Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61892
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2Department of Entomology, The Center for Infectious Disease Dynamics, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.

Abstract

צרעת התכשיטים, נסוניה ויטריפניס, הפכה למערכת מודל יעילה לחקר אפיגנטיקה של קביעת מין haplo-diploid, ביולוגיה של כרומוזום B, אינטראקציות מארח סימביונט, דגימה, סינתזת ארס. למרות הזמינות של מספר כלים מולקולריים, כולל CRISPR /Cas9, מחקרים גנטיים תפקודיים עדיין מוגבלים באורגניזם זה. המגבלה העיקרית של יישום טכנולוגיית CRISPR/Cas9 ב- N. vitripennis נובעת מהאתגרים של מיקרו-אינג'ים עובריים. זריקות של עוברים קשות במיוחד באורגניזם זה ובכלל בצרעות טפיליות רבות, בשל גודל עובר קטן והדרישה של גולם מארח להתפתחות עוברית. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, Cas9 ribonucleoprotein משלוח מורכב לתוך השחלות הנשיות על ידי הזרקת מבוגרים, ולא microinjection עוברי, היה אופטימיזציה, וכתוצאה מכך הן עריכות נבט סומטי תורשה. הליכי ההזרקה היו אופטימיזציה של גורים וצרעות נקבה באמצעות בקרת ReMOT (טרנסדוקציה השחלות בתיווך קולטן של מטען) או BAPC (קפסולות פפטיד אמפיפיליות מסועפות). שיטות אלה מוצגות כאלטרנטיבות יעילות להזרקת עוברים, המאפשרות מוטציות חיידקים ספציפיות לאתר ותורמיות.

Introduction

CRISPR / Cas9 עריכת גנים היא טכנולוגיה רבת עוצמה למחקרים גנטיים תפקודיים, במיוחד באורגניזמים מודל עולה רבים כגון צלופת התכשיט, Nasonia vitripennis. קלות ההתרבות והזמינות של גנום שלם הופכים את צלופת התכשיט למערכת ניסיונית חשובה להבהרת המנגנונים המולקולריים של תהליכים ביולוגיים שונים. לדוגמה, N. vitripennis שימש לאחרונה כדי לפענח את הבסיס האפיגנטי של מערכת קביעת מין haplodiploid1,2, הביולוגיה של כרומוזומי B3,4,5,6, ואת הבסיס הגנטי עבור ויסות ביולוגי ועונתי7,8. חלק מהתכונות שהופכות N. vitripennis נוח לעבוד עם כוללים זמן הדור הקצר (~ 2 שבועות ב 25 °C (69 °F), שיעורי רבייה גבוהים, הפרדת מין קלה בשלב pupal, ואת היכולת diapause ולאחסן זנים ב 4 °C (69 °F). מחזור החיים מתחיל עם צרעות נקבה טפילים הגומות של blowfly, סרקופגה bullata. דרך הביצית שלהם, הנקבות מטילות עד 50 ביצים במקרה הפופאלי של הזיוף. ביצים מתפתחות לזחלים הניזונים מגולם S. bullata, ממשיכים להתפתח במהלך הימים הקרובים, ולאחר מכן גור, ואחריו eclosion למבוגרים והופעתו מן puparium המארח9.

כלים מולקולריים לביצוע מחקרים גנטיים תפקודיים ב- N. vitripennis, כגון הפרעות RNA (RNAi)10 ו- CRISPR/Cas911,12, זמינים, אך מוגבלים, בעיקר בשל קשיים בביצוע microinjections עוברי13. כמו N. vitripennis ביצים דורשים מארח pupal לפיתוח, מניפולציה ביצה הוא מאוד מאתגר. יש לאסוף עוברי במה שלפני הפיצוץ מהגלמים המארחים, לעבור במהירות מיקרו-אינג'פקט, ולהעבירם מיד חזרה למארח לפיתוח13. צעדים אלה דורשים דיוק והכשרה מיוחדת כדי למנוע פגיעה בעוברים microinjected או המארחים pupal13. יתר על כן, הביצים קטנות מאוד ושבירות, במיוחד לאחר microinjections, עם ציטופלסמה צמיגה מאוד גורם סתימת מתמשך של מחט הזרקת13. תכונות אלה הופכות את המיקרו-אינג'ים העובריים למאתגרים במיוחד, ודורשים מפעילים מיומנים וציוד מיוחד הנעדר ברוב מעבדות N. vitripennis.

אופטימיזציה של שיטות הזרקה חלופיות לאספקת ריאגנטים CRISPR יתרום לאיחוד של N. vitripennis כאורגניזם מודל. המניפולציה של גולם ומבוגרים היא פחות מאתגרת מאשר מניפולציה עוברים והוא יכול להתבצע עם הגדרת הזרקה בסיסית. כאן מתוארים שני פרוטוקולים להזרקת גלמים ומבוגרים: האחד כולל ציוד מיוחד לזריקות, והשני כולל שימוש במכלול צינור שאיפה המצויד במחט נימי זכוכית. השימוש בצינור שאיפה מתאים במיוחד למעבדות שאין להן גישה לציוד מיוחד למיקרו-אינג'ים של עוברים. זריקות יעילות של שלבים התפתחותיים שונים של N. vitripennis, כולל גולים לבנים או שחורים וצעות למבוגרים, הם הפגינו. צרעות בשלב הגומה הלבנה מתאימות במיוחד לניסויי הפלה בתיווך RNAi. למרות RNAi ב Nasonia תואר לראשונה על ידי לינץ 'ו Desplan בשנת 200610, אין הליך חזותי זמין עבור איך זריקות RNAi מבוצעים. RNAi שימש לאחרונה כדי לגלות את הגן haploidizer של PSR כרומוזום B (יחס מין אבהי)3 וללמוד את המעורבות של גן השעון, נקודה, במקצבים ביולוגיים N. vitripennis 7.

ניתן להשתמש בגולם שחור ובצרעות למבוגרים כדי לגרום לעריכת גנים של נבטים CRISPR/Cas9 באמצעות ReMOT Control (התמרת השחלות בתיווך קולטן של מטען) ופרוטוקולי BAPC (כמוסות פפטיד אמפיפיליות מסועפות). שתי שיטות אלה משלוח השחלות תוארו לאחרונה להיות יעיל Nasonia ליצירת מוטציות נבט בגן היעד, cinnabar7,12. כאן, פרוטוקול פשוט מסופק עבור זריקות כולל הליך חזותי של מתודולוגיה צעד אחר צעד עבור זריקות ומבוגרים כאחד שניתן להשתמש בהם כדי ליצור מחקרים גנטיים תפקודיים Nasonia וסביר צרעות טפיליות אחרות, ללא צורך בציוד מיוחד ועקיפת microinjections עוברי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. גידול נסוניה

  1. הגדר ~ 20 נקבות מזווגות באופן ייחודי במבחנות זכוכית קטנות המחוברות מכותנה.
    הערה: כדי להפחית את שטח גידול, 10 x 85 ס"מ, 4 צינורות מ"ל הם אופטימליים. הנקבות נבדלות בקלות מהזכרים בגלל הכנפיים הגדולות יותר ונוכחותו של הביוביפוסטור(איור 1A). פרוטוקולים מפורטים לגידול N. vitripennis ניתן למצוא גם בספרות אחרת13,14,15.
    1. הוסף שני מארחי S. bullata לכל צינור, ולשמור על הצרעות ב 25 ± 1 °C (60 °F) ו 30% לחות יחסית, עם מחזור 12:12 כהה בהיר במשך 2-3 ימים.
      הערה: צרעות ניתן לשמור בטמפרטורה נמוכה יותר או בטמפרטורת החדר; עם זאת, הפיתוח יואט.
  2. לאחר 2-3 ימים, בעזרת מברשת צבע עדינה, להסיר בעדינות את הנקבות, כדי למנוע oviposition מתמשך אסינכרוני בהתפתחות צאצאים.
    הערה: ניתן לארח מחדש או לאחסן נקבות שהוסרו ב-5°C למשך חודש.
    1. שמור על המארח טפילי ב 25 °C (69 °F) ו 30% לחות יחסית, עם מחזור 12:12 כהה בהיר במשך 7 ימים אם שלב ההזרקה הרצוי דורש גלפה לבנה; במשך 13 ימים אם השלב ההתפתחותי הנדרש הוא גולם שחור; או 14 ימים למבוגרים צעירים שזה עתה יצאו.
      הערה: ניתן גם לאחסן גלפים צהובים ושחורים ב-5 מעלות צלזיוס למשך שבוע. אחסון ארוך יותר יגדיל את תדירות הדיפאוזה בזחלים עבור הדור הבא, מה שהופך את ההקרנה שלאחר ההזרקה והקמת קווי מוטנטים לקשה יותר.
    2. סדקו את הפופאריום המארח עם מחט מנתחת כדי לשחזר את גולם N. vitripennis ומבוגרים בשלב הרצוי(איור 1A).
      הערה: עבור זריקות בגיל מבוגר מסוים או לאיסוף נקבות בתולה, מומלץ להסיר את הגומות הכהות ביום 13 מהמארח, להיפרד על ידי מין, ולאסוף מבוגרים לאחר הופעתה.

2. יישור של גלמי לבן ושחור

  1. הכן שקופית זכוכית על-ידי החלת קו של דבק בית הספר במרכז. מורחים את הדבק עם מחט מנתחת כדי להשיג שכבה עבה (איור 1B), אשר ישמש כדי ליישר את הגומות. תן את הדבק יבש ~ 2 דקות לפני העברת גלם.
    הערה: אל תגזים את הדבק, אחרת גלם לא יהיה מחובר כראוי לשקופית יחליק במהלך הזריקות.
  2. תחת מיקרוסקופ מנתח, באמצעות מחט מנתחת, להחיל דבק על החלק האחורי של הראש של גלם.
  3. חבר את הגום לשכבת הדבק בשקופית כאשר בטנו פונה כלפי מעלה. ישר 20-30 גולם זה לצד זה בשקופית (איור 1C).
    הערה: הימנע מנגיעה בבטן עם הדבק, ולהימנע מהשקעת הגומי בדבק; אחרת, המבוגרים לא יוכלו לצאת.
  4. מניחים את המגלשה עם גלם בצלחת פטרי לתת את הדבק יבש במשך ~ 10 דקות. לפני תחילת הזריקות, לבדוק את הדבקות של גלם לדבק על ידי דחיפת אותם בעדינות עם המחט מנתח. אם רוב הגומים משוחררים, הכינו שקופית חדשה. לחלופין, להסיר את כל הגומי כי הם רופף, ולהמשיך להזריק אלה המחוברים כראוי לשקופית.

3. הכנת מחט

  1. לטעון צינור זכוכית נימי אחד לתוך מושך מחט, ולמשוך מחטים בעקבות הוראות היצרן.
    הערה: P-1000 חוט פלטינה מחט מושך נימי זכוכית אלומיניום סיליקט משמשים הדגמה זו. מדריך הפעולה עבור מכשיר זה (ראה טבלה של חומרים)מסביר כיצד לטעון כראוי צינורות זכוכית נימי ולהגדיר תוכניות על מכשיר זה. השתמש בפרמטרים הבאים (חום: 536; משוך: 80; Vel: 100; עיכוב: 70) על נימי זכוכית אלומיניום סיליקט להזריק גלמי צהוב, גלמי שחור, ומבוגרים.
    בנוסף, P-2000 מחט פולר שימש להכנת מחטי קוורץ בעקבות הפרמטרים (חום: 805; משיכה: 145; Vel: 50; עיכוב: 145). המדריך מספק הוראות לטעינת צינורות קוורץ נימי והתקנת תוכניות במכשיר זה. בהיעדר מושך, זכוכית נימי להתאמה אישית זמינה.
  2. טען את המחט עם 5 μL של תערובת ההזרקה (מוכן מראש בעקבות פרוטוקולים קודמים עבור RNAi10 או CRISPR / Cas9 ריבונוקלאופרוטאין12 (RNP) זריקות N. vitripennis) באמצעות טיפים פיפטה microloader.
    הערה: במהלך ההדגמה, המחט עמוסה RNA דו גדילי (dsRNA) בשילוב עם צבע אדום (ראה טבלה של חומרים)להזרקה של גלמי במה לבנה עם BAPC-Cas9-sgRNA להזרקה של צרעות גלמים שחורים ומבוגרים. ריאגנטים אלה יתמקדו בגן הסינבאר. צרעות כי הם הפילו בהצלחה / החוצה יראה עיניים אדומות במקום עיניים חומות סוג פראי.
  3. פתחו את המחט והחליקו את הקצה על משטח העשוי משתי שקופיות חופפות (איור 1D). לחלופין, פתח את קצה המחט עם זוג מלקחיים עדינים כדי ליצור קצה חד או על ידי חודר לאט את בית החזה או הבטן של הצרעה.

4. הזרקת פופל עם פמטוג'ט

  1. מקם את השקופית עם הגומה המיושרת תחת מיקרוסקופ מנתח. הכנס את המחט לתוך צינור ההזרקה של femtojet ולהדק את ראש האחיזה.
  2. כשמסתכלים על המחט מתחת למיקרוסקופ, מפעילים את הפמטוג'ט ומגדירים פרמטרים של הזרקת מחשב ופיי על ידי סיבוב הידיות הסיבוביות.
    הערה: ערך מחשב של 600 hPa מומלץ עבור זרימה רציפה של הנוזל. ערך המחשב תלוי בפתיחת המחט. עבור מחטים שהוכנו באמצעות הפרמטרים שצוינו P-1000 מחט מושך, ערכי מחשב בין 500 hPa ו 700 hPa לייצר זרימה מתמדת. אם נדרשים ערכים נמוכים יותר של מחשב, הדבר מצביע על כך שהפתח עשוי להיות גדול מדי ועלול לגרום נזק לחרקים, בעוד שערכים גבוהים יותר מצביעים על כך שהמחט עדיין סגורה, או שהפתח קטן מדי.
  3. הכנס בזהירות את המחט בין 2 ל-3 מקטעי הבטן הנראים לעין בזווית אנכית של כ-30°(איור 1E). להזריק עם זרימה רציפה עד הבטן כולה הופך ורוד במקרה של גולם בשלב לבן, או עד הבטן עולה בגודל במקרה של גולם שחור. להפסיק להזריק כאשר ברור כי הבטן לא יכול לקחת עוד נוזלים, או כאשר הנוזל מתחיל לזרום מהגוף. עבור בזהירות אל הגום הבא וחזור על שלבים אלה.
    הערה: הימנע מנגיעה ופגיעה ovipositor עם המחט במהלך ההזרקה.
  4. מעבירים את המגלשה עם הגומי המוזרק לצלחת פטרי המכילה מגבת נייר ספוגה במים שעברו דהיונים לשמירה על לחות. מכסים את המנה במכסה שלה, ומניחים אותה על 25 מעלות צלזיוס עד הופעתה של צרעה(איור 1F).

5. הזרקת פופל עם צינור שאיפה

  1. לחשב את כמות תערובת ההזרקה באמצעות הגורם: 4 גולם מוזרק/1 פתרון μL.
    הערה: זריקה טיפוסית של 20-30 גלמים דורשת ~ 5-8 μL של ריבונוקלאופרוטאין (RNP) תערובת מורכבת-סאפונין או RNP עם BAPC12.
  2. יישרו את הגומי, כפי שהוצע בסעיף 2, והניחו שקופית אחת עם הגומה המיושרת תחת מיקרוסקופ מנתח(איור 1E).
  3. קח את אחת המחטים נימי לשבור את הקצה בין שתי שקופיות זכוכית, כפי שצוין בשלב 3.4 (איור 1D). ודאו שקצה המחט פתוח מספיק כדי לאפשר לפתרון ההזרקה לצאת החוצה על ידי ניפוח אוויר בפה, אך לא פתוח מדי כדי למנוע איבוד נוזלים ופגיעה בשלמות(איור 1E).
    הערה: שלב זה הוא קריטי כי המשתמש ישתמש באוויר מהפה כדי לדחוף את תערובת ההזרקה לתוך hemolymph חרקים. עדיף לתרגל כדי לברר איזה סוג של צמצם מחט הוא אופטימלי עבור הקרביים של תערובת פתרון מסוים. חמש קבוצות של זריקות של 20 גולמים לכל קבוצה עשוי להיות מספיק כדי להתרגל למערכת הזרקת הפה.
  4. לטעון מחט אחת עם פתרון ריבונוקלאופרוטאין12 באמצעות קצה microloading, ולהכניס את המחט לתוך חבילת המחבר של הרכבת צינור השואף.
    הערה: במהלך ההפגנה, המחט עמוסה BAPC-Cas9-sgRNA מיקוד הגן נסוניה cinnabar 12.
  5. הכנס בזהירות את המחט בין 2 ל-3 מקטעי הבטן הנראים לעין בזווית אנכית של כ-30°(איור 1E). להזריק עם זרימה רציפה עד הבטן כולה הופך ורוד במקרה של גולם בשלב לבן או עד הבטן מגדילה את גודל במקרה של גולם שחור. להפסיק להזריק כאשר ברור כי הבטן לא יכול לקחת עוד נוזלים או כאשר הנוזל מתחיל לזרום מהגוף. עבור בזהירות אל הגום הבא וחזור על שלבים אלה
    הערה: הימנע מנגיעה ופגיעה ovipositor עם המחט במהלך ההזרקה.
  6. מעבירים את המגלשה עם הגומי המוזרק לצלחת פטרי המכילה מגבת נייר ספוגה במים שעברו דהיונים לשמירה על לחות. מכסים את המנה במכסה ומניחים אותה על 25 מעלות צלזיוס עד להופעתה של צרעה(איור 1F).

6. הזרקת מבוגרים עם צינור שאיפה

  1. להכנת מבוגרים, קבוצות נפרדות של 20 נקבות בתולה במבחנה קטנה ונקייה עם מכחול דק. מניחים את הצינור על הקרח במשך 5 דקות עד שהנקבות מורדמת. לחלופין, ניתן לרופד ולהזריק נקבות באמצעות CO2.
    הערה: קרח עדיף כמו הרדמה כמו צרעות מבוגרים הם עמידים קר להתאושש בקלות לאחר הזריקות. נקבות יכולות לקחת נוזל מוזרק יותר מאשר גולם: 1 μL של פתרון יכול לשמש שלוש נקבות במקום ארבעה גולמים. הכן אמצעי אחסון בהתאם.
  2. הכינו דלי קרח, מניחים מגלשת זכוכית אחת על הקרח. יישר את הנקבות זו לצד זו בשקופית הקרה כאשר הבטן פונה כלפי מעלה (איור 1E) תחת טווח ניתוח.
  3. לטעון מחט אחת עם פתרון ריבונוקלאופרוטאין12 באמצעות קצה microloading, ולהכניס את המחט לתוך חבילת המחבר של הרכבת צינור השואף. תמיכה הנקבות מהצד הנגדי עם מחטים ניתוח קהה תוך הזרקת לאט לתוך הבטן מהצד השני. הימנע מנגיעה ביציפוסיטור, הדבר יפגע קשות במבנה הרבייה הקריטי הזה (איור 1E).
    הערה: כל כיוון מקובל, בהתאם להעדפת האופרטור.
  4. הכנס בזהירות את המחט בין 2 ל-3 מקטעי הבטן הנראים לעין בזווית אנכית של כ-30°(איור 1E). להזריק את הפתרון לתוך הבטן הנשית, לעצור כאשר אין יותר נוזל יכול להיכנס, או כאשר דליפה של פתרון עודף נצפתה. עבור בזהירות לצפצה הבאה וחזור על שלבים אלה
    הערה: להזריק לאט, משאיר את המחט בתוך הבטן במשך כ 3 שניות לפני הסרתו לאט מאוד. זה יעזור להתאים את הלחץ הנוזלי הפנימי ולמנוע דליפת פתרון מאתר ההזרקה לאחר הסרת מחט.
  5. בסיום, מעבירים בעדינות נקבות מוזרקות בודדות לצינור חדש עם מארח אחד באמצעות מברשת צבע. השאירו להתאושש בטמפרטורת החדר כ 1 שעות, המאשר הישרדות, ולאחר מכן להחזיר את הצינורות לחממה גידול.
    הערה: במהלך ההפגנה, המחט עמוסה BAPC-Cas9-sgRNA מיקוד הגן נסוניה cinnabar 12.

7. טיפול לאחר הזרקה והקרנת מוטנטים

  1. לאחר הרחקת מבוגרים מהגומה המוזרקת, הניחו צרעות בודדות בצינור זכוכית המחובר מכותנה והכניסו מארח S. bullata אחד(איור 1G). לעומת זאת, המקום הזריק נקבות בצינורות בודדים עם מארחים מיד לאחר ההזרקה.
  2. לניסויי נוקאאוט CRISPR/Cas9, אפשרו לנקבות לשתק את המארחים ליום אחד, ולהחליף את המארח בכל יום במשך שלושה ימים רצופים.
    הערה: בשל מערכת קביעת מין haplodiploid ב N. vitripennis16, נקבות בתולה ייצרו broods זכר haploid, אשר מקל על גילוי מוטציות. להפלה באמצעות RNAi של גנים ספציפיים לגברים, אנשים מוזרקים יכולים להיות מזדווגים באופן ייחודי עם אנשים מסוג פראי מותר טפיל מארחים. השתמש במחשב מארח אחד ביום והחלף את המחשבים המארחים בהתבסס על ההתקנה הניסיונית.
  3. מניחים את המארחים טפילי ב 25 מעלות צלזיוס עד הופעתה של צאצאי זכר G0 (במשך ~ 13-14 ימים).
  4. תחת מיקרוסקופ מנתח, זכרי מסך G0 עבור פנוטיפים שעברו מוטציה. גן הסינאבר אחראי לפיגמנטציה של העיניים12: צרעות עם עיניים חומות הן מסוג פראי, וצרות עם עיניים אדומות בוהקות או וריאציות בין עיניים אדומות לחומות הן מוטציות(איור 1H).

8. לאחר הזרקה צלבים וגידול

  1. מניחים את כל זכרי G0 המוטנטים בעיניים אדומות (הגן cinnabar12משובש פנוטיפית) עם נקבות בתולות מסוג בר למשך 1-2 ימים(איור 2A).
    הערה: אם הגן המשובש אינו מעניק פנוטיפ גלוי, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ואחריה רצף של גן היעד נדרשת כדי לזהות את בעלי החיים המוטנטים. לפני קבלת ה-DNA מזכרים G0 עבור PCR, זה יהיה אידיאלי להזדווג איתם עם נקבות בתולה סוג פראי. לחלופין, יש לחלץ דנ"א מרגל של זכר G0 כדי לזהות מוטנטים, ולהזדווג רק עם מוטציות מאומתות.
  2. הוסף שני מארחי S. bullata לנקבה, ולאפשר oviposit ב 25 °C (69 °F) ו 30% לחות יחסית עם מחזור 12:12 כהה בהיר. החלף את המארחים כל 2-3 ימים.
    1. אחסן מארחים טפיליים ב 25 °C (60 °F) ו 30% לחות יחסית, עם מחזור 12:12 כהה בהיר במשך ~ 10 ימים.
    2. לאחר ~ 10 ימים, לפצח לפתוח את המארח טפיל עם מחט לנתח, ולהסיר כל גולם N. vitripennis מהמארח.
    3. בעזרת מברשת צבע עדינה, בחרו גולם נשי (איור 1A).
      הערה: הנקבות הן דיפלואידיות והטרוזיגניות, ולכן צבע העיניים יהיה פראי.
  3. מניחים 15-20 גלמים נקבה בצינורות זכוכית ב 25 מעלות צלזיוס עד הופעתה. לאחר הופעתה, להוסיף ~ 20 S. bullata המארחים ולתת את הנקבות G1 בתולה טפיל המארחים במשך 2-3 ימים.
    הערה: נקבות אלה ייצרו 50% זכרים מוטנטים G2.
    1. יש לאחסן מארחים טפיליים ב-25°C ו-30% לחות יחסית, עם מחזור של 12:12 בהיר-כהה עד להופעת זכר G2.
    2. מניחים את גלמי G1 הנותרים ב 5 מעלות צלזיוס במשך 8-10 ימים. לאחר תקופה זו, הסר אותם והנח אותם ב 25 °C (70 °F) ו 30% לחות יחסית, עם מחזור 12:12 כהה בהיר עד הופעתה (איור 2A).
  4. לאחר הופעתם של זכרי G2 בשלב 8.3.1, מסך לנוכחות של פנוטיפ מוטציה עיניים אדומות. בעזרת מברשת צבע עדינה, נפרדים זכרים אדומי עיניים מזכרים מסוג פראי.
    הערה: נוכחותן של צרעות אדומות עיניים בדור זה (G2, איור 2A)מצביעה על כך שעריכת גנים התרחשה בחיידק, ושהמוטציה היא תורשתית.
  5. הניחו זכרים אדומי עיניים עם נקבות ה-G1 שהתגלו לאחרונה בשלב 8.3.2(איור 2A),ותנו להם להזדווג במשך יום-יומיים. הוסף 2 מארחי בולטה S. לנקבה, ומניחים אותם ב 25 °C (60 °F) ו 30% לחות יחסית עם מחזור 12:12 כהה בהיר במשך 10-11 ימים.
    1. לאחר 10-11 ימים, פתחו את המארח הטפילי במחט מנתחת, והוציאו כל גולם של N. vitripennis מהמארח(איור 2A).
    2. בעזרת מברשת צבע עדינה, צרעות נפרדות אדומות עיניים (זכרים ונקבות) מסוג פראי (איור 1H). ממשיכים לגדל צרעות אדומות עיניים יחד בצינורות זכוכית, ואינם מתערבבים עם צרעות מסוג בר.
      הערה: בשלב זה (G3, איור 2A), זכרים הפלואידים ונקבות דיפלואידיות נושאים ומראים פנוטיפים למוטציות הסינבאר. אם הגן המושפע מקודד פנוטיפ בלתי נראה, לחצות זכר G0 באופן ייחודי עם נקבה אחת סוג פראי במשך ~ 1 יום. לאחר מכן, להסיר את הזכר עבור אפיון מולקולרי של המוטציה על ידי PCR רצף, ולתת לנקבה טפילים מארח. המשיכו את תוכנית המעבר רק עם צאצאיו של זכר מוטנט מאושר(איור 2B). אם המטרה היא הפלה על ידי RNAi של גן מועמד, לבצע את הבדיקה התפקודית הרצויה (כגון קטלניות, סטריליות, או בדיקת אינדוקציה diapause3,7) ישירות באמצעות אנשים מוזרקים עם dsRNA. מכיוון ש-RNAi הוא ארעי, לא ניתן ליצור מושבה עם הפנוטיפ הרצוי (איור 2C)3,7.

Figure 1
איור 1: ציר זמן למיקרו-injection של סופאל ומבוגרת של נסוניה ויטריפניס. (A) גלמים לבנים (עליונים) ושחורים (תחתונים) נאספים, (B-C) מיושרים ומודבקים לשקופית זכוכית להזרקה. (D)מחט נימי מוכן ונפתח, מחליק אותו על שתי שקופיות חופפות. (E)מחט מחוברת גם Femtojet (למעלה) או צינור שאיפה (למטה) עבור זריקות. (ו)הגומי המוזרק על המגלשה מועברים לצלחת פטרי עם רקמה רטובה בתחתית כדי לשמור על לחות. עם הופעתן,(G)הנקבות ממוקמות באופן ייחודי בצינורות זכוכית קטנים ומורשים לביזיפוסיט על גלם סרקופגה. (ח)הקרנת הצאצאים לגילוי מוטנטים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ערכת חצייה לאחר ההזרקה. ייצוג סכמטי של הליך ערכת חצייה במקרה של עריכת גנים בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים (A) שגורמים לפניוטיפ גלוי ו- (B) שאינם מעניקים פנוטיפ גלוי. (ג) ייצוג סכמטי של הליך סינון RNAi. קיצורים: cin = סינבאר; PCR = תגובת שרשרת פולימראז. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נייר זה מציג שתי שיטות קלות עבור pupal ו microinjection למבוגרים, או באמצעות femtojet או צינור שאיפה. השיטה הראשונה מאפשרת הזרקה מדויקת יותר של נוזל, אשר חשוב עבור עקביות RNAi, ואילו השני מאפשר הזרקה של כמויות גדולות יותר של נוזל לתוך גולם Nasonia או מבוגרים.

תוצאות מייצגות המוצגות בטבלה 1 מראות שיעורי הישרדות טובים (מ-20% ל-89%) ויעילות של קבלת פנוטיפ הרצוי (או להפיל באמצעות RNAi או עריכת גנים באמצעות CRISPR) באמצעות שיטות ההזרקה המתוארות כאן ללא צורך זריקות ביצה מייגעות.

במה מגיב ריכוז ng/μL (חלבון/gRNA או dsRNA) N מוזרק N הישרדות (%) אנשים מוזרקים מניחים צאצאים אנשים מוזרקים המייצרים צאצאים עם פנוטיפים צאצאים המציגים פנוטיפים של נוקאאוט/נוקאאוט
 N % N % מתוך הסכום הכולל שהוזרק % מאנשים המייצרים צאצאים N מוטנטים / גולם מוזרק או מבוגר
גולם לבן dsRNA* 3000-4000 80 69 (86%) 69 100% 45 56% 65% 1263 נה
גולם שחור קסי9 2903/2741 39 34 (87%) 19 49% 2 5% 11% 2 0.05
P2C-CAS9-EGFP** 454/227 40 6 (15%) 2 5% 1 3% 50% 3 0.08
P2C-Cas9 725/750 28 28 (100%) 16 57% 0 0% 0% 0 0.00
תואר ראשון 500/200 20 11 (55%) 9 45% 3 15% 33% 5 0.25
תואר ראשון 400/600 20 17 (85%) 10 50% 0 0% 0% 0 0.00
תואר ראשון 360/360 20 16 (80%) 16 80% 2 10% 13% 3 0.15
מבוגר בן 24 שעות-48 שעות קסי9 2769/3290 11 10 (90%) 1 9% 0 0% 0% 0 0.00
P2C-CAS9-EGFP 454/227 34 30 (89%) 12 35% 3 9% 25% 3 0.06
P2C-Cas9 2903/3076 36 36 (100%) 17 47% 4 11% 24% 4 0.05
*ניסויי RNAi בוצעו על זכרים שהזדווגו לאחר מכן לנקבות בר שאינן מוזרקות. לכן המספרים חוזרים על מספר הצלבים שיצרו צאצאים ואלה שיצרו פנוטיפים.
** זריקה ראשונה על גולם על ידי המחברים. קיצורים: dsRNA = RNA דו-גדילי; EGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; BAPC = כמוסות פפטיד אמפיפיליות מסועפות.

טבלה 1: שיעור הישרדות ויעילות של RNAi ו- CRISPR/Cas9 באמצעות זריקות פופל ומבוגרים. יעילות בניסויי RNAi מייצגת יעילות בהפלת גן העניין, ומעניקה אפקט מדיד כגון עיוות יחס מין3. עבור CRISPR/Cas9, היעילות מייצגת את מספר הנקבות המוזרקות המייצרות צאצאי מוטנטים. קיצורים: dsRNA = RNA דו-גדילי; gRNA = מדריך RNA; EGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; BAPC = כמוסות פפטיד אמפיפיליות מסועפות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עם השימוש המוגבר האחרון של Nasonia vitripennis כאורגניזם מודל לשאלות ביולוגיות שונות2,3,7,17, יש צורך לפתח ולייעל שיטות הזרקה כדי לאפשר פרוטוקול פשוט ויעיל לניתוח תפקודי של N. vitripennis גנים. השיטות הנוכחיות הכרוכות במיקרו-אינג'ינג עוברי של ריאגנטים לעריכת גנים מאתגרות13, הדורשות ציוד מיוחד וכוח אדם מיומן מאוד. לכן, כדי להפוך את טכנולוגיית עריכת הגנים לנגישה יותר למעבדות שאינן מתמחות, חיוני לפתח גישות אספקה חלופיות של ריאגנטים CRISPR. לכן, הוכח כאן היא טכניקה חזותית מפורטת המתארת שני הליכי הזרקה חלופיים כדי לאפשר משלוח של ריאגנטים עריכה (CRISPR / Cas9 או dsRNA) לתוך hemolymph חרקים ושחלות.

הזרקת dsRNA לתוך המוקול חרקים היא גישה נפוצה להעברת dsRNA במינים שונים של פרוקירגליים 18,19,20,21,22. זה גם יעיל N. vitripennis כאשר נעשה שימוש בגאולים לבנים, כפי שדווח בעבר3,7. שיטות CRISPR/Cas9 עבור mutagenesis חרקים נבט להסתמך כמעט אך ורק על microinjections עוברי. ניסויים מוצלחים מעטים אספקת ריאגנטים CRISPR לתוך נימפות או מבוגרים דווחו12,23,24,25,26,27. בסך הכל, השיטות המתוארות כאן מציעות מספר יתרונות משמעותיים ביחס לשיטותהקיימות 13. ראשית, הם מאפשרים הזרקה של מספר שלבים התפתחותיים של צרעות N. vitripennis: לבן, גולם שחור, ומבוגרים. בנוסף, הזרקה לתוך hemolymph מאפשר גם להפיל באמצעות RNAi או עריכת גנים נבט באמצעות CRISPR, עקיפת microinjections עוברי.

השלב הראשון בפרוטוקול זה הוא לקבוע ולסנן צרעות נסוניה לשלב ההתפתחותי הנכון בהתבסס על הבדיקה הפונקציונלית של עניין (למשל, עריכת גנום, RNAi). חשוב להתרגל לזיהוי שני המינים בשלם לבן וכהה ומבוגרים. N. נקבות vitripennis להטיל עד חמישים ביצים במקרה pupal של blowfly, S. bullata, ואת גלמי צרעה ניתן לאסוף בקלות מוקרן במספרים גדולים, החל מן הבמה הלבנה. בנוסף, האפשרות לאחסן גולם בשלבים שונים כדי להאט את קצב הפיתוח במשך שבועות ב 5 מעלות צלזיוס עושה את המערכת גמישה מאוד במונחים של זמן וארגון9.

ההישרדות של גולם ומבוגרים לאחר ההזרקה היא היבט זה חייב להיות אופטימיזציה על ידי משתמשים. לדוגמה, בפרוטוקול זה, הזריקה הראשונה של ריאגנטים CRISPR/Cas9 בגולים השפיעה על ההישרדות באופן דרמטי (15%) בהשוואה להישרדותם של מבוגרים מוזרקים (90%). עם זאת, בפגישה השנייה, הישרדות הגלם עלתה עד 60%. לאחר מספר מפגשי הזרקה, ניתן היה לשמור על הישרדות דומה (80%-100%) לאחר הזרקת גולם או מבוגרים. אכן, הישרדות לאחר הזרקה ניתן לשפר אם פרמטרים הקשורים יישור הצרעות, בחירת הצמצם הנכון עבור המחט, והימנעות פירסינג או דקירת הצרעות עם המחט הם אופטימיזציה.

יישור והכנת גולם ונקבות לזריקות, בהתבסס על הפרוטוקול המוצג כאן, יכול להפחית את התמותה. יתר על כן, השיטה המוצגת כדי ליישר את גלמי immobile על ידי הדבקת אותם לשקופית יכול להקל על תהליך ההזרקה, כי זה מונע מהם לנוע במהלך ההזרקה. לכן, גולם לאחר מכן ניתן להזריק במהירות רבה, להתגבר על האופי זמן רב של הצעדים המעורבים microinjections עוברי. בנוסף, כמו זריקות ניתן לעשות עם שאיפה בפה, אין ציוד מיוחד נדרש כדי לבצע אירועי עריכת גנים. עם זאת, טכניקה זו דורשת את הצרעות להיות ממוקם בזמן על הדבק; אחרת, הם לא יהיו מחוברים כראוי יהיה להחליק מן השקופית במהלך החדרת המחט. ניתן לתקן זאת לאחר מספר ניסויים ביישור.

מבוגרים לא ניתן ליישר בשיטה זו כי הם יכולים להזיז את הבטן והרגליים שלהם; לפיכך, הם צריכים להיות מורדם. שיטת הבחירה המועדפת בפרוטוקול זה כרוכה בהצבת הצינור המכיל את הצרעות בקרח במשך ~ 5 דקות עד שהצרעות נופלות, ולאחר מכן העברתן בקבוצות למגלשה צוננת מראש על הקרח. שיטה זו מאפשרת יישור והכנת הצרעות להזרקה בקבוצות של צרעות 10-15 הפונות כלפי מעלה, עם צלחת פטרי חדשה המכילה קרח לכל קבוצת הזרקה חדשה. מניעת המסת הקרח במהלך ההזרקה תסייע לשמור על יציבות המגלשה ולהפחית את הסיכון לשבור את המחטים או להרוג את הצרעות בטעות. ניתן לשפר שלב זה באמצעות טבלה מצמררת, אם היא נגישה.

לחלופין, ניתן להשתמש ברפידות CO2 כדי לחטא את הצרעות. כדי לעשות זאת, יהיהצורך לייעל את זמן החשיפה ל- CO2 במהלך ההזרקה ולקבוע את ההשפעות של חשיפה CO 2 על הישרדות ופוריות, כפי שדווח בעבר עבור מינים אחרים18. משוכה נוספת בעת הזרקת מבוגרים מסתמכת על השיטה המשמשת להחזיק את הצרעה הרדמה להזרקה. חפץ מחודד קהה שיכול להחזיק את הבעיעה ללא הסיכון של פירסינג או דקירה זה מתאים ביותר. באופן כללי, מחטי ניתוח או מלקחיים קהים פועלים היטב.

לאחר היישור וההחזקה הנכונה של הצרעות שולט, תהליך ההזרקה עשוי להמשיך מהר מאוד. זריקות גולם ומבוגרים ניתן להזריק עם נפחי פתרון בטווח של מאות nanoliters, להקל על הכנתו בריכוזים שונים המבוססים על העדפת המשתמש. עם זאת, חשוב להשתמש מחטים נאותה להזריק את הכמות הנכונה של נוזל ללא הסיכון של פגיעה והורג את הצלופח. באופן כללי, מחטים ארוכות מאוד עם פתחים קטנים מאוד טובים יותר כי הם גורמים פחות נזק פיזי לבטן של הגומי. יתר על כן, זרימת הנוזל היא איטית, הימנעות שינויים גדולים בלחץ והכי חשוב, מניעת דליפת הפתרון דרך החור שנוצר על ידי המחט.

החסרונות של פתח קטן הם כי המחטים יכול לשבור בקלות כאשר נוגעים שלד חיצוני קשה של הצרעות והוא יכול גם לקבל סתום עם החומר מתוך הבטן. לכן, מחטי צמצם קטנות עובדות טוב מאוד באמצעות femtojet או nanoject, והשימוש בהם דורש טיפול רב כדי למנוע שבירתם. מחטים אלה אינם מתאימים לשואף הפה כי זה מאוד קשה להזריק נוזל עם הפה דרך צמצם קטן. עבור שיטה זו, המחט האידיאלית דורשת את הצמצם המינימלי המאפשר לפתרון לזרום בצורה חלקה תוך מניעת הנזק שיכול להיגרם עם מחט צמצם גדולה. שוב, היבט זה צריך להיות ממוטב על ידי המשתמשים. בכל מקרה, שינוי המחט לעתים קרובות יעזור למנוע סתימה ופגיעה בקצה כי יקטין את ההישרדות ואת היעילות.

ב N. vitripennis, כל מקום בבטן יכול לשמש כדי לספק ריאגנטים לתוך hemolymph. עם זאת, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע נזק לביפוסיטור של הצלופה שכן זה משמש להאכלה והטלת ביצים. עבור גולם ומבוגרים כאחד, טכניקות קיבוע הוצעו בפרוטוקול זה כדי לאפשר הזרקה מן הביצית, בעיקר באזור הגחון לכיוון החלק הקדמוני של הבטן. בנוסף, אצל מבוגרים, זה יכול להיות מושגת גם על ידי הזרקה בצדדים או באזור הגב. שיטת היישור עבור גולם המתוארת בזאת עשויה להקל על הזרקת צד, אך לא גב. בכל מקרה, המאמצים למנוע פירסינג חלקי גוף אחרים או נזק הבטן הם בראש סדר העדיפויות.

ברגע שהמחט מוכנסת, זרימת הנוזל צריכה להיות איטית וקבועה. femtojet מאפשר זאת בקלות, אם כי הלחץ עשוי להיות מותאם עבור כל מחט. בעת שימוש בשאיפה לפה, הזרקה של כמויות גדולות של נוזל מהר מדי יש להימנע כי זה עלול לגרום לו לדלוף דרך הנקבובית של הזריקה. למעשה, מלבד התבוננות בבטן נפיחות עם נוזל, דליפה היא סימן לעצור זריקה. לאחר סיום ההזרקה, הצרעות הבוגרות חייבות להישאר על המגלשה עד שהן מתאוששות ולאחר מכן מועברות לצינור עם המארחים.

המערכות המוצגות כאן ניתנות להתאמה בקלות למיני חרקים אחרים המאתגרים במיוחד עבור מיקרו-חיידקים של ביצים. לדוגמה, צרעות טפיליות רבות מטילות ביצים לזחלי חרקים אחרים. לפיכך, ביצים אינן ניתנות להשגה ולהזרקה במינים אלה. הביצים של מינים מזיקים אחרים, כגון psyllid הדרים אסיה Diaphorina citri, הם גם מאוד קשה להגיע להזרקה כי הם מחוברים לצמח שבו הם מוטלים. דו"ח שפורסם לאחרונה מצביע על כך שניתן להשתמש ב- BAPC לעריכת גנים של CRISPR בפסילידה הדרים אסייתית, D. citri27. באופן דומה, משלוח P2C בתיווך של החלבון, mCherry, הושג בשחלות של מין זה28, מה שמרמז כי טכניקות הזרקה אלה המתוארות כאן יכול להקל על היישום של RNAi ו CRISPR במגוון רחב של מינים מזיקים חרקים ולעזור בתכנון אסטרטגיות שליטה המסייעים במניעת נזק היבול הקשורים אליהם.

היישום במינים אחרים דורש אופטימיזציה המבוססת על מחזור החיים של המינים המעניינים. לדוגמה, חשוב לקבוע את השלב הנכון של הזרקה גם מבוסס על הבדיקה הפונקציונלית של עניין. לכן, למסירה של CRISPR / Cas9 לתוך השחלות, חשוב לדעת מתי vitellogenesis פעיל כדי לאפשר את ספיגת ריאגנטים עריכת גנים על ידי השחלות24,25,26,27,28. לעומת זאת, להפלה יעילה, חשוב לדעת מתי הגן מתבטא ופונקציונלי. יישום עתידי של טכניקות הזרקה אלה יכול לכלול משלוח של סוגים שונים של חומצות גרעין, כגון DNA פלסמיד, לתוך hemolymph חרקים ושחלות. זה מאפשר לקדם ביטוי חולף של גנים הנמצאים ב- DNA פלסמיד. בנוסף, שילוב CRISPR/Cas מגיב עם DNA תבנית יכול לעזור לתווך transgenesis באמצעות תיקון מונחה הומולוגיה (HDR) או לגרום transgenesis בתיווך טרנספוזון, עקיפת מיקרוניקציה עוברית. לסיכום, טכניקה משופרת זו יכולה לשמש כדי ליצור סוגים רבים של ניתוח פונקציונלי, כגון הפלה באמצעות RNAi, אינדוקציה של מוטציות, מחיקות, ואולי אפילו הכנסות טרנסג'ין כדי ליצור מהונדס N. vitripennis, שיוך טרנספוזונים עם BAPC, אשר אמור להאיץ מאוד מחקר פונקציונלי באורגניזם זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JLR ו- DCR הגישו בקשה להגנה זמנית על פטנטים בטכנולוגיית ReMOT Control. O.S.A. הוא מייסד אגראג'ין בע"מ, בעל עניין במניות, ומשמש בוועדה המדעית המייעצת של החברה. כל הסופרים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרנות סטארט-אפ UCSD המופנות למענק O.S.A. ו- NSF / BIO 1645331 לג'יי.אל.אר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile Sigma 960-97693-083
Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) Sutter Instruments BF100-58-10 Can also use Borosilicate or Quartz
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
BAPC phoreus biotech BAPtofect-25 0.5 mg Kit
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
Dissecting needle VWR 10806-330
DNase/RNase-Free distilled Water Invitrogen 10977-015
Femtojet Express programmable microinjector Eppendorf
Femtotips Microloader tips Fisher Scientific E5242956003
Fine-tip paintbrush ZEM 2595
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata Ward's Science 470180-392
Food colorant dye
Glass Test Tubes Fisher Scientific 982010
Glue Elmer's washable, no toxic school glue
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000 or P-2000
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-A3
Stereo Microscope Olympus SZ51

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
  2. Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
  3. Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
  4. Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
  5. Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
  6. Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
  7. Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
  8. Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
  9. Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
  10. Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
  11. Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
  12. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
  13. Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
  14. Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
  15. Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
  16. Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
  17. Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
  18. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
  19. Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
  20. Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
  21. Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
  22. Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
  23. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
  24. Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
  25. Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
  26. Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
  27. Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
  28. Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 166 נסוניה ויטריפניס CRISPR/Cas9 ReMOT CRISPR בסיוע BAPC זריקות למבוגרים RNAi
זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR <em>בנסוניה ויטריפניס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dalla Benetta, E.,… More

Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J. Vis. Exp. (166), e61892, doi:10.3791/61892 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter