lækagen af opløsningen gennem hullet skabt af nålen.
Ulemperne ved en lille blænde er, at nålene let kan bryde, når de rører ved hvepsens hårde exoskelet og også kan blive tilstoppet med materialet inde fra maven. Derfor fungerer små blændenåle meget godt ved hjælp af en femtojet eller en nanoject, og deres brug kræver stor omhu for at undgå at bryde dem. Disse nåle er ikke egnet til en mund aspirator, fordi det er meget vanskeligt at injicere væske med munden gennem en lille blænde. Til denne metode kræver den ideelle nål den minimale blændeåbning, der gør det muligt for løsningen at flyde jævnt og samtidig forhindre den skade, der kan forårsages med en stor blændenål. Igen skal dette aspekt optimeres af brugerne. Under alle omstændigheder vil ændring af nålen ofte bidrage til at undgå tilstopning og beskadige spidsen, der vil reducere overlevelse og effektivitet.
I N. vitripennis kan ethvert sted i maven bruges til at levere reagenser i hæmolymphen. Der skal dog udvises ekstra omhu for at undgå skader på hvepsens ovipositor, da dette bruges til fodring og æglægning. For både pupper og voksne er immobiliseringsteknikker blevet foreslået i denne protokol for at tillade injektion væk fra ovipositoren, hovedsagelig i ventralområdet mod den forreste del af maven. Derudover kan dette hos voksne også opnås ved at injicere på siderne eller i dorsalområdet. Den justeringsmetode for pupper, der er beskrevet heri, kan lette sideinjektionen, men ikke dorsal. Under alle omstændigheder er bestræbelser på at forhindre piercing andre kropsdele eller skade maven en prioritet.
Når nålen er indsat, skal strømmen af væsken være langsom og konstant. Femtojet gør det nemt, selvom trykket muligvis skal justeres for hver nål. Ved brug af en mund aspirator bør injektion af store mængder væske for hurtigt undgås, da dette kan få den til at lække gennem injektionens pore. Faktisk, udover at observere maven hævelse med væske, lækage er et tegn på at stoppe en injektion. Når injektionen er færdig, skal de voksne hveps efterlades på diaset, indtil de kommer sig og derefter overføres til et rør med værter.
De systemer, der præsenteres her, kan let tilpasses andre insektarter, der er særligt udfordrende for ægmikroinjections. For eksempel lægger mange parasitoide hveps æg i andre insektlarver. Æg er derfor umulige at nå og injicere i disse arter. Æggene fra andre skadedyrsarter, såsom den asiatiske citrus psyllid Diaphorina citri, er også meget vanskelige at nå til injektion, fordi de er fastgjort til planten, hvor de er lagt. En nylig rapport tyder på, at BAPC kan bruges til CRISPR-genredigering i det asiatiske citrus psyllid, D. citri27. Tilsvarende P2C-medieret levering af proteinet, mCherry, blev udført i æggestokkene af denne art28, hvilket tyder på, at disse injektionsteknikker, der er beskrevet her, kan lette implementeringen af RNAi og CRISPR i en bred vifte af skadedyrsarter og hjælpe med at designe bekæmpelsesstrategier, der hjælper med at forhindre de afgrødeskader, der er forbundet med dem.
Implementeringen i andre arter kræver optimering baseret på livscyklussen for de pågældende arter. For eksempel er det vigtigt at etablere det rigtige injektionsstadium også baseret på den funktionelle test af interesse. For levering af CRISPR/Cas9 til æggestokke er det derfor vigtigt at vide, hvornår vitellogenese er aktiv for at tillade optagelse af genredigeringsreagenserne af æggestokkene24,25,26,27,28. I modsætning hertil er det vigtigt at vide, hvornår genet udtrykkes og fungerer, for en effektiv knockdown. Den fremtidige gennemførelse af disse injektionsteknikker kan indebære levering af forskellige typer nukleinsyrer, såsom plasmid-DNA, til insektmolymph og æggestokke. Dette gør det muligt at fremme forbigående ekspression af gener, der er til stede i plasmid-DNA'et. Desuden kan en kombination af CRISPR/Cas-reagens med et skabelon-DNA hjælpe med at mægle transgenese via homologistyret reparation (HDR) eller fremkalde en transpononmedieret transgenese, der omgår embryonal mikroinjection. Afslutningsvis kan denne forbedrede teknik bruges til at generere mange former for funktionel analyse, såsom knockdown via RNAi, induktion af mutationer, sletninger og muligvis endda transgene indsættelser for at generere transgene N. vitripennis, der forbinder transposoner med BAPC, hvilket i høj grad bør fremskynde funktionel forskning i denne organisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JLR og DCR har ansøgt om midlertidig patentbeskyttelse på ReMOT Control teknologi. O.S.A er grundlægger af Agragene, Inc., har en egenkapitalinteresse og sidder i selskabets Scientific Advisory Board. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af UCSD-startmidler rettet mod O.S.A. og NSF/BIO-tilskud 1645331 til J.L.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
