Summary
Här beskriver vi metoder för effektiva poppal- och vuxeninjektioner i Nasonia vitripennis som tillgängliga alternativ till embryomikroinjektion, vilket möjliggör funktionell analys av gener av intresse med antingen RNA-ljuddämpande via RNA-interferens (RNAi) eller gen knockout via CRISPR / Cas9 genomredigering.
Abstract
Juvelstepsen Nasonia vitripennishar blivit ett effektivt modellsystem för att studera epigenetik av haplo-diploid könsbestämning, B-kromosombiologi, värd symbiont interaktioner, speciation och giftsyntes. Trots tillgången på flera molekylära verktyg, inklusive CRISPR/Cas9, är funktionella genetiska studier fortfarande begränsade i denna organism. Den största begränsningen av tillämpningen av CRISPR/Cas9-teknik i N. vitripennis härrör från utmaningarna med embryonala mikroinjektioner. Injektioner av embryon är särskilt svåra i denna organism och i allmänhet i många parasitoidsteps, på grund av liten embryostorlek och kravet på en värdvalpa för embryonal utveckling. För att ta itu med dessa utmaningar optimerades Cas9 ribonukleoprotein komplexa leverans till kvinnliga äggstockar genom vuxna injektion, snarare än embryonal microinjection, vilket resulterar i både somatiska och ärftliga könsceller redigeringar. Injektionsprocedurerna optimerades i poppar och kvinnliga kastare med antingen ReMOT Control (Receptor-medierad äggstockstransduktion av last) eller BAPC (Grenade amfifila peptidkapslar). Dessa metoder visas vara effektiva alternativ till embryoinjektion, vilket möjliggör platsspecifika och ärftliga könsceller mutationer.
Introduction
CRISPR/ Cas9 genredigering är en kraftfull teknik för funktionella genetiska studier, särskilt i många stigande modellorganismer som juvelstepsen Nasonia vitripennis. Den enkla uppfödningen och tillgången till ett komplett genom gör juvelvingen till ett viktigt experimentellt system för att belysa de molekylära mekanismerna i olika biologiska processer. Till exempel har N. vitripennis nyligen använts för att riva upp den epigenetiska grunden för haplodiploid sexbestämningssystem1,2, biologin hos B-kromosomer3,4,5,6, och den genetiska grunden för dygnsrytm och säsongsreglering7,8. Några av de funktioner som gör N. vitripennis mottagliga för att arbeta med inkluderar kort generationstid (~ 2 veckor vid 25 °C), höga reproduktionshastigheter, enkel könsseparation på pupalstadiet och förmågan att diapause och lagra stammar vid 4 °C. Livscykeln börjar med kvinnliga tjurar som parasiterar blåsflyens puppar, Sarcophaga bullata. Genom sin ovipositor lägger kvinnor upp till 50 ägg i pupal fallet med blåsflyen. Ägg utvecklas till larver som matar på S. bullata poppa, fortsätter att utvecklas under de kommande dagarna och sedan popp, följt av vuxen eclosion och uppkomst från värden puparium9.
Molekylära verktyg för att utföra funktionella genetiska studier i N. vitripennis, såsom RNA-interferens (RNAi)10 och CRISPR / Cas911,12, finns tillgängliga, men är begränsade, främst på grund av svårigheter att utföra embryonala mikroinjektioner13. Eftersom N. vitripennis ägg kräver en pupal värd för utveckling, är äggmanipulation mycket utmanande. Embryon före blastodermstadiet måste samlas in från värdens blåsflytuppar, snabbt mikroin injiceras och omedelbart överföras tillbaka till värden för utveckling13. Dessa steg kräver precision och specialiserad utbildning för att undvika att skada de mikroinjected embryona eller pupal värdarna13. Dessutom är äggen mycket små och bräckliga, särskilt efter mikroinjektioner, med en mycket trögflytande cytoplasma som orsakar en kontinuerlig igensättning av injektionsnålen13. Dessa funktioner gör embryonala mikroinjektioner exceptionellt utmanande, vilket kräver högutbildade operatörer och specialiserad utrustning som saknas i de flesta N. vitripennis-laboratorier.
Optimeringen av alternativa injektionsmetoder för leverans av CRISPR-reagenser skulle bidra till konsolideringen av N. vitripennis som modellorganism. Manipulering av puppar och vuxna är mindre utmanande än att manipulera embryon och kan åstadkommas med en grundläggande injektionsinställning. Här beskrivs två protokoll för injektion av puppar och vuxna: en som omfattar specialiserad utrustning för injektioner och den andra som inbegriper användning av en aspiratorrörsenhet utrustad med en glaskapillär nål. Användningen av ett aspiratorrör är särskilt lämplig för laboratorier som inte har tillgång till specialiserad utrustning för embryomikroinjektioner. Effektiva injektioner av olika utvecklingsstadier av N. vitripennis, inklusive vita eller svarta poppar och vuxna stekar, påvisas. Varpsar på det vita pupalstadiet är särskilt lämpade för RNAi-medierade knockdown-experiment. Även om RNAi i Nasonia först beskrevs av Lynch och Desplan 200610, finns det ingen visuell procedur tillgänglig för hur RNAi injektioner utförs. RNAi användes nyligen för att upptäcka haploidizergenen av B-kromosom PSR (Paternal Sex Ratio)3 och för att studera inblandning av klockgenen, period, i N. vitripennis biologiska rytmer7.
Svarta puppar och vuxna kastare kan användas för att inducera CRISPR/Cas9-germlin genredigering med remotkontroll (receptormedierad äggstockstransduktion av last) och BAPC -protokoll (branched amphiphilic peptidkapslar). Dessa två äggstocksleveransmetoder har nyligen beskrivits vara effektiva i Nasonia för att generera könsceller mutationer i mål genen, cinnabar7,12. Här finns ett förenklat protokoll för injektioner inklusive ett visuellt förfarande av en steg-för-steg-metodik för både poppal och vuxna injektioner som kan användas för att generera funktionella genetikstudier i Nasonia och sannolikt i andra parasitoidsteps, utan att kräva specialiserad utrustning och kringgå embryonala mikroinjektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nasonia uppfödning
- Ställ in ~20 parade honor i små glas provrör pluggade med bomull.
OBS: För att minska uppfödningsutrymmet är 10 x 85 cm, 4 ml-rör optimala. Kvinnor skiljer sig lätt från män på grund av de större vingarna och närvaron av ovipositoren (Figur 1A). Detaljerade protokoll för uppfödning av N. vitripennis finns också i annan litteratur13,14,15.- Tillsätt två S. bullata-värdar per rör och behåll stearna vid 25 ± 1 °C och 30% relativ fuktighet, med en 12:12 ljus-mörk cykel i 2-3 dagar.
OBS: Kastare kan hållas vid lägre temperatur eller rumstemperatur; Utvecklingen kommer dock att bromsas.
- Tillsätt två S. bullata-värdar per rör och behåll stearna vid 25 ± 1 °C och 30% relativ fuktighet, med en 12:12 ljus-mörk cykel i 2-3 dagar.
- Efter 2-3 dagar, med hjälp av en finspetsborste, ta försiktigt bort kvinnorna för att undvika kontinuerlig oviposition och asynkron i avkommans utveckling.
OBS: Borttagna honor kan eventuellt återvärdas eller förvaras vid 5 °C i upp till en månad.- Behåll den parasiterade värden vid 25 °C och 30% relativ fuktighet, med en 12:12 ljus-mörk cykel i 7 dagar om det önskade injektionssteget kräver vita puppar; i 13 dagar om det nödvändiga utvecklingsstadiet är svart pupp; eller 14 dagar för unga, nyuppkomna vuxna.
OBS: Gula och svarta puppar kan också förvaras vid 5 °C i upp till en vecka. Längre lagring kommer att öka frekvensen av diapause i larver för nästa generation, vilket gör screening efter injektion och etablering av mutantlinjer svårare. - Öppna värdpupariumet med en dissekerande nål för att återställa N. vitripennis puppar och vuxna i önskat skede (Figur 1A).
OBS: För injektioner i en viss vuxen ålder eller för insamling av jungfruliga honor rekommenderas att ta bort den mörka poppen dag 13 från värden, separera efter kön och samla vuxna efter uppkomsten.
- Behåll den parasiterade värden vid 25 °C och 30% relativ fuktighet, med en 12:12 ljus-mörk cykel i 7 dagar om det önskade injektionssteget kräver vita puppar; i 13 dagar om det nödvändiga utvecklingsstadiet är svart pupp; eller 14 dagar för unga, nyuppkomna vuxna.
2. Justering av vita och svarta puppar
- Förbered en glasrutschbana genom att applicera en linje av skollim i mitten. Sprid limet med en dissekerande nål för att få ett tjockt lager (Figur 1B), som kommer att användas för att justera popparna. Låt limet torka i ~ 2 min innan du överför popparna.
OBS: Överbemörka inte limet, annars kommer popparna inte att vara ordentligt fastsatta på bilden och kommer att glida över under injektionerna. - Applicera lim på baksidan av poppans huvud under ett dissekerande mikroskop med hjälp av dissekeringsnålen.
- Fäst poppan på limskiktet på bilden med buken uppåt. Justera 20-30 puppar sida vid sida på bilden (Bild 1C).
OBS: Undvik att vidröra buken med limet och undvik att dränka popparna i limet; Annars kommer de vuxna inte att kunna dyka upp. - Placera rutschkanan med popparna i en petriskål för att låta limet torka i ~ 10 min. Innan injektionerna påbörjas, testa puppens vidhäftning till limet genom att trycka dem försiktigt med dissekeringsnålen. Om de flesta puppor lossas, förbered en ny bild. Alternativt kan du ta bort alla puppar som är lösa och fortsätta att injicera de som är ordentligt fästa vid bilden.
3. Nålberedning
- Ladda ett kapillärglasrör i en nåldragare och dra nålar enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: En P-1000 platinafilament nåldragare och aluminium silikatglas kapillärer används i denna demonstration. Bruksanvisningen för detta instrument (se Materialförteckningen)förklarar hur man korrekt laddar kapillärglasrör och ställer in program på detta instrument. Använd följande parametrar (Värme: 536; Drag: 80; Vel: 100; Fördröjning: 70) på aluminium silikatglas kapillärer för att injicera gula puppar, svarta puppar och vuxna.
Dessutom användes P-2000 nåldragare för att förbereda kvartsnålar enligt parametrarna (Värme: 805; Drag: 145; Vel: 50; Försening: 145). Handboken innehåller instruktioner för lastning av kapillärkvartsrör och installation av program i detta instrument. I avsaknad av en puller finns anpassningsbart kapillärglas. - Ladda nålen med 5 μL av injektionsblandningen (beredd i förväg enligt tidigare protokoll för RNAi10 eller CRISPR/Cas9 ribonukleoprotein12 (RNP) injektioner i N. vitripennis) med hjälp av mikrolastarpipettspetsar.
OBS: Under demonstrationen är nålen laddad med dubbelsträngat RNA (dsRNA) kombinerat med rött färgämne (se Materialförteckning)för injektion av vita stegpuppar och med BAPC-Cas9-sgRNA för injektion av svarta poppuppar och vuxna. Dessa reagenser kommer att rikta in sig på cinnabargenen. Stear som slås ner/ut kommer att visa röda ögon istället för de vilda bruna ögonen. - Öppna nålen och skjut spetsen på en yta gjord av två överlappande diabilder (Bild 1D). Alternativt kan du öppna nålens spets med ett par fina tångar för att skapa en skarp kant eller genom att långsamt genomborra toraxen eller buken på korgen.
4. Pupal injektion med femtojet
- Placera bilden med de justerade pupporna under ett dissekerande mikroskop. Sätt in nålen i femtojets injektionsrör och dra åt griphuvudet.
- När du tittar på nålen under mikroskopet slår du på femtojet och ställer in pc- och pi-injektionsparametrar genom att rotera de roterande rattarna.
OBS: Ett pc-värde på 600 hPa rekommenderas för ett kontinuerligt flöde av vätskan. Datorvärdet beror på nålens öppning. För nålar som bereds med de angivna parametrarna i P-1000 nåldragning, Pc värden mellan 500 hPa och 700 hPa ger ett konstant flöde. Om lägre värden på pc krävs indikerar detta att öppningen kan vara för stor och kan skada insekterna, medan högre värden indikerar att nålen fortfarande är stängd eller att öppningen är för liten. - För försiktigt in nålen mellan de 2 och 3 synliga buksegmenten med en vertikal vinkel på ca 30° (Figur 1E). Injicera med ett kontinuerligt flöde tills hela buken blir rosa vid popp i vitt stadium, eller tills buken ökar i storlek vid svart popp. Sluta injicera när det är klart att buken inte kan ta mer vätska, eller när vätskan börjar strömma ut ur kroppen. Flytta försiktigt till nästa popp och upprepa dessa steg.
OBS: Undvik att vidröra och skada ovipositoren med nålen under injektionen. - Överför rutschkanan med den injicerade poppan till en petriskål som innehåller en pappershandduk som blötläggs med avjoniserat vatten för att bibehålla luftfuktigheten. Täck skålen med locket och placera den vid 25 °C tills vepsen uppstår (figur 1F).
5. Pupal injektion med aspiratorrör
- Beräkna mängden injektionsblandning med hjälp av faktorn: 4 poppar injicerade/1 μL-lösning.
OBS: En typisk injektion av 20-30 puppar kräver ~ 5-8 μL ribonukleoprotein (RNP) komplex-saponinblandning eller RNP med BAPC12. - Justera popparna, som föreslås i avsnitt 2, och placera en bild med de justerade pupporna under ett dissekerande mikroskop (Figur 1E).
- Ta en av kapillärnålarna och bryt spetsen mellan två glasrutschbanor, enligt steg 3.4 (Figur 1D). Se till att nålspetsen är tillräckligt öppen för att injektionslösningen ska kunna gå ut genom att blåsa luft med munnen, men inte för öppen för att undvika att förlora vätska och skada popparna (Figur 1E).
OBS: Detta steg är kritiskt eftersom användaren kommer att använda luft från munnen för att trycka injektionsblandningen i insekts hemolymfen. Det är bättre att öva för att fastställa vilken typ av nålöppning som är optimal för viskositeten hos en viss lösningsblandning. Fem uppsättningar injektioner på 20 puppar per uppsättning kan räcka för att vänja sig vid muninjektionssystemet. - Ladda en nål med ribonukleoproteinlösningen12 med hjälp av en mikrolastningsspets och för in nålen i anslutningsförpackningen på aspiratorröret.
OBS: Under demonstrationen är nålen laddad med BAPC-Cas9-sgRNA som riktar sig mot Nasonia cinnabar genen 12. - För försiktigt in nålen mellan de 2 och 3 synliga buksegmenten med en vertikal vinkel på ca 30° (Figur 1E). Injicera med ett kontinuerligt flöde tills hela buken blir rosa vid popp i vitt stadium eller tills buken ökar i storlek vid svart pupp. Sluta injicera när det är klart att buken inte kan ta mer vätska eller när vätskan börjar strömma ut ur kroppen. Flytta försiktigt till nästa popp och upprepa dessa steg
OBS: Undvik att vidröra och skada ovipositoren med nålen under injektionen. - Överför rutschkanan med den injicerade poppan till en petriskål som innehåller en pappershandduk som blötläggs med avjoniserat vatten för att bibehålla luftfuktigheten. Täck skålen med locket och placera den vid 25 °C tills vepsen uppstår (Figur 1F).
6. Vuxen injektion med aspiratorrör
- För vuxenberedning, separata grupper av 20 jungfruliga honor i ett rent litet provrör med en fin pensel. Placera röret på is i 5 minuter tills honorna bedövas. Alternativt kan kvinnor bedövas och injiceras med CO2.
OBS: Is är att föredra som bedövningsmedel eftersom vuxna stekar är kalltoleranta och återhämtar sig lätt efter injektionerna. Kvinnor kan ta upp mer injicerad vätska än popparna: 1 μL lösning kan användas för tre honor istället för för fyra puppar. Förbered volymerna i enlighet därmed. - Förbered en ishink och placera en glasrutschbana ovanpå isen. Rikta in honorna sida vid sida på den kalla rutschkanan med buken uppåt (figur 1E) under ett dissekeringsomfång.
- Ladda en nål med ribonukleoproteinlösningen12 med hjälp av en mikrolastningsspets och för in nålen i anslutningsförpackningen på aspiratorröret. Stöd honorna från motsatt sida med trubbiga dissekerande nålar medan de långsamt injicerar i buken från andra sidan. Undvik att röra vid ovipositorn, detta kommer allvarligt att skada denna kritiska reproduktiva struktur (Figur 1E).
OBS: Båda orienteringarna är acceptabla, beroende på operatörens önskemål. - För försiktigt in nålen mellan de 2 och 3 synliga buksegmenten med en vertikal vinkel på ca 30° (Figur 1E). Injicera lösningen i den kvinnliga buken, stoppa när ingen mer vätska kan komma in, eller när läcka av överskottslösning observeras. Flytta försiktigt till nästa varp och upprepa dessa steg
OBS: Injicera långsamt och lämna nålen inuti buken i ca 3 s innan du tar bort den mycket långsamt. Detta hjälper till att justera det inre vätsketrycket och undvika att lösningen läcker ut från injektionsstället efter borttagning av nålar. - När det är klart överför du försiktigt enstaka injicerade honor till ett nytt rör med en värd med en pensel. Låt återhämta sig vid rumstemperatur i cirka 1 timme, bekräfta överlevnaden och sätt sedan tillbaka rören på uppfödningsinkubatorn.
OBS: Under demonstrationen är nålen laddad med BAPC-Cas9-sgRNA som riktar sig mot Nasonia cinnabar genen 12.
7. Vård efter injektion och mutant screening
- Efter vuxen eklosion från den injicerade poppan, placera enstaka tjurar i ett glasrör pluggat med bomull och sätt in en S. bullata värd (Figur 1G). Placera däremot injicerade honor i enskilda rör med värdar omedelbart efter injektionen.
- För CRISPR/ Cas9 knockout experiment, låt kvinnor parasitera värdarna för en dag och ersätta värden varje dag i tre dagar i följd.
OBS: På grund av haplodiploid sexbestämningssystemet i N. vitripennis16,jungfruliga honor kommer att producera haploid manliga kullar, vilket underlättar upptäckten av mutationer. För knockdown via RNAi av manliga specifika gener kan de injicerade individerna vara singularly parade med vilda typ individer och tillåtas parasitera värdar. Använd en värd per dag och ersätt värdarna baserat på den experimentella installationen. - Placera de parasiterade värdarna vid 25 °C tills G0-manliga avkommor (i ~ 13-14 dagar).
- Under ett dissekerande mikroskop, skärm G0 män för muterade fenotyper. Cinnabargenen är ansvarig för ögonpigmentering12:stear med bruna ögon är vilda typer, och stear med ljusröda ögon eller variationer mellan röda och bruna ögon är mutanter (Figur 1H).
8. Kors efter injektion och uppfödning
- Placera alla mutanta G0-hanar med röda ögon (den fenotypiskt störda cinnabar12-genen)med vilda jungfruliga honor i 1-2 dagar (Figur 2A).
OBS: Om den störda genen inte ger en synlig fenotyp krävs polymeraskedjereaktion (PCR) följt av sekvensering av målgenen för att identifiera de muterade djuren. Innan du får DNA från G0-män för PCR, skulle det vara idealiskt att para dem med vilda jungfruliga honor. Alternativt, extrahera DNA från ett ben av en G0 hane för att identifiera mutanter, och kompisera endast de med verifierade mutationer. - Tillsätt två S. bullata-värdar per kvinna och låt oviposit vid 25 °C och 30% relativ fuktighet med en 12:12 ljus-mörk cykel. Byt ut värdarna var 2-3:e dag.
- Förvara parasiterade värdar vid 25 °C och 30% relativ luftfuktighet, med en 12:12 ljus-mörk cykel i ~ 10 dagar.
- Efter ~ 10 dagar, öppna den parasiterade värden med en dissekerande nål och ta bort varje N. vitripennis-poppa från värden.
- Välj kvinnliga puppar ( figur1A) med hjälp av en finpensel.
OBS: Kvinnor är diploid och heterozygous, och därmed kommer ögonfärgen att vara vild typ.
- Placera 15-20 kvinnliga puppar i glasrör vid 25 °C tills de uppstår. Efter framväxten, lägg till ~ 20 S. bullata värdar och låt jungfru G1-kvinnorna parasitera värdarna i 2-3 dagar.
OBS: Dessa honor kommer att producera 50% G2 mutanta män.- Lagra parasiterade värdar vid 25 °C och 30% relativ fuktighet, med en 12:12 ljus-mörk cykel tills G2 manliga vuxna uppkomst.
- Placera de återstående G1-pupparna vid 5 °C i 8-10 dagar . Efter denna period, ta bort dem och placera dem vid 25 °C och 30% relativ fuktighet, med en 12:12 ljus-mörk cykel tills den uppstår (Figur 2A).
- Efter uppkomsten av G2 män i steg 8.3.1, skärm för förekomsten av rödögda mutant fenotyp. Med hjälp av en finspetspensel separerar rödögda män från vilda män.
OBS: Förekomsten av rödögda kastare i denna generation (G2, figur 2A) indikerar att genredigering inträffade i könscellen och att mutationen är ärftlig. - Placera rödögda män med G1-honorna som nyligen dykt upp i steg 8.3.2 (Figur 2A), och låt dem kompisera i 1-2 dagar. Tillsätt 2 S. bullata värdar per kvinna och placera dem vid 25 °C och 30% relativ fuktighet med en 12:12 ljus-mörk cykel i 10-11 dagar.
- Efter 10-11 dagar, öppna den parasiterade värden med en dissekerande nål och ta bort varje N. vitripennis poppa från värden (Figur 2A).
- Med hjälp av en finspetsborste separerar du rödögda tärningar (hanar och honor) från vild typ (Figur 1H). Fortsätt uppfödningen av rödögda stekar tillsammans i glasrör och blanda inte med vilda stear.
OBS: I detta skede (G3, figur 2A),haploid män och diploid honor bära och visa fenotyper för cinnabar mutationer. Om den drabbade genen kodar för en osynlig fenotyp, korsa G0 hanen singularly med en vild typ kvinna i ~ 1 dag. Ta sedan bort hanen för molekylär karakterisering av mutationen genom PCR och sekvensering och låt kvinnan parasitera en värd. Fortsätt korsningssystemet endast med avkomman till en bekräftad mutant hane (Figur 2B). Om målet är att RNAi ska slå ner en kandidatgen, utför den önskade funktionella analysen (såsom dödlighet, sterilitet eller diapauseinduktionsanalys3,7) direkt med hjälp av individer injicerade med dsRNA. Eftersom RNAi är övergående är det inte möjligt att generera en koloni med önskad fenotyp (Figur 2C)3,7.
Figur 1: Tidslinje för mikroinjektion av pupal och vuxen Nasonia vitripennis. ( A) Manliga och kvinnliga vita (överkant) och svarta (botten) puppar samlas in, (B-C) justeras och limmas på en glasbild för injektion. (D) Kapillärnålen bereds och öppnas och glider den på två överlappande diabilder. (E) Nålen är fäst antingen på Femtojet (överst) eller på ett aspiratorrör (botten) för injektioner. (F) De injicerade pupparna på rutschkanan överförs till en petriskål med en våt vävnad på botten för att hålla luftfuktigheten. Vid uppkomstplaceras ( G) honor singularly i små glasrör och får oviposit på Sarcophaga pupa. (H)Screening av avkomman för att upptäcka mutanter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Korsningsschema efter injektion. Schematisk representation av korsning schema förfarande när det gäller CRISPR/Cas9-medierad genredigering av gener (A) som inducerar en synlig fenotyp och (B) som inte ger synliga fenotyp. c) Schematisk representation av RNAi-screeningförfarandet. Förkortningar: cin = cinnabar; PCR = polymeraskedjereaktion. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta dokument presenterar två enkla metoder för pupal och vuxen mikroinjektion, antingen med hjälp av en femtojet eller ett aspiratorrör. Den första metoden möjliggör en mer exakt injektion av vätska, vilket är viktigt för RNAi konsistens, medan den andra tillåter injektion av större mängder vätska i Nasonia puppar eller vuxna.
Representativa resultat som presenteras i tabell 1 visar god överlevnad (från 20 % till 89 %) och effektivitet för att få önskad fenotyp (antingen knockdown via RNAi eller genredigering via CRISPR) med hjälp av de injektionsmetoder som beskrivs här utan att kräva mödosamma ägginjektioner.
| etapp | reagens | Koncentration ng/μL (protein/gRNA eller dsRNA) | N Injicerad | N Överlevnad (%) | Injicerade individer som lägger avkommor | Injicerade individer som producerar avkommor med fenotyper | Avkommor som visar knockdown/knockout fenotyper | ||||
| N | % | N | % av det totala injicerade | % av individer som producerar avkommor | N | Mutanter/ injicerade puppar eller vuxna | |||||
| Vit pupp | dsRNA* | 3000-4000 | 80 | 69 (86%) | 69 | 100% | 45 | 56% | 65% | 1263 | Na |
| Svart pupp | Cas9 (på andra) | 2903/2741 | 39 | 34 (87%) | 19 | 49% | 2 | 5% | 11% | 2 | 0.05 |
| P2C-CAS9-EGFP** | 454/227 | 40 | 6 (15%) | 2 | 5% | 1 | 3% | 50% | 3 | 0.08 | |
| P2C-Cas9 (på andra) | 725/750 | 28 | 28 (100%) | 16 | 57% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC (på alla) | 500/200 | 20 | 11 (55%) | 9 | 45% | 3 | 15% | 33% | 5 | 0.25 | |
| BAPC (på alla) | 400/600 | 20 | 17 (85%) | 10 | 50% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC (på alla) | 360/360 | 20 | 16 (80%) | 16 | 80% | 2 | 10% | 13% | 3 | 0.15 | |
| 24 h-48-h-gammal vuxen | Cas9 (på andra) | 2769/3290 | 11 | 10 (90%) | 1 | 9% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 |
| P2C-CAS9-EGFP | 454/227 | 34 | 30 (89%) | 12 | 35% | 3 | 9% | 25% | 3 | 0.06 | |
| P2C-Cas9 (på andra) | 2903/3076 | 36 | 36 (100%) | 17 | 47% | 4 | 11% | 24% | 4 | 0.05 | |
| *RNAi experiment utfördes på män som sedan parades till icke-injicerade vilda kvinnor. Därför reperesent numrerar av korsar, som producerade avkommor och de som producerade fenotyper. | |||||||||||
| ** Mycket första injektion på puppar av författarna. Förkortningar: dsRNA = dubbelsträngat RNA; EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; BAPC = förgrenade amphifila peptidkapslar. | |||||||||||
Tabell 1: Överlevnad och effektivitetsgrad för RNAi och CRISPR/Cas9 via pupal- och vuxeninjektioner. Effektivitet i RNAi-experiment representerar effektivitet i knockdown av intressegenen, vilket ger en mätbar effekt som könskvotförvrängning3. För CRISPR/Cas9 representerar effektiviteten antalet injicerade honor som producerar mutanta avkommor. Förkortningar: dsRNA = dubbelsträngat RNA; gRNA = guide RNA; EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; BAPC = förgrenade amphifila peptidkapslar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den senaste tidens ökade användning av Nasonia vitripennis som modellorganism för olika biologiska frågor2,3,7,17, finns det ett behov av att utveckla och optimera injektionsmetoder för att möjliggöra ett förenklat och effektivt protokoll för funktionell analys av N. vitripennis gener. De nuvarande metoderna som involverar embryonal mikroinjektion av genredigeringsreagenser utmanar13, vilket kräver specialiserad utrustning och högutbildad personal. För att göra genredigeringstekniken mer tillgänglig för icke-specialiserade laboratorier är det därför viktigt att utveckla alternativa leveransmetoder för CRISPR-reagenser. Därför, visat här är en detaljerad visuell teknik som beskriver två alternativa injektion förfaranden för att tillåta leverans av redigering reagenser (CRISPR/Cas9 eller dsRNA) i insekt hemolymph och äggstockar.
Injektion av dsRNA i insektsklacken är ett vanligt tillvägagångssätt för att leverera dsRNA i olika arter av leddjur18,19,20,21,22. Det är också effektivt i N. vitripennis när det används i vita puppar, som rapporteratstidigare 3,7. CRISPR/Cas9-metoder för bakterieinsekt mutagenes förlitar sig nästan uteslutande på embryonala mikroinjektioner. Få framgångsrika experiment som levererar CRISPR-reagenser i nymfer eller vuxna har rapporterats12,23,24,25,26,27. Sammantaget erbjuder de metoder som beskrivs här ett antal betydande fördelar med avseende på befintliga metoder13. Först möjliggör de injektion av flera utvecklingsstadier av N. vitripennis stear: vita, svarta puppar och vuxna. Dessutom tillåter injektion i hemolymfen antingen knockdown via RNAi eller bakteriedolin genredigering via CRISPR, kringgå embryonala mikroinjektioner.
Det första steget i detta protokoll är att bestämma och screena Nasonia-stear för rätt utvecklingsstadium baserat på det funktionella testet av intresse (t.ex. genomredigering, RNAi). Det är viktigt att vänja sig vid att identifiera både kön i vita och mörka puppar och vuxna. N. vitripennis honor lägger upp till femtio ägg i pupal fallet av blowfly, S. bullata, och wasp puppar kan enkelt samlas in och screenas i stort antal, från den vita scenen. Dessutom gör möjligheten att lagra puppar i olika stadier för att sakta ner utvecklingshastigheten i veckor vid 5 °C systemet mycket flexibelt när det gäller tid och organisation9.
Överlevnaden av puppar och vuxna efter injektion är en aspekt som måste optimeras av användare. I detta protokoll påverkade till exempel den första injektionen av CRISPR/Cas9-reagenser hos puppar överlevnaden dramatiskt (15%) jämfört med överlevnaden för injicerade vuxna (90%). Men under den andra sessionen ökade poppöverlevnaden upp till 60%. Efter flera injektionssessioner var det möjligt att upprätthålla en liknande överlevnad (80%-100%) efter att ha injicerat poppar eller vuxna. Överlevnad efter injektion kan faktiskt förbättras om parametrar relaterade till att justera läpparna, välja rätt bländare för nålen och undvika piercing eller stickning av läpparna med nålen optimeras.
Att justera och förbereda puppar och honor för injektioner, baserat på protokollet som presenteras här, kan minska dödligheten. Dessutom kan den metod som presenteras för att justera de orörliga pupporna genom att limma dem till bilden underlätta injektionsprocessen, eftersom det hindrar dem från att röra sig under injektionen. Således kan puppar sedan injiceras mycket snabbt och övervinna den tidskrävande karaktären hos stegen som är involverade i embryonala mikroinjektioner. Dessutom, som injektioner kan göras med en mun aspirator, ingen specialiserad utrustning krävs för att utföra genredigering händelser. Denna teknik kräver dock att 10-orna placeras i tid på limet; Annars kommer de inte att vara ordentligt fastsatta och glider av från bilden under nålinsättningen. Detta kan korrigeras efter flera försök med justering.
Vuxna kan inte justeras med denna metod eftersom de kan flytta buken och benen; Därför måste de bedövas. Den föredragna metoden i detta protokoll innebär att placera röret som innehåller rävarna i is i ~ 5 minuter tills rävarna slås ner och sedan överföra dem i grupper till en förkyld glidning på is. Denna metod möjliggör justering och beredning av stearna för injektion i grupper om 10-15 stear mot uppåt, med en ny Petri-skål som innehåller is för varje ny injektionsgrupp. Att förhindra smältning av isen under injektionen hjälper till att hålla glidningen stabil och minska risken för att bryta nålarna eller döda ingångorna av misstag. Det här steget kan förbättras med hjälp av ett kylbord, om tillgängligt.
Alternativt kan CO2-kuddar användas för att bedöva steorna. För att göra detta skulle det vara nödvändigt att optimera tidpunkten för exponering för CO2 under injektionen och att bestämma effekterna av CO2-exponering på överlevnad och fertilitet, vilket tidigare rapporterats för andra arter18. Ytterligare ett hinder vid injektion av vuxna är beroende av den metod som används för att hålla den bedövade waspen för injektion. Ett trubbigt spetsigt föremål som kan hålla varpen utan risk för piercing eller knivhugg är mest lämplig. I allmänhet fungerar dissekeringsnålar eller trubbiga tångar bra.
När 10-orna har färdats och hållits på rätt sätt kan injektionsprocessen gå mycket snabbt. Popp- och vuxeninjektioner kan injiceras med lösningsvolymer i intervallet hundratals nanoliter, vilket underlättar preparatet vid olika koncentrationer baserat på användarens önskemål. Det är dock viktigt att använda rätt nålar för att injicera rätt mängd vätska utan risk för att skada och döda vätskan. I allmänhet är mycket långa nålar med mycket små bländare bättre eftersom de orsakar mindre fysisk skada på poppens buk. Dessutom är flödet av vätskan långsamt, vilket undviker stora tryckförändringar och viktigast av allt, vilket förhindrar läckage av lösningen genom hålet som skapas av nålen.
Nackdelarna med en liten bländare är att nålarna lätt kan brytas när man rör vid 10-ornas hårda exoskelett och kan också bli igensatta med materialet inifrån buken. Därför fungerar små bländarnålar mycket bra med en femtojet eller ett nanoject, och deras användning kräver stor försiktighet för att undvika att bryta dem. Dessa nålar är inte lämpliga för en munaspirator eftersom det är mycket svårt att injicera vätska med munnen genom en liten bländare. För denna metod kräver den idealiska nålen den minimala bländaren som gör att lösningen kan flyta smidigt samtidigt som den förhindrar skador som kan orsakas med en stor bländare. Återigen måste denna aspekt optimeras av användarna. Hur som helst, att byta nålen hjälper ofta till att undvika igensättning och skada spetsen som minskar överlevnaden och effektiviteten.
I N. vitripennis kan alla rum i buken användas för att leverera reagenser i hemolymfen. Extra försiktighet måste dock vidtas för att undvika skador på wasps ovipositor eftersom detta används för utfodring och äggläggning. För både poppar och vuxna har immobilisering tekniker föreslagits i detta protokoll för att tillåta injektion bort från ovipositor, främst i ventrala området mot den främre delen av buken. Dessutom kan detta hos vuxna också uppnås genom att injicera på sidorna eller i dorsala området. Justeringsmetoden för puppar som beskrivs häri kan underlätta sidoinjektion, men inte dorsal. I vilket fall som helst är ansträngningar för att förhindra piercing andra kroppsdelar eller skada buken en prioritet.
När nålen har satts in ska vätskan vara långsam och konstant. Femtojet möjliggör detta enkelt, även om trycket kan behöva justeras för varje nål. Vid användning av munaspirator bör injektion av stora mängder vätska för snabbt undvikas eftersom detta kan orsaka att den läcker genom injektionens por. Faktum är att förutom att observera buksvullnad med vätska, är läckage ett tecken för att stoppa en injektion. När injektionen är klar måste de vuxna rävarna lämnas på bilden tills de återhämtar sig och sedan överföras till ett rör med värdar.
De system som presenteras här kan enkelt anpassas till andra insektsarter som är särskilt utmanande för äggmikroinjektioner. Till exempel lägger många parasitoidsteps ägg i andra insektslarver. Ägg är därför omöjliga att nå och injicera i dessa arter. Ägg av andra skadedjursarter, såsom den asiatiska citrus psyllid Diaphorina citri, är också mycket svåra att nå för injektion eftersom de är fästa vid växten där de läggs. En ny rapport tyder på att BAPC kan användas för CRISPR genredigering i den asiatiska citrus psyllid, D. citri27. På samma sätt uppnåddes P2C-medierad leverans av proteinet, mCherry, i äggstockarna av denna art28, vilket tyder på att dessa injektionstekniker som beskrivs här kan underlätta genomförandet av RNAi och CRISPR i ett brett spektrum av insektsskadearter och hjälpa till att utforma bekämpningsstrategier som hjälper till att förhindra de växtskador som är förknippade med dem.
Implementeringen av andra arter kräver optimering baserat på livscykeln för de arter som är av intresse. Det är till exempel viktigt att fastställa rätt injektionsstadium också baserat på det funktionella testet av intresse. Således, för leverans av CRISPR / Cas9 till äggstockar, är det viktigt att veta när vitellogenesis är aktiv för att tillåta upptag av genredigeringsreagenserna av äggstockarna24,25,26,27,28. För en effektiv knockdown är det däremot viktigt att veta när genen uttrycks och fungerar. Framtida implementering av dessa injektionstekniker kan innebära leverans av olika typer av nukleinsyror, såsom plasmid-DNA, till insekts hemolymf och äggstockar. Detta gör det möjligt att främja övergående uttryck av gener som finns i plasmid-DNA. Dessutom, kombinera CRISPR/Cas reagens med en mall DNA kan hjälpa till att förmedla transgenes via homology-riktad reparation (HDR) eller inducera en transposon-medierad transgenes, kringgå embryonal microinjection. Sammanfattningsvis kan denna förbättrade teknik användas för att generera många typer av funktionell analys, såsom knockdown via RNAi, induktion av mutationer, borttagningar och eventuellt till och med transgeneinfogningar för att generera transgena N. vitripennis, associera transposoner med BAPC, vilket kraftigt bör påskynda funktionell forskning i denna organism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JLR och DCR har ansökt om provisoriskt patentskydd för ReMOT Control-teknik. O.S.A är grundare av Agragene, Inc., har ett aktieintresse och sitter i bolagets Scientific Advisory Board. Alla andra författare förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av UCSD-startfonder riktade till O.S.A. och NSF/ BIO-1645331 till J.L.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
