Summary
Her beskriver vi metoder for effektive pupal- og vokseninjeksjoner i Nasonia vitripennis som tilgjengelige alternativer til embryomikroinjeksjon, noe som muliggjør funksjonell analyse av gener av interesse ved hjelp av enten RNA-silencing via RNA-interferens (RNAi) eller gen knockout via CRISPR / Cas9 genomredigering.
Abstract
Juvelvevepsen, Nasonia vitripennis, har blitt et effektivt modellsystem for å studere epigenetikk av haplo-diploid sexbestemmelse, B-kromosombiologi, vertssympymiske interaksjoner, spesiering og giftsyntese. Til tross for tilgjengeligheten av flere molekylære verktøy, inkludert CRISPR / Cas9, er funksjonelle genetiske studier fortsatt begrenset i denne organismen. Den største begrensningen ved bruk av CRISPR/Cas9-teknologi i N. vitripennis stammer fra utfordringene ved embryonale mikroinjeksjoner. Injeksjoner av embryoer er spesielt vanskelig i denne organismen og generelt i mange parasitoidveps, på grunn av liten embryostørrelse og kravet om en vertsvalpe for embryonal utvikling. For å løse disse utfordringene ble Cas9 ribonucleoprotein kompleks levering til kvinnelige eggstokkene ved vokseninjeksjon, i stedet for embryonal mikroinjeksjon, optimalisert, noe som resulterte i både somatiske og arvelige bakterieredigeringer. Injeksjonsprosedyrene ble optimalisert i pupper og kvinnelige veps ved hjelp av enten ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) eller BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Disse metodene viser seg å være effektive alternativer til embryoinjeksjon, noe som muliggjør stedsspesifikke og arvelige bakteriemutasjoner.
Introduction
CRISPR/Cas9 genredigering er en kraftig teknologi for funksjonelle genetiske studier, spesielt i mange stigende modellorganismer som juvel veps, Nasonia vitripennis. Den enkle oppdretten og tilgjengeligheten av et komplett genom gjør juvelvevepsen til et viktig eksperimentelt system for å belyse molekylære mekanismer i forskjellige biologiske prosesser. For eksempel har N. vitripennis nylig blitt brukt til å avdekke det epigenetiske grunnlaget for haplodiploid sexbestemmelsessystem1,2, biologien til B-kromosomene3,4,5,6og det genetiske grunnlaget for circadian og sesongregulering7,8. Noen av funksjonene som gjør N. vitripennis egnet til å jobbe med inkluderer kort generasjons tid (~ 2 uker ved 25 °C), høye reproduksjonshastigheter, enkel kjønnsseparasjon på puppetrinnet og evnen til å diapause og lagre stammer ved 4 °C. Livssyklusen begynner med kvinnelige hvepe som parasiterer blowflyens pupper, Sarcophaga bullata. Gjennom sin ovipositor legger kvinner opptil 50 egg i puppetuiet av blowflyen. Egg utvikler seg til larver som spiser på S. bullata pupa, fortsetter å utvikle seg i løpet av de neste dagene, og deretter puperer, etterfulgt av voksen eklosjon og fremvekst fra verten puparium9.
Molekylære verktøy for å utføre funksjonelle genetiske studier i N. vitripennis, for eksempel RNA-interferens (RNAi)10 og CRISPR / Cas911,12, er tilgjengelige, men er begrenset, hovedsakelig på grunn av vanskeligheter med å utføre embryonale mikroinjeksjoner13. Siden N. vitripennis egg krever en pupal vert for utvikling, egg manipulasjon er svært utfordrende. Pre-blastoderm stadium embryoer må samles fra verten blowfly pupper, raskt mikroinjisert, og umiddelbart overført tilbake til verten for utvikling13. Disse trinnene krever presisjon og spesialisert trening for å unngå å skade de mikroinjiserte embryoene eller puppevertene13. Videre er eggene svært små og skjøre, spesielt etter mikroinjeksjoner, med en veldig viskøs cytoplasma som forårsaker en kontinuerlig tilstopping av injeksjonsnålen13. Disse funksjonene gjør embryonale mikroinjeksjoner usedvanlig utfordrende, og krever høyt utdannede operatører og spesialisert utstyr som er fraværende i de fleste N. vitripennis laboratorier.
Optimalisering av alternative injeksjonsmetoder for levering av CRISPR-reagenser vil bidra til konsolidering av N. vitripennis som modellorganisme. Manipulering av pupper og voksne er mindre utfordrende enn å manipulere embryoer og kan oppnås med et grunnleggende injeksjonsoppsett. Her er to protokoller beskrevet for injeksjon av pupper og voksne: den ene involverer spesialisert utstyr for injeksjoner, og den andre involverer bruk av en aspiratorrørmontering utstyrt med en glasskapillær nål. Bruken av et aspiratorrør er spesielt egnet for laboratorier som ikke har tilgang til spesialisert utstyr for embryomikroinjeksjoner. Effektive injeksjoner av ulike utviklingsstadier av N. vitripennis, inkludert hvit eller svart pupper og voksenveps, demonstreres. Wasps på den hvite puppetrinnet er spesielt egnet for RNAi-medierte knockdown-eksperimenter. Selv om RNAi i Nasonia først ble beskrevet av Lynch og Desplan i 200610, er det ingen visuell prosedyre tilgjengelig for hvordan RNAi-injeksjoner utføres. RNAi ble nylig brukt til å oppdage haploidizer genet av B-kromosomet PSR (Paternal Sex Ratio)3 og for å studere involvering av klokkegenet, periode, i N. vitripennis biologiske rytmer7.
Svart pupper og voksne veps kan brukes til å indusere CRISPR/Cas9 germline genredigering ved hjelp av ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) og BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules) protokoller. Disse to eggstokkleveringsmetodene har nylig blitt beskrevet å være effektive i Nasonia for å generere bakteriemutasjoner i målgenet, cinnabar7,12. Her er en forenklet protokoll gitt for injeksjoner, inkludert en visuell prosedyre for en trinnvis metodikk for både pupal og voksen injeksjoner som kan brukes til å generere funksjonelle genetikkstudier i Nasonia og sannsynligvis i andre parasitoidveps, uten å kreve spesialisert utstyr og omgå embryonale mikroinjeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nasonia oppdrett
- Sett opp ~ 20 parrede kvinner entall i små glassrør plugget med bomull.
MERK: For å redusere oppdrettsplassen er 10 x 85 cm, 4 ml rør optimale. Hunnene skiller seg lett fra menn på grunn av de større vingene og tilstedeværelsen av ovipositoren (Figur 1A). Detaljerte protokoller for oppdrett av N. vitripennis finnes også i annen litteratur13,14,15.- Tilsett to S. bullata verter per rør, og vedlikehold vepsene ved 25 ± 1 °C og 30 % relativ fuktighet, med en 12:12 lys-mørk syklus i 2-3 dager.
MERK: Veps kan opprettholdes ved lavere temperatur eller romtemperatur; Utviklingen vil imidlertid avta.
- Tilsett to S. bullata verter per rør, og vedlikehold vepsene ved 25 ± 1 °C og 30 % relativ fuktighet, med en 12:12 lys-mørk syklus i 2-3 dager.
- Etter 2-3 dager, ved hjelp av en fin-tip pensel, fjern hunnene forsiktig for å unngå kontinuerlig oviposisjon og asynkron i avkomutvikling.
MERK: Fjernede kvinner kan eventuelt hostes på nytt eller oppbevares ved 5 °C i opptil en måned.- Opprettholde den parasitererte verten ved 25 °C og 30 % relativ fuktighet, med en 12:12 lys mørk syklus i 7 dager hvis ønsket injeksjonsstadium krever hvit pupper; i 13 dager hvis det nødvendige utviklingsstadiet er svart pupper; eller 14 dager for unge, nyoppdagede voksne.
MERK: Gul og svart pupper kan også oppbevares ved 5 °C i opptil én uke. Lengre lagring vil øke hyppigheten av diapause i larver for neste generasjon, noe som gjør screening etter injeksjon og etablering av mutantlinjer vanskeligere. - Sprekk opp vertspupariumet med en dissekerende nål for å gjenopprette N. vitripennis pupper og voksne på ønsket stadium (Figur 1A).
MERK: For injeksjoner i en bestemt voksen alder eller for å samle jomfruhunner, anbefales det å fjerne den mørke puppene på dag 13 fra verten, skilt etter kjønn og samle voksne etter fremveksten.
- Opprettholde den parasitererte verten ved 25 °C og 30 % relativ fuktighet, med en 12:12 lys mørk syklus i 7 dager hvis ønsket injeksjonsstadium krever hvit pupper; i 13 dager hvis det nødvendige utviklingsstadiet er svart pupper; eller 14 dager for unge, nyoppdagede voksne.
2. Justering av hvit og svart pupper
- Forbered et glasssklie ved å bruke en linje med skolelim i midten. Spred limet med en dissekeringsnål for å få et tykt lag (Figur 1B), som vil bli brukt til å justere puppene. La limet tørke i ca 2 min før du overfører puppene.
MERK: Ikke overdry limet, ellers vil ikke puppene være ordentlig festet til lysbildet og vil gli over under injeksjonene. - Under et dissekerende mikroskop, ved hjelp av dissekeringsnålen, påfør lim på baksiden av puppens hode.
- Fest puppen til limlaget på lysbildet med magen vendt opp. Juster 20-30 pupper side ved side på lysbildet (Figur 1C).
MERK: Unngå å berøre magen med limet, og unngå å senke puppene ned i limet; Ellers vil de voksne ikke kunne dukke opp. - Legg gliden med puppene i en Petri-tallerken for å la limet tørke i ca. 10 min. Før du starter injeksjonene, test valpens overholdelse til limet ved å skyve dem forsiktig med dissekeringsnålen. Hvis de fleste puppene løsnes, lag et nytt lysbilde. Alternativt kan du fjerne alle puppene som er løse, og fortsette å injisere de som er riktig festet til lysbildet.
3. Nål forberedelse
- Legg ett kapillærglassrør i en nåletrekker, og trekk nåler etter produsentens anvisninger.
MERK: En P-1000 platina filament nåltrekker og aluminium silikat glass kapillærer brukes i denne demonstrasjonen. Bruksanvisningen for dette instrumentet (se Materialfortegnelse) forklarer hvordan kapillærglassrørene skal lastes riktig og sette opp programmer på dette instrumentet. Bruk følgende parametere (Varme: 536; Trekk: 80; Vel: 100; Forsinkelse: 70) på aluminiumssilikatglass kapillærer for å injisere gul pupper, svart pupper og voksne.
I tillegg ble P-2000 nåletrekkeren brukt til å forberede kvartsnåler etter parametrene (Varme: 805; Trekk: 145; Vel: 50; Forsinkelse: 145). Håndboken gir instruksjoner for lasting av kapillære kvartsrør og oppsett av programmer i dette instrumentet. I fravær av en puller er tilpassbart kapillærglass tilgjengelig. - Legg kanylen med 5 μL av injeksjonsblandingen (fremstilt på forhånd etter tidligere protokoller for RNAi10 eller CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein12 (RNP) injeksjoner i N. vitripennis) ved hjelp av pipettespisser for mikroloader.
MERK: Under demonstrasjonen er nålen lastet med dobbeltstrenget RNA (dsRNA) kombinert med rødt fargestoff (se Materialbord) for injeksjon av hvit scenepupp og med BAPC-Cas9-sgRNA for injeksjon av svarte puppeveveps og voksne. Disse reagensene vil målrette cinnabar genet. Wasps som er vellykket slått ned / ut vil vise røde øyne i stedet for den ville typen brune øyne. - Åpne kanylen og skyv spissen på en overflate laget av to overlappende lysbilder (Figur 1D). Alternativt kan du åpne spissen av nålen med et par fine tang for å skape en skarp kant eller ved å sakte piercing thoraxen eller magen på vepsen.
4. Pupal injeksjon med femtojet
- Plasser lysbildet med den justerte puppen under et dissekerende mikroskop. Sett nålen inn i femtojetens injeksjonsrør og stram grephodet.
- Når du ser på nålen under mikroskopet, slår du på femtojet og setter opp Pc- og Pi-injeksjonsparametere ved å rotere dreieknappene.
MERK: En PC-verdi på 600 hPa anbefales for en kontinuerlig strøm av væsken. Pc-verdien avhenger av åpningen av nålen. For nåler tilberedt ved hjelp av de angitte parametrene i P-1000 nåletrekkeren, produserer PC-verdier mellom 500 hPa og 700 hPa en konstant strømning. Hvis det kreves lavere verdier av Pc, indikerer dette at åpningen kan være for stor og kan skade insekter, mens høyere verdier indikerer at nålen fortsatt er lukket, eller at åpningen er for liten. - Sett forsiktig inn kanylen mellom de 2 og 3 synlige buksegmentene med en vertikal vinkel på ca. 30° (figur 1E). Injiser med en kontinuerlig strøm til hele magen blir rosa når det gjelder hvite pupper, eller til magen øker i størrelse når det gjelder svart pupper. Slutt å injisere når det er klart at magen ikke kan ta mer væske, eller når væsken begynner å strømme ut av kroppen. Flytt forsiktig til neste pupa og gjenta disse trinnene.
MERK: Unngå å berøre og skade ovipositoren med kanylen under injeksjonen. - Overfør lysbildet med den injiserte puppen til en Petri-tallerken som inneholder et papirhåndkle gjennomvåt med deionisert vann for å opprettholde fuktighet. Dekk parabolen med lokket, og plasser den ved 25 °C til vepsen kommer opp (Figur 1F).
5. Pupal injeksjon med aspiratorrør
- Beregn mengden injeksjonsblanding ved hjelp av faktoren: 4 pupper injisert / 1 μL oppløsning.
MERK: En typisk injeksjon med 20-30 pupper krever ~ 5-8 μL ribonukleoprotein (RNP) kompleks saponinblanding eller RNP med BAPC12. - Juster puppene, som foreslått i avsnitt 2, og plasser ett lysbilde med den justerte puppen under et dissekeringsmikroskop (figur 1E).
- Ta en av kapillærnålene og bryt spissen mellom to glasssklier, som angitt i trinn 3.4 (Figur 1D). Påse at nålespissen er åpen nok til at injeksjonsoppløsningen kan slukkes ved å blåse luft med munnen, men ikke for åpen for å unngå å miste væske og skade puppene (Figur 1E).
MERK: Dette trinnet er kritisk fordi brukeren vil bruke luft fra munnen for å skyve injeksjonsblandingen inn i insektets hemolymfe. Det er bedre å øve for å fastslå hvilken type nåleåpning som er optimal for viskositeten til en bestemt løsningsblanding. Fem sett med injeksjoner på 20 pupper per sett kan være nok til å bli vant til munninjeksjonssystemet. - Legg en nål med ribonukleoproteinoppløsningen12 ved hjelp av en mikrolastspiss, og sett nålen inn i koblingspakken til aspiratorrørenheten.
MERK: Under demonstrasjonen er nålen lastet med BAPC-Cas9-sgRNA rettet mot Nasonia cinnabar gen12. - Sett forsiktig inn kanylen mellom de 2 og 3 synlige buksegmentene med en vertikal vinkel på ca. 30° (figur 1E). Injiser med en kontinuerlig strøm til hele magen blir rosa når det gjelder hvite pupper eller til magen øker i størrelse når det gjelder svart pupper. Slutt å injisere når det er klart at magen ikke kan ta mer væske eller når væsken begynner å strømme ut av kroppen. Flytt forsiktig til neste pupa og gjenta disse trinnene
MERK: Unngå å berøre og skade ovipositoren med kanylen under injeksjonen. - Overfør lysbildet med den injiserte puppen til en Petri-tallerken som inneholder et papirhåndkle gjennomvåt med deionisert vann for å opprettholde fuktighet. Dekk fatet med lokket og legg det ved 25 °C til vepseoppkomsten (Figur 1F).
6. Voksen injeksjon med aspiratorrør
- For voksen forberedelse, separate grupper på 20 jomfruhunner i et rent lite reagensrør med fin pensel. Plasser røret på is i 5 min til hunnene er bedøvet. Alternativt kan kvinner bedøves og injiseres ved hjelp av CO2.
MERK: Is er å foretrekke som bedøvelse da voksne veps er kaldtolerante og gjenoppretter lett etter injeksjonene. Hunnene kan ta opp mer injisert væske enn puppene: 1 μL oppløsning kan brukes til tre kvinner i stedet for for fire pupper. Forbered volumer deretter. - Forbered en isbøtte, plasser en glasssklie på toppen av isen. Juster hunnene side om side på den kalde sklien med magen vendt opp (Figur 1E) under et dissekeringsomfang.
- Legg en nål med ribonukleoproteinoppløsningen12 ved hjelp av en mikrolastspiss, og sett nålen inn i koblingspakken til aspiratorrørenheten. Støtt hunnene fra motsatt side med stumpe dissekeringsnåler mens de injiserer sakte inn i magen fra den andre siden. Unngå å berøre ovipositoren, dette vil alvorlig skade denne kritiske reproduktive strukturen (Figur 1E).
MERK: Begge retningene er akseptable, avhengig av operatørpreferanse. - Sett forsiktig inn kanylen mellom de 2 og 3 synlige buksegmentene med en vertikal vinkel på ca. 30° (figur 1E). Injiser løsningen i den kvinnelige magen, stopp når ikke mer væske kan komme inn, eller når det observeres lekkasje av overskuddsløsning. Flytt forsiktig til neste veps og gjenta disse trinnene
MERK: Injiser langsomt, la nålen ligge inne i magen i ca. 3 s før du fjerner den veldig sakte. Dette vil bidra til å justere det interne væsketrykket og unngå at oppløsning lekker fra injeksjonsstedet etter at kanylen er fjernet. - Når du er ferdig, overfør forsiktig single injiserte kvinner til et nytt rør med en vert ved hjelp av en pensel. La det komme seg ved romtemperatur i ca. 1 time, bekrefte overlevelse, og returner deretter rørene til oppdrettsinkubatoren.
MERK: Under demonstrasjonen er nålen lastet med BAPC-Cas9-sgRNA rettet mot Nasonia cinnabar gen12.
7. Pleie etter injeksjon og mutantscreening
- Etter voksen eklosjon fra den injiserte puppen, plasser enkeltveps i et glassrør plugget med bomull og sett inn en S. bullata-vert (Figur 1G). I motsetning, plasser injiserte kvinner i individuelle rør med verter umiddelbart etter injeksjon.
- For CRISPR/Cas9 knockout-eksperimenter, la kvinner parasitere vertene i en dag, og erstatte verten hver dag i tre påfølgende dager.
MERK: På grunn av haplodiploid sexbestemmelsessystemet i N. vitripennis16, jomfruhunner vil produsere haploide mannlige brød, noe som letter påvisning av mutasjoner. For knockdown via RNAi av mannsspesifikke gener, kan de injiserte individer enkeltvis parres med ville type individer og få lov til å parasitere verter. Bruk én vert per dag, og erstatt vertene basert på det eksperimentelle oppsettet. - Plasser de parasitererte vertene ved 25 °C til fremveksten av G0 mannlige avkom (i ~ 13-14 dager).
- Under et dissekerende mikroskop, skjerm G0 menn for muterte fenotyper. Cinnabar genet er ansvarlig for øyepigmentering12: hvepe med brune øyne er vill type, og hvepe med lyse røde øyne eller variasjoner mellom røde og brune øyne er mutanter (Figur 1H).
8. Etterinjeksjonskryss og oppdrett
- Plasser alle mutant G0 menn med røde øyne (fenotypisk forstyrret cinnabar12gen) med vill type jomfruhunner i 1-2 dager (Figur 2A).
MERK: Hvis det forstyrrede genet ikke gir en synlig fenotype, er polymerasekjedereaksjon (PCR) etterfulgt av sekvensering av målgenet nødvendig for å identifisere mutantdyrene. Før du får DNA fra G0 menn for PCR, ville det være ideelt å mate dem med vill type jomfruhunner. Alternativt kan du trekke ut DNA fra et ben av en G0-mann for å identifisere mutanter, og mate bare de med verifiserte mutasjoner. - Tilsett to S. bullata verter per kvinne, og la til oviposit ved 25 °C og 30 % relativ fuktighet med en 12:12 lys-mørk syklus. Bytt ut vertene hver 2-3 dager.
- Oppbevar parasitererte verter ved 25 °C og 30 % relativ fuktighet, med en 12:12 lys mørk syklus i ca. 10 dager.
- Etter ~ 10 dager åpner du den parasitererte verten med en dissekeringsnål, og fjerner hver N. vitripennis pupa fra verten.
- Ved hjelp av en fin-tip pensel, velg kvinnelig pupper (Figur 1A).
MERK: Hunnene er diploide og heterozygote, og dermed vil øyenfargen være vill type.
- Plasser 15-20 kvinnelige pupper i glassrør ved 25 °C til fremveksten. Etter fremveksten, legg til ~ 20 S. bullata verter og la jomfru G1 kvinner parasitere vertene i 2-3 dager.
MERK: Disse hunnene vil produsere 50% G2 mutant menn.- Oppbevar parasitererte verter ved 25 °C og 30 % relativ fuktighet, med en 12:12 lys mørk syklus til G2 mannlig voksen fremvekst.
- Plasser de resterende G1-puppene ved 5 °C i 8-10 dager . Etter denne perioden fjerner du dem og plasserer dem ved 25 °C og 30 % relativ fuktighet, med en 12:12 lys mørk syklus til fremveksten (Figur 2A).
- Etter fremveksten av G2-hannene i trinn 8.3.1, skjerm for tilstedeværelse av rødøyet mutantfenotype. Ved hjelp av en fin-tip pensel, skille rødøyne menn fra vill type menn.
MERK: Tilstedeværelsen av rødøyde veps i denne generasjonen (G2, figur 2A) indikerer at genredigering skjedde i bakterien, og at mutasjonen er arvelig. - Plasser rødøyne menn med G1-hunnene nylig dukket opp i trinn 8.3.2 (Figur 2A), og la dem mate i 1-2 dager. Tilsett 2 S. bullata verter per kvinne, og plasser dem ved 25 °C og 30 % relativ fuktighet med en 12:12 lys-mørk syklus i 10-11 dager.
- Etter 10-11 dager åpner du den parasitererte verten med en dissekeringsnål, og fjerner hver N. vitripennis pupa fra verten (Figur 2A).
- Ved hjelp av en fin-tip pensel, skille rødøyde veps (menn og kvinner) fra vill type (Figur 1H). Fortsett oppdrett av rødøyde hvepe sammen i glassrør, og bland ikke med de ville vepsene.
MERK: På dette stadiet (G3, figur 2A),bærer haploide hanner og diploide kvinner og viser fenotyper for cinnabarmutasjonene. Hvis det berørte genet koder for en usynlig fenotype, kryss G0 mann entall med en vill type kvinne i ~ 1 dag. Fjern deretter hanen for molekylær karakterisering av mutasjonen ved PCR og sekvensering, og la kvinnen parasitere en vert. Fortsett kryssingsordningen bare med avkom av en bekreftet mutant mann (Figur 2B). Hvis målet er knockdown av RNAi av et kandidatgen, utfør ønsket funksjonell analyse (for eksempel dødelighet, sterilitet eller diapause induksjonsanalyse3,7) direkte ved hjelp av personer injisert med dsRNA. Siden RNAi er forbigående, er det ikke mulig å generere en koloni med ønsket fenotype (Figur 2C)3,7.
Figur 1: Tidslinje for pupal og voksen Nasonia vitripennis mikroinjeksjon. (A) Mannlige og kvinnelige hvite (øverst) og svarte (nederste) pupper samles, (B-C) justeres og limes til et glasssklie for injeksjon. (D) Kapillærnålen er klargjort og åpnet, og skyver den på to overlappende lysbilder. (E) Nålen er festet enten til Femtojet (øverst) eller til et aspiratorrør (nederst) for injeksjoner. (F) Den injiserte puppen på gliden overføres til en Petri-tallerken med et vått vev på bunnen for å holde fuktigheten. Ved fremveksten plasseres kvinner (G) entall i små glassrør og får lov til å oviposit på Sarcophaga pupa. (H) Screening av avkom for å oppdage mutanter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kryssing av ordningen etter injeksjon. Skjematisk representasjon av kryssingsskjemaprosedyre ved CRISPR/Cas9-mediert genredigering av gener (A) som induserer en synlig fenotype og (B) som ikke gir synlig fenotype. (C) Skjematisk representasjon av RNAi screening prosedyre. Forkortelser: cin = cinnabar; PCR = polymerase kjedereaksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette papiret presenterer to enkle metoder for pupal og voksen mikroinjeksjon, enten ved hjelp av en femtojet eller et aspiratorrør. Den første metoden tillater en mer presis injeksjon av væske, noe som er viktig for RNAi-konsistens, mens den andre tillater injeksjon av større mengder væske i Nasonia-pupper eller voksne.
Representative resultater presentert i tabell 1 viser god overlevelsesrate (fra 20 % til 89 %) og effektivitet for å få ønsket fenotype (enten knockdown via RNAi eller genredigering via CRISPR) ved hjelp av injeksjonsmetodene beskrevet her uten å kreve arbeidskrevende egginjeksjoner.
| stadium | Reagent | Konsentrasjon ng/μL (Protein/gRNA eller dsRNA) | N Injisert | N Overlevelse (%) | Injiserte individer som legger avkom | Injiserte individer som produserer avkom med fenotyper | Avkom som viser knockdown/ knockout fenotyper | ||||
| N | % | N | % av den totale injiserte | % av individer som produserer avkom | N | Mutanter/injisert pupper eller voksen | |||||
| Hvit pupper | dsRNA* | 3000-4000 | 80 | 69 (86%) | 69 | 100% | 45 | 56% | 65% | 1263 | Na |
| Svart pupper | Cas9 | 2903/2741 | 39 | 34 (87%) | 19 | 49% | 2 | 5% | 11% | 2 | 0.05 |
| P2C-CAS9-EGFP** | 454/227 | 40 | 6 (15%) | 2 | 5% | 1 | 3% | 50% | 3 | 0.08 | |
| P2C-Cas9 | 725/750 | 28 | 28 (100%) | 16 | 57% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 500/200 | 20 | 11 (55%) | 9 | 45% | 3 | 15% | 33% | 5 | 0.25 | |
| BAPC | 400/600 | 20 | 17 (85%) | 10 | 50% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 360/360 | 20 | 16 (80%) | 16 | 80% | 2 | 10% | 13% | 3 | 0.15 | |
| 24 h-48-h-gammel voksen | Cas9 | 2769/3290 | 11 | 10 (90%) | 1 | 9% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 |
| P2C-CAS9-EGFP | 454/227 | 34 | 30 (89%) | 12 | 35% | 3 | 9% | 25% | 3 | 0.06 | |
| P2C-Cas9 | 2903/3076 | 36 | 36 (100%) | 17 | 47% | 4 | 11% | 24% | 4 | 0.05 | |
| *RNAi eksperimenter ble utført på menn som deretter ble parret til ikke-injiserte wildtype kvinner. Derfor reperesent antall kryss som produserte avkom og de som produserte fenotyper. | |||||||||||
| ** Aller første injeksjon på pupper av forfatterne. Forkortelser: dsRNA = dobbeltstrenget RNA; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; BAPC = forgrenede amfifile peptidkapsler. | |||||||||||
Tabell 1: Overlevelses- og effektivitetsgraden til RNAi og CRISPR/Cas9 via pupal- og vokseninjeksjoner. Effektivitet i RNAi eksperimenter representerer effektivitet i knockdown av genet av interesse, og gir en målbar effekt som sexforhold forvrengning3. For CRISPR/Cas9 representerer effektivitet antall injiserte kvinner som produserer mutantavkom. Forkortelser: dsRNA = dobbeltstrenget RNA; gRNA = guide RNA; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; BAPC = forgrenede amfifile peptidkapsler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den nylig økte bruken av Nasonia vitripennis som modellorganisme for ulike biologiske spørsmål2,3,7,17, er det behov for å utvikle og optimalisere injeksjonsmetoder for å muliggjøre en forenklet og effektiv protokoll for funksjonell analyse av N. vitripennis gener. De nåværende metodene som involverer embryonal mikroinjeksjon av genredigeringsreagenser er utfordrende13, som krever spesialisert utstyr og høyt utdannet personell. For å gjøre genredigeringsteknologi mer tilgjengelig for ikke-spesialiserte laboratorier, er det derfor viktig å utvikle alternative leveringsmetoder for CRISPR-reagenser. Derfor, demonstrert her er en detaljert visuell teknikk som beskriver to alternative injeksjon prosedyrer for å tillate levering av redigering reagenser (CRISPR / Cas9 eller dsRNA) i insekt hemolymph og eggstokkene.
Injeksjon av dsRNA i insektet hemocoel er en vanlig tilnærming for å levere dsRNA i ulike arter av leddyr18,19,20,21,22. Det er også effektivt i N. vitripennis når det brukes i hvite pupper, som rapportert tidligere3,7. CRISPR/Cas9-metoder for germline insektmutagenese er nesten utelukkende avhengige av embryonale mikroinjeksjoner. Få vellykkede eksperimenter som leverer CRISPR-reagenser i nymfer eller voksne har blitt rapportert12,23,24,25,26,27. Samlet sett tilbyr metodene beskrevet her en rekke betydelige fordeler med hensyn til eksisterende metoder13. For det første muliggjør de injeksjon av flere utviklingsstadier av N. vitripennis hvepe: hvit, svart pupper og voksne. I tillegg tillater injeksjon i hemolymfen enten knockdown via RNAi eller germline genredigering via CRISPR, omgå embryonale mikroinjeksjoner.
Det første trinnet i denne protokollen er å bestemme og screene Nasonia veps for riktig utviklingsstadium basert på den funksjonelle testen av interesse (f.eks. genomredigering, RNAi). Det er viktig å bli vant til å identifisere begge kjønn i hvite og mørke pupper og voksne. N. vitripennis kvinner legger opp til femti egg i puppetuiet av blowfly, S. bullata, og vepspuppene kan enkelt samles og screenes i store mengder, fra den hvite scenen. I tillegg gjør muligheten for å lagre pupper på forskjellige stadier for å bremse utviklingshastigheten i uker ved 5 °C systemet svært fleksibelt når det gjelder tid og organisasjon9.
Overlevelsen av pupper og voksne etter injeksjon er et aspekt som må optimaliseres av brukerne. For eksempel, i denne protokollen, den første injeksjonen av CRISPR / Cas9 reagenser i pupper påvirket overlevelse dramatisk (15%) sammenlignet med overlevelsen til injiserte voksne (90%). Men i den andre økten økte overlevelsen av pupper opptil 60%. Etter flere injeksjonsøkter var det mulig å opprettholde en lignende overlevelse (80% -100%) etter injeksjon av pupper eller voksne. Faktisk kan overlevelse etter injeksjon forbedres hvis parametere knyttet til å justere vepsene, velge riktig blenderåpning for nålen, og unngå piercing eller stikke vepsene med nålen er optimalisert.
Å justere og forberede pupper og kvinner til injeksjonsvæsker, basert på protokollen som presenteres her, kan redusere dødeligheten. Videre kan metoden som presenteres for å justere immobile pupper ved å lime dem til lysbildet lette injeksjonsprosessen, fordi den forhindrer dem i å bevege seg under injeksjonen. Dermed kan pupper injiseres veldig raskt, overvinne den tidkrevende naturen til trinnene som er involvert i embryonale mikroinjeksjoner. I tillegg, som injeksjoner kan gjøres med en munnaspirator, er det ikke nødvendig med spesialisert utstyr for å utføre genredigeringshendelser. Denne teknikken krever imidlertid at vepsene plasseres i tide på limet; Ellers vil de ikke være ordentlig festet og vil gli av fra lysbildet under nåleinnsettingen. Dette kan korrigeres etter flere justeringsforsøk.
Voksne kan ikke justeres ved hjelp av denne metoden fordi de kan bevege magen og bena; Derfor må de bedøves. Den foretrukne metoden for valg i denne protokollen innebærer å plassere røret som inneholder vepsene i is i ~ 5 minutter til vepsene er slått ned, og deretter overføre dem i grupper til en forhåndskjølt lysbilde på is. Denne metoden tillater justering og tilberedning av vepsene til injeksjon i grupper på 10-15 veps vendt oppover, med en ny Petri-tallerken som inneholder is for hver nye injeksjonsgruppe. Forebygging av issmelting under injeksjonen vil bidra til å holde skredet stabilt og redusere risikoen for å bryte nålene eller drepe vepsene ved et uhell. Dette trinnet kan forbedres ved å bruke et kjølebord, hvis tilgjengelig.
Alternativt kan CO2-pads brukes til å bedøve vepsene. For å gjøre dette vil det være nødvendig å optimalisere eksponeringstiden for CO2 under injeksjon og for å bestemme effekten av CO2-eksponering på overlevelse og fruktbarhet, som rapportert tidligere for andre arter18. Et ekstra hinder ved injeksjon av voksne er avhengig av metoden som brukes til å holde bedøvet veps til injeksjon. En stump spiss gjenstand som kan holde vepsen uten risiko for piercing eller stikking, er mest egnet. Generelt fungerer disseksjonsnåler eller stumpe tang godt.
Etter at justeringen og riktig oppbevaring av vepsene er mestret, kan injeksjonsprosessen fortsette veldig raskt. Pupae og voksne injeksjoner kan injiseres med løsningsvolumer i området hundrevis av nanoliter, noe som letter forberedelsen ved forskjellige konsentrasjoner basert på brukerens preferanse. Det er imidlertid viktig å bruke riktige nåler for å injisere riktig mengde væske uten risiko for å skade og drepe vepsen. Generelt er svært lange nåler med svært små blenderåpninger bedre fordi de forårsaker mindre fysisk skade på puppens underliv. Videre er strømmen av væsken langsom, unngår store endringer i trykket og viktigst, og forhindrer lekkasje av løsningen gjennom hullet skapt av nålen.
Ulempene med en liten blenderåpning er at nålene lett kan bryte når de berører vepsens harde eksoskjelett og kan også bli tilstoppet med materialet fra innsiden av magen. Derfor fungerer små blendernåler veldig bra ved hjelp av en femtojet eller et nanoprosjekt, og deres bruk krever stor forsiktighet for å unngå å bryte dem. Disse nålene er ikke egnet for en munnaspirator fordi det er svært vanskelig å injisere væske med munnen gjennom en liten blenderåpning. For denne metoden krever den ideelle nålen den minimale blenderåpningen som gjør at løsningen kan strømme jevnt samtidig som skaden som kan forårsakes av en stor blenderåpning nål. Igjen må dette aspektet optimaliseres av brukerne. I alle fall vil endring av nålen ofte bidra til å unngå tilstopping og skade spissen som vil redusere overlevelsen og effektiviteten.
I N. vitripennis kan ethvert sted i magen brukes til å levere reagenser i hemolymfen. Det må imidlertid utvises ekstra forsiktighet for å unngå skade på vepsens ovipositor, da dette brukes til fôring og egglegging. For både pupper og voksne har immobiliseringsteknikker blitt foreslått i denne protokollen for å tillate injeksjon vekk fra ovipositoren, hovedsakelig i ventralområdet mot den fremre delen av magen. I tillegg, hos voksne, kan dette også oppnås ved å injisere på sidene eller i dorsalområdet. Justeringsmetoden for pupper som er beskrevet her, kan lette sideinjeksjonen, men ikke dorsal. I alle fall er innsats for å forhindre piercing andre kroppsdeler eller skade magen en prioritet.
Når nålen er satt inn, skal væskens strøm være langsom og konstant. Femtojet tillater dette enkelt, selv om trykket kanskje må justeres for hver nål. Ved bruk av munnaspirator bør injeksjon av store mengder væske for fort unngås fordi dette kan føre til at den lekker gjennom poren på injeksjonen. Faktisk, i tillegg til å observere magen hevelse med væske, er lekkasje et tegn på å stoppe en injeksjon. Etter at injeksjonen er ferdig, må de voksne vepsene stå på lysbildet til de gjenoppretter og deretter overføres til et rør med verter.
Systemene som presenteres her kan enkelt tilpasses andre insektarter som er spesielt utfordrende for eggmikroinjeksjoner. For eksempel legger mange parasitoidveps egg i andre insektslarver. Egg er derfor umulig å nå og injisere i disse artene. Eggene av andre skadedyrsarter, som den asiatiske sitruspsyllid diaphorina citri, er også svært vanskelig å nå til injeksjon fordi de er festet til planten der de legges. En nylig rapport antyder at BAPC kan brukes til CRISPR genredigering i den asiatiske sitrus psyllid, D. citri27. På samme måte ble P2C-mediert levering av proteinet, mCherry, oppnådd i eggstokkene til denne arten28, noe som tyder på at disse injeksjonsteknikkene beskrevet her kan lette implementeringen av RNAi og CRISPR i et bredt spekter av skadedyrsarter og bidra til å designe kontrollstrategier som bidrar til å forhindre avlingsskaden forbundet med dem.
Implementeringen i andre arter krever optimalisering basert på livssyklusen til arten av interesse. For eksempel er det viktig å etablere riktig injeksjonsstadium også basert på den funksjonelle testen av interesse. For levering av CRISPR/Cas9 til eggstokkene er det derfor viktig å vite når vitellogenesis er aktiv for å tillate opptak av genredigeringsreagensene av eggstokkene24,25,26,27,28. For en effektiv knockdown er det derimot viktig å vite når genet uttrykkes og fungerer. Fremtidig implementering av disse injeksjonsteknikkene kan innebære levering av ulike typer nukleinsyrer, som plasmid DNA, i insekt hemolymf og eggstokkene. Dette gjør det mulig å fremme forbigående uttrykk for gener tilstede i plasmid-DNA. I tillegg kan kombinasjon av CRISPR/Cas-reagens med et mal-DNA bidra til å formidle transgenese via homologistyrt reparasjon (HDR) eller indusere en transposonmediert transgenese, omgå embryonal mikroinjeksjon. Til slutt kan denne forbedrede teknikken brukes til å generere mange typer funksjonell analyse, for eksempel knockdown via RNAi, induksjon av mutasjoner, slettinger og muligens til og med transgene innsettinger for å generere transgene N. vitripennis, som forbinder transposoner med BAPC, som i stor grad bør akselerere funksjonell forskning i denne organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JLR og DCR har søkt om foreløpig patentbeskyttelse på ReMOT Control-teknologi. O.S.A er grunnlegger av Agragene, Inc., har en eierandel, og sitter i selskapets Scientific Advisory Board. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av UCSDs oppstartsfond rettet mot O.S.A. og NSF/BIO grant 1645331 til J.L.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
