Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

שימור פוריות באמצעות ויטריפיקציה של אוציט: פרספקטיבות קליניות ומעבדתיות

Published: September 16, 2021 doi: 10.3791/61963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Summary

שימור קריופרציה של Oocyte מוכר על ידי מספר חברות מדעיות בינלאומיות כסטנדרט הזהב לשימור פוריות אצל נשים לאחר הפוסט-פוסט-פוריות. אסטרטגיות קליניות ומעבדות מתאימות מבטיחות יעילות מרבית, יעילות ובטיחות של טיפולי שימור פוריות.

Abstract

שמירה על פוריות האישה חיונית במערכת בריאות רב תכליתית המטפלת באיכות החיים העתידית של המטופלים. שימור קריופרציה של Oocyte מוכר על ידי מספר חברות מדעיות בינלאומיות כסטנדרט הזהב לשימור פוריות אצל נשים לאחר הפוסט-פוסט-פוסט-רפואיות, הן עבור אינדיקציות רפואיות והן עבור אינדיקציות לא רפואיות. הסימנים הרפואיים העיקריים הם מחלות אונקולוגיות, מחלות גניקולוגיות כגון אנדומטריוזיס חמור, מחלות מערכתיות המתפשרות על שמורת השחלות, ותנאים גנטיים הכרוכים בגיל המעבר בטרם עת. מאמר זה מתאר את כל העבודה הקלינית והמעבדה של טיפול לשימור פוריות על ידי מתווה המלצות לייעוץ אובייקטיבי ומבוסס ראיות. יתר על כן, הוא מתמקד ביעילות ההליך ומתאר את האסטרטגיות המתאימות ביותר לנצל באופן מלא את עתודת השחלות ולמקסם את מספר הביציות שאוחזרו בזמן הקצר ביותר האפשרי. הערכת עתודת השחלות, ההגדרה של פרוטוקול גירוי אידיאלי, כמו גם הליכי אחזור ביציות, גינוי ו- vitrification פורטו יחד עם גישות כדי למקסם את היעילות שלהם, יעילות, ובטיחות.

Introduction

פיתוח ויישום של תוכנית הקפאה יעילה עבור ביציות אנושיות היוו פריצת דרך משמעותית ברפואת הרבייה. על פי עדויות אחרונות, vitrification היא האסטרטגיה היעילה ביותר כדי cryopreserve metaphase II (MII) ביציות, כפי שהוא מביא שיעורי הישרדות גבוהים יותר סטטיסטית לעומת הקפאה איטית, ללא תלות באוכלוסיית המטופלים(חוליםעקרים או תוכנית תרומת ביציות) 1,2,3. ההישגים המדהימים של vitrification oocyte הובילו את ועדות התרגול של האגודה האמריקאית לרפואת פוריות (ASRM) והאגודה לטכנולוגיית פוריות בסיוע (SART) לבטא טכניקה זו כיעילה ביותר לשימור פוריות אלקטיבית אצל נשים לאחר הפוסט-pubertal, עבור אינדיקציות רפואיות ולא רפואיות4,5,6. אינדיקציות רפואיות לשימור פוריות כוללות (i) סרטן ומחלות אוטואימוניות הדורשות טיפולים7 כגון הקרנות, כימותרפיה ציטוטוקסית וטיפול אנדוקריני (שהשפעתו המזיקה על שמורת השחלות קשורה לגיל אימהי כמו גם לסוג ומינון הטיפול); (ii) מחלות השחלות הדורשות ניתוח חוזר או רדיקלי (כגון אנדומטריוזיס)8; וכן (iii) תנאים גנטיים (למשל, שברירי X) או אי ספיקת שחלות מוקדמת. בנוסף, שימור פוריות הפך לאופציה חשובה עבור כל הנשים שלא השיגו את מטרתן ההורית מסיבות שאינן רפואיות (הידועות גם בשם הקפאה חברתית).

ללא קשר לאינדיקציה לשימור פוריות ועל פי ההנחיות הבינלאומיות העיקריות לשמירה על פוריות, כל המטופלים המוכנים להמחיש את הביציות שלהם צריכים לקבל ייעוץ מתאים כדי לקבל מידע על סיכוייהם הריאליים להצלחה, העלויות, הסיכונים והמגבלות של ההליך9,10,11,12,13. והכי חשוב, זה צריך להיות ברור כי vitrifying קבוצה של ביציות MII אינו מבטיח הריון, אבל זה מציע סיכוי גבוה יותר להצלחה בעתיד הפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית) טיפול, במידת הצורך14. בהקשר זה, גיל האישה בזמן vitrification הביצית הוא ללא ספק הגורם המגביל החשוב ביותר15 כמו גיל אימהי מתקדם (AMA; >35 שנים) הוא הגורם העיקרי לאי פוריות נשית16. מלבד הפחתה הדרגתית בשמורת השחלות, AMA קשורה לפגיעה בכשירות הביצית עקב מסלולים פיזיולוגיים פגומים כגון חילוף חומרים, רגולציה אפיגנטית, מחסומי מחזור תאים והפרדה מיוטית17. לכן, המספר הסביר של ביצים כדי לvitrify תלוי בעיקר בגיל האימהי. אצל נשים מתחת לגיל 36, לפחות 8-10 ביוצים18 נדרשים כדי למקסם את סיכויי ההצלחה. באופן כללי, ככל שמספר היוציטים גבוה יותר, כך גדל הסיכוי להצלחה. לכן, התאמת גירוי השחלות על פי סמני עתודה השחלות כגון רמות הורמון אנטי מולרי (AMH) או ספירת זקיק אנטרלי (AFC) חיוני כדי לנצל באופן מלא את עתודת השחלות בזמן הקצר ביותר האפשרי.

הבטיחות של ההליך כולו היא הנושא המרכזי השני בעת רישום חולים לשימור פוריות. רופאים צריכים להשתמש באסטרטגיות הטובות ביותר כדי למזער את הסיכונים ולמנוע (i)תסמונת גירוי יתר השחלות (OHSS) באמצעות גישות בטוחות כגון הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH) פרוטוקול אנטגוניסט ואחריו גורם אגוניסט GnRH19 ו -(ii) את המרוחק, עדיין אפשרי, סיכונים של דימום צפק, פגיעה במבני האגן (השופכן, המעי, נספח, עצבים), או זיהום באגן במהלך אחזור ביציות. לבסוף, (iii) משטרים מסורתיים לגירוי קשורים אסטרדיול סרום סופרפיזיולוגי ולכן, אינם מומלצים במחלות רגישות לאסטרוגן כגון סרטן השד. פרוטוקולים מעורבים מעכבי ארומטאז (כגון letrozole או טמוקסיפן) מתאימים יותר במקרים אלה20,21. בסביבת המעבדה, הפרוטוקול הנפוץ ביותר עבור vitrification oocyte הוא עדיין אחד שתואר לראשונה על ידי Kuwayama ועמיתיו 2,23, אשר מורכבהליךצעד הכולל תוספת הדרגתית של cryoprotectants (CPAs). בשלב הראשון (שיווי משקל/התייבשות), ביציות נחשפות בתמיסת רו"ח המכילה 7.5% v/v אתילן גליקול ו-7.5% v/v דימתיל סולפוקסיד (DMSO), ואילו בשלב השני, ביציות מועברות לתמיסת vitrification עם 15% v/v אתילן גליקול ו-15% v/v DMSO, בתוספת 0.5 סול/ל סוכרוז. לאחר דגירה קצרה באמצע של vitrification, הביציות ניתן להציב ב קריודוויצים מעוצבים במיוחד, פתוח ולבסוף צללו חנקן נוזלי ב -196 °C כדי להיות מאוחסן עד השימוש.

כאן, כל העבודה הקלינית והמעבדה של טיפול לשימור פוריות תוארה על ידי (1) מתווה המלצות לייעוץ אובייקטיבי ומבוסס ראיות, (ii) תוך התמקדות בעלויות האפקטיביות של ההליך, ו-(iii) תיאור האסטרטגיות המתאימות ביותר לניצול מלא של עתודת השחלות ולמקסם את מספר הביציות שאוחזרו בזמן הקצר ביותר האפשרי. הערכת עתודת השחלות, ההגדרה של פרוטוקול גירוי אידיאלי, כמו גם הליכי אחזור ביציות, גינוי והתחדשות יפורטו יחד עם גישות כדי למקסם את היעילות שלהם, יעילות, ובטיחות. מאחר שפרוטוקולים או התאמות אחרות של פרוטוקול זה קיימות בספרות, התוצאות הייצוגיות וסעיפי הדיון בכתב יד זה חלים רק על הליך זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייעוץ רפואי וייעוץ קליני

הערה: במקרה של מטופלים הזקוקים לשימור פוריות מסיבות אונקולוגיות, ודאו כי אין רשימת המתנה לייעוץ תזמון, והמינוי יינתן בהקדם האפשרי.

  1. לבחון את ההיסטוריה הרפואית ואת המסמכים הקודמים, ולהעריך את מצבו הבריאותי הכללי של המטופל.
  2. תעד את כל המידע (כולל אישור האונקולוג לעבור גירוי שחלות במקרה של חולי סרטן) במסד נתונים יחסי.
  3. לספק למטופל ייעוץ ספציפי לגבי היתכנות ההליך. הסבר את שלבי ההליך (גירוי השחלות, אחזור ביציות, ביציות), וליידע אותה על סיכויי ההצלחה הריאליים (תלויים בעיקר בגיל האימהי ובמספר הצפוי של ביציות MII בזמן אחזור הביצית), כמו גם על העלות והמגבלות של ההליך.
  4. בצע אולטרסאונד transvaginal כדי לקבל מידע על עתודת השחלות (כלומר, AFC) ולהעריך את הנגישות של השחלות לאיסוף ביצים.
  5. בקש בדיקות דם כדי להעריך את קבוצת הדם ואת גורם רזוס, הקרנת קרישה (ספירת דם, פרוטרומבין, פקקת, פיברינוגן, חלבון C, חלבון S, אנטי תרומבין III, הומוציסטאין), ומחלות זיהומיות (הפטיטיס B, הפטיטיס C, HIV, מעבדה לחקר מחלות מין/Treponema pallidum Hemagglutination Assay).
    הערה: במקרה של חולים גישה לתוכנית שימור פוריות מסיבות רפואיות לא דחופות, הערכה מקיפה יותר עשויה לכלול הורמון מגרה זקיק בזית (FSH), הורמון מחלמן (LH), אסטרדיול, AMH, בדיקת שד, בדיקת Papanicolaou, הקרנה גנטית של קרישה (גורם V של ליידן ופרוטרומבין), והקרנת לפיד (טוקסופלזמוזיס, רובלה, ציטומגלובירוס).
  6. בקש הערכה קרדיולוגית (אלקטרוקרדיוגרמה).
  7. ממליץ על ייעוץ פסיכולוגי.

2. פרוטוקולי גירוי שחלות מבוקרים לשימור פוריות

הערה: כאשר הזמן הזמין לפני תחילת הטיפול בסרטן מוגבל, פרוטוקול התחלה אקראית (כלומר, החל גירוי השחלות בכל עת במהלך המחזור החודשי) מומלץ עבור גירוי השחלות בחולים אונקולוגיים המועמדים לשימור פוריות. בתוכנית לשימור פוריות מסיבות רפואיות או מסיבות חברתיות לא דחופות, גירוי קונבנציונלי החל בשלב הזקיקים המוקדם עדיף, וגירוי השחלות מתחיל בהתבסס על המחזור החודשי. גישות גירוי השחלות מבוקרות (COS) צריכות להתבצע על פי הנחיות החברה האירופית האחרונה לרבייה ועובריות אנושיות (ESHRE)24.

  1. חייט COS בהתאם למאפייני המטופל וסמני המילואים של השחלות, בעיקר גיל אימהי, FSH, AMH ו- AFC.
  2. התחל COS ביום 5 של המחזור החודשי באמצעות רקומביננטי או שתן FSH עם מנה קבועה של 150-300 IU ליום (פרוטוקול אנטגוניסט).
    הערה: באוכלוסיית מטופלים ספציפית עם מחסור ב- LH או תגובה תת-אופטימלית ירודה, ניתן לתת LH 75/150 IU ליום נוסף בהתאם לתגובת השחלות, רמות ה- LH ושיפוט הגינקולוג.
  3. בחולים עם מחלות רגישות לאסטרוגן, כוללים גונדוטרופינים הקשורים מעכבי ארומטאז (letrozole) מיום 1 של גירוי עד יום 7 לאחר אחזור ביציות.
  4. לנהל מנה קבועה של גונדוטרופינים במשך 4 ימים.
  5. לפקח על צמיחת זקיקים ביום 5 ולאחר מכן כל 2-3 ימים; בסופו של דבר, להתאים את המינון גונדוטרופין.
  6. ברגע שלפחות 3 זקיקים מגיעים לקוטר 17-18 מ"מ, לנהל את ההדק להבשלת ביציות סופית עם בולוס תת עורי יחיד של אגוניסט GnRH במינון של 0.5 מ"ל.

3. אחזור אוציט

  1. הכנה לאחזור ביטים
    1. עבור חומרים נדרשים, עיין בטבלת החומרים, ולשמור על נעלי מעבדה מוכנות ותלבושת, מסכת פנים כירורגית, כיסוי שיער, כפפות כירורגיות, סמן קבוע לא רעיל, פינצטה, גזות קטנות סטריליות, ספקולום חד פעמי או לשימוש חוזר, ציוד ניתוח נרתיקי וחומר חיטוי משטח. ודאו את זמינות ציוד ההחייאה, תרופות הרדמה להיפוך, ערכה המוכנה לטיפול בהלם אנפילקטי וחמצן בחדר הניתוח.
    2. בצע את הליך אחזור הביצית על פי המלצות קבוצת העבודה ESHRE על אולטראסאונד בטכנולוגיות רבייה בסיוע (ART)25.
      1. ניהול תרופות מרגיעות או הרדמה כללית, ואנטיביוטיקה עבור מניעתי.
        הערה: בפרוטוקול זה, נשימה עמוקה הושגה על ידי administrating propofol (אשר המינון מותאם על פי משקל המטופל) ו 50-100 מיקרוגרם של פנטניל, 1000 מ"ג של אקמול, ואוורור מסכה בסיוע עם חמצן.
      2. בצע אחזור ביוציטים באמצעות יחידת שאיפה המורכבת ממשאבת ואקום, צינור איסוף המחובר למחט 17 G של לומן יחיד וצינור איסוף ביוציטים. במהלך האיסוף, לא יעלה על לחץ של ~ 120 ממ כג כדי למנוע את הסיכון של נזק oocytes כגון הפשטת תאי קומולוס או שבירת pellucida.
      3. כייל את טמפרטורת משטח העבודה כדי להבטיח 37 °C (7°F) במדיה התרבותית. במהלך כל ההליך, למזער את החשיפה oocyte אפילו טמפרטורה חולפת שעשויה להשפיע על היכולת ההתפתחותית שלהם.
      4. בסוף אחזור הביצית, יש לבחון את המטופל במשך 3-4 שעות לפני השחרור.
  2. מבצע תיאטרון
    1. לפני הכניסה לחדר הניתוח, לזהות את המטופל ולאשר את זמן הדק הביוץ.
    2. שהמטופל ישכב על שולחן הניתוחים בתנוחה גינקולוגית.
    3. יש לנקות את הנרתיק/צוואר הרחם לפני אחזור הביצית כדי למזער זיהום חיידקי.
    4. בצע אולטרסאונד transvaginal ראשוני כדי להעריך את המיקום של השחלות ואת היחסים האנטומיים עם האיברים השונים וכלי הדם.
    5. תחת הדרכת אולטרסאונד, הכנס מחט לומן יחיד דרך דופן הנרתיק לתוך זקיק השחלות, תוך כדי קפדנות לא לפגוע באיברים או בכלי הדם הממוקמים בין דופן הנרתיק והשחלה.
    6. התחל שאיפה מהזקיק הקרוב ביותר ועבר אל אלה הדיסטליים ביותר.
    7. לנקב את כל הזקיקים בקוטר גדול מ 11-12 מ"מ, ביצוע "תנועות פיתול" של המחט כדי לשאוף את כל נוזל הזקיקים, אשר משתחרר לאחר מכן לתוך צינור סטרילי (תחתית עגולה 14 מ"ל) מחומם מראש בתנור הבלוק של חדר הניתוח.
    8. מיד לאחר אחזור, לאטום ולתייג את הצינור עם פרטים של זהות המטופל.
    9. ודא כי האחות מביאה את הצינור למעבדה, שם הוא מוקרן מיד לנוכחות של מתחמי קומולוס-ביציות (COCs).
    10. הורה לעוברים ליידע את המטפל על המספר הכולל של COCs שאוחזרו.
    11. לאחר השלמת ההליך עבור השחלה הראשונה, לשטוף את המחט עם מדיום נקי, ולהמשיך עם השחלה השנייה באמצעות אותו הליך.
    12. לאחר אחזור הביצית, להעריך כל דימום מן השחלות או כלי הדם של parametrium ונוזל חופשי בכיס של דאגלס.
      הערה: כדי להפוך ולשפר את האפקטיביות של גמטה ומעקב אחר העובר ברמה הקלינית, מערכת ראייה אלקטרונית (EWS) יושמה במרכז26. עם זאת, פרוטוקול זה אינו מזכיר את EWS, כדי להבטיח שחזור של הפרוטוקול בכל מעבדה IVF. עם זאת, שקול כי כל שלבי ההליך דורשים מפעיל שני (כלומר עד) כדי להבטיח מעקב gamete ועובר.

4. מעבדת IVF

  1. יום לפני הליך אחזור הביצית
    1. הכן צינורות איסוף oocyte (עיין בטבלת החומרים).
      1. יש לפזר 1 מ"ל של מדיום IVF (עיין בטבלת החומרים)בכל צינור איסוף ביציות (תחתית עגולה, 5 מ"ל), ולכסות ב-0.2 מ"ל של שמן מינרלי (עיין בטבלת החומרים)לתרבות העובר.
        הערה: מספר הצינורות יוגדר בהתאם למספר הזקיקים הצפויים להיות מאוחזרים. כל צינור עשוי להכיל עד 4 COCs.
    2. לאטום את הצינורות עם הכובע (הצמדה ראשונה). תייג את הצינורות עם פרטים על סוג הבינוני ותאריך ההכנה. לדגור על הצינורות לילה ב 37 °C (37 °C) באטמוספירה מבוקרת (6% CO2,5% 02).
  2. ביום אחזור הביצית
    1. לפני המלחמה את אספקת הפלסטיק ב 37 °C (מנות תרבות סטרילית פיפטות פסטר).
    2. בקש מהמטופלים לאשר את זהותם (שם מלא ותאריך לידה) ואת זמן הדק הביוץ. יש לציין בגיליון המעבדה כי הליך הזיהוי (ID) הושג, וכי זמן הדק הביוץ אושר.
    3. קח את צינורות איסוף ביציות את האינקובטור (ממש לפני ההליך מתחיל), ולדחוף את המכסה כדי להבטיח סגירה הדוקה. תייג את צינורות איסוף האוציטים עם המידע של המטופל. מניחים את צינורות איסוף ביציות בתנור הבלוק ב 37 °C (50 °F).
    4. בדוק את הנוזל הזקיקי במנות התרבות הסטרילית המוארות מראש, וזיהה COCs. לאחר זיהוי COCs אחד או יותר, לשטוף אותם פעמיים בשתי טיפות של בינוני כדי להסיר את נוזל הזקיקים וזיהום הדם.
    5. העבר את COCs לצינורות איסוף ביציות וביאור מספר COCs על הצינור. שחררו את המכסים של הצינורות הבינוניים, ומיד לדגור אותם ב 37 °C (5 °F) באווירה של 6% CO2, 5% O2.
    6. חזור על שלבים 7 עד 9 בהתאם למספר הביציות שאוחזרו. עדכן את גיליון המעבדה.
      הערה: ודא כי עד בודק כי כל בלוקי חימום הצינור (כולל אלה בחדר הניתוח) ריקים וחותמת על סגירת ההליך על גיליון המעבדה.
    7. נגב את שלב העבודה לאחר השלמת ההליך.

5. גינוי אוציט

  1. לפני המלחמה 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינתאנסולפונית (HEPES) חוצצת בינונית היאלורונידאז (עיין בטבלת החומרים) ב 37 °C לפחות 1 שעה לפני תחילת.
  2. הכן צלחת IVF 4-well (עיין בטבלת החומרים) עם 0.6 מ"ל / באר של מדיום חציית HEPES מחמם מראש (בתוספת אלבומין סרום אנושי 5% [HSA]) מכוסה 0.3 מ"ל של שמן מינרלי לתרבות העובר, וחום ב 37 °C לפחות 30 דקות.
  3. תייג את צלחת ההוקעה של האוציט עם פרטים על זהות המטופל.
  4. מיד לפני תחילת ההליך, להוסיף היאלורונידאז לבאר הראשונה כדי לקבל ריכוז סופי של כ 20 IU / מ"ל.
  5. מניחים מספר מוגבל של COCs (עד 6) בבאר הראשונה המכילה את האנזים כדי לפזר את תאי קומולוס.
  6. כדי לשפר את ההסרה אנזימטית של הקומולוס ותאי הקורונה, בצעו את ההפשטה של תאי קומולוס על ידי צנרת של בוציטים שוב ושוב דרך פיפטה פסטר בקוטר פנימי של כ -250 מיקרומטר עד 30 מעלות. לאחר ניתוק התא הראשוני הוא ציין, להעביר את oocytes לבאר השנייה המכיל רק HEPES-חוצץ מדיום, דואג לשאת על כמות מינימלית של האנזים.
  7. בצע גינוי נוסף כדי להסיר את תאי קורונה באמצעות פיפטות denuding עם הפחתת קטרים פנימיים (170-145 מיקרומטר). השתמש בקטרים נמוכים יותר (135μm) רק אם יש צורך בקפדנות.
  8. יש לשטוף בזהירות את הקציטים המושחתים כדי לשטוף את האנזים.
  9. לאחר ההוקעה, לבחון את oocytes תחת מיקרוסקופ הפוך כדי להעריך את שלמותם ואת שלב ההתבגרות. הפרד את ה- MII oocytes מהבלתי בוגרים (נצנצים נבטים ומטפאז-I).
  10. העבר את הביציות MII לאזור ה- vitrification כדי לבצע באופן מיידי שימור קריופ. עדכן את גיליון המעבדה.

6. vitrification Oocyte

הערה: בצע vitrification ביציוט רצוי בתוך 38 שעות של אחזור ביצית ומיד לאחר denudation. הליך ה-vitrification המתואר כאן צריך להתבצע בטמפרטורת החדר (RT) ובאמצעות פיפטה חשפנית בקוטר פנימי של 170 מיקרומטר כדי לא לפגוע ביציות במהלך מניפולציה.

  1. כ 30 דקות לפני ההליך, להביא את פתרון שיווי משקל (ES) ופתרון vitrification (VS) ל RT (25-27 °C (25 °C).
  2. תייג כראוי את הקריודביקסים עם שם המטופל ותעודת הזהות שלו, תעודת זהות הטיפול, תאריך ההקפאה, מספר ביציות והקפאה.
  3. מלאו ארון קירור חד פעמי עד למעלה בחנקן נוזלי טרי, והתחלו את תהליך העיקור.
  4. סמן את לוחית ההדבקה (עיין בטבלת החומרים) עם שם המטופל ותעודת הזהות. בקש מעד לבדוק את המזהה הנכון של הקריודביקסים.
  5. הפוך בזהירות כל מקטורינה פעמיים כדי לערבב את תוכנו לפני השימוש, ולהכין את המכסה של צלחת פטרי 6 מ"מ עם טיפה אחת של 30 μL של בינוני HEPES-buffered (עם 5% HSA) וטיפה סמוכה אחת של 30 μL של ES.
    הערה: יש להניח טיפות ממש לפני השימוש כדי להגביל אידוי בינוני.
  6. באמצעות פיפטה חשפנית בקוטר 170 מיקרומטר, מניחים את היוציטים (עד 9) בטיפה הראשונה עם הנפח הקטן ביותר האפשרי של בינוני. באמצעות פיפטת החשפנית, צור גשר של בינוני בין הטיפה n.1 ו- n.2 כדי להשיג עלייה הדרגתית בריכוז של CPAs (איור 1A).
  7. לדגור את oocytes בירידה הראשונה במשך 3 דקות. הוסף טיפה שלישית של 30 μL של ES (n.3). לאחר 3 דקות, העבירו את היוציטים לטיפה השנייה של ES, ויצרו גשר בינוני בין טיפות n.3 ו- n.2 (איור 1B). לדגור את oocytes טיפה n.3 במשך 3 דקות.
  8. במהלך הדגירה, להוסיף טיפה אחת 30 μL של ES עבור כל קריודוביצה כי ישמש (אם 9 ביציות הם להיות cryopreservedreserved, למקם 3 טיפות של ES עם 3 ביציות בכל טיפה של ES). העבירו את היוציטים לתמיסת ES טהורה, והותירו אותם למשך 6-9 דקות (עד שהם ישחזרו את גודלם ההתחלתי לאחר ההתכווצות) (איור 1C).
  9. הכן מנה באר מרכזית (60 x 15 מ"מ) עם 1 מ"ל של VS. בסוף 6 הדקות הראשונות, להעביר את oocytes להיות cryopreserved לתוך פתרון VS, שחרור מדיום קטן ככל האפשר. השאירו את oocytes VS במשך 1 דקות, לשטוף אותם בזהירות על ידי העברת אותם מלמטה לחלק העליון של המנה כדי להסיר את עודף של ES.
  10. כ -10 לפני סוף דקת הדגירה, מניחים את הקריודביצה מתחת למיקרוסקופ, ומתאימה את המיקוד בסימן השחור (כלומר, קצה הקריודביצה). הניחו את הקיציטים על הקריודביצה לצד הסימון השחור עם הכמות המינימלית של VS(איור 2A).
  11. הרחו את פיפטת החשפנית מהביציאטים, והסירו את עודף המדיום VS(איור 2B)כך שהאוציטים יישארו מכוסים בשכבה דקה של בינוני(איור 2C).
  12. במהירות לצלול cryodevice בחנקן נוזלי, במהירות לנער אותו כדי להסיר בועות אוויר מפני השטח שלה. החזק את מכסה המגן של cryodevice עם פינצטה, ולמלא אותו עם חנקן נוזלי; ואז להכניס את cryodevice לתוכו תוך שמירה על רצועות פרופילן בחנקן נוזלי.
  13. אחסן את הקריודביצה ב visiotube שתויג בעבר עם המידע של המטופל. עדכן את גיליון המעבדה.

7. התחממות אוציט

  1. כ-30 דקות לפני ההליך, מחממים את תמיסת ההפשרה (TS), פתרון הדילול (DS) ופתרון הכביסה (WS) ל-RT (25-27 מעלות צלזיוס). הפוך בזהירות כל 800 פעמיים כדי לערבב את תוכנו. מניחים 1 מ"ל של TS בצלחת פטרי מרכזית, ומחממים אותו ב 37 °C לפחות 1 שעה לפני תחילת ההליך.
  2. סמן את כל חומרי הפלסטיק עם שם המטופל ותעודת הזהות וסוג הפתרון. בקש מעד לאשר את המידע של המטופל על הקריודביצה.
  3. כדי שכל קריודציה תתחמם, הכינו צלחת של 6 בארות עם 200 μL של DS בבאר הראשונה וכמות שווה של WS בשנייה ובשלישית (בשם WS1 ו- WS2, בהתאמה). מוסיפים תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) או מים סטריליים באזור שמחוץ לבארות כדי למנוע אידוי.
  4. מוציאים את צלחת ה-TS מהאינקובטור ומניחים אותה מתחת למיקרוסקופ. התאימו את מוקד המיקרוסקופ למרכז צלחת הפטרי.
  5. בזהירות לסובב ולהסיר את מכסה המגן של cryodevice, תוך שמירה על רצועות פרופילן בחנקן נוזלי. העבר את cryodevice מן החנקן הנוזלי לתוך TS מהר ככל האפשר כדי למנוע את הסיכון של devitrification וליזום את הספירה לאחור (1 דקות).
  6. לוקליזציה של ביוציטים על ידי התמקדות בקצה הקריודביצה (כלומר, הסימן השחור). בעזרת פיפטה חשפנית, שחררו את הקיצנים מהקריודביצה.
    הערה: נסה לא לשאוף את היוציטים מהקריודביצה; שחררו עליהם בעדינות מדיה עד שהם עוברים ל-TS.
  7. באמצעות פיפטה חשפנית בקוטר 170 מיקרומטר, להעביר את oocytes ל- DS עם כמות קטנה של TS (כדי ליצור שיפוע), ולהשאיר אותם DS במשך 3 דקות. העבר את היוציות ל- WS1 באופן דומה, והותיר אותם למשך 5 דקות. לבסוף, להעביר את oocytes ל WS2 במשך 1 דקות.
  8. מעבירים את היוציטים למדיום מתאים של תרבית IVF לפני ההפריה ההוריתית, ודגר אותם למשך שעה אחד לפני שתמשיכו בהזרקת זרע אינטריסטופלסמי (ICSI). עדכן את גיליון המעבדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סקירה כללית של התוכנית לשימור פוריות במרכז

במשך תקופה של 12 שנים (2008-2020), 285 נשים עברו לפחות אחזור ביציות אחד שנובע את ההבשלה של כל קבוצת הביצים הבוגרות שנאספו. רוב הנשים הללו (n=250) עברו אחזור אחד, ו-35 עברו אחזורים מרובים. הסיבות לאחזור הביצית לוויטוריזציה של ביצים מסוכמות ל-4 קטגוריות: רפואי (למעט סרטן), סרטן, לא רפואי ועוד. בין 250 הנשים שעברו בדיקת ביציות אחת לוויטוריזציה של ביצים, ל-8% היו סיבות רפואיות מלבד סרטן (10 אנדומטריוזיס, 3 מיומה, 4 ציסטות שחלות, 1 הידרוסלפינקס), ל-16% היו סרטן (31 סרטן השד, 3 סרטן השחלות, 2 סרטן המעי הגס, 2 לימפומה של הודג'קין, 1 סרטן הפות e 1 סרטן צוואר הרחם), ל-53% היו סיבות לא רפואיות, ול-23% היו סיבות אחרות (43 היעדר זרע שאוחזר, 10 סיכון ל-OHSS, 4 זיהומים ו-1 חום). התפלגות זו הייתה שונה בקרב מטופלים שעברו אחזורי ביציות מרובים להתחדשות ביצים. באופן ספציפי, ל -9% היו סיבות רפואיות מלבד סרטן (1 אנדומטריוזיס, 2 עתודה מופחתת בשחלות), 6% סבלו מסרטן (2 סרטן השד), ל -80% היו סיבות לא רפואיות, ול -3% היו סיבות אחרות (1 היעדר זרע שאוחזר). אף אחת מהמטופלות שעברו אחזורי ביציות מרובות לביציות ביצים לא חיממה את הביצים הללו, בעוד ש-78 מתוך 250 הנשים שעברו מחזור vitrification ביצה אחד חזרו להשתמש בביציות האלה(איור 3).

טבלה 1 מסכמת את הנתונים של 250 הנשים העוברות מחזור vitrification ביציות יחיד המקובצים בהתאם לסיבות הקשורות. החולים עם סיבה רפואית להתחדשות הביציות והמטופלים שעברו שימור פוריות בגלל סרטן היו צעירים יותר (גיל אימהי ממוצע < 35 שנים) והראו עתודה טובה יותר לשחלות (AFCs גבוהות יותר) מאשר חולים מסיבות שאינן רפואיות או אחרות. עם זאת, שיעורי ההבשלה הממוצעים (מספר הביציות של MII/מספר COCs שאוחזרו) היו מעט נמוכים יותר (72-73% לעומת 77-79%), כך שמספר הביציות שהוחזרו בממוצע היה דומה ב-4 הקבוצות (9-10 ביציות). חשוב לציין, 9 מתוך 40 חולים אונקולוגיים (22.5%) עברו פרוטוקול גירוי שחלות התחלה אקראית כי היה להם זמן מוגבל לפני תחילת כימותרפיה או הקרנות. מעניין שכמחצית מהחולים עם סיבות רפואיות שאינן סרטן (53%) ורוב החולים עם סיבות אחרות להתחדשות ביצים (76%) חזרו למעשה להתחממות. לעומת זאת, מעט מאוד חולים עברו שימור פוריות לסרטן (17.5%) או מסיבות לא רפואיות (13%) השתמשו ב- oocytes המשובח שלהם להפריה חוץ גופית. מדהים גם הוא הזמן שחלף בין vitrification והתחממות בקרב החולים שחזרו: בממוצע, 283 ימים בחולים עם סיבות רפואיות מלבד סרטן, 132 ימים בחולים עם סיבות אחרות, 1264 ימים בחולים אונקולוגיים, ו 1547 ימים בחולים עם סיבות לא רפואיות. ללא קשר לכל ההבדלים הרלוונטיים הללו, שיעור ההישרדות היה דומה (83-88%; בממוצע, 8-11 ביציות התחממו, ו 7-9 ביציות שרדו) בין החולים ב -4 הקבוצות, ובכך אישרו את היעילות והבטיחות של פרוטוקולי vitrification והתחממות ביציות. יתר על כן, שיעור ההישרדות אינו תלוי בהתחדשות ובחוויית מפעיל ההתחממות(איור 4א,B). טבלה 1 מציגה את שיעורי ההפריה ב-4 הקבוצות, שהם כ-70%, למעט חולים עם סיבות לא רפואיות לביציות ביציות (כ-80%). עם זאת, נתונים אלה אינם דומים בשל גודל מדגם קטן ואת ההטיה של גורם הזרע על תוצאת ההפריה27.

Figure 1
איור 1: תצורת טיפה בינונית עבור שימור קריופרציה של oocyte. כדי לבצע בהדרגה שיווי משקל, ביציות ממוקמות תחילה בטיפה (A)של BS ומעורבבות עם (B) טיפה שלES. לאחר 3 דקות של דגירה,(C)טיפה שלישית של פתרון ESמעורבת, וביציות מדגרות במשך 6-9 דקות. קיצורים: HEPES = 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינתאנסולניק; BS = מדיום עם אגירה HEPES; ES = פתרון שפל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: טעינת אוציטים במכשיר cryopreservation. ביוציטים ממוקמים על cryodevice ב (A) טיפה קטנה אחת של VS. (B)פיפטת החשפנית מוזזת מן oocytes, ו (C)עודף VS הוא שאיפה מחדש להשאיר רק שכבה דקה סביב כל ביוך. קיצור: VS = פתרון vitrification. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מחזורי vitrification Oocyte שבוצעו במרכז GENERA לרפואת פוריות של רומא (שנים 2008-2020). במהלך 12 השנים, 250 חולים עברו אחזור ביציות אחד עבור vitrification ביציות, בעוד 35 עברו מחזורי אחזור ביציות מרובים. הסיבות המובנות לביטור ביציות מוצגות באיור. המטופלות החוזרות להתחממות (n=78) שייכות רק לקבוצת הנשים אשר עברו מחזור ביציה אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: שיעור הישרדות ממוצע לכל קבוצה של ביוציטים מחוממים. (א)ניסיון מפעילי התחממות ו-( B). כל מטופל כלול רק במחזור ההתחממות הראשון. הבדלים מובהקים סטטיסטית הוערכו באמצעות מבחן Uמאן-ויטני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מורפולוגיה של אוציט בתחילתו ובסוף הליך ההתיכוננות. כדי לקבוע את התוצאה של הליך שיווי משקל, זה עשוי להיות שימושי כדי ביאורים (A) מורפולוגיה ביציות לפני תחילת ההליך. (B)התכווצות חדה של הביוציט נצפית לאחר חשיפה ראשונה לתמיסת ההקפאה. הליך השיוויון יכול להיחשב שלם כאשר (C) ביוט התאושש נפחו הראשוני. סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סיבה לביטורציה של ביציט רפואי מלבד סרטן (n = 19) סרטן (n=40) לא רפואי (n=133) אחר (n=58)
גיל אימהי באחזור ביציות, ממוצע±SD 33.6±6.4 שנים 34.6±5.9 שנים 37.0±3.4 שנים 38.2±4.3 שנים
בז"ל FSH, ממוצע±SD 7.5±4.2 IU/L 7.6±1.7 כיב"ל/ל' 7.8±4.1 IU/L 8.8±5.2 IU/L
AMH, ממוצע±SD 1.8±1.7 ננוגרם/מ"ל 1.9±0.2 ננוגרם/מ"ל 2.2±2.4 ננוגרם/מ"ל 3.0±2.5 ננוגרם/מ"ל
AFC, ממוצע±SD 12.7±5.0 13.3±7.0 11.6±6.1 10.7±6.7
BMI, ממוצע±SD 20.1±1.5 21.8±1.6 20.2±3.1 22.9±3.6
משך הגירוי, ממוצע±SD 10.0±1.5 9.6±1.7 9.9±2.1 10.3±2.1
9/40, 22.5%
התחלה אקראית
COCs, סה±40 פחמן דו±SD 239 551 1493 592
12.6±5.3 13.8±9.1 11.2±7.1 10.2±8.5
כל ביטים, סה±D ממוצע 167 400 1161 462
8.8±3.3 10.0±7.2 8.7±5.7 8.0±6.7
קצב התבגרות, ממוצע±SD 72.4±13.6% 72.1±19.6% 79.5±17.5% 77.4±22.2%
חולים חוזרים להתחממות, סך כל החולים עברו התחדשות 10/19, 52.6% 7/40, 17.5% 17/133, 12.8% 44/58, 75.9%
ימים בין התחדשות להתחממות ראשונה, ממוצע±SD 283±225 1264±764 1547±709 132±203
בוציטים מחוממים, ממוצע מוחלט±SD 82 66 191 409
8.2±2.8 9.4±4.8 11.2±5.8 9.3±7.2
שרד את כל היוציות, ממוצע מוחלט±SD 73 55 160 345
7.3±3.3 7.9±4.0 9.4±4.8 7.8±6.9
שיעור הישרדות, ממוצע±SD 87.6±18.1% 83.2±1.7% 85.4% ±14.5% 84.7±21.9%
גורם זרע
N, n, % 5/10, 50% 4/7, 57% 13/17, 76% 13/44, 29%
MMF, n, % 3/10, 30% 3/7, 43% 3/17, 18% 17/44, 39%
OAT, n, % 2/10, 20% - 1/17, 6% 11/44, 25%
NOA, n, % - - - 3/44, 7%
שיעור הפריה, ממוצע±SD 70.0±14.4% 70.0±17.0% 78.5±20.6% 71.0±24.3%

טבלה 1: חולים העוברים מחזור אחד של vitrification ביוט. קיצורים: FSH = הורמון מגרה זקיק; AMH = הורמון אנטי מולרי; BMI = מדד מסת גוף; COC = מתחמי קומולוס ביציות; MII = מטפאזה-II; N = נורמוזוספרמי; MMF = גורם גברי מתון (1-2 פגמים בזרע); OAT = אוליגואסתאטראטרוזופרמי; NOA = אזוספרמיה לא חסימתית (זרע נאספו באמצעות מיצוי זרע האשכים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיקולים קליניים

למרות אסטרטגיות המתעוררות, כגון קריופרה של רקמת השחלות והבשלת הפריה חוץ גופית, נחקרו, vitrification oocyte לאחר COS היא טכניקה סטנדרטית זהב לשימור פוריות. בתרחיש זה, מספר הביציות שאוחזרו והקפאה צריך להיות מוגדל בזמן הקצר ביותר האפשרי כמו רוב חולי הסרטן עשויים להפיק תועלת אך ורק ממחזור שחלות אחד לפני שהם צריכים להתחיל את הטיפול בסרטן שלהם(ים). לכן, פרוטוקול גירוי שחלות תקין הוא חיוני כדי לנצל באופן מלא את עתודת השחלות ולהגדיל את הסיכוי המצטבר של לידה חיה בעתיד28, תוצאה תלויה מאוד בגיל האימהי באחזור הביצית. בהקשר זה, גיל אידיאלי עבור vitrification oocyte למטרות שימור פוריות עדיין לא הוצע29, וקונצנזוס נדרש בין 35 שנים18 או 37 שנים30,31. עם זאת, שימור פוריות צריך להיות נגיש לכל המטופלים, כולל נשים מעל גיל 37, בתנאי שהם מקבלים ייעוץ נאות על שיעורי ההצלחה בהתבסס על גילם.

הפרוטוקול ואת המינון ההתחלתי של תרופות צריך להיות מתואר על פי שיקול דעתו של הגינקולוג והכי חשוב, בהתבסס על הזמןהזמין 32,33. החל גירוי קונבנציונלי בשלב הזקיקים המוקדמים מומלץ כאשר הזמן אינו בעיה. עם זאת, במידת הצורך, הגישה של התחלה אקראית אפשרית כדי למזער עיכובים בהתחלת טיפולים דחופים לסרטן / רפואי34,35. התפתחות זקיקי דווחה להיות תהליך דינמי מאוד כמו גלים מרובים של גיוס זקיק תוארו לאורך מחזור השחלות אחד. למרות המנגנונים הביולוגיים מאחורי תופעה זו עדיין צריך להיחשף, ביציות מוסמכות ניתן לאחזר cryopreserved ללא תלות בשלב המחזור החודשי שבו COS הוא התחיל36.

במרכז זה, גירוי השחלות מבוצע בדרך כלל באמצעות פרוטוקול אנטגוניסט GnRH ו 150-300 IU ליום של רקומביננט-FSH או גונדוטרופין גיל המעבר האנושי. באוכלוסיות ספציפיות של חולים מעל גיל 35 שנים, עם מחסור ב- LH, או מראה תגובה תת-אופטימלית לאחר COS סטנדרטי, LH עשוי להתווסף במהלך COS כדי להגדיל את הגיוס והצמיחה של זקיקים באמצעות פעולה סיסרגית עם גורם גדילה דמוי אינסולין 116,37,38. יתר על כן, פרוטוקול אנטגוניסט GnRH ואחריו גורם אגוניסטי GnRH דווח להיות קצר, בטוח, פרוטוקול גירוי נוח מאוד כדי למקסם את התגובה השחלות ולמזער את הסיכון עבור OHSS39. בחולים עם מחלות רגישות לאסטרוגן כגון סרטן השד, גונדוטרופינים הקשורים מעכבי ארומטאז, כגון letrozole, מנוהלים20.

למעשה, סקירה שנערכה לאחרונה הראתה כי letrozole כרוך בתגובת שחלות דומה כמו גירוי קונבנציונלי ללא סיבוכים במונחים של פגמים מולדים, הישנות ממאירות, ותמותה מוגברת40. באופן דומה, טמוקסיפן עשוי לשמש במהלך COS במקרה של גידולים רגישים לאסטרוגן, אשר, כמו letrozole, הראה שום השפעה על יכולת ביציות41,42. עם זאת, זה צריך להיות מאושר במחקרים גדולים יותר. במרכז זה, letrozole מנוהל מיום 1 של גירוי עד יום 7 לאחר אחזור ביציות במקרה של גידולים רגישים אסטרדיול. הסיכון עבור OHSS, שהוא הסיבוך החשוב ביותר של COS כי גם לעכב עוד יותר טיפולים נגד סרטן, יש לקחת בחשבון, במיוחד בחולים צעירים עם AFCs גבוה. במקרים אלה, הפעלת הביוץ עם אגוניסט GnRH במקום גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) הוכיח להיות מועיל. נושאים אחרים שיש למנוע הם (i) תרומבו-תסחיף, אשר דורש ניהול של הפרין במשקל מולקולרי נמוך במהלך COS, ו -(ii) תגובה השחלות מופחת לאחר COS43. כדי לפצות על האחרון, שני גירויים רצופים במחזור שחלות אחד עשוי להתבצע. פרוטוקול COS חדשני לא קונבנציונלי זה, המכונה DuoStim, כרוך בגירויים של שלבים זקיקיים ולוחמים ושני אחזורי ביציות בפרק זמן קצר (~ 15 ימים) ויש לחקור אותו למטרות שימור פוריות בעתיד44,45,46.

אסטרטגיות אפשריות אחרות לשימור פוריות אצל נשים הן: (i) הקפאת רקמת השחלות, שהיא האפשרות היחידה הזמינה עבור נקבות טרום-פטרואל. אפשרות זו מבטיחה לשיקום פעילות הרבייה והאנדוקרינית ולהימנעות מעיכוב בהתחלת הטיפול בסרטן מכיוון שאין צורך בגירוי הורמונלי. עם זאת, הוא עדיין ניסיוני ודורש ניתוח לפרוסקופי עם השתלה מאוחרת יותר, ויש את הסיכון לשידור מחדש של סרטן אורתוטופי. (ii) שימור קריופרציה עוברית, הכוללת שיעור הישרדות גבוה יותר לאחר ההתחממות, אך מעכבת את הטיפול בסרטן ודורשת מבן זוג או תורם גברי להיות מעורבים, ובכך גם מגבילה את אוטונומיה פוריות עתידית של אישה47. יתר על כן, זה עשוי להיות כפוף למגבלות משפטיות במדינות מסוימות. בהתחשב במגבלות אלה, vitrification ביציות נחשב הגישה המבוססת והמקובלת ביותר מבחינה אתית. באופן אידיאלי, כל בתי החולים הגדולים, שבהם מטופלים נשים שנפגעו מסרטן בגיל הפוריות שלהם, צריכים לספק תוכניות לשימור פוריות, וכל התהליך צריך להיות ללא תשלום עבור חולים אלה כדי להבטיח גישה שווה לתוכנית זו. ובכל זאת, שימור קריופרה oocyte חייב להתבצע אך ורק במרכזים עם מספיק מומחיות לא להשפיע על יכולת ביוצית בתהליך48.

שלבים קריטיים בפרוטוקול ה- vitrification ובפתרון בעיות

Vitrification הוא מעבר שלב פסאודו מסדר שני (IUPAC Compendium של מינוח כימי) שגורם להתמצקות דמוית זכוכית בתוך התאים המונעים התגרענות וגזרה של גביש קרח, הגורם הסיבתי העיקרי לפגיעה בתא. כדי להשיג vitrification נכון, שילוב של לפחות שני CPAs נדרש (בדרך כלל אתילן גליקול ו- DMSO כסוכנים מחלחלים וסוכרוז כסוכן שאינו מחלחל) יחד עם קצב קירור גבוה במיוחד (>20,000 °C/min) מושגת על ידי מזעור נפחי הטעינה או על ידי חשיפה ישירה של הדגימות לחנקן נוזלי (התקנים פתוחים). כמו oocytes הם התאים הגדולים ביותר של הגוף, הם מכילים את הכמות הגדולה ביותר של מים. לכן, הם רגישים יותר להקפאת פציעות מאשר עוברים. במהלך שימור קריופרציה ביוצית, נזק לאברונים תאיים (למשל, ציטוסקלטון או ציר מיוטי), שינוי חדירות הממברנה, התקשות zona pellucida, הפעלת ביציות, שינוי של המסלולים הביוכימיים, ואולי מוות תאי יכול להתרחש49. מסיבה זו, יש להבטיח איזון עדין בין גורמים מרובים לשימור מוצלח של כדאיות ביציות ויכולת התפתחותית. כדי להשיג עקביות בשיעור ההישרדות לאחר vitrification ולהגיע לרמות אמת המידה, כל השלבים המכריעים של ההליך חייב להיות נשלט בקפדנות.

מעבדי בגרות, אוסמוליות תאים ושיעורי קירור

כדי להגדיל את ההסתברות של vitrification, הצמיגות של המדיום (ולכן ריכוז רו"ח) חייב להיות מוגדל. עם זאת, הרעילות של CPAs תמיד צריך להישמר תחת שליטה50. לכך, חשוב למזער הן את זמן החשיפה לתאים ל- CPAs והן את נפחי הטעינה, ותמיד לעבוד בטמפרטורת החדר (25-27 °C(51°F) . פרוטוקולים אחרים כוללים שילובים שונים של CPAs ו cryodevices ומתבצעים ב 37 °C (70 °F); עם זאת, הם לא תוארו כאן. לפיכך, ההערות, התוצאות הייצוגיות וסעיפי הדיון בכתב יד זה חלים רק על פרוטוקול ההחלטה המפורט כאן.

במהלך cryopreservation, oocytes חשופים פתרונות רו"ח של ריכוז אוסמוליטים מוגבר כדי לקדם התייבשות תאים התכווצות ציטופלסמית. במהלך ההתחממות, הם נחשפים לפתרונות עם ריכוז אוסמולייט מופחת כדי לשחזר את הנפח הציטופלסמי. במהלך vitrification, הביציות מיובשים, ותנודות לא מכוונות בנפח התא יכול לגרום להלם אוסמוטי חמור, ובכך להתפשר הישרדות ופוטנציאל התפתחותי לאחרהתחממות 52. מציאת קצב הקירור האופטימלי היא היבט מרכזי לשמירה על כדאיות התא מכיוון שהיא משפיעה על osmolality53 ועל פוטנציאל התפתחותי התא54. לדוגמה, כאשר תא חשוף לשיעורי קירור איטיים יותר מהשיעורים האופטימליים, הוא עשוי להיחשף בהרחבה לתנאים היפרטוניים המובילים למוות תאים.

כדי להשיג את קצב הקירור האופטימלי, יש למזער את נפחי הטעינה, יש לשלוט ב- RT כדי לא להשפיע על מהירות תהליך השתוות, ודגימות צריכות להיחשף ישירות לחנגן נוזלי. אחת ה דרך להעריך מתי שוויון נעשה היא ביאור המורפולוגיה של ביציות (בפרט, רוחב החלל perivitelline ואת עובי של zona pellucida) לפני תחילת ההליך (איור 5A). לאחר שלב ראשוני של הפחתת נפח התא (איור 5B), הבורית צפויה לשחזר את נפחה ההתחלתי (איור 5C). למרות ש- pH נכון נשמר במהלך טיפול ביוציטים תחת אטמוספרת האוויר בגלל zwitterions אגירת פתרונות התחממות vitrification, osmolality בינוני תלויה במקום זאת במיוחד בטמפרטורה53. לכן, השיטה של הכנת צלחת היא קריטית כדי להפחית כל השפעה מזיקה אפשרית55.

כיסוי שמן הוא בהחלט מכריע כדי למנוע אידוי ולהימנע מכל עלייה osmolality בתקשורת IVF56. עם זאת, לא ניתן להשתמש בו בעת ביצוע הליכי ההתחדשות וההתחממות. לכן, כמה טיפים חשובים עבור מפעילים: (i) להכין את הטיפות מהר ככל האפשר ומיד לפני השימוש; (ii) לשקול כמויות גדולות יותר של טיפות כדי למזער משמרות osmolarity (<30 μL אינו מומלץ); (iii) כאשר לא ניתן לתקנן את התנאים הסביבתיים, ניתן להשתמש בלוחית של 6 בארות, וניתן להוסיף מים סטריליים או PBS למאגר הסמוך כדי להגביל את האידוי; (4) לשים לב לתאריך הפתיחה הראשונה של הבקבוקון של בינוני כמו osmolality יכול להשתנות אם הבקבוק נפתח שוב ושוב.

התחממות אוציטים ופיתוח ביוט

הצעד המכריע ביותר שעשוי להשפיע על העקביות בשיעור ההישרדות הוא בהחלט תהליך ההתחממות57. במהלך שלב זה, מעבדי CPAs מוסרים בהדרגה מהביצות ומדולדלים כדי למנוע כל השפעה ציטוטוקסית פוטנציאלית. Devitrification, כלומר היווצרות של גרעיני קרח או גבישי קרח במהלך ההתחממות של פתרון vitrified או בטעות במהלך ביקורת, הובלה, או אחסון באדים, הוא אחד הסיכונים העיקריים של vitrification58,59,60. לכן, כדי למנוע פיחות ופציעה במהלך ההתחממות, יש למקסם את ההבדל בטמפרטורה בין השלב הראשון והאחרון של התהליך. כפי שניתן לראות על ידי Seki ו מזור57 ביציות מורין בכפוף להתחדשות והתחממות בקצבים שונים, מהר יותר ההתחממות, גבוה יותר ההישרדות. נפח וטמפרטורה של TS הם הגורמים העיקריים לשלוט: TS צריך להיות מחומם כראוי ל 37 °C (לפחות 1 שעות לפני ההליך), ואת מתלה חנקן נוזלי צריך להיות מלא עד קצה הקיבולת שלה להציב קרוב ככל האפשר סטריומיקרוסקופ. המפעיל צריך להיות מהיר ככל האפשר בעת העברת נושאת ההקפאה מהחנקן הנוזלי ל- TS. בגלל היעילות הגבוהה של vitrification, פרוטוקול התחממות אוניברסלי יכול לשמש ללא קשר לפרוטוקול ההקפאה המעורב, מה שהופך את הניהול של כל מחזורי ההתחממות קל יותר גם כאשר ביציות מיובאים ממרכז IVF אחר61.

פתיחת מכשירים וסיכון לזיהום

תעסוקה של מערכות פתוחות וחשיפה ישירה של הדגימות לחנקן נוזלי נדרשים כדי להשיג את שיעורי הקירור וההתחממות הגבוהים ביותר התומכים ביעילות פרוטוקול זה. למרות vitrification הוא הליך המהווה סיכון נמוך לזיהום צולב, כי זה כרוך בכמויות קטנות מאוד ומתבצע לאחר מספר כביסות מדגם המדללים כל עומס ויראלי putative, זה חיוני כדי לאמץ את כל אמצעי הזהירות כדי להגביר את הבטיחות שלה. בהתבסס על הראיות הנוכחיות, מערכות סגורות אינן מציעות חלופה תחרותית למערכות פתוחות לפחות עבור vitrification oocyte62,63. כדי לשמור על האפקטיביות של מערכות vitrification פתוחות תוך מזעור הסיכונים הקשורים במגע ישיר עם חנקן נוזלי, האחרון עשוי להיות מעוקר על ידי הקרנה אולטרה סגולה64,65. לחלופין, מיכלי אחסון אדים עשויים לשמש, אשר ידועים להוות סיכון נמוך יותר של זיהום מאשר אלה קונבנציונאלי, אבל הוכיחו להיות יעיל בשמירה על הכדאיות ביציות66,67.

חשיבות ניטור מתמיד של אינדיקטורים לביצועי מפתח עבור תוכניות vitrification oocyte

במעבדת IVF, ניטור של אינדיקטורים לביצועי מפתח (KPIs) חיוני לניטור ושיפור מתמיד של תוצאות68. באופן כללי, בעת הגדרת KPIs לניטור תהליכים ונהלים, יש לקחת בחשבון שלושה תחומים עיקריים: מבנה, תהליך ותוצאה. KPIs מבניים למדוד את איכות המעבדה IVF על ידי מתווה המאפיינים של משאבים פיזיים ואנושיים. דוגמה ל- KPI מבני הקשור למתקן בתוכנית cryopreservation עשויה להיות מספר הקריוטנקים ביחס למספר הכולל של הליכי ART הדורשים שימור קריופרציה המבוצע בפרק זמן נתון או מספר מיכלי ההקפאה ביחס למטרים הרבועים הכוללים של ההקפאה. עם זאת, משאבי אנוש ובמיוחד, מיומנויות מפעיל הם בעלי חשיבות עליונה בעת התמודדות עם הליך עדין כגון vitrification. למעשה, למרות יעיל מאוד, טכניקת vitrification היא הליך מאתגר מעורבים כמה שלבים פרוצדורליים עם תזמונים מחמירים כי יש לשלוט בקפדנות: כמות קטנה מאוד של מדיום צמיג משמעותי צריך להיות מנוהל על פני תקופה קצרה מאוד.

אין מכונת הקפאה עם הגדרת פרמטרי קירור ספציפיים מעורבת בהליך; לכן, סטנדרטיזציה של פרטי פרוטוקול והכשרה הם חיוניים. לתהליך הידני יש דרישות מיומנות קפדניות שיש למלא כדי להשיג שיעורי הישרדות תאים עקביים וניתן לשחזור גבוהים. הדרכה ספציפית צריכה להיות לספק לכל מפעיל טירון כדי להפוך אותם בקיאים בשליטה על כל הנקודות הקריטיות של ההליך, בפרט, זמן החשיפה של הדגימות CPAs ואת הטיפול של התאים במדיום צמיג מאוד. עם זאת, על פי Dessolle ומחברים שותפים,69 עקומת הלמידה עבור הליך vitrification לא צריך להיות כל כך הרבה זמן אפילו עבור עוברים זוטרים כמו ההישג של מיומנות מוגבלת בעיקר על ידי אתגרי מניפולציה. לאחר שהושגה מומחיות ב- vitrification, יש לאמת במדויק ובאופן קבוע את הביצועים של כל מפעיל בודד באמצעות שימוש ב- KPIs כדי להעריך באופן קבוע את תחזוקת ערכי הכשירות שנקבעו על ידי ניירות קונצנזוס70. יתר על כן, אמון מפעיל / יכולת חייב להיות דומה כדי לא להשפיע על התוצאות.

מחווני KP של תהליכים מודדים עד כמה מעבדת ההפריה הפוריתית פועלת. פרוטוקולים ונהלים של ויטריפיקציה והתחממות צריכים להתבצע בזמן, ויש למזער את התנודות בתנאי התרבות על ידי מתן תשומת לב מיוחדת לשמירה על אוסמולאריות וטמפרטורה נאותה לשימור לא רק יכולת התפתחותית של ביציות, אלא גם של בטיחות המפעיל תוך טיפול בחנקן נוזלי. דוגמאות לתהליך KPIs הן אחוז הפציעות של עובדי המעבדה בעת טיפול בחנקן נוזלי לפי מספר הליכי IVF בשנה, אחוז הגמטות/עוברים שאבדו/ניזוקו במהלך הליכי התחדשות/התחממות, וביקורת לפי מספר הליכים בשנה.

לבסוף, תוצאה KPIs למדוד את האפקטיביות של מעבדת IVF ובדרך כלל מתייחסים להישרדות ביציות לאחר המלחמה המוגדר כשיעור של ביציות שלמות מורפולוגית בזמן ICSI (במקרה של vitrification ביציות, ערך הכשירות צריך להיות >50% ואת ערך אמת המידה הוא 75%)70. בנוסף, שיעורי ההפריה (נמוכים ב-<10% מהביציות הטריות המופרות במרכז מאוכלוסיית מטופלים דומה), התפתחות העובר (זהה לאוכלוסיית מטופלים דומה באמצעות ביציות טריות) והשתלה (נמוכה < ב-10%-30% מאוכלוסייה דומה של עוברים טריים במרכז) ישימים כ-KPIs התוצאה עבור ביציות מובאות70. עם זאת, תוצאות קליניות כפופות יותר למאפיינים ספציפיים לזוג מאשר להליכים קליניים פגומים71,72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ללא

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
  2. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  3. Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
  4. Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
  5. Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
  6. Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
  7. Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
  8. Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
  9. Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
  10. Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1 (2016).
  11. Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
  12. Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
  13. Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, Suppl 6 160-170 (2013).
  14. Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
  15. Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
  16. Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94 (2019).
  17. Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327 (2018).
  18. Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
  19. Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
  20. Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049 (2019).
  21. Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
  22. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
  23. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  24. Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
  25. ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025 (2019).
  26. Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
  27. Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
  28. Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
  29. Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
  30. Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
  31. Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
  32. Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
  33. Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
  34. Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
  35. Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
  36. Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
  37. Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
  38. Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
  39. Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
  40. Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
  41. Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
  42. Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
  43. Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
  44. Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
  45. Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317 (2018).
  46. Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
  47. Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
  48. Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
  49. Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
  50. Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
  51. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reproductive Biomedicine Online. 9 (6), 680-691 (2004).
  52. Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268 (2014).
  53. Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
  54. Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
  55. Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
  56. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  57. Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
  58. Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
  59. Jin, B., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biololgy of Reproduction. 82 (2), 444-450 (2010).
  60. Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
  61. Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
  62. Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
  63. Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123 (2018).
  64. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  65. Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
  66. Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
  67. Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
  68. Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
  69. Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
  70. Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
  71. Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
  72. Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).

Tags

ביולוגיה גיליון 175 שימור פוריות גירוי השחלות ביציות מטאפזה II vitrification התחממות אינדיקטורים לביצועי מפתח (KPI)
שימור פוריות באמצעות ויטריפיקציה של אוציט: פרספקטיבות קליניות ומעבדתיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggiulli, R., Vaiarelli, A.,… More

Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter