Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Conservazione della fertilità attraverso la vitrificazione degli ovociti: prospettive cliniche e di laboratorio

Published: September 16, 2021 doi: 10.3791/61963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Summary

La crioconservazione degli ovociti è riconosciuta da diverse società scientifiche internazionali come il gold standard per la conservazione della fertilità nelle donne postpuberali. Adeguate strategie cliniche e di laboratorio garantiscono la massima efficacia, efficienza e sicurezza dei trattamenti di conservazione della fertilità.

Abstract

Preservare la fertilità femminile è fondamentale in un sistema sanitario multifunzionale che si prende cura della futura qualità della vita dei pazienti. La crioconservazione degli ovociti è riconosciuta da diverse società scientifiche internazionali come il gold standard per la conservazione della fertilità nelle donne postpuberali, sia per indicazioni mediche che non mediche. Le principali indicazioni mediche sono le malattie oncologiche, le malattie ginecologiche come l'endometriosi grave, le malattie sistemiche che compromettono la riserva ovarica e le condizioni genetiche che comportano la menopausa precoce. Questo documento descrive l'intero work-up clinico e di laboratorio di un trattamento di conservazione della fertilità delineando raccomandazioni per una consulenza obiettiva e basata sull'evidenza. Inoltre, si concentra sull'efficacia della procedura e descrive le strategie più appropriate per sfruttare appieno la riserva ovarica e massimizzare il numero di ovociti recuperati nel più breve tempo possibile. La valutazione della riserva ovarica, la definizione di un protocollo di stimolazione ideale, nonché le procedure di prelievo degli ovociti, denudazione e vitrificazione sono state dettagliate insieme agli approcci per massimizzarne l'efficacia, l'efficienza e la sicurezza.

Introduction

Lo sviluppo e l'implementazione di un efficiente programma di crioconservazione per gli ovociti umani è stato un passo avanti significativo nella medicina riproduttiva. Secondo recenti evidenze, la vitrificazione è la strategia più efficace per crioconservare gli ovociti della metafase II (MII), in quanto si traduce in tassi di sopravvivenza statisticamente più elevati rispetto al congelamento lento, indipendentemente dalla popolazione di pazienti (pazienti infertili o programma di donazione di ovociti)1,2,3. I notevoli risultati della vitrificazione degli ovociti hanno portato i comitati di pratica dell'American Society for Reproductive Medicine (ASRM) e della Society for Assisted Reproductive Technology (SART) a dichiarare questa tecnica come la più efficace per la conservazione elettiva della fertilità nelle donne postpuberali, sia per indicazioni mediche che non mediche4,5,6. Le indicazioni mediche per la conservazione della fertilità includono (i) il cancro e le malattie autoimmuni che richiedono terapie7 come la radioterapia, la chemioterapia citotossica e la terapia endocrina (il cui effetto dannoso sulla riserva ovarica è associato all'età materna, nonché al tipo e alla dose del trattamento); (ii) malattie ovariche che richiedono un intervento chirurgico ripetuto o radicale (come l'endometriosi)8; e (iii) condizioni genetiche (ad esempio, X-fragile) o insufficienza ovarica prematura. Inoltre, la conservazione della fertilità è diventata un'opzione preziosa per tutte le donne che non hanno raggiunto il loro obiettivo genitoriale per motivi non medici (noto anche come congelamento sociale).

Indipendentemente dall'indicazione per la conservazione della fertilità e secondo le principali linee guida internazionali sulla conservazione della fertilità, tutti i pazienti disposti a vetrificare i loro ovociti dovrebbero ricevere una consulenza appropriata per essere informati sulle loro realistiche possibilità di successo, i costi, i rischi e le limitazioni della procedura9,10,11,12,13. Ancora più importante, dovrebbe essere chiaro che la vitrificazione di una coorte di ovociti MII non garantisce una gravidanza, ma che offre una maggiore possibilità di successo per il futuro trattamento di fecondazione in vitro (FIV), se necessario14. A questo proposito, l'età della donna al momento della vitrificazione degli ovociti è sicuramente il fattore limitante15 più importante in quanto l'età materna avanzata (AMA; >35 anni) è la causa principale dell'infertilità femminile16. Oltre a una progressiva riduzione della riserva ovarica, l'AMA è associata a una compromissione della competenza degli ovociti a causa di percorsi fisiologici difettosi come il metabolismo, la regolazione epigenetica, i checkpoint del ciclo cellulare e la segregazione meiotica17. Pertanto, il numero ragionevole di uova da vetrificare dipende principalmente dall'età materna. Nelle donne di età inferiore ai 36 anni, sono necessari almeno 8-10 ovociti MII18 per massimizzare le possibilità di successo. In generale, maggiore è il numero di ovociti vitrificati, maggiore è la probabilità di successo. Pertanto, adattare la stimolazione ovarica in base ai marcatori della riserva ovarica come i livelli di ormone anti-Mülleriano (AMH) o la conta dei follicoli antrali (AFC) è fondamentale per sfruttare appieno la riserva ovarica nel più breve tempo possibile.

La sicurezza dell'intera procedura è l'altra questione chiave quando si arruolano pazienti per la conservazione della fertilità. I medici dovrebbero impiegare le migliori strategie per ridurre al minimo i rischi e prevenire la sindrome da iperstimolazione (i) ovarica (OHSS) utilizzando approcci sicuri come il protocollo antagonista dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) seguito da un trigger agonista GnRH19 e (ii) i rischi remoti, ma possibili, di sanguinamento peritoneale, lesioni alle strutture pelviche (uretere, intestino, appendice, nervi) o infezione pelvica durante il recupero degli ovociti. Infine, (iii) i regimi tradizionali per la stimolazione sono associati all'estradiolo sierico soprafisiologico e, pertanto, non sono raccomandati nelle malattie sensibili agli estrogeni come il cancro al seno. I protocolli che coinvolgono inibitori dell'aromatasi (come letrozolo o tamoxifene) sono più adatti in questi casi20,21. In laboratorio, il protocollo più diffuso per la vitrificazione degli ovociti è ancora quello descritto per la prima volta da Kuwayama e colleghi2,23,che consiste in una procedura graduale che prevede l'aggiunta graduale di crioprotezioni (CPA). Nella prima fase (equilibrio/disidratazione), gli ovociti sono esposti in una soluzione di CPA contenente il 7,5% v/v di glicole etilenico e il 7,5% v/v dimetilsolfossido (DMSO), mentre nella seconda fase gli ovociti vengono spostati in una soluzione di vetrificazione con 15% v/v etilenglicole e 15% v/v DMSO, più 0,5 mol/L saccarosio. Dopo una breve incubazione nel mezzo della vitrificazione, gli ovociti possono essere collocati in criodevice aperte appositamente progettate e infine immersi in azoto liquido a -196 °C per essere conservati fino all'uso.

Qui, l'intero work-up clinico e di laboratorio di un trattamento di conservazione della fertilità è stato descritto (i) delineando raccomandazioni per una consulenza obiettiva e basata sull'evidenza, (ii) concentrandosi sul rapporto costo-efficacia della procedura e (iii) descrivendo le strategie più appropriate per sfruttare appieno la riserva ovarica e massimizzare il numero di ovociti recuperati nel più breve tempo possibile. La valutazione della riserva ovarica, la definizione di un protocollo di stimolazione ideale, nonché le procedure di recupero degli ovociti, denudazione e vitrificazione saranno dettagliate insieme agli approcci per massimizzarne l'efficacia, l'efficienza e la sicurezza. Poiché esistono altri protocolli o adattamenti di questo protocollo in letteratura, i risultati rappresentativi e le sezioni di discussione di questo manoscritto si applicano solo a questa procedura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Work-up e consulenza clinica

NOTA: Nel caso di pazienti che richiedono la conservazione della fertilità per motivi oncologici, assicurarsi che non vi sia alcuna lista d'attesa per la pianificazione della consultazione e che l'appuntamento sia fornito il prima possibile.

  1. Esaminare la storia medica e la documentazione precedente e valutare lo stato di salute generale del paziente.
  2. Registrare tutte le informazioni (compresa l'approvazione dell'oncologo a sottoporsi a stimolazione ovarica in caso di pazienti oncologiche) in un database relazionale.
  3. Fornire al paziente una consulenza specifica sulla fattibilità della procedura. Spiegare le fasi della procedura (stimolazione ovarica, prelievo di ovociti, vitrificazione degli ovociti) e informarla sulle realistiche possibilità di successo (principalmente a seconda dell'età materna e del numero previsto di ovociti MII al momento del prelievo degli ovociti), nonché del costo e dei limiti della procedura.
  4. Eseguire l'ecografia transvaginale per ottenere informazioni sulla riserva ovarica (cioè AFC) e per valutare l'accessibilità delle ovaie per la raccolta degli ovuli.
  5. Richiedere esami del sangue per valutare il gruppo sanguigno e il fattore Rhesus, lo screening della coagulazione (emocromo, protrombina, tromboplastina, fibrinogeno, proteina C, proteina S, antitrombina III, omocisteina) e malattie infettive (epatite B, epatite C, HIV, laboratorio di ricerca sulle malattie veneree / Treponema pallidum Hemagglutinanation Assay).
    NOTA: Nel caso di pazienti che accedono a un programma di conservazione della fertilità per motivi medici non urgenti, una valutazione più completa può includere l'ormone follicolo-stimolante basale (FSH), l'ormone luteinizzante (LH), estradiolo, AMH, esame del seno, test Papanicolaou, screening genetico della coagulazione (fattore V di Leida e protrombina) e screening TORCH (toxoplasmosi, rosolia, citomegalovirus).
  6. Richiedi una valutazione cardiologica (elettrocardiogramma).
  7. Raccomandare la consulenza psicologica.

2. Protocolli di stimolazione ovarica controllata per la conservazione della fertilità

NOTA: Quando il tempo disponibile prima di iniziare il trattamento del cancro è limitato, il protocollo di avvio casuale (cioè l'inizio della stimolazione ovarica in qualsiasi momento durante il ciclo mestruale) è raccomandato per la stimolazione ovarica in pazienti oncologiche che sono candidate per la conservazione della fertilità. In un programma di conservazione della fertilità per motivi medici non urgenti o sociali, è preferibile la stimolazione convenzionale che inizia nella fase follicolare precoce e la stimolazione ovarica viene avviata in base al ciclo mestruale. Gli approcci di stimolazione ovarica controllata (COS) dovrebbero essere eseguiti secondo le recenti linee guida della Società europea di riproduzione umana ed embriologia (ESHRE)24.

  1. Personalizza il COS in base alle caratteristiche della paziente e ai marcatori di riserva ovarica, principalmente età materna, FSH, AMH e AFC.
  2. Iniziare cos il giorno 5 del ciclo mestruale utilizzando FSH ricombinante o urinario con una dose fissa di 150-300 UI / die (protocollo antagonista).
    NOTA: In una specifica popolazione di pazienti con deficit di LH o scarsa risposta non ottimale, può essere somministrato un ulteriore LH 75/150 UI/die in base alla risposta ovarica, ai livelli di LH e al giudizio del ginecologo.
  3. Nei pazienti con malattie sensibili agli estrogeni, includere gonadotropine associate a inibitori dell'aromatasi (letrozolo) dal giorno 1 della stimolazione fino al giorno 7 dopo il recupero degli ovociti.
  4. Somministrare una dose fissa di gonadotropine per 4 giorni.
  5. Monitorare la crescita follicolare il giorno 5 e poi ogni 2-3 giorni; eventualmente, regolare il dosaggio di gonadotropina.
  6. Una volta che almeno 3 follicoli raggiungono i 17-18 mm di diametro, somministrare il trigger per la maturazione finale degli ovociti con un singolo bolo sottocutaneo di agonista del GnRH alla dose di 0,5 ml.

3. Recupero degli ovociti

  1. Preparazione per il recupero degli ovociti
    1. Per i materiali richiesti, fare riferimento alla Tabella dei materialie tenere pronte calzature e abbigliamento da laboratorio, maschera facciale chirurgica, copertura per capelli, guanti chirurgici, un marcatore permanente non tossico, pinzette, piccole garze sterili, speculum monouso o riutilizzabile, attrezzature per la chirurgia vaginale e disinfettante per superfici. Garantire la disponibilità di attrezzature per la rianimazione, farmaci anestetici per l'inversione, un kit preparato per il trattamento dello shock anafilattico e ossigeno in sala operatoria.
    2. Eseguire la procedura di prelievo degli ovociti secondo le raccomandazioni del gruppo di lavoro ESHRE sugli ultrasuoni nelle tecnologie di riproduzione assistita (ART)25.
      1. Somministrare sedazione o anestesia generale e antibiotici per la profilassi.
        NOTA: In questo protocollo, la sedazione profonda è stata ottenuta ingostrando propofol (il cui dosaggio è regolato in base al peso del paziente) e 50-100 μg di fentanil, 1000 mg di paracetamolo e ventilazione assistita della maschera con ossigeno.
      2. Eseguire il prelievo degli ovociti utilizzando un'unità di aspirazione composta da una pompa per vuoto, un tubo di raccolta collegato a un ago da 17 G a lume singolo e un tubo di raccolta degli ovociti. Durante la raccolta, non superare una pressione di ~ 120 mmHg per evitare il rischio di danni agli ovociti come la rimozione delle cellule del cumulo o la fratturazione della zona pellucida.
      3. Calibrare la temperatura della superficie di lavoro per garantire 37 °C nel substrato di coltura. Durante l'intera procedura, ridurre al minimo l'esposizione degli ovociti anche a temperature transitorie che possono influire sulla loro competenza evolutiva.
      4. Alla fine del recupero degli ovociti, osservare il paziente per 3-4 ore prima della dimissione.
  2. Sala operatoria
    1. Prima di entrare in sala operatoria, identificare il paziente e confermare il momento di attivazione dell'ovulazione.
    2. Avere il paziente sdraiato sul tavolo operatorio in posizione ginecologica.
    3. Pulire la vagina / cervice prima del recupero degli ovociti per ridurre al minimo la contaminazione batterica.
    4. Eseguire un'ecografia transvaginale preliminare per valutare la posizione delle ovaie e le relazioni anatomiche con i vari organi e vasi sanguigni.
    5. Sotto guida ecografica, inserire un ago a singolo lume attraverso la parete vaginale e in un follicolo ovarico, facendo attenzione a non ferire gli organi o i vasi sanguigni situati tra la parete vaginale e l'ovaio.
    6. Inizia l'aspirazione dal follicolo più vicino e passa a quelli più distali.
    7. Forare tutti i follicoli di diametro superiore a 11-12 mm, eseguendo "movimenti di torsione" dell'ago per aspirare l'intero fluido follicolare, che viene poi rilasciato in un tubo sterile (fondo rotondo 14 mL) preriscaldato nel riscaldatore a blocchi della sala operatoria.
    8. Subito dopo il recupero, sigillare ed etichettare il tubo con i dettagli dell'identità del paziente.
    9. Assicurarsi che l'infermiere porti il tubo in laboratorio, dove viene immediatamente sottoposto a screening per la presenza di complessi cumulo-ovociti (COC).
    10. Istruire gli embriologi a informare il clinico del numero totale di COC recuperati.
    11. Una volta completata la procedura per la prima ovaia, lavare l'ago con un mezzo pulito e procedere con la seconda ovaia utilizzando la stessa procedura.
    12. Dopo il prelievo degli ovociti, valutare qualsiasi sanguinamento dalle ovaie o dai vasi sanguigni del parametrio e del liquido libero nella sacca di Douglas.
      NOTA: Per automatizzare e migliorare l'efficacia della tracciabilità dei gameti e degli embrioni a livello clinico, nel centro26è stato implementato un sistema di testimonianza elettronica (EWS). Tuttavia, questo protocollo non menziona l'EWS, per garantire la riproducibilità del protocollo in qualsiasi laboratorio di fecondazione in vitro. Tuttavia, considera che tutte le fasi della procedura richiedono un secondo operatore (cioè un testimone) per garantire la tracciabilità dei gameti e degli embrioni.

4. Laboratorio di fecondazione in vitro

  1. Il giorno prima della procedura di prelievo degli ovociti
    1. Preparare le provette per la raccolta degli ovociti (fare riferimento alla Tabella dei materiali).
      1. Erogare 1 mL di terreno di fecondazione in vitro (fare riferimento alla Tabella dei materiali)in ogni tubo di raccolta degli ovociti (fondo tondo, 5 ml) e coprire con 0,2 ml di olio minerale (fare riferimento alla Tabella dei materiali)per la coltura embrionale.
        NOTA: Il numero di tubi sarà definito in base al numero di follicoli che si prevede di recuperare. Ogni tubo può contenere fino a 4 COC.
    2. Sigillare i tubi con il cappuccio (primo scatto). Etichettare i tubi con i dettagli del tipo di mezzo e della data di preparazione. Incubare i tubi durante la notte a 37 °C in atmosfera controllata (6% CO2, 5% 02).
  2. Il giorno del prelievo degli ovociti
    1. Preriscaldare le forniture di plastica a 37 °C (piatti di coltura sterili e pipette Pasteur).
    2. Chiedi alle pazienti di confermare la loro identità (nome completo e data di nascita) e l'ora di attivazione dell'ovulazione. Annotare sul foglio di laboratorio che la procedura di identificazione (ID) è stata eseguita e che il tempo di attivazione dell'ovulazione è stato confermato.
    3. Togliere i tubi di raccolta degli ovociti dall'incubatrice (subito prima dell'inizio della procedura) e spingere verso il basso il cappuccio per garantire una chiusura ermetica. Etichettare i tubi di raccolta degli ovociti con le informazioni del paziente. Posizionare le provette di raccolta degli ovociti nel riscaldatore a blocchi a 37 °C.
    4. Esaminare il fluido follicolare nei piatti di coltura sterili prebellici e identificare i COC. Una volta identificati uno o più COC, sciacquarli due volte in due gocce di mezzo per rimuovere il fluido follicolare e la contaminazione del sangue.
    5. Trasferire i COC nelle tubette di raccolta degli ovociti e annotare il numero di COC sul tubo. Allentare i tappi dei tubi medi, e incubarli prontamente a 37 °C in un'atmosfera del 6% CO2,5% O2.
    6. Ripetere i passaggi da 7 a 9 in base al numero di ovociti recuperati. Aggiornare la scheda di laboratorio.
      NOTA: Assicurarsi che un testimone controlli che tutti i blocchi riscaldanti del tubo (compresi quelli in sala operatoria) siano vuoti e segni la chiusura della procedura sul foglio di laboratorio.
    7. Pulire la fase di lavoro dopo il completamento della procedura.

5. Denudazione degli ovociti

  1. Mezzo tamponato con acido prebellico 4-(2-idrossietil)-1-piperazinetansolfonico (HEPES) e ialuronidasi (fare riferimento alla tabella dei materiali)a 37 °C almeno 1 ora prima dell'inizio.
  2. Preparare una piastra per fecondazione in vitro a 4 pozzetti (fare riferimento alla Tabella dei materiali)con 0,6 ml / pozzetti di terreno tamponato HEPES preriscaldato (integrato con il 5% di albumina sierica umana [HSA]) coperto con 0,3 ml di olio minerale per la coltura embrionale e riscaldare a 37 ° C per almeno 30 minuti.
  3. Etichettare la piastra di denudazione degli ovociti con i dettagli dell'identità del paziente.
  4. Immediatamente prima di iniziare la procedura, aggiungere la ialuronidasi al primo pozzet per ottenere una concentrazione finale di circa 20 UI/ml.
  5. Posizionare un numero limitato di COC (fino a 6) nel primo pozzo contenente l'enzima per disperdere le cellule del cumulo.
  6. Per migliorare la rimozione enzimatica delle cellule del cumulo e della corona, eseguire lo stripping delle cellule del cumulo pipettando ripetutamente gli ovociti attraverso una pipetta Pasteur con un diametro interno di circa 250 μm per un massimo di 30 s. Dopo aver osservato la dissociazione cellulare iniziale, trasferire gli ovociti al secondo pozzo contenente solo mezzo tamponato con HEPES, avendo cura di trasportare una quantità minima dell'enzima.
  7. Eseguire un'ulteriore denudazione per rimuovere le cellule corona utilizzando pipette denudanti con diametri interni decrescenti (170-145 μm). Utilizzare diametri inferiori (135μm) solo se strettamente necessario.
  8. Lavare accuratamente gli ovociti denudati per lavare via l'enzima.
  9. Dopo la denudazione, esaminare gli ovociti al microscopio invertito per valutarne l'integrità e lo stadio di maturazione. Separare gli ovociti MII da quelli immaturi (vescicola germinale e metafase-I).
  10. Spostare gli ovociti MII nell'area di vitrificazione per eseguire immediatamente la crioconservazione. Aggiornare la scheda di laboratorio.

6. Vitrificazione degli ovociti

NOTA: Eseguire la vitrificazione degli ovociti preferibilmente entro 38 ore dal prelievo degli ovociti e immediatamente dopo la denudazione. La procedura di vitrificazione qui descritta deve essere eseguita a temperatura ambiente (RT) e utilizzando una pipetta stripper con un diametro interno di 170 μm in modo da non danneggiare gli ovociti durante la manipolazione.

  1. Circa 30 minuti prima della procedura, portare la soluzione di equilibratura (ES) e la soluzione di vetrificazione (VS) a RT (25-27 °C).
  2. Etichettare correttamente i criodevici con il nome e l'ID del paziente, l'ID del trattamento, la data di congelamento, il numero di ovociti e il criobarcodice.
  3. Riempire un rack di raffreddamento monouso fino all'alto con azoto liquido fresco e avviare il processo di sterilizzazione.
  4. Etichettare la piastra di vetrificazione (fare riferimento alla Tabella dei Materiali)con il nome e l'ID del paziente. Chiedere a un testimone di verificare l'ID corretto dei criododvici.
  5. Invertire con cautela ogni flaconcino due volte per mescolarne il contenuto prima dell'uso e preparare il coperchio di una capsula di Petri da 6 mm con una goccia di 30 μL di mezzo tamponato HEPES (con il 5% di HSA) e una goccia adiacente di 30 μL di ES.
    NOTA: Posizionare le gocce appena prima dell'uso per limitare l'evaporazione media.
  6. Utilizzando una pipetta stripper da 170 μm di diametro, posizionare gli ovociti (fino a 9) nella prima goccia con il minor volume possibile di mezzo. Utilizzando la pipetta stripper, creare un ponte di mezzo tra la goccia n.1 e n.2 per ottenere un graduale aumento della concentrazione dei CPA (Figura 1A).
  7. Incubare gli ovociti nella prima goccia per 3 minuti. Aggiungere una terza goccia di 30 μL di ES (n.3). Dopo 3 min, trasferire gli ovociti nella seconda goccia di ES, e creare un ponte medio tra le gocce n.3 e n.2 (Figura 1B). Incubare gli ovociti in goccia n.3 per 3 min.
  8. Durante l'incubazione, aggiungere una goccia di ES da 30 μL per ogni criodevice che verrà utilizzata (se 9 ovociti devono essere crioconservati, posizionare 3 gocce di ES con 3 ovociti in ogni goccia di ES). Spostare gli ovociti in soluzione ES pura e lasciarli per 6-9 minuti (fino a quando non recuperano la loro dimensione iniziale dopo il restringimento) (Figura 1C).
  9. Preparare un piatto centrale (60 x 15 mm) con 1 ml di VS. Alla fine dei primi 6 minuti, trasferire gli ovociti da crioconservare nella soluzione VS, rilasciando il minor mezzo possibile. Lasciare gli ovociti in VS per 1 minuto e lavarli accuratamente spostandoli dal basso verso l'alto del piatto per rimuovere l'eccesso di ES.
  10. Circa 10 s prima della fine del minuto di incubazione, posizionare la criodevica sotto il microscopio e regolare la messa a fuoco sul segno nero (cioè la punta della criodevica). Posizionare gli ovociti sulla criodevica accanto al segno nero con la quantità minima di VS (Figura 2A).
  11. Spostare la pipetta stripper lontano dagli ovociti e rimuovere l'eccesso di mezzo VS (Figura 2B) in modo che gli ovociti rimangano coperti da un sottile strato di mezzo (Figura 2C).
  12. Immergere rapidamente la criodevica in azoto liquido, scuotendola rapidamente per rimuovere le bolle d'aria dalla sua superficie. Tenere il cappuccio protettivo della criodevica con una pinzetta e riempirlo con azoto liquido; quindi inserire la criodevica in esso mantenendo le strisce di propilene in azoto liquido.
  13. Conservare il criodevice in un visiotube precedentemente etichettato con le informazioni del paziente. Aggiornare la scheda di laboratorio.

7. Riscaldamento degli ovociti

  1. Circa 30 minuti prima della procedura, riscaldare la soluzione di scongelamento (TS), la soluzione di diluizione (DS) e la soluzione di lavaggio (WS) a RT (25-27 °C). Invertire con cautela ogni flaconcino due volte per mescolarne il contenuto. Posizionare 1 mL di TS in una capsula di Petri del pozzef bene centrale e riscaldarla a 37 °C per almeno 1 ora prima di iniziare la procedura.
  2. Etichettare tutti i materiali di plastica con il nome e l'ID del paziente e il tipo di soluzione. Chiedere a un testimone di confermare le informazioni del paziente sulla criodevica.
  3. Per ogni criodevice da riscaldare, preparare una piastra a 6 pozzetti con 200 μL di DS nel primo pozzo e una quantità uguale di WS nel secondo e nel terzo (denominati WS1 e WS2, rispettivamente). Aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o acqua sterile nell'area esterna ai pozzi per evitare l'evaporazione.
  4. Prendi la parabola TS dall'incubatrice e mettila sotto il microscopio. Regolare la messa a fuoco del microscopio al centro della capsula di Petri.
  5. Ruotare e rimuovere con attenzione il cappuccio protettivo della criodevica, mantenendo le strisce di propilene in azoto liquido. Trasferire il criodevice dall'azoto liquido nel TS il più rapidamente possibile per evitare il rischio di devitrificazione e iniziare il conto alla rovescia (1 min).
  6. Localizzare gli ovociti concentrandosi sulla punta della criodevica (cioè il segno nero). Usando una pipetta stripper, rilascia gli ovociti dalla criodevica.
    NOTA: Cercare di non aspirare gli ovociti dalla criodevica; rilasciare delicatamente alcuni media su di loro fino a quando non si spostano nel TS.
  7. Utilizzando una pipetta stripper da 170 μm di diametro, trasferire gli ovociti in DS con una piccola quantità di TS (per creare un gradiente) e lasciarli nel DS per 3 minuti. Spostare gli ovociti su WS1 allo stesso modo e lasciarli per 5 minuti. Infine, trasferire gli ovociti a WS2 per 1 min.
  8. Trasferire gli ovociti in un terreno di coltura IVF preequilibrato appropriato e incubarli per 1 ora prima di procedere con l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI). Aggiornare la scheda di laboratorio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Panoramica del programma di conservazione della fertilità al centro

In un periodo di 12 anni (2008-2020), 285 donne sono state sottoposte ad almeno un prelievo di ovociti che ha comportato la vitrificazione dell'intera coorte di ovuli maturi raccolti. La maggior parte di queste donne (n = 250) ha subito un singolo recupero e 35 hanno subito più recuperi. Le ragioni per sottoporsi al prelievo di ovociti per la vitrificazione degli ovuli sono riassunte in 4 categorie: medico (ad eccezione del cancro), cancro, non medico e altri. Tra le 250 donne sottoposte a un singolo prelievo di ovociti per la vitrificazione dell'uovo, l'8% aveva ragioni mediche diverse dal cancro (10 endometriosi, 3 miomi, 4 cisti ovariche, 1 idrosalpinx), il 16% aveva il cancro (31 cancro al seno, 3 carcinoma ovarico, 2 cancro del colon-retto, 2 linfoma di Hodgkin, 1 cancro vulvare e 1 cancro cervicale), il 53% aveva ragioni non mediche e il 23% aveva altri motivi (43 assenza di spermatozoi recuperati, 10 rischio di OHSS, 4 infezioni e 1 febbre). Questa distribuzione era diversa tra le pazienti sottoposte a recupero di più ovociti per la vitrificazione dell'uovo. In particolare, il 9% aveva ragioni mediche diverse dal cancro (1 endometriosi, 2 riserve ovariche ridotte), il 6% aveva il cancro (2 tumori al seno), l'80% aveva ragioni non mediche e il 3% aveva altri motivi (1 assenza di sperma recuperato). Nessuna delle pazienti sottoposte a più prelievi di ovociti per la vitrificazione degli ovuli ha riscaldato quelle uova, mentre 78 delle 250 donne sottoposte a un singolo ciclo di vitrificazione dell'uovo sono tornate a utilizzare quegli ovociti (Figura 3).

La Tabella 1 riassume i dati delle 250 donne sottoposte ad un singolo ciclo di vitrificazione ovocitaria raggruppate in base alle relative motivazioni. Le pazienti con un motivo medico per la vitrificazione dell'uovo e le pazienti sottoposte a conservazione della fertilità a causa del cancro erano più giovani (età materna media < 35 anni) e mostravano una migliore riserva ovarica (AFC più elevata) rispetto alle pazienti con motivi non medici o di altro tipo. Tuttavia, i tassi medi di maturazione (numero di ovociti MII/numero di COC recuperati) erano leggermente inferiori (72-73% contro 77-79%), così che il numero di ovociti vitrificati in media era simile nei 4 gruppi (9-10 ovociti). È importante sottolineare che 9 pazienti oncologiche su 40 (22,5%) sono state sottoposte a un protocollo di stimolazione ovarica ad avvio casuale perché avevano un tempo limitato prima di iniziare la chemioterapia o la radioterapia. È interessante notare che circa la metà dei pazienti con motivi medici diversi dal cancro (53%) e la maggior parte dei pazienti con altri motivi per la vitrificazione dell'uovo (76%) sono effettivamente tornati per il riscaldamento. Al contrario, pochissimi pazienti sottoposti a conservazione della fertilità per cancro (17,5%) o motivi non medici (13%) hanno utilizzato i loro ovociti vitrificati per la fecondazione in vitro. Notevole anche il tempo trascorso tra la vitrificazione e il riscaldamento tra i pazienti che sono tornati: in media, 283 giorni in pazienti con motivi medici diversi dal cancro, 132 giorni in pazienti con altri motivi, 1264 giorni in pazienti oncologici e 1547 giorni in pazienti con motivi non medici. Indipendentemente da tutte queste differenze rilevanti, il tasso di sopravvivenza è stato simile (83-88%; in media, 8-11 ovociti sono stati riscaldati e 7-9 ovociti sono sopravvissuti) tra i pazienti nei 4 gruppi, confermando così l'efficacia e la sicurezza dei protocolli di vitrificazione e riscaldamento degli ovociti. Inoltre, il tasso di sopravvivenza è indipendente dalla vetrificazione e dall'esperienza dell'operatore di riscaldamento (Figura 4A,B). La Tabella 1 mostra i tassi di fecondazione nei 4 gruppi, che sono ~ 70%, ad eccezione dei pazienti con motivi non medici per la vitrificazione degli ovociti (~ 80%). Tuttavia, questi dati non sono comparabili a causa di una piccola dimensione del campione e della distorsione del fattore spermatozoo sull'esito della fecondazione27.

Figure 1
Figura 1: Configurazione delle goccioline medie per la crioconservazione degli ovociti. Per eseguire gradualmente l'equilibrio, gli ovociti vengono prima posti in una goccia(A)di BS e mescolati con (B) una goccia di ES. Dopo 3 minuti di incubazione,(C)vienemiscelata una terza goccia di soluzione di ES e gli ovociti vengono incubati per 6-9 minuti. Abbreviazioni: HEPES = acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico; BS = mezzo tamponato HEPES; ES = soluzione di equilibrio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Carico di ovociti sul dispositivo di crioconservazione. Gli ovociti sono posti sulla criodevica in (A) una singola piccola goccia di VS. (B) La pipetta stripper viene spostata lontano dagli ovocitie (C) l'eccesso di VS viene rias aspirato per lasciare solo uno strato sottile attorno a ciascun ovocita. Abbreviazione: VS = soluzione di vetrificazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Cicli di vitrificazione degli ovociti eseguiti presso il centro GENERA di medicina riproduttiva di Roma (anni 2008-2020). Nel corso del periodo di 12 anni, 250 pazienti sono stati sottoposti a un singolo prelievo di ovociti per la vitrificazione degli ovociti, mentre 35 sono stati sottoposti a cicli di recupero di più ovociti. Le ragioni intrinseche per la vitrificazione degli ovociti sono mostrate nella figura. Le pazienti che ritornano per il riscaldamento (n = 78) appartengono solo al gruppo di donne che hanno subito un singolo ciclo di vitrificazione degli ovociti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Tasso medio di sopravvivenza per coorte di ovociti riscaldati. (A) Vitrificazione e (B) esperienza degli operatori di riscaldamento. Ogni paziente è incluso solo per il primo ciclo di riscaldamento. Differenze statisticamente significative sono state valutate utilizzando Mann-Whitney U-test. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Morfologia degli ovociti all'inizio e alla fine della procedura di equilibratura. Per determinare l'esito della procedura di equilibratura, può essere utile annotare la morfologia degli ovociti (A) prima di iniziare la procedura. (B) Si osserva un forte restringimento dell'ovocita dopo la prima esposizione alla soluzione crioprotettiva. La procedura di equilibratura può essere considerata completa quando (C) l'ovocita ha recuperato il suo volume iniziale. Barre della scala = 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Motivo della vitrificazione degli ovociti Medico diverso dal cancro (n=19) Cancro (n=40) Non medico (n=133) Altro (n=58)
Età materna al prelievo degli ovociti, mean±SD 33.6±6.4 anni 34.6±5.9 anni 37.0±3.4 anni 38.2±4.3 anni
FSH basale, media±SD 7,5±4,2 UI/L 7,6±1,7 UI/L 7,8±4,1 UI/L 8,8±5,2 UI/L
AMH, media±SD 1,8±1,7 ng/ml 1,9±0,2 ng/mL 2,2±2,4 ng/mL 3,0±2,5 ng/mL
AFC, media±SD 12,7±5,0 13,3±7,0 11.6±6.1 10.7±6.7
BMI, media±SD 20.1±1.5 21.8±1.6 20.2±3.1 22.9±3.6
Durata della stimolazione, media±SD 10.0±1.5 9.6±1.7 9.9±2.1 10.3±2.1
9/40, 22.5%
Avvio casuale
COC, totale, media±SD 239 551 1493 592
12.6±5.3 13.8±9.1 11.2±7.1 10.2±8.5
Ovociti MII totali, media±SD 167 400 1161 462
8.8±3.3 10.0±7.2 8.7±5.7 8.0±6.7
Tasso di maturazione, media±SD 72,4±13,6% 72,1±19,6% 79,5±17,5% 77,4±22,2%
Pazienti che ritornano per riscaldamento, percentuale totale di pazienti sottoposti a vitrificazione 10/19, 52.6% 7/40, 17.5% 17/133, 12.8% 44/58, 75.9%
Giorni tra la vetrificazione e il primo riscaldamento, media±SD 283±225 1264±764 1547±709 132±203
Ovociti MII riscaldati, media totale±SD 82 66 191 409
8.2±2.8 9.4±4.8 11.2±5.8 9.3±7.2
Ovociti MII sopravvissuti, media totale±SD 73 55 160 345
7.3±3.3 7.9±4.0 9.4±4.8 7.8±6.9
Tasso di sopravvivenza, media±SD 87,6±18,1% 83,2±1,7% 85,4%±14,5% 84,7±21,9%
Fattore spermatico
N, n, % 5/10, 50% 4/7, 57% 13/17, 76% 13/44, 29%
FCM, n, % 3/10, 30% 3/7, 43% 3/17, 18% 17/44, 39%
Avena, n, % 2/10, 20% - 1/17, 6% 11/44, 25%
NOA, n, % - - - 3/44, 7%
Tasso di fecondazione, media±SD 70,0±14,4% 70,0±17,0% 78,5±20,6% 71,0±24,3%

Tabella 1: Pazienti sottoposti a un singolo ciclo di vitrificazione degli ovociti. Abbreviazioni: FSH = ormone follicolo-stimolante; AMH = ormone anti-mülleriano; BMI = indice di massa corporea; COC = complessi di ovociti cumuliformi; MII = metafase-II; N = normozoospermico; MMF = fattore maschile moderato (1-2 difetti dello sperma); OAT = oligoastenoteratozoospermico; NOA = azoospermia non ostruttiva (gli spermatozoi sono stati raccolti attraverso l'estrazione di spermatozoi testicolari).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Considerazioni cliniche

Sebbene siano state esplorate strategie emergenti, come la crioconservazione del tessuto ovarico e la maturazione in vitro, la vitrificazione degli ovociti dopo COS è la tecnica gold standard per la conservazione della fertilità. In questo scenario, il numero di ovociti recuperati e crioconservati dovrebbe essere massimizzato nel più breve tempo possibile poiché la maggior parte dei pazienti oncologici potrebbe beneficiare esclusivamente di un ciclo ovarico prima di dover iniziare il trattamento del cancro. Pertanto, un adeguato protocollo di stimolazione ovarica è fondamentale per sfruttare appieno la riserva ovarica e aumentare la possibilità cumulativa di un futuro parto vivo28, un risultato fortemente dipendente dall'età materna al prelievo degli ovociti. A questo proposito, non è stata ancora proposta un'età ideale per la vitrificazione degli ovociti a scopo di conservazione della fertilità29e un consenso è richiesto tra 35 anni18 o 37 anni30,31. Tuttavia, la conservazione della fertilità dovrebbe essere accessibile a tutti i pazienti, comprese le donne di età superiore ai 37 anni, a condizione che ricevano una consulenza adeguata sui tassi di successo in base alla loro età.

Il protocollo e la dose iniziale dei farmaci devono essere delineati secondo il giudizio del ginecologo e, soprattutto, in base al tempo disponibile32,33. L'avvio della stimolazione convenzionale nella fase follicolare precoce è raccomandato quando il tempo non è un problema. Tuttavia, se necessario, l'approccio di avvio casuale è fattibile per ridurre al minimo i ritardi nell'inizio di trattamenti medici / oncologici urgenti34,35. Lo sviluppo follicolare è stato segnalato come un processo estremamente dinamico in quanto sono state descritte più ondate di reclutamento follicolare durante un singolo ciclo ovarico. Sebbene i meccanismi biologici alla base di questo fenomeno debbano ancora essere svelati, gli ovociti competenti possono essere recuperati e crioconservati indipendentemente dalla fase del ciclo mestruale in cui viene avviata la COS36.

In questo centro, la stimolazione ovarica viene in genere eseguita utilizzando il protocollo antagonista del GnRH e 150-300 UI / die di FSH ricombinante o gonadotropina umana della menopausa. In specifiche popolazioni di pazienti di età superiore ai 35 anni, con deficit di LH, o che mostrano una risposta non ottimale dopo COS standard, LH potrebbe essere aggiunto durante il COS per aumentare il reclutamento e la crescita dei follicoli attraverso un'azione sinergica con fattore di crescita insulino-simile 116,37,38. Inoltre, il protocollo antagonista del GnRH seguito da un trigger agonista del GnRH è stato segnalato come un protocollo di stimolazione breve, sicuro e altamente conveniente per massimizzare la risposta ovarica e ridurre al minimo il rischio di OHSS39. Nei pazienti con malattie sensibili agli estrogeni come il cancro al seno, le gonadotropine associate agli inibitori dell'aromatasi, come il letrozolo, vengono somministrate20.

In effetti, una recente revisione ha dimostrato che il letrozolo comporta una risposta ovarica simile a quella della stimolazione convenzionale senza complicazioni in termini di difetti congeniti, recidiva di malignità e aumento della mortalità40. Allo stesso modo, il tamoxifene potrebbe essere usato durante il COS in caso di tumori sensibili agli estrogeni, che, come il letrozolo, non hanno mostrato alcun impatto sulla competenza degli ovociti41,42. Tuttavia, questo deve essere confermato in studi più ampi. In questo centro, il letrozolo viene somministrato dal giorno 1 della stimolazione fino al giorno 7 dopo il recupero degli ovociti in caso di tumori sensibili all'estradiolo. Il rischio di OHSS, che è la complicanza più importante della COS che ritarderebbe ulteriormente i trattamenti antitumorali, dovrebbe essere considerato, in particolare nei pazienti giovani con AFC elevati. In questi casi, l'attivazione dell'ovulazione con un agonista del GnRH invece della gonadotropina corionica umana (hCG) ha dimostrato di essere utile. Altri problemi che devono essere prevenuti sono (i) trombo-embolia, che richiede la somministrazione di eparina a basso peso molecolare durante la COS, e (ii) una ridotta risposta ovarica dopo COS43. Per compensare quest'ultimo, potrebbero essere eseguite due stimolazioni consecutive in un singolo ciclo ovarico. Questo nuovo protocollo COS non convenzionale, noto come DuoStim, comporta stimolazioni follicolari e di fase luteale e due recuperi di ovociti in un breve lasso di tempo (~ 15 giorni) e dovrebbe essere studiato per scopi di conservazione della fertilità in futuro44,45,46.

Altre possibili strategie per la conservazione della fertilità nelle donne sono: (i) crioconservazione del tessuto ovarico, che è l'unica opzione disponibile per le femmine prepuberali. Questa possibilità è promettente per ripristinare l'attività riproduttiva ed endocrina ed evitare ritardi nell'inizio del trattamento del cancro in quanto non è necessaria alcuna stimolazione ormonale. Tuttavia, è ancora sperimentale e richiede un intervento chirurgico laparoscopico con successivo trapianto, e c'è il rischio di ritrasmissione del cancro ortotopico. (ii) Crioconservazione degli embrioni, che comporta un tasso di sopravvivenza più elevato dopo il riscaldamento, ma ritarda il trattamento del cancro e richiede il coinvolgimento di un partner maschile o di un donatore, limitando così anche la futura autonomia riproduttiva di una donna47. Inoltre, potrebbe essere soggetto a limitazioni legali in alcuni paesi. Considerando queste limitazioni, la vitrificazione degli ovociti è considerata l'approccio più consolidato ed eticamente accettabile. Idealmente, tutti i principali ospedali, dove vengono trattate le donne affette da cancro nella loro età riproduttiva, dovrebbero fornire programmi per la conservazione della fertilità e l'intero processo dovrebbe essere gratuito per questi pazienti per garantire parità di accesso a questo programma. Tuttavia, la crioconservazione degli ovociti deve essere eseguita esclusivamente in centri con esperienza sufficiente a non influenzare la competenza degli ovociti nel processo48.

Passaggi critici nel protocollo di vetrificazione e nella risoluzione dei problemi

La vitrificazione è una pseudo transizione di fase di secondo ordine (IUPAC Compendium of Chemical Terminology) che induce una solidificazione simile al vetro all'interno delle cellule impedendo la nucleazione e la crescita dei cristalli di ghiaccio, il principale fattore causale della lesione cellulare. Per ottenere una corretta vetrificazione, è necessaria una combinazione di almeno due CPA (tipicamente glicole etilenico e DMSO come agenti permeanti e saccarosio come agente non permeabile) insieme a una velocità di raffreddamento estremamente elevata (>20.000 °C / min) ottenuta riducendo al minimo i volumi di carico o mediante esposizione diretta dei campioni all'azoto liquido (dispositivi aperti). Poiché gli ovociti sono le cellule più grandi del corpo, contengono la più grande quantità di acqua. Pertanto, sono più sensibili alle lesioni da congelamento rispetto agli embrioni. Durante la crioconservazione degli ovociti, possono verificarsi danni agli organelli intracellulari (ad esempio, il citoscheletro o il fuso meiotico), alterazione della permeabilità della membrana, indurimento della zona pellucida, attivazione degli ovociti, alterazione delle vie biochimiche e possibilmente morte cellulare49. Per questo motivo, è necessario garantire un delicato equilibrio tra molteplici fattori per preservare con successo la vitalità degli ovociti e la competenza dello sviluppo. Per raggiungere la coerenza del tasso di sopravvivenza dopo la vetrificazione e raggiungere i livelli di riferimento, tutte le fasi cruciali della procedura devono essere rigorosamente controllate.

CPA, osmolalità cellulare e velocità di raffreddamento

Per aumentare la probabilità di vetrificazione, la viscosità del mezzo (e quindi la concentrazione di CPA) deve essere massimizzata. Tuttavia, la tossicità dei CPA deve essere sempre tenuta sotto controllo50. A tal fine, è fondamentale ridurre al minimo sia il tempo di esposizione della cella ai CPA che i volumi di carico, e lavorare sempre a temperatura ambiente (25-27 °C)51. Altri protocolli prevedono diverse combinazioni di CPA e criododvice e vengono eseguiti a 37 °C; tuttavia, non sono stati descritti qui. Pertanto, le note, i risultati rappresentativi e le sezioni di discussione di questo manoscritto si applicano solo al protocollo di vitrificazione dettagliato qui.

Durante la crioconservazione, gli ovociti sono esposti a soluzioni CPA di maggiore concentrazione di osmoliti per promuovere la disidratazione cellulare e il restringimento citoplasmatico. Durante il riscaldamento, sono esposti a soluzioni con ridotta concentrazione di osmoliti per ripristinare il volume citoplasmatico. Durante la vitrificazione, gli ovociti sono disidratati e fluttuazioni involontarie del volume cellulare possono causare gravi shock osmotici, compromettendo così la sopravvivenza e il potenziale di sviluppo dopo il riscaldamento52. Trovare la velocità di raffreddamento ottimale è un aspetto chiave per preservare la vitalità cellulare in quanto influisce sull'osmolalità53 e sul potenziale di sviluppo cellulare54. Ad esempio, quando una cellula è esposta a velocità di raffreddamento più lente delle velocità ottimali, può essere ampiamente esposta a condizioni ipertoniche che portano alla morte cellulare.

Per ottenere la velocità di raffreddamento ottimale, i volumi di carico devono essere ridotti al minimo, RT deve essere controllato in modo da non influire sulla velocità del processo di equilibratura e i campioni devono essere esposti direttamente all'azoto liquido. Un modo per valutare quando è stato raggiunto l'equilibrio è quello di annotare la morfologia dell'ovocita (in particolare, la larghezza dello spazio perivitelline e lo spessore della zona pellucida) prima dell'inizio della procedura (Figura 5A). Dopo una fase iniziale di riduzione del volume cellulare (Figura 5B), l'ovocita dovrebbe recuperare il suo volume iniziale (Figura 5C). Sebbene il pH corretto venga mantenuto durante la manipolazione degli ovociti in atmosfera atmosferica a causa degli zwitterioni che tamponano le soluzioni di vitrificazione-riscaldamento, l'osmolalità media dipende invece in particolare dalla temperatura53. Pertanto, il metodo di preparazione del piatto è fondamentale per ridurre qualsiasi possibile effetto dannoso55.

La sovrapposizione di olio è sicuramente fondamentale per prevenire l'evaporazione ed evitare qualsiasi aumento dell'osmolalità nei mezzi IVF56. Tuttavia, non può essere utilizzato durante l'esecuzione delle procedure di vetrificazione e riscaldamento. Pertanto, alcuni suggerimenti sono importanti per gli operatori: (i) preparare le goccioline il più rapidamente possibile e immediatamente prima dell'uso; (ii) considerare volumi maggiori di goccioline per ridurre al minimo gli spostamenti di osmolarità (<30 μL non è raccomandato); iii) quando le condizioni ambientali non possono essere standardizzate, è possibile utilizzare una piastra a 6 pozzetti e aggiungere acqua sterile o PBS al serbatoio adiacente per limitare l'evaporazione; iv) prestare attenzione alla data della prima apertura del flaconcino del mezzo poiché l'osmolalità può cambiare se il flacone viene aperto ripetutamente.

Riscaldamento degli ovociti e devitrificazione degli ovociti

Il passo più cruciale che può influenzare la consistenza nel tasso di sopravvivenza è sicuramente il processo di riscaldamento57. Durante questa fase, i CPA vengono gradualmente rimossi dall'ovocita e diluiti per prevenire qualsiasi potenziale effetto citotossico. La devitrificazione, vale a dire la formazione di nuclei di ghiaccio o cristalli di ghiaccio durante il riscaldamento di una soluzione vetrificata o accidentalmente durante l'audit, il trasporto o lo stoccaggio in vapore, è uno dei principali rischi della vetrificazione58,59,60. Pertanto, per prevenire la devitrificazione e le lesioni durante il riscaldamento, la differenza di temperatura tra la prima e l'ultima fase del processo deve essere massimizzata. Come dimostrato da Seki e Mazur57 negli ovociti murini soggetti a vitrificazione e riscaldamento a velocità diverse, più veloce è il riscaldamento, maggiore è la sopravvivenza. Il volume e la temperatura del TS sono i principali fattori da controllare: TS deve essere adeguatamente riscaldato a 37 °C (almeno 1 ora prima della procedura) e il rack di azoto liquido deve essere riempito fino al bordo della sua capacità e posizionato il più vicino possibile allo stereomicroscopio. L'operatore deve essere il più veloce possibile durante il trasferimento del vettore di crioconservazione dall'azoto liquido al TS. A causa dell'elevata efficienza della vitrificazione, è possibile utilizzare un protocollo di riscaldamento universale indipendentemente dal protocollo di congelamento coinvolto, rendendo più facile la gestione di tutti i cicli di riscaldamento anche quando gli ovociti vengono importati da un diverso centro di fecondazione in vitro61.

Dispositivi aperti e rischio di contaminazione

L'impiego di sistemi aperti e l'esposizione diretta dei campioni all'azoto liquido sono necessari per ottenere i tassi di raffreddamento e riscaldamento estremamente elevati che supportano l'efficacia di questo protocollo. Sebbene la vetrificazione sia una procedura che presenta un basso rischio di contaminazione incrociata, perché coinvolge volumi molto piccoli e viene effettuata dopo diversi lavaggi di campioni che diluiscono qualsiasi carica virale putativa, è essenziale adottare tutte le misure precauzionali per aumentarne la sicurezza. Sulla base delle evidenze attuali, i sistemi chiusi non offrono un'alternativa competitiva ai sistemi aperti almeno per la vitrificazione degli ovociti62,63. Per mantenere l'efficacia dei sistemi di vetrificazione aperti riducendo al minimo i rischi associati al contatto diretto con l'azoto liquido, quest'ultimo potrebbe essere sterilizzato mediante irradiazione ultravioletta64,65. In alternativa, potrebbero essere utilizzati serbatoi di stoccaggio del vapore, che sono noti per rappresentare un rischio inferiore di contaminazione rispetto a quelli convenzionali, ma hanno dimostrato di essere efficaci nel preservare la vitalità degli ovociti66,67.

Importanza del monitoraggio costante degli indicatori chiave di prestazione per i programmi di vitrificazione degli ovociti

In un laboratorio di fecondazione in vitro, il monitoraggio degli indicatori chiave di prestazione (KPI) è essenziale per monitorare e migliorare costantemente i risultati68. In generale, quando si definiscono i KPI per il monitoraggio di processi e procedure, è necessario considerare tre aree principali: struttura, processo e risultato. I KPI strutturali misurano la qualità del laboratorio di fecondazione in vitro delineando le caratteristiche delle risorse fisiche e umane. Un esempio di KPI strutturale relativo alla struttura in un programma di crioconservazione potrebbe essere il numero di criotank rispetto al numero totale di procedure ART che richiedono la crioconservazione condotte in un determinato periodo di tempo o il numero di crio-serbatoi rispetto ai metri quadrati totali della criocamera. Tuttavia, le risorse umane e, in particolare, le competenze dell'operatore sono della massima importanza quando si tratta di una procedura delicata come la vetrificazione. Infatti, sebbene estremamente efficace, la tecnica di vetrificazione è una procedura impegnativa che coinvolge diverse fasi procedurali con tempistiche stringenti che devono essere rigorosamente controllate: una piccolissima quantità di un mezzo significativamente viscoso dovrebbe essere gestita in un periodo molto breve.

Nessuna macchina di congelamento con impostazione specifica dei parametri di raffreddamento è coinvolta nella procedura; pertanto, la standardizzazione dei dettagli del protocollo e la formazione sono essenziali. Il processo manuale ha severi requisiti di abilità che devono essere soddisfatti per ottenere tassi di sopravvivenza cellulare coerenti e altamente riproducibili. A ciascun operatore alle prime armi dovrebbe essere fornita una formazione specifica per renderli abili nel controllo di tutti i punti critici della procedura, in particolare il tempo di esposizione dei campioni ai CPA e la manipolazione delle cellule in un mezzo altamente viscoso. Tuttavia, secondo Dessolle e coautori,69 la curva di apprendimento per la procedura di vitrificazione non dovrebbe essere così lunga anche per gli embriologi junior poiché il raggiungimento della competenza è principalmente limitato da sfide di manipolazione. Una volta raggiunta l'esperienza nella vitrificazione, le prestazioni di ogni singolo operatore devono essere verificate in modo accurato e regolare attraverso l'uso di KPI per valutare regolarmente il mantenimento dei valori di competenza stabiliti dai documenti di consenso70. Inoltre, la fiducia/competenza dell'operatore deve essere comparabile in modo da non influire sui risultati.

I KPI di processo misurano il funzionamento del laboratorio di fecondazione in vitro. I protocolli e le procedure di vitrificazione e riscaldamento dovrebbero essere condotti in modo tempestivo e le fluttuazioni delle condizioni di coltura dovrebbero essere ridotte al minimo prestando particolare attenzione al mantenimento di un'osmolarità e una temperatura adeguate per preservare non solo la competenza dello sviluppo degli ovociti, ma anche la sicurezza dell'operatore durante la manipolazione dell'azoto liquido. Esempi di KPI di processo sono la percentuale di infortuni del personale di laboratorio durante la manipolazione di azoto liquido per numero di procedure di fecondazione in vitro all'anno, la percentuale di gameti / embrioni persi / danneggiati durante le procedure di vitrificazione / riscaldamento e audit per numero di procedure all'anno.

Infine, i KPI di esito misurano l'efficacia del laboratorio di fecondazione in vitro e generalmente si riferiscono alla sopravvivenza degli ovociti post-guerra definita come la proporzione di ovociti morfologicamente intatti al momento dell'ICSI (in caso di vitrificazione degli ovociti, il valore di competenza deve essere >50% e il valore di riferimento è del 75%)70. Inoltre, i tassi di fecondazione (<10% inferiori rispetto agli ovociti freschi inseminati al centro da una popolazione di pazienti comparabile), lo sviluppo embrionale (lo stesso di una popolazione di pazienti comparabile che utilizza ovociti freschi) e l'impianto (<10-30% inferiore a una popolazione comparabile di embrioni freschi al centro) sono applicabili come kpI di esito per gli ovociti vitrificati70. Tuttavia, gli esiti clinici sono più soggetti a caratteristiche specifiche di coppia che a procedure clinicheerrate 71,72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Nessuno

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
  2. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  3. Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
  4. Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
  5. Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
  6. Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
  7. Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
  8. Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
  9. Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
  10. Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1 (2016).
  11. Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
  12. Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
  13. Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, Suppl 6 160-170 (2013).
  14. Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
  15. Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
  16. Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94 (2019).
  17. Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327 (2018).
  18. Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
  19. Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
  20. Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049 (2019).
  21. Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
  22. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
  23. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  24. Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
  25. ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025 (2019).
  26. Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
  27. Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
  28. Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
  29. Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
  30. Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
  31. Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
  32. Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
  33. Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
  34. Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
  35. Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
  36. Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
  37. Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
  38. Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
  39. Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
  40. Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
  41. Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
  42. Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
  43. Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
  44. Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
  45. Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317 (2018).
  46. Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
  47. Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
  48. Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
  49. Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
  50. Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
  51. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reproductive Biomedicine Online. 9 (6), 680-691 (2004).
  52. Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268 (2014).
  53. Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
  54. Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
  55. Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
  56. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  57. Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
  58. Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
  59. Jin, B., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biololgy of Reproduction. 82 (2), 444-450 (2010).
  60. Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
  61. Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
  62. Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
  63. Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123 (2018).
  64. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  65. Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
  66. Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
  67. Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
  68. Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
  69. Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
  70. Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
  71. Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
  72. Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).

Tags

Biologia Numero 175 Preservazione della fertilità stimolazione ovarica ovocita metafase II vitrificazione riscaldamento Indicatori chiave di prestazione (KPI)
Conservazione della fertilità attraverso la vitrificazione degli ovociti: prospettive cliniche e di laboratorio
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggiulli, R., Vaiarelli, A.,… More

Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter