Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Oosit Vitrifikasyonu ile Doğurganlığın Korunması: Klinik ve Laboratuvar Perspektifleri

Published: September 16, 2021 doi: 10.3791/61963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Summary

Oosit kriyoprezervasyonu, postpubertal kadınlarda doğurganlığın korunması için altın standart olarak çeşitli uluslararası bilim toplumları tarafından kabul edilmektedir. Uygun klinik ve laboratuvar stratejileri, doğurganlık koruma tedavilerinin maksimum etkinliğini, verimliliğini ve güvenliğini sağlar.

Abstract

Kadın doğurganlığının korunması, hastaların gelecekteki yaşam kalitesiyle ilgilenen çok işlevli bir sağlık sisteminde çok önemlidir. Oosit kriyoprezervasyonu, birçok uluslararası bilim topluluğu tarafından postpubertal kadınlarda doğurganlığın korunması için altın standart olarak kabul edilir, hem tıbbi hem de tıbbi olmayan endikasyonlar için. Başlıca tıbbi endikasyonlar onkolojik hastalıklar, ağır endometriozis gibi jinekolojik hastalıklar, yumurtalık rezervini tehlikeye atarak sistemik hastalıklar ve erken menopoz içeren genetik durumlardır. Bu makalede, objektif ve kanıta dayalı danışmanlık önerileri sıralanarak doğurganlık koruma tedavisinin tüm klinik ve laboratuvar çalışmaları açıklanmaktadır. Ayrıca, prosedürün etkinliğine odaklanır ve yumurtalık rezervinden tam olarak yararlanmak ve mümkün olan en kısa sürede alınan oosit sayısını en üst düzeye çıkarmak için en uygun stratejileri açıklar. Yumurtalık rezervinin değerlendirilmesi, ideal bir stimülasyon protokolünün tanımı, ayrıca oosit alma, denudasyon ve vitrifikasyon prosedürleri, etkinliklerini, verimliliklerini ve güvenliklerini en üst düzeye çıkarmak için yaklaşımlarla birlikte ayrıntılı olarak verilmiştir.

Introduction

İnsan oositleri için verimli bir kriyoprezervasyon programının geliştirilmesi ve uygulanması üreme tıbbında önemli bir atılım olmuştur. Son kanıtlara göre, vitrifikasyon, hasta popülasyonundan bağımsız olarak (infertil hastalar veya oosit bağış programı) 1 ,2,3' e kıyasla yavaş donmaya kıyasla istatistiksel olarakdaha yüksek sağkalım oranları ile sonuçladığı için, metafaz II (MII) oositlerini kriyoprezite etmek için en etkili stratejidir. Oosit vitrifikasyonunun dikkat çekici başarıları, Amerikan Üreme Tıbbı Derneği (ASRM) ve Yardımcı Üreme Teknolojisi Derneği (SART) Uygulama Komitelerinin bu tekniği postpubertal kadınlarda hem tıbbi hem de tıbbi olmayan endikasyonlar için elektif doğurganlığın korunmasında en etkili olacak şekilde telaffuz etmesine yol açmıştır4,5,6. Doğurganlığın korunması için tıbbi endikasyonlar şunlardır: (i) radyoterapi, sitotoksik kemoterapi ve endokrin tedavi gibi7 tedavi gerektiren kanser ve otoimmün hastalıklar (yumurtalık rezervi üzerindeki zararlı etkisi anne yaşı ve tedavinin türü ve dozu ile ilişkilidir); (ii) tekrarlanan veya radikal cerrahi gerektiren yumurtalık hastalıkları (endometriozis gibi)8; ve (iii) genetik durumlar (örneğin, X-kırılgan) veya erken yumurtalık yetmezliği. Ek olarak, doğurganlığın korunması, tıbbi olmayan nedenlerle (sosyal donma olarak da bilinir) ebeveyn hedefini gerçekleştiremeyen tüm kadınlar için değerli bir seçenek haline gelmiştir.

Doğurganlığın korunması için endikasyondan bağımsız olarak ve doğurganlığın korunmasına ilişkin başlıca uluslararası yönergelere göre, oositlerini vitrifiye etmek isteyen tüm hastalar, gerçekçi başarı şansları, maliyetleri, riskleri ve prosedürün sınırlamaları hakkında bilgi sahibi olmak için uygun danışmanlık almalıdır9, 10,11,12,13. En önemlisi, bir MII oosit kohortunun vitrifiye edilmesi hamileliği sağlamaz, ancak gerekirse gelecekteki in vitro fertilizasyon (IVF) tedavisi için daha yüksek bir başarı şansı sunduğu açık olmalıdır14. Bu bağlamda, kadının oosit vitrifikasyonu sırasındaki yaşı kesinlikle en önemli sınırlayıcı faktördür15 ileri anne yaşı (AMA; >35 yıl) kadın kısırlığının ana nedenidir16. Yumurtalık rezervinde ilerleyici bir azalmanın yanı sıra, AMA metabolizma, epigenetik düzenleme, hücre döngüsü kontrol noktaları ve meiotik ayrım gibi kusurlu fizyolojik yollar nedeniyle oosit yeterliliği bozukluğu ile ilişkilidir17. Bu nedenle, vitrifiye etmek için makul sayıda yumurta esas olarak anne yaşına bağlıdır. 36 yaşından küçük kadınlarda başarı şansını en üst düzeye çıkarmak için en az 8-10 MII oosit18 gereklidir. Genel olarak, vitrifiye oosit sayısı ne kadar yüksekse, başarı olasılığı da o kadar yüksektir. Bu nedenle, yumurtalık rezervinin anti-Müllerian hormon (AMH) seviyeleri veya antral folikül sayısı (AFC) gibi yumurtalık rezervi belirteçlerine göre uyarılması, yumurtalık rezervinin mümkün olan en kısa sürede tam olarak istismar etmesi için çok önemlidir.

Tüm prosedürün güvenliği, hastaları doğurganlık korumasına kaydederken diğer önemli konudur. Klinisyenler, riskleri en aza indirmek ve (i)yumurtalık hiperstimülasyon sendromunun (OHSS) gonadotropin salgılayan hormon (GnRH) antagonist protokolü ve ardından bir GnRH agonisttetikleyicisi 19 ve (ii) uzaktan kumanda gibi güvenli yaklaşımları kullanarak önlemek için en iyi stratejileri kullanmalıdır, ancak olası, periton kanaması riskleri, pelvik yapılarda yaralanma (üreter, bağırsak, apandisit, sinirler) veya oosit alımı sırasında pelvik enfeksiyon. Son olarak, (iii) stimülasyon için geleneksel rejimler suprafizyolojik serum estradiol ile ilişkilidir ve bu nedenle meme kanseri gibi östrojene duyarlı hastalıklarda önerilmez. Aromataz inhibitörlerini (letrozol veya tamoksifen gibi) içeren protokoller bu durumlarda daha uygundur20,21. Laboratuvar ortamında, oosit vitrifikasyonu için en yaygın protokol hala Kuwayama ve meslektaşları tarafından ilk açıklananprotokoldür 2,23 , kriyoprotekantların(CPAs)kademeli olarak eklenmesini içeren adım adım bir prosedürden oluşur. İlk fazda (denge/dehidratasyon) oositler %7,5 v/v etilen glikol ve %7,5 v/v dimetil sülfit (DMSO) içeren bir CPA çözeltisinde maruz kalırken, ikinci aşamada, oositler% 15 v / v etilen glikol ve% 15 v / v DMSO, artı 0.5 mol / L sakkaroz ile bir vitrifikasyon çözeltisine taşınır. Vitrifikasyon ortamında kısa bir inkübasyondan sonra, oositler özel olarak tasarlanmış, açık kriyodevices içine yerlenebilir ve son olarak kullanıma kadar saklanmak üzere -196 ° C'de sıvı nitrojene daldırılabilir.

Burada, bir doğurganlık koruma tedavisinin tüm klinik ve laboratuvar çalışmaları (i) objektif ve kanıta dayalı danışmanlık için önerilerin özetlenmesi, (ii) prosedürün maliyet etkinliğine odaklanılması ve (iii) yumurtalık rezervinden tam olarak yararlanmak ve mümkün olan en kısa sürede alınan oosit sayısını en üst düzeye çıkarmak için en uygun stratejileri tanımlamakla tanımlanmıştır. Yumurtalık rezervinin değerlendirilmesi, ideal bir stimülasyon protokolünün tanımı, ayrıca oosit alma, denudasyon ve vitrifikasyon prosedürleri, etkinliklerini, verimliliklerini ve güvenliklerini en üst düzeye çıkarmak için yaklaşımlarla birlikte ayrıntılı olarak açıklanacaktır. Literatürde bu protokolün diğer protokolleri veya uyarlamaları mevcut olduğu için, bu makalenin temsili sonuçları ve tartışma bölümleri sadece bu prosedür için geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. İş ve klinik danışmanlık

NOT: Onkolojik nedenlerle doğurganlığın korunmasını gerektiren hastalarda, konsültasyon planlama için bekleme listesi olmadığından ve randevunun mümkün olan en kısa sürede sağlandığından emin olun.

  1. Tıbbi geçmişi ve önceki belgeleri inceleyin ve hastanın genel sağlık durumunu değerlendirin.
  2. Tüm bilgileri (kanser hastalarında yumurtalık stimülasyonuna tabi tutulmak için onkolog onayı dahil) ilişkisel bir veritabanına kaydedin.
  3. Hastaya prosedürün fizibilitesi hakkında özel danışmanlık sağlayın. Prosedürün adımlarını (yumurtalık stimülasyonu, oosit alımı, oosit vitrifikasyonu) açıklayın ve gerçekçi başarı şansı (esas olarak anne yaşına ve oosit alımı sırasında beklenen MII oosit sayısına bağlı) ve prosedürün maliyeti ve sınırlamaları hakkında onu bilgilendirin.
  4. Yumurtalık rezervi (yani AFC) hakkında bilgi edinmek ve yumurtalıkların yumurta toplama için erişilebilirliğini değerlendirmek için transvajinal ultrason işlemi gerçekleştirin.
  5. Kan grubu ve Rhesus faktörünü, pıhtılaşma taramasını (kan sayımı, protrombin, tromboplastin, fibrinojen, Protein C, Protein S, anti-trombin III, homosistein) ve bulaşıcı hastalıkları (Hepatit B, Hepatit C, HIV, Zührevi Hastalık Araştırma Laboratuvarı/Treponema pallidum Hemagglutination Assay) değerlendirmek için kan testleri isteyin.
    NOT: Hastaların acil olmayan tıbbi nedenlerle doğurganlık koruma programına erişmesi durumunda, daha kapsamlı bir değerlendirme bazal folikül uyarıcı hormon (FSH), luteinize edici hormon (LH), estradiol, AMH, meme muayenesi, Papanicolaou testi, pıhtılaşmanın genetik taraması (Leiden ve protrombin faktör V) ve TORCH taramasını (toksoplazmoz, kızamıkçık, sitomegalovirüs) içerebilir.
  6. Kardiyolojik değerlendirme (elektrokardiyogram) isteyin.
  7. Psikolojik danışmanlık tavsiye edin.

2. Doğurganlığın korunması için kontrollü yumurtalık stimülasyon protokolleri

NOT: Kanser tedavisine başlamadan önce mevcut süre sınırlı olduğunda, doğurganlığın korunmasına aday onkolojik hastalarda yumurtalık stimülasyonu için rastgele başlangıç protokolü (yani adet döngüsü sırasında herhangi bir zamanda yumurtalık stimülasyonuna başlama) önerilir. Acil olmayan tıbbi nedenlerle veya sosyal nedenlerle doğurganlık koruma programında, erken foliküler fazda başlayan konvansiyonel stimülasyon tercih edilir ve adet döngüsüne göre yumurtalık stimülasyonuna başlanır. Kontrollü yumurtalık stimülasyonu (COS) yaklaşımları son Avrupa İnsan Üreme ve Embriyoloji Derneği (ESHRE) yönergelerine göre yapılmalıdır24.

  1. COS'yi hastanın özelliklerine ve yumurtalık rezervi belirteçlerine göre, özellikle anne yaşı, FSH, AMH ve AFC'ye göre uyarlar.
  2. Cos'a adet döngüsünün 5. gününde 150-300 IU/gün sabit dozda rekombinant veya üriner FSH kullanarak başlayın (antagonist protokol).
    NOT: LH eksikliği veya zayıf-yetersiz yanıt ile belirli bir hasta popülasyonunda, yumurtalık yanıtına, LH seviyelerine ve jinekologun kararına göre ek LH 75/150 IU/gün uygulanabilir.
  3. Östrojene duyarlı hastalıkları olan hastalarda, stimülasyonun 1. gününden oosit alımından sonraki 7. güne kadar aromataz inhibitörleri (letrozol) ile ilişkili gonadotropinleri içerir.
  4. 4 gün boyunca sabit bir doz gonadotropin sürün.
  5. Foliküler büyümeyi 5. günde ve daha sonra her 2-3 günde bir izleyin; sonunda, gonadotropin dozajını ayarlayın.
  6. En az 3 folikül 17-18 mm çapa ulaştığında, son oosit olgunlaşması için tetiği 0,5 mL dozda tek bir GnRH agonist altı bolusu ile uygulayın.

3. Oosit alımı

  1. Oosit alımına hazırlanıyor
    1. Gerekli malzemeler için, Malzeme Masası'nabakın ve laboratuvar ayakkabısı ve kıyafetini, cerrahi yüz maskesini, saç örtüsünü, cerrahi eldivenleri, kalıcı toksik olmayan bir işaretleyiciyi, cımbızları, steril küçük gazlı bezleri, tek kullanımlık veya yeniden kullanılabilir spekulum, vajinal cerrahi ekipmanı ve yüzey dezenfektanını hazır tutun. Resüstisyasyon ekipmanının, ters çevrilmesi için anestezik ilaçların, anafilaktik şokun tedavisi için hazırlanmış bir kitin ve ameliyathanede oksijenin kullanılabilirliğini sağlayın.
    2. Yardımcı üreme teknolojilerinde Ultrasonda ESHRE Çalışma Grubu'nun önerilerine göre oosit alma prosedürünü gerçekleştirin (ART)25.
      1. Sedasyon veya genel anestezi ve profilaksi için antibiyotikler sunun.
        NOT: Bu protokolde propofol (dozajı hastanın ağırlığına göre ayarlanmıştır) ve 50-100 μg fentanil, 1000 mg parasetamol ve oksijen ile destekli maske havalandırması yönetilerek derin sedasyon sağlanmıştır.
      2. Vakum pompası, 17 G tek lümen iğneye bağlı bir toplama tüpü ve bir oosit toplama tüpünden oluşan bir aspirasyon ünitesi kullanarak oosit alımını gerçekleştirin. Toplama sırasında, kümülüs hücrelerini sıyırma veya zona pellucida'yı kırma gibi oositlerin zarar görme riskini önlemek için ~ 120 mmHg'lik bir basıncı aşmayın.
      3. Kültür ortamlarında 37 °C'den emin olmak için çalışma yüzeyi sıcaklığını kalibre edin. Tüm prosedür sırasında, gelişimsel yeterliliklerini etkileyebilecek geçici sıcaklığa bile oosit maruziyetini en aza indirin.
      4. Oosit alımının sonunda, taburcu olmadan önce hastayı 3-4 saat gözlemleyin.
  2. Operasyon tiyatrosu
    1. Ameliyathaneye girmeden önce hastayı tanımlayın ve yumurtlama tetikleyicisinin zamanını onaylayın.
    2. Hasta ameliyat masasına jinekolojik pozisyonda yatsa.
    3. Bakteriyel kontaminasyonu en aza indirmek için oosit alımından önce vajinayı/serviksi temizleyin.
    4. Yumurtalıkların konumunu ve çeşitli organlar ve kan damarları ile anatomik ilişkileri değerlendirmek için bir ön transvajinal ultrason gerçekleştirin.
    5. Ultrason rehberliğinde, vajina duvarı ile yumurtalık arasında bulunan organlara veya kan damarlarına yaralanmamaya dikkat ederek vajinal duvardan ve yumurtalık folikülüne tek lümenli bir iğne yerleştirin.
    6. Aspirasyona en yakın folikülün içinden başlayın ve en distal olanlara ilerleyin.
    7. 11-12 mm'den büyük bir çaptaki tüm folikülleri delin, tüm foliküler sıvıyı aspire etmek için iğnenin "bükülme hareketlerini" gerçekleştirin, daha sonra ameliyathanenin blok ısıtıcısında önceden ısıtılmış steril bir tüpe (yuvarlak alt 14 mL) salınır.
    8. Aldıktan hemen sonra, tüpü hastanın kimliğinin ayrıntılarıyla kapatın ve etiketleyin.
    9. Hemşirenin tüpü laboratuvara getirdiğinden emin olun, burada kümülüs-oosit komplekslerinin (COC) varlığı için hemen taranır.
    10. Embriyologlara, alınan toplam COC sayısı hakkında klinisyeni bilgilendirmelerini söyleyin.
    11. İlk yumurtalık için işlem tamamlandıktan sonra, iğneyi temiz ortamla yıkayın ve aynı prosedürü kullanarak ikinci yumurtalığa devam edin.
    12. Oosit alımından sonra, parametriumun yumurtalıklarından veya kan damarlarından ve Douglas'ın kesesinde serbest sıvıdan kaynaklanan kanamaları değerlendirin.
      NOT: Gamet ve embriyo izlenebilirliğinin klinik düzeydeki etkinliğini otomatikleştirmek ve iyileştirmek için merkezde elektronik tanık sistemi (EWS) uygulanmıştır26. Bununla birlikte, bu protokol, protokolün herhangi bir IVF laboratuvarında tekrarlanabilirliğini sağlamak için EWS'den bahsetmemektedir. Yine de, prosedürün tüm adımlarının gamet ve embriyo izlenebilirliğini sağlamak için ikinci bir operatör (yani bir tanık) gerektirdiğini düşünün.

4. Tüp bebek laboratuvarı

  1. Oosit alma işleminden bir gün önce
    1. Oosit toplama tüpleri hazırlayın (Malzeme Tablosunabakın).
      1. Embriyo kültürü için her oosit toplama tüpüne (yuvarlak alt, 5 mL) 1 mL IVF ortamı dağıtın (MalzemeTablosuna bakın) ve 0,2 mL mineral yağ (Malzeme Tablosunabakın) ile örtün.
        NOT: Tüp sayısı, alınması beklenen folikül sayısına göre tanımlanacaktır. Her tüp en fazla 4 COC içerebilir.
    2. Tüpleri kapakla kapatın (ilk çıtçıt). Tüpleri orta ve hazırlık tarihinin ayrıntılarıyla etiketle. Tüpleri kontrollü bir atmosferde 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın (%6 CO2,%5 02).
  2. Oosit alma gününde
    1. Plastik malzemeleri 37 °C'de (steril kültür yemekleri ve Pasteur pipetler) önceden ısıtın.
    2. Hastalardan kimliklerini (tam adı ve doğum tarihi) ve yumurtlama tetikleyici zamanını onaylamalarını isteyin. Laboratuvar sayfasında tanımlama (ID) prosedürünün tamamlandığını ve yumurtlama tetikleyicisinin zamanının doğrulandığını belirtin.
    3. Oosit toplama tüplerini inkübatörden alın (prosedür başlamadan hemen önce) ve sıkı kapanmayı sağlamak için kapağı aşağı itin. Oosit toplama tüplerini hastanın bilgileriyle etiketle. Oosit toplama tüplerini 37 °C'de blok ısıtıcıya yerleştirin.
    4. Önceden ısıtılan steril kültür yemeklerindeki foliküler sıvıyı inceleyin ve COC'leri tanımlayın. Bir veya daha fazla COC tanımlandıktan sonra, foliküler sıvıyı ve kan kirlenmesini gidermek için iki damla ortamda iki kez durulayın.
    5. COC'leri oosit toplama tüplerine aktarın ve tüpteki COC sayısına açıklama ekleme. Orta tüplerin kapaklarını gevşetin ve derhal% 6 CO 2 , % 5O2atmosferinde 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
    6. Alınan oosit sayısına göre 7 ile 9 arasında olan adımları yineleyin. Laboratuvar sayfasını güncelleyin.
      NOT: Bir tanığın tüm tüp ısıtma bloklarının (ameliyathanedekiler dahil) boş olup olmadığını kontrol ettiğinden ve prosedürün laboratuvar sayfasındaki kapanışını imzaladığından emin olun.
    7. İşlem tamamlandıktan sonra çalışma aşamasını silin.

5. Oosit denudasyonu

  1. Prewarm 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethaneslfonic asit (HEPES)-tamponlanmış orta ve hyaluronidaz (Malzeme Tablosunabakın) başlamadan önce en az 1 saat 37 °C'de.
  2. Embriyo kültürü için 0,3 mL mineral yağ ile kaplanmış 0,6 mL/önceden ısıtılmış HEPES tamponlu ortam (%5 insan serum albümini [HSA] ile desteklenmiş) ile 4 kuyulu bir IVF plakası hazırlayın (Malzeme Masasınabakın) ve en az 30 dakika boyunca 37 °C'de ısıtın.
  3. Oosit denudasyon plakasını hastanın kimliğinin ayrıntılarıyla etiketleyin.
  4. İşleme başlamadan hemen önce, yaklaşık 20 IU / mL'lik son bir konsantrasyon elde etmek için ilk kuyuya hyaluronidaz ekleyin.
  5. Kümülüs hücrelerini dağıtmak için enzimi içeren ilk kuyuya sınırlı sayıda COC (6'ya kadar) yerleştirin.
  6. Kümülüs ve korona hücrelerinin enzymatic olarak çıkarılmasını geliştirmek için, oositleri 30 s'ye kadar yaklaşık 250 μm iç çaplı bir Pasteur pipet aracılığıyla tekrar tekrar pipetleterek kümülüs hücrelerinin sıyırmasını gerçekleştirin. İlk hücre ayrışması gözlendikten sonra, oositleri sadece HEPES tamponlu ortam içeren ikinci kuyuya aktarın ve minimum miktarda enzim taşımaya dikkat edin.
  7. İç çapları azalan (170-145 μm) pipetleri kullanarak korona hücrelerini çıkarmak için daha fazla denudasyon gerçekleştirin. Sadece kesinlikle gerekliyse daha düşük çaplar (135μm) kullanın.
  8. Enzimi yıkamak için denuded oositleri dikkatlice yıkayın.
  9. Denudasyondan sonra, oositleri ters bir mikroskop altında inceleyerek bütünlüklerini ve olgunlaşma aşamalarını değerlendirin. MII oositlerini olgunlaşmamış olanlardan ayırın (germinal veziklin ve metafaz-I).
  10. Hemen kriyoprezervasyon yapmak için MII oositlerini vitrifikasyon bölgesine taşıyın. Laboratuvar sayfasını güncelleyin.

6. Oosit vitrifikasyonu

NOT: Tercihen 38 saat içinde ve denudasyondan hemen sonra oosit vitrifikasyonu gerçekleştirin. Burada açıklanan vitrifikasyon prosedürü, manipülasyon sırasında oositlere zarar vermemek için oda sıcaklığında (RT) ve iç çapı 170 μm olan bir striptizci pipet kullanılarak yapılmalıdır.

  1. İşlemden yaklaşık 30 dakika önce, denge çözeltisini (ES) ve vitrifikasyon çözeltisini (VS) RT'ye (25-27 °C) getirin.
  2. Kriyodevices hastanın adı ve kimliği, tedavi kimliği, donma tarihi, oosit sayısı ve kriyobarkod ile uygun şekilde etiketlenin.
  3. Tek kullanımlık bir soğutma rafını taze sıvı nitrojenle doldurun ve sterilizasyon işlemini başlatın.
  4. Vitrifikasyon plakasını (Malzeme Tablosunabakın) hastanın adı ve kimliği ile etiketleyin.
  5. Kullanmadan önce içeriğini karıştırmak için her şişeyi dikkatlice iki kez ters çevirin ve 6 mm Petri kabının kapağını bir damla 30 μL HEPES tamponlu ortam (%5 HSA ile) ve bir bitişik damla 30 μL ES ile hazırlayın.
    NOT: Orta buharlaşmayı sınırlamak için damlaları kullanımdan hemen önce yerleştirin.
  6. 170 μm çapında bir striptizci pipeti kullanarak, oositleri (9'a kadar) mümkün olan en küçük ortam hacmiyle ilk damlaya yerleştirin. Striptizci pipetini kullanarak, EBM konsantrasyonunda kademeli bir artış elde etmek için n.1 ve n.2 damlası arasında bir orta köprü oluşturun (Şekil 1A).
  7. Oositleri ilk düşüşte 3 dakika kuluçkaya bırakın. 30 μL ES 'lik (n.3) üçüncü bir damla ekleyin. 3 dakika sonra, oositleri ES'nin ikinci damlasına aktarın ve n.3 ve n.2 damlaları arasında orta bir köprü oluşturun (Şekil 1B). 3 dakika boyunca n.3 damlasında oositleri kuluçkaya bırakın.
  8. Kuluçka sırasında, kullanılacak her kriyodevice için bir 30 μL ES damlası ekleyin (9 oosit kriyoprezervasyon yapılacaksa, ES'nin her damlasına 3 oositli 3 damla ES yerleştirin). Oositleri saf ES çözeltisine taşıyın ve 6-9 dakika (büzüldükten sonra ilk boyutlarını kurtarana kadar) bırakın (Şekil 1C).
  9. 1 mL VS ile merkezi bir kuyu kabı (60 x 15 mm) hazırlayın. İlk 6 dakikanın sonunda, kriyoprezokreserv edilecek oositleri VS çözeltisine aktarın ve mümkün olduğunca az ortam serbest bırakın. Oositleri VS'de 1 dakika bekletin ve ES fazlalığını gidermek için alttan kabın üstüne taşıyarak dikkatlice yıkayın.
  10. Kuluçka dakikasının bitiminden yaklaşık 10 s önce, kriyodevice'i mikroskop altına yerleştirin ve odağı siyah işarete (yani kriyodevice'in ucuna) ayarlayın. Oositleri kriyodevice üzerine minimum VS miktarı ile siyah işaretin yanına yerleştirin (Şekil 2A).
  11. Striptizci pipetini oositlerden uzaklaştırın ve VS ortamının fazlalığını çıkarın (Şekil 2B) böylece oositler ince bir orta tabaka ile kaplı kalır (Şekil 2C).
  12. Kriyodevice'i sıvı nitrojene hızla daldırarak, hava kabarcıklarını yüzeyinden çıkarmak için hızla sallayın. Kriyodevice'in koruyucu kapağını cımbızla tutun ve sıvı nitrojenle doldurun; daha sonra propilen şeritlerini sıvı nitrojende tutarken kriyodevice'i içine yerleştirin.
  13. Kriyodevice'i daha önce hastanın bilgileriyle etiketlenmiş bir visiotube'da saklayın. Laboratuvar sayfasını güncelleyin.

7. Oosit ısınması

  1. İşlemden yaklaşık 30 dakika önce, çözme çözeltisini (TS), seyreltme çözeltisini (DS) ve yıkama çözeltisini (WS) RT'ye (25-27 °C) ısıtın. İçeriğini karıştırmak için her şişeyi dikkatlice iki kez ters çevirin. Merkezi bir kuyu Petri kabına 1 mL TS yerleştirin ve prosedüre başlamadan önce en az 1 saat boyunca 37 °C'de ısıtın.
  2. Tüm plastik malzemeleri hastanın adı, kimliği ve çözüm türü ile etiketlenin. Bir tanıktan hastanın kriyodevice hakkındaki bilgilerini doğrulamasını isteyin.
  3. Isınacak her kriyodevice için, birinci kuyuda 200 μL DS ve ikinci ve üçüncülerde eşit miktarda WS (sırasıyla WS1 ve WS2 olarak adlandırılır) 6 kuyu plakası hazırlayın. Buharlaşmayı önlemek için kuyuların dışındaki alana fosfat tamponlu salin (PBS) veya steril su ekleyin.
  4. TS kabını inkübatörden çıkar ve mikroskop altına yerleştir. Mikroskobun odağını Petri kabının ortasına ayarlayın.
  5. Propilen şeritlerini sıvı nitrojende tutarken kriyodevice'in koruyucu kapağını dikkatlice bükün ve çıkarın. Kriyodevice sıvı nitrojenden TS'ye mümkün olduğunca çabuk aktarın ve sapma riskini önlayın ve geri sayımı başlatın (1 dk).
  6. Kriyodevice'in ucuna (yani kara lekeye) odaklanarak oositleri lokalize edin. Bir striptizci pipeti kullanarak, oositleri kriyodevice'den serbest bırakın.
    NOT: Oositleri kriyodevice'den aspire etmemeye çalışın; TS'ye geçene kadar üzerlerinde biraz medya bırakın.
  7. 170 μm çapında bir striptizci pipeti kullanarak, oositleri az miktarda TS ile DS'ye aktarın (bir degrade oluşturmak için) ve 3 dakika boyunca DS'de bırakın. Oositleri aynı şekilde WS1'e taşıyın ve 5 dakika bekletin. Son olarak, oositleri 1 dakika boyunca WS2'ye aktarın.
  8. Oositleri uygun bir önkoşulu IVF kültür ortamına aktarın ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonuna (ICSI) devam etmeden önce 1 saat kuluçkaya yatırın. Laboratuvar sayfasını güncelleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Merkezdeki doğurganlık koruma programına genel bakış

12 yıllık bir süre boyunca (2008-2020), 285 kadın, toplanan olgun yumurtaların tüm kohortunun vitrifikasyonu gerektiren en az bir oosit alımı geçirdi. Bu kadınların çoğu (n=250) tek bir geri alma işleminden, 35'inden ise birden fazla geri alma işlemi yapıldı. Yumurta vitrifikasyonu için oosit alımının nedenleri 4 kategoride özetlenmiştir: tıbbi (kanser hariç), kanser, tıbbi olmayan ve diğerleri. Yumurta vitrifikasyonu için tek bir oosit alımı yapılan 250 kadın arasında% 8'inin kanser dışında tıbbi nedenleri vardı (10 endometriozis, 3 miyom, 4 yumurtalık kisti, 1 hidrosalpinks), %16'sı kanser (31 meme kanseri, 3 yumurtalık kanseri, 2 kolorektal kanser, 2 Hodgkin lenfoma, 1 vulvar kanser e 1 serviks kanseri), %53'ünün tıbbi olmayan nedenleri, %23'ünün ise başka nedenleri vardı (43'ünün sperm alınmaması, 10'u İsG, 4 enfeksiyon ve 1 ateş riski). Bu dağılım, yumurta vitrifikasyonu için birden fazla oosit alımı yapılan hastalar arasında farklıydı. Özellikle, %9'unun kanser (1 endometriozis, 2'si yumurtalık rezervi azalması), %6'sının kanser (2 meme kanseri), %80'inin tıbbi olmayan nedenler ve %3'ünün başka nedenleri vardı (1 sperm yokluğu alındı). Yumurta vitrifikasyonu için birden fazla oosit alımı yapılan hastaların hiçbiri bu yumurtaları ısıtmazken, tek bir yumurta vitrifikasyon döngüsü geçiren 250 kadından 78'i bu oositleri kullanmak için geri döndü (Şekil 3).

Tablo 1, ilgili nedenlere göre kümelenmiş tek bir oosit vitrifikasyon döngüsü geçiren 250 kadının verilerini özetler. Yumurta vitrifikasyonu için tıbbi bir nedeni olan hastalar ve kanser nedeniyle doğurganlık koruması uygulanan hastalar daha gençti (ortalama anne yaşı < 35 yıl) ve tıbbi olmayan veya başka nedenleri olan hastalara göre daha iyi bir yumurtalık rezervi (daha yüksek APC) gösterdi. Bununla birlikte, ortalama olgunlaşma oranları (ALıNAN MI oosit sayısı/IC sayısı) biraz daha düşüktü (%77-79'a karşı%72-73), böylece ortalama vitrifiye edilen oosit sayısı 4 grupta (9-10 oosit) benzerdi. Daha da önemlisi, 40 onkolojik hastadan 9'una (%22,5) kemoterapi veya radyoterapiye başlamadan önce sınırlı zamanları olduğu için rastgele başlayan yumurtalık stimülasyon protokolü uygulandı. Kanser dışında tıbbi nedenleri olan hastaların yaklaşık yarısının (%53) ve yumurta vitrifikasyonu için başka nedenleri olan hastaların çoğunluğunun (%76) aslında ısınmak için geri dönmesi ilginçtir. Tersine, kanser (%17,5) veya tıbbi olmayan nedenlerle (%13) doğurganlık koruması uygulanan çok az hasta vitrifiye oositlerini IVF için kullandı. Ayrıca geri dönen hastalar arasında vitrifikasyon ve ısınma arasında geçen süre de dikkat çekicidir: kanser dışında tıbbi nedeni olan hastalarda ortalama 283 gün, başka nedeni olan hastalarda 132 gün, onkolojik hastalarda 1264 gün ve tıbbi olmayan nedenlere sahip hastalarda 1547 gün. Tüm bu ilgili farklılıklardan bağımsız olarak, 4 gruptaki hastalar arasında sağkalım oranı benzerdi (%83-88; ortalama olarak 8-11 oosit ısındı ve 7-9 oosit hayatta kaldı) böylece oosit vitrifikasyon ve ısınma protokollerinin etkinliğini ve güvenliğini teyit etti. Ayrıca, sağkalım oranı vitrifikasyondan ve ısınma operatörünün deneyiminden bağımsızdır (Şekil 4A,B). Tablo 1, oosit vitrifikasyonu için tıbbi olmayan nedenleri olan hastalar dışında ~% 70 olan 4 gruptaki döllenme oranlarını göstermektedir (~% 80). Bununla birlikte, bu veriler küçük bir örneklem büyüklüğü ve sperm faktörünün döllenme sonucu üzerindeki önyargısı nedeniyle karşılaştırılamaz27.

Figure 1
Şekil 1: Oosit kriyoprezervasyonu için orta damlacık konfigürasyonu. Yavaş yavaş dengeyi sağlamak için, oositler önce bir (A) BS damlasına yerleştirilir ve (B) bir damla ES ilekarıştırılır. 3 dakikalık inkübasyondan sonra, (C) üçüncü bir ES çözeltisi damlasıkarıştırılır ve oositler 6-9 dakika kuluçkalanır. Kısaltmalar: HEPES = 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesülonik asit; BS = HEPES arabelleğe alınmış ortam; ES = denge çözümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Kriyoprezervasyon cihazına oosit yüklemesi. Oositler kriyodevice üzerine yerleştirilir (A) tek bir küçük VS damlası. (B) Striptizci pipeti oositlerden uzağa kaydırılır ve (C) VS'nin fazlalığı her oosit etrafında sadece ince bir tabaka bırakacak şekilde yeniden emilir. Kısaltma: VS = vitrifikasyon çözümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Roma üreme tıbbı genera merkezinde gerçekleştirilen oosit vitrifikasyon döngüleri (yıl 2008-2020). 12 yıllık dönemde 250 hastaya oosit vitrifikasyonu için tek bir oosit alımı, 35 hastaya ise çoklu oosit alma döngüsü uygulandı. Oosit vitrifikasyonun doğal nedenleri şekilde gösterilmiştir. Isınma için dönen hastalar (n=78) sadece tek bir oosit vitrifikasyon döngüsü geçiren kadın grubuna aittir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Isıtılmış oosit kohort başına ortalama sağkalım oranı. (A) Vitrifikasyon ve (B) işletmecilerin deneyimi. Her hasta sadece ilk ısınma döngüsü için dahildir. Mann-Whitney U-testikullanılarak istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar değerlendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Denge prosedürünün başında ve sonunda oosit morfolojisi. Denge prosedürünün sonucunu belirlemek için, prosedüre başlamadan önce (A) oosit morfolojisine açıklama eklemek yararlı olabilir. (B) Kriyoprotektif çözeltiye ilk maruz kaldıktan sonra oositte keskin bir büzülme gözlenir. Equilibration prosedürü, (C) oosit ilk hacmini kurtardığında tam olarak kabul edilebilir. Ölçek çubukları = 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Oosit vitrifikasyon nedeni Kanser dışında tıp (n=19) Kanser (n=40) Tıbbi olmayan (n=133) Diğer (n=58)
Oosit alımında anne yaşı, ortalama±SD 33.6±6.4 yıl 34.6±5.9 yıl 37.0±3.4 yıl 38.2±4.3 yıl
Bazal FSH, ortalama±SD 7,5±4,2 IU/L 7.6±1.7 IU/L 7.8±4.1 IU/L 8.8±5.2 IU/L
AMH, ortalama±SD 1,8±1,7 ng/mL 1,9±0,2 ng/mL 2.2±2.4 ng/mL 3.0±2.5 ng/mL
AFC, ortalama±SD 12.7±5.0 13.3±7.0 11.6±6.1 10,7±6,7
BMI, ortalama±SD 20.1±1.5 21,8±1,6 20.2±3.1 22,9±3,6
Stimülasyon süresi, ortalama±SD 10,0±1,5 9,6±1,7 9,9±2,1 10,3±2,1
9/40, 22.5%
Rastgele başlangıç
COC'ler, toplam, ortalama±SD 239 551 1493 592
12,6±5,3 13.8±9.1 11.2±7.1 10,2±8,5
MII oositler, toplam, ortalama±SD 167 400 1161 462
8.8±3.3 10,0±7,2 8.7±5.7 8,0±6,7
Olgunlaşma hızı, ortalama±SD 72.4±13.6% 72.1±19.6% 79±17,5% 77.4±22.2%
Isınma için geri dönen hastalar, vitrifikasyon uygulanan hastaların toplam % 'si 10/19, 52.6% 7/40, 17.5% 17/133, 12.8% 44/58, 75.9%
Vitrifikasyon ve ilk ısınma arasındaki günler, ortalama±SD 283±225 1264±764 1547±709 132±203
Isıtılmış MII oositleri, toplam ortalama±SD 82 66 191 409
8.2±2.8 9,4±4,8 11±25,8 9.3±7.2
Hayatta kalan MII oositleri, toplam ortalama±SD 73 55 160 345
7.3±3.3 7,9±4,0 9,4±4,8 7,8±6,9
Sağkalım oranı, ortalama±SD 87.6±18.1% 83.2±1.7% 85.4% ±14.5% 84.7±21.9%
Sperm Faktörü
N, n, % 5/10, 50% 4/7, 57% 13/17, 76% 13/44, 29%
MMF, n, % 3/10, 30% 3/7, 43% 3/17, 18% 17/44, 39%
YULAF, n, % 2/10, 20% - 1/17, 6% 11/44, 25%
NOA, n, % - - - 3/44, 7%
Gübreleme oranı, ortalama±SD 70.0±14.4% 70.0±17.0% 78±5±20,6% 71.0±24.3%

Tablo 1: Tek bir oosit vitrifikasyon döngüsü geçiren hastalar. Kısaltmalar: FSH = folikül uyarıcı hormon; AMH = anti-Müllerian hormonu; VKİ = vücut kitle indeksi; COC = kümülüs oosit kompleksleri; MII = metafaz-II; N = normozoospermik; MMF = orta derecede erkek faktörü (1-2 sperm defektleri); YULAF = oligoasthenoteratozoospermik; NOA = obstrüktif olmayan azoospermi (sperm testis sperm ekstraksiyonu ile toplandı).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Klinik hususlar

Yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonu ve in vitro olgunlaşma gibi gelişmekte olan stratejiler araştırılmış olsa da, COS sonrası oosit vitrifikasyonu doğurganlığın korunması için altın standart tekniktir. Bu senaryoda, çoğu kanser hastası kanser tedavilerine başlamadan önce sadece bir yumurtalık döngüsünden yararlanabileceğinden, alınan ve kriyoprezerserve edilen oosit sayısı mümkün olan en kısa sürede en üst düzeye çıkarılmalıdır. Bu nedenle, uygun bir yumurtalık stimülasyon protokolü, yumurtalık rezervini tam olarak kullanmak ve gelecekteki bir canlı doğumun kümülatif şansını artırmak için çok önemlidir28, oosit alımında anne yaşına güçlü bir şekilde bağlı bir sonuç. Bu bağlamda, doğurganlık koruma amacıyla oosit vitrifikasyonu için ideal bir yaş henüz önerilmemiştir29ve 35 yıl18 veya 37 yıl arasında bir konsensüs gereklidir30,31. Bununla birlikte, doğurganlık koruması, yaşlarına göre başarı oranları hakkında uygun danışmanlık verilmesi koşuluyla, 37 yaşından büyük kadınlar da dahil olmak üzere tüm hastalar için erişilebilir olmalıdır.

İlaçların protokolü ve başlangıç dozu jinekoloğun kararına göre ve en önemlisi mevcut zamana göre özetlenmelidir32,33. Konvansiyonel stimülasyonun erken foliküler fazda başlaması, zaman sorun olmadığında önerilir. Bununla birlikte, gerekirse, acil kanser / tıbbi tedavilerin başlatılmasındaki gecikmeleri en aza indirmek için rastgele başlangıç yaklaşımı mümkündür34,35. Folikül gelişimi, tek bir yumurtalık döngüsü boyunca birden fazla folikül işe alım dalgası tanımlandığı için son derece dinamik bir süreç olduğu bildirilmiştir. Bu fenomenin arkasındaki biyolojik mekanizmaların hala ortaya açıklanması gerekse de, yetkin oositler, COS'un başlatıldığı adet döngüsünün aşamasından bağımsız olarak alınabilir ve kriyoprezerserve edilebilir36.

Bu merkezde, yumurtalık stimülasyonu tipik olarak GnRH antagonist protokolü ve 150-300 IU/ gün rekombinant-FSH veya insan menopoz gonadotropin kullanılarak gerçekleştirilir. 35 yaşından büyük, LH eksikliği olan veya standart COS sonrası suboptimal yanıt gösteren belirli hasta popülasyonlarında, insülin benzeri büyüme faktörü 116,37,38ile sinerjik bir eylemle foliküllerin işe alımını ve büyümesini artırmak için COS sırasında LH eklenebilir. Ayrıca, GnRH antagonist protokolü ve ardından bir GnRH agonist tetikleyicisinin yumurtalık yanıtını en üst düzeye çıkarmak ve İSG39riskini en aza indirmek için kısa, güvenli ve son derece uygun bir stimülasyon protokolü olduğu bildirilmiştir. Meme kanseri gibi östrojene duyarlı hastalıkları olan hastalarda letrozol gibi aromataz inhibitörleri ile ilişkili gonadotropinleruygulanır 20.

Aslında, yeni bir inceleme letrozolün konjenital kusurlar, malignite nüks ve artan mortalite açısından komplikasyonsuz geleneksel stimülasyon ile benzer yumurtalık yanıtı içerdiğini göstermiştir40. Benzer şekilde, tamoksifen COS sırasında, letrozol gibi, oosit yeterliliği üzerinde hiçbir etki göstermeyen östrojene duyarlı tümörler durumunda kullanılabilir41,42. Ancak, bunun daha büyük çalışmalarda onaylanması gerekir. Bu merkezde letrozol, estradiol duyarlı tümörlerde oosit alımından sonra stimülasyonun 1. gününden 7. gününe kadar uygulanır. CoS'un antikanser tedavilerini daha da geciktirecek en önemli komplikasyonu olan İsG riski, özellikle yüksek AFC'li genç hastalarda göz önünde bulundurulmalıdır. Bu durumlarda, insan koryonik gonadotropin (hCG) yerine bir GnRH agonisti ile yumurtlamayı tetiklemenin yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Önlenmesi gereken diğer konular şunlardır: (i) COS sırasında düşük moleküler ağırlıklı heparin yönetimini gerektiren trombo-emboli ve (ii) COS43'densonra azaltılmış yumurtalık yanıtı . İkincisini telafi etmek için, tek bir yumurtalık döngüsünde art arda iki stimülasyon yapılabilir. DuoStim olarak bilinen bu geleneksel olmayan COS protokolü, foliküler ve luteal faz stimülasyonları ve kısa bir süre içinde (~15 gün) iki oosit alımını gerektirir ve gelecekte doğurganlık koruma amacıyla araştırılmalıdır44,45,46.

Kadınlarda doğurganlığın korunması için diğer olası stratejiler şunlardır: (i) prepubertal kadınlar için mevcut tek seçenek olan yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonu. Bu olasılık, üreme ve endokrin aktiviteyi geri yüklemek ve hormonal stimülasyona gerek olmadığı için kanser tedavisine başlamakta gecikmeden kaçınmak için umut vericidir. Ancak halen deneyseldir ve daha sonra nakil ile laparoskopik cerrahi gerektirir ve ortotopik kanserin yeniden iletimi riski vardır. (ii) Isındıktan sonra daha yüksek bir sağkalım oranı içeren, ancak kanser tedavisini geciktiren ve bir erkek partnerin veya donörün dahil olmasını gerektiren embriyo kriyoprezervasyonu, böylece bir kadının gelecekteki üreme özerkliğini desınırlandırmak 47. Ayrıca, bazı ülkelerde yasal sınırlamalara tabi olabilir. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, oosit vitrifikasyonu en yerleşik ve etik olarak kabul edilebilir yaklaşım olarak kabul edilir. İdeal olarak, üreme çağında kanserden etkilenen kadınların tedavi edildiği tüm büyük hastaneler, doğurganlığın korunması için programlar sağlamalı ve bu hastaların bu programa eşit erişim sağlaması için tüm süreç ücretsiz olmalıdır. Yine de, oosit kriyoprezervasyonu sadece süreçte oosit yeterliliğini etkilemeyecek kadar uzmanlığa sahip merkezlerde yapılmalıdır48.

Vitrifikasyon protokolünde ve sorun gidermede kritik adımlar

Vitrifikasyon, hücre hasarının ana etkeni olan buz kristali çekirdeğini ve büyümesini önleyen hücrelerin içinde cam benzeri bir katılaşmaya neden olan sahte bir ikinci derece faz geçişidir (IUPAC Kimyasal Terminoloji Özeti). Doğru vitrifikasyonu elde etmek için, yükleme hacimlerini en aza indirerek veya numunelerin sıvı nitrojene (açık cihazlar) doğrudan maruz kalmasıyla elde edilen son derece yüksek bir soğutma oranı (>20.000 °C/dk) ile birlikte en az iki CPA kombinasyonu (tipik olarak etilen glikol ve DMSO permayan ajanlar olarak ve sakkaroz) gereklidir. Oositler vücudun en büyük hücreleri olduğundan, en büyük miktarda su içerirler. Bu nedenle, donma yaralanmalarına embriyolara göre daha duyarlıdırlar. Oosit kriyoprezervasyonu sırasında hücre içi organellerde hasar (örneğin, sitoskeleton veya meiotik iğ), membran geçirgenliğinin değiştirilmesi, zona pellucida sertleşmesi, oosit aktivasyonu, biyokimyasal yolların değiştirilmesi ve muhtemelen hücre ölümü meydana gelebilir49. Bu nedenle, oosit canlılığının ve gelişimsel yeterliliğin başarılı bir şekilde korunması için birden fazla faktör arasında hassas bir denge sağlanmalıdır. Vitrifikasyon sonrası sağkalım oranında tutarlılık sağlamak ve kıyaslama seviyelerine ulaşmak için prosedürün tüm önemli adımları kesinlikle kontrol edilmelidir.

EBM'ler, hücre osmolalitesi ve soğutma hızları

Vitrifikasyon olasılığını artırmak için ortamın viskozitesi (ve dolayısıyla EBM konsantrasyonu) en üst düzeye çıkarılmalıdır. Bununla birlikte, EBM'lerin toksisitesi her zaman kontrol altında tutulmalıdır50. Bu amaçla, hem EBM'lere hem de yükleme hacimlerine hücre maruz kalma süresini en aza indirmek ve her zaman oda sıcaklığında (25-27 °C)51çalışmak çok önemlidir. Diğer protokoller farklı EBM ve kriyodevices kombinasyonlarını içerir ve 37 °C'de gerçekleştirilir; ancak, burada tanımlanmadılar. Bu nedenle, bu makalenin notları, temsili sonuçları ve tartışma bölümleri sadece burada ayrıntılı olarak açıklanan vitrifikasyon protokolü için geçerlidir.

Kriyoprezervasyon sırasında, oositler hücre dehidrasyonunu ve sitoplazmik büzülmeyi teşvik etmek için artan ozmolit konsantrasyonunun CPA çözeltilerine maruz kalır. Isınma sırasında, sitoplazmik hacmi geri yüklemek için azalmış ozmolit konsantrasyonuna sahip çözeltilere maruz kalırlar. Vitrifikasyon sırasında, oositler susuzdur ve hücre hacmindeki kasıtsız dalgalanmalar şiddetli ozmotik şoka neden olabilir, böylece ısınmadan sonra hayatta kalma ve gelişim potansiyelinden ödün verebilir52. En uygun soğutma oranını bulmak, osmolality53 ve hücre gelişim potansiyelini etkilediği için hücre canlılığını korumak için önemli bir husustur54. Örneğin, bir hücre en uygun oranlardan daha yavaş soğutma hızlarına maruz kaldığında, hücre ölümüne yol açan hipertonik koşullara yoğun bir şekilde maruz kalabilir.

Optimum soğutma hızına ulaşmak için yükleme hacimleri en aza indirilmeli, denge sürecinin hızını etkilemeyecek şekilde RT kontrol edilmeli ve numuneler doğrudan sıvı nitrojene maruz kalmalıdır. Dengenin ne zaman gerçekleştirildiğini değerlendirmenin bir yolu, prosedürün başlangıcından önce oosit morfolojisine (özellikle perivitellin alanının genişliği ve zona pellucida kalınlığı) açıklama eklemektir (Şekil 5A). Hücre hacmi azaltmanın ilk aşamasından sonra (Şekil 5B), oositin başlangıç hacmini kurtarması beklenir (Şekil 5C). Vitrifikasyon-ısınma çözeltilerini tamponlayan zwitterions nedeniyle hava atmosferi altında oosit kullanımı sırasında doğru pH korunsa da, orta osmolalite bunun yerine özellikle sıcaklığa bağlıdır53. Bu nedenle, bulaşık hazırlama yöntemi olası zararlı etkileri azaltmak için kritik öneme sahiptir55.

Yağ kaplaması, buharlaşmayı önlemek ve IVF medyasında osmolalitede herhangi bir artışı önlemek için kesinlikle çokönemlidir 56. Ancak vitrifikasyon ve ısınma işlemleri yapılırken kullanılamaz. Bu nedenle, operatörler için bazı ipuçları önemlidir: (i) damlacıkları mümkün olduğunca çabuk ve kullanımdan hemen önce hazırlayın; (ii) ozmolaritedeki kaymaları en aza indirmek için daha büyük hacimlerde damlacıkları göz önünde bulundurun (<30 μL önerilmez); (iii) çevresel koşullar standartlaştırılamadığında, 6 kuyulu bir plaka kullanılabilir ve buharlaşmayı sınırlamak için bitişik rezervuara steril su veya PBS eklenebilir; (iv) şişe tekrar tekrar açılırsa osmolalite değişebileceğinden, orta şişenin ilk açıldığı tarihe dikkat edin.

Oosit ısınması ve oosit sapması

Hayatta kalma oranındaki tutarlılığı etkileyebilecek en önemli adım kesinlikle ısınmasürecidir 57. Bu adım sırasında, EBM'ler yavaş yavaş oositten çıkarılır ve olası sitotoksik etkiyi önlemek için seyreltilir. Sapma, yani vitrifiye bir çözeltinin ısınması sırasında veya buharda denetim, taşıma veya depolama sırasında yanlışlıkla buz çekirdeği veya buz kristallerinin oluşumu, vitrifikasyonun ana risklerinden biridir58,59,60. Bu nedenle, ısınma sırasında sapma ve yaralanmayı önlemek için, işlemin ilk ve son adımları arasındaki sıcaklık farkı en üst düzeye çıkarılmalıdır. Seki ve Mazur57'nin farklı oranlarda vitrifikasyona ve ısınmaya maruz kalan murine oositlerinde gösterdiği gibi, ısınma ne kadar hızlı, hayatta kalma o kadar yüksektir. TS'nin hacmi ve sıcaklığı kontrol edilmesi gereken ana faktörlerdir: TS, işlemden önce 37 °C'ye (işlemden en az 1 saat önce) uygun şekilde ısıtılmalı ve sıvı azot rafı kapasitesinin kenarına doldurulmalı ve stereomikroskopa mümkün olduğunca yakın yerleştirilmelidir. Operatör, kriyoprezervasyon taşıyıcısını sıvı nitrojenden TS'ye aktarırken mümkün olduğunca hızlı olmalıdır. Vitrifikasyonun yüksek verimliliği nedeniyle, ilgili dondurma protokolünden bağımsız olarak evrensel bir ısınma protokolü kullanılabilir, bu da farklı bir IVF merkezinden oositler ithal edildiğinde bile tüm ısınma döngülerinin yönetimini kolaylaştırır61.

Açık cihazlar ve kontaminasyon riski

Bu protokolün etkinliğini destekleyen son derece yüksek soğutma ve ısınma oranlarına ulaşmak için açık sistemlerin istihdamı ve numunelerin sıvı nitrojene doğrudan maruz kalması gerekmektedir. Vitrifikasyon çapraz kontaminasyon için düşük risk oluşturan bir prosedür olmasına rağmen, çok küçük hacimler içerdiğinden ve herhangi bir putatif viral yükü seyrelten birkaç numune yıkamadan sonra gerçekleştirildiği için, güvenliğini artırmak için tüm ihtiyati önlemlerin alınması önemlidir. Mevcut kanıtlara dayanarak, kapalı sistemler en azından oosit vitrifikasyonu için açık sistemlere rekabetçi bir alternatif sunmaz62,63. Sıvı azotla doğrudan temasla ilgili riskleri en aza indirirken açık vitrifikasyon sistemlerinin etkinliğini korumak için, ikincisi ultraviyole ışınlama64,65ile sterilize edilebilir. Alternatif olarak, geleneksel olanlara göre daha düşük kontaminasyon riski oluşturduğu bilinen, ancak oosit canlılığının korunmasında etkili olduğu kanıtlanmış buhar depolama tankları kullanılabilir66,67.

Oosit vitrifikasyon programları için temel performans göstergelerinin sürekli izlenmesinin önemi

Bir IVF laboratuvarında, temel performans göstergelerinin (KPI' lar) izlenmesi, sonuçların izlenmesi ve sürekli iyileştirilmesi için gereklidir68. Genel olarak, izleme süreçleri ve prosedürleri için KPI'lar tanımlanırken, üç ana alan göz önünde bulundurulmalıdır: yapı, süreç ve sonuç. Yapısal KPI'lar, fiziksel ve insan kaynaklarının özelliklerini özetleyerek tüp bebek laboratuvarının kalitesini ölçer. Bir kriyoprezervasyon programındaki tesisle ilgili yapısal bir KPI örneği, belirli bir zaman diliminde gerçekleştirilen kriyoprezervasyon gerektiren toplam ART prosedür sayısına göre kriyotank sayısı veya kriyoroomun toplam metrekaresine göre kriyo-tank sayısı olabilir. Bununla birlikte, vitrifikasyon gibi hassas bir prosedürle uğraşırken insan kaynakları ve özellikle operatör becerileri son derece önemlidir. Aslında, son derece etkili olmasına rağmen, vitrifikasyon tekniği, kesinlikle kontrol edilmesi gereken katı zamanlamalara sahip birkaç prosedür aşamasını içeren zorlu bir prosedürdür: çok kısa bir süre içinde önemli ölçüde viskoz bir ortamın çok küçük bir miktarı yönetilmelidir.

Prosedürde belirli soğutma parametreleri ayarına sahip hiçbir dondurma makinesi yer almamaktadır; bu nedenle, protokol ayrıntılarının ve eğitimin standartlaştırılması esastır. Manuel süreç, tutarlı ve yüksek oranda tekrarlanabilir hücre sağkalım oranları elde etmek için yerine getirilmesi gereken katı beceri gereksinimlerine sahiptir. Her acemi operatöre, prosedürün tüm kritik noktalarını, özellikle de numunelerin EBM'lere maruz kalma süresini ve hücrelerin son derece viskoz bir ortamda işlenmesini kontrol etmede yetkin olmaları için özel eğitim verilmelidir. Bununla birlikte, Dessolle ve ortak yazarlara göre,69 vitrifikasyon prosedürü için öğrenme eğrisi, yeterlilik başarısı esas olarak manipülasyon zorlukları ile sınırlı olduğundan, genç embriyologlar için bile çok uzun olmamalıdır. Vitrifikasyonda uzmanlık elde edildikten sonra, konsensüs kağıtları tarafından belirlenen yetkinlik değerlerinin bakımını düzenli olarak değerlendirmek için KPI'ların kullanımıyla her bir operatörün performansı doğru ve düzenli olarak doğrulanmalıdır70. Ayrıca, operatörlerin güven/yetkinliği, sonuçları etkilememek için karşılaştırılabilir olmalıdır.

Proses KPI'ları IVF laboratuvarının ne kadar iyi çalıştığını ölçar. Vitrifikasyon ve ısınma protokolleri ve prosedürleri zamanında yapılmalı, sadece oosit gelişimsel yeterliliğinin değil, aynı zamanda sıvı nitrojenin kullanımına ilişkin operatör güvenliğinin korunması için yeterli ozmolarite ve sıcaklığın korunmasına özellikle dikkat edilerek kültür koşullarındaki dalgalanmalar en aza indirilmelidir. Proses KPI'larına örnek olarak, yılda tüp bebek işlem sayısı başına sıvı nitrojen elleçlenirken laboratuvar personeli yaralanmalarının yüzdesi, vitrifikasyon/ısınma prosedürleri sırasında kaybedilen/hasar gören gametlerin/embriyoların yüzdesi ve yılda işlem sayısı başına yapılan denetimler verilebilir.

Son olarak, sonuç KPI'ları IVF laboratuvarının etkinliğini ölçer ve genellikle ICSI sırasında morfolojik olarak bozulmamış oositlerin oranı olarak tanımlanan ısıt sonrası okosit sağkalımını ifade eder (oosit vitrifikasyonu durumunda, yetkinlik değeri >50 ve kıyaslama değeri% 75'tir) 70. Ek olarak, döllenme oranları (10-30daha düşüktür) vitrifiye oositler için sonuç KPI'ları olarak geçerlidir. Bununla birlikte, klinik sonuçlar hatalı klinik prosedürlere göre çifte özgü özelliklere daha fazla tabidir71,72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Hiç kimse

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
  2. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  3. Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
  4. Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
  5. Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
  6. Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
  7. Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
  8. Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
  9. Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
  10. Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1 (2016).
  11. Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
  12. Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
  13. Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, Suppl 6 160-170 (2013).
  14. Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
  15. Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
  16. Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94 (2019).
  17. Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327 (2018).
  18. Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
  19. Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
  20. Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049 (2019).
  21. Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
  22. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
  23. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  24. Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
  25. ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025 (2019).
  26. Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
  27. Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
  28. Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
  29. Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
  30. Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
  31. Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
  32. Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
  33. Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
  34. Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
  35. Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
  36. Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
  37. Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
  38. Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
  39. Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
  40. Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
  41. Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
  42. Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
  43. Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
  44. Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
  45. Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317 (2018).
  46. Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
  47. Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
  48. Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
  49. Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
  50. Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
  51. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reproductive Biomedicine Online. 9 (6), 680-691 (2004).
  52. Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268 (2014).
  53. Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
  54. Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
  55. Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
  56. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  57. Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
  58. Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
  59. Jin, B., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biololgy of Reproduction. 82 (2), 444-450 (2010).
  60. Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
  61. Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
  62. Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
  63. Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123 (2018).
  64. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  65. Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
  66. Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
  67. Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
  68. Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
  69. Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
  70. Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
  71. Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
  72. Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).

Tags

Biyoloji Sayı 175 Doğurganlık koruma yumurtalık stimülasyonu metafaz II oosit vitrifikasyon ısınma Temel Performans Göstergeleri (KPI)
Oosit Vitrifikasyonu ile Doğurganlığın Korunması: Klinik ve Laboratuvar Perspektifleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggiulli, R., Vaiarelli, A.,… More

Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter