Summary
卵母细胞冷冻保存被一些国际科学协会确认为后普生妇女生育保护的黄金标准。适当的临床和实验室策略可确保生育保护治疗的最大疗效、效率和安全性。
Abstract
在照顾患者未来生活质量的多功能医疗保健系统中，保持女性生育能力至关重要。卵母细胞冷冻保存被一些国际科学协会确认为后普生妇女生育保护的黄金标准，用于医疗和非医学适应症。主要医学适应症是结节性疾病、严重子宫内膜异位症等妇科疾病、影响卵巢储备的全身性疾病以及涉及早年更年期的遗传疾病。本文通过概述客观和循证咨询的建议，描述了生育保护治疗的整个临床和实验室工作。此外，它侧重于程序的有效性，并描述了充分利用卵巢储备和在尽可能短的时间内检索卵母细胞数量的最适当策略。卵巢储备的评估、理想刺激协议的定义以及卵母细胞检索、鉴定和病毒化程序以及最大限度地提高卵巢的疗效、效率和安全性的方法都得到了详细阐述。
Introduction
开发和实施有效的人类卵母细胞冷冻保存方案是生殖医学的重大突破。根据最近的证据，病毒化是冷冻保存元相II（MII）卵母细胞的最有效策略，因为它导致统计学上更高的存活率相比，缓慢冻结，独立于患者群体（不孕不育患者或卵母细胞捐赠计划）1，2，3。卵母细胞化的显著成就导致美国生殖医学学会（ASRM）和辅助生殖技术协会（SART）的实践委员会宣布这项技术对于选择性生育保护在后普生妇女中最为有效，无论是医疗还是非医学适应症4，5，6。维持生育力的医学适应症包括（一） 癌症和自身免疫性疾病，需要治疗7，如放疗、细胞毒性化疗和内分泌治疗（其对卵巢储备的有害影响与产妇年龄以及治疗的类型和剂量有关）：（二） 需要重复或彻底手术的卵巢疾病（如子宫内膜异位症）8：和 （iii） 遗传条件（如 X 脆弱）或卵巢过早衰竭。此外，对于所有因非医疗原因（也称为社会冻结）而未能完成父母目标的妇女来说，生育保护已成为一个有价值的选择。
无论生育保护的迹象如何，根据关于生育保护的主要国际准则，所有愿意使卵母细胞变质的患者都应接受适当的咨询，了解其成功的实际机会、费用、风险和程序9、10、11、12、13的局限性。最重要的是，应该清楚的是，对一组MII卵母细胞进行视网化并不能确保怀孕，但如果有必要的话，它为未来的体外受精（IVF）治疗提供了更高的成功机会。在这方面，女性在卵母细胞化时的年龄无疑是最重要的限制因素15作为晚期产妇年龄（AMA：>35岁）是女性不育的主要原因16。除了卵巢储备的逐步减少外，AMA还与卵母细胞能力受损有关，原因是有缺陷的生理途径，如新陈代谢、表观遗传调节、细胞周期检查点和美血隔离17。因此，卵子的合理数量主要取决于产妇的年龄。在36岁以下的女性中，至少需要8-10个MII卵母细胞18个，以最大限度地提高成功的机会。一般来说，卵母细胞的数量越多，成功的可能性就越大。因此，根据卵巢储备标记（如抗梅勒激素 （AMH） 水平或蚂蚁卵泡计数 （AFC） 定制卵巢刺激对于在尽可能短的时间内充分利用卵巢储备至关重要。
在整个程序的安全性是另一个关键问题，当注册患者为生育保护。临床医生应采用最佳策略，通过使用安全的方法，如腺激素释放激素 （GnRH） 拮抗协议，然后使用 GnRH 激动剂触发19和 （ii） 远程， 来最大限度地降低风险并预防 （i） 卵巢过度刺激综合征 （OHSS）。 然而，在卵母细胞检索过程中，腹膜出血、骨盆结构（尿管、肠道、附录、神经）受伤或骨盆感染的风险是可能的。最后，（三） 刺激的传统方案与超生理血清雌二醇有关，因此，在雌激素敏感疾病（如乳腺癌）中不建议使用。涉及芳香酶抑制剂（如莱罗佐尔或塔莫西芬）的协议更适合在这些情况下20，21。在实验室环境中，最广泛的卵母细胞化方案仍然是Kuwayama和同事2，23首先描述的，其中包括一个循序渐进的程序，涉及逐步添加低温保护剂（CMA）。在第一阶段（均衡/脱水），卵母细胞暴露在包含 7.5% v/v 乙二醇和 7.5% v/v 二甲基硫化物 （DMSO） 的 CPA 溶液中，而在第二阶段， 卵母细胞被转移到一个葡萄化解决方案与15%v/v乙二醇和15%v/v DMSO，加上0.5摩尔/L蔗糖。在病毒化介质中短暂孵化后，卵母细胞可以放置在专门设计的开放式低温中，最后在 -196 °C 下沉入液氮中储存，直至使用。
在这里，（一） 概述了客观和循证咨询的建议，（二） 侧重于手术的成本效益，（三） 描述了充分利用卵巢储备和在最短时间内检索卵母细胞数量的最适当策略。卵巢储备的评估、理想刺激协议的定义以及卵母细胞检索、鉴定和病毒化程序将与最大限度地提高卵巢疗效、效率和安全性的方法一起进行详细评估。由于文献中存在本协议的其他协议或改编，因此本手稿的代表性结果和讨论部分仅适用于此程序。
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Protocol
1. 工作和临床咨询
注：如因不合逻辑原因需要保育的病人，确保没有预约会诊的等候名单，并尽快提供预约。
- 检查病史和以前的文件，并评估患者的一般健康状况。
- 在关系数据库中记录所有信息（包括肿瘤学家批准在癌症患者的情况下接受卵巢刺激）。
- 为患者提供有关手术可行性的具体咨询。解释手术的步骤（卵巢刺激、卵母细胞检索、卵母细胞病毒化），并告知她成功的实际机会（主要取决于母体年龄和卵母细胞检索时预计的MII卵母细胞数量），以及手术的成本和限制。
- 进行阴道超声波检查，以获取有关卵巢储备的信息（即AFC），并评估卵巢收集卵子的可及性。
- 要求血液测试，以评估血型和恒河因子，凝血筛查（血液计数，前列腺素，血栓形成素，纤维蛋白原，蛋白质C，蛋白质S，抗血栓III，同型半胱氨酸），和传染病（乙型肝炎，丙型肝炎，艾滋病毒，静脉疾病研究实验室/特雷波内马苍白血栓分析）。
注：如果患者因非紧急医疗原因获得生育保护计划，更全面的评估可能包括基底卵泡刺激激素（FSH）、叶黄素化激素（LH）、雌二醇、AMH、乳房检查、帕帕尼科拉乌测试、凝血基因筛查（莱顿和前列腺素的因素V）和火炬筛查（弓形虫病、风疹、巨细胞病毒）。 - 请求心分评估（心电图）。
- 推荐心理咨询。
2. 控制卵巢刺激程序，以保持生育能力
注：当开始癌症治疗前可用的时间有限时，建议在月经周期内随时开始卵巢刺激的随机启动方案（即在月经周期内随时开始卵巢刺激）用于选择生育保护的肿瘤患者的卵巢刺激。在出于非紧急医疗原因或社会原因的生育保护计划中，从卵泡早期开始的传统刺激更可取，卵巢刺激基于月经周期开始。受控卵巢刺激（COS）方法应根据最近的欧洲人类生殖和胚胎学会（ESHRE）指南24进行。
- 根据患者的特点和卵巢储备标记量身定做 COS，主要是母体年龄、FSH、AMH 和 AFC。
- 在月经周期的第 5 天使用重组剂或泌尿 FSH 开始 COS，固定剂量为 150-300 IU/天（拮抗协议）。
注：在有LH缺乏或反应欠佳的特定患者群体中，可根据卵巢反应、LH水平和妇科医生的判断，每天额外管理LH 75/150 IU/天。 - 在雌激素敏感性疾病的患者中，包括从刺激的第一天到卵母细胞检索后的第 7 天与芳香酶抑制剂 （letrozole） 相关的角蛋白。
- 服用固定剂量的戈纳多特罗平4天。
- 监测第5天，然后每2-3天监测卵泡生长;最终， 调整戈纳多特罗平剂量。
- 一旦至少3个毛囊达到17-18毫米直径，管理触发器的最后卵母细胞成熟与单皮的GnRH激动剂在0.5ml的剂量。
3. 卵母细胞检索
- 准备卵母细胞检索
- 对于所需的材料，请参阅 材料表，并保留现成的实验室鞋类和服装、手术面罩、护发罩、手术手套、永久无毒标记、钳子、无菌小纱布、一次性或可重复使用的镜面、阴道手术设备和表面消毒剂。确保复苏设备、用于逆转的麻醉药物、用于治疗过敏性休克的试剂盒和手术室中的氧气供应。
- 根据辅助生殖技术超声（ART）25的ESHRE超声工作组的建议，执行卵母细胞检索程序。
- 施用安乐或全身麻醉，以及预防抗生素。
注：在本协议中，通过管理异丙酚（其剂量根据患者的体重进行调整）和50-100μg芬太尼，1000毫克扑热息痛，并协助面罩用氧气通气，实现了深度沉着。 - 使用真空泵、连接到 17 G 单流明针的收集管和卵母细胞收集管组成的吸气装置进行卵母细胞检索。在收集过程中，不要超过 ±120 mmHg 的压力，以避免卵母细胞受损的风险，例如剥离积细胞或压裂佐纳颗粒。
- 校准工作表面温度，以确保培养介质中的 37 °C。在整个过程中，尽量减少卵母细胞暴露在甚至可能影响其发育能力的瞬态温度下。
- 在卵母细胞检索结束时，在出院前观察患者3-4小时。
- 施用安乐或全身麻醉，以及预防抗生素。
- 手术室
- 在进入手术室之前，识别患者并确认排卵触发时间。
- 让病人躺在手术台上，处于妇科位置。
- 在卵母细胞检索之前清洁阴道/子宫颈，以尽量减少细菌污染。
- 进行初步的阴道超声波检查，以评估卵巢的位置以及与各种器官和血管的解剖关系。
- 在超声波指导下，将单流明针插入阴道壁和卵巢卵泡，注意不要伤害位于阴道壁和卵巢之间的器官或血管。
- 从最近的毛囊开始渴望，然后转向最远的毛囊。
- 刺穿直径大于 11-12 mm 的所有毛囊，执行针头的"扭曲运动"，以吸气整个卵泡液，然后释放到手术室块加热器中预热的无菌管（圆形底部 14 mL）中。
- 取回后，立即密封并标记管子，并注照患者身份的详细信息。
- 确保护士将管子带到实验室，在那里立即筛查是否存在积聚卵母细胞复合物 （COC）。
- 指示胚胎学家将检索到的 COC 总数通知临床医生。
- 第一卵巢完成手术后，用清洁介质冲洗针头，然后使用相同的程序继续使用第二卵巢。
- 卵母细胞检索后，评估任何出血从卵巢或血管的副位和自由液体在道格拉斯袋。
注：为了自动化和提高在临床层面的游戏和胚胎可追溯性的有效性，在中心26号实施了电子见证系统（EWS）。然而，本协议没有提到EWS，以确保协议在任何试管婴儿实验室的可重复性。不过，请考虑程序的所有步骤都需要第二个操作员（即证人），以确保游戏和胚胎的可追溯性。
4. 试管婴儿实验室
- 卵母细胞检索程序的前一天
- 准备卵母细胞收集管（指 材料表）。
- 在每个卵母细胞收集管（圆底，5 mL）中分配1mL的试管管（指 材料表），并盖上0.2兆L的矿物油（指 材料表），用于胚胎培养。
注：管的数量将根据预期检索的卵泡数量来定义。每个管子可能包含多达 4 个 COC。
- 在每个卵母细胞收集管（圆底，5 mL）中分配1mL的试管管（指 材料表），并盖上0.2兆L的矿物油（指 材料表），用于胚胎培养。
- 用盖子密封管子（第一次捕捉）。给管子贴上中等类型和准备日期的详细信息。在受控大气中（6% CO 2，5%0 2）在 37 °C 下隔夜孵育管子。
- 准备卵母细胞收集管（指 材料表）。
- 卵母细胞检索当天
- 在 37 °C（无菌培养皿和巴斯德移液器）预温塑料供应。
- 要求患者确认其身份（全名和出生日期）和排卵触发时间。在实验室表上注明身份识别（ID）程序已经完成，排卵触发器的时间已得到确认。
- 将卵母细胞收集管从孵化器上取下（在手术开始前），并按下盖子以确保紧闭。将卵母细胞收集管标注与患者信息。将卵母细胞收集管置于 37 °C 的块加热器中。
- 检查预保温无菌培养皿中的卵泡液，并识别 COC。一旦发现一个或多个COC，在两滴中冲洗两次，以消除卵泡液和血液污染。
- 将 COC 转移到卵母细胞收集管中，并注释管上的 COC 数量。松开中管的盖子，在37°C的大气中迅速孵育它们，温度为6%CO2，5%O2。
- 根据检索到的卵母细胞数量重复步骤 7 到 9。更新实验室表。
注意：确保证人检查所有管加热块（包括手术室的块）是否空，并在实验室纸上签署关闭程序的提示。 - 完成程序后擦拭工作阶段。
5. 卵母细胞否认
- 预热4-（2-羟基乙基）-1-管道酸（HEPES）缓冲介质和透明质酶（指 材料表）在37°C至少1小时开始前。
- 准备一个4井IVF板（指 材料表）与0.6 mL/井预热HPES缓冲介质（辅以5%的人类血清白蛋白[HSA]）覆盖0.3mL矿物油胚胎培养，并在37°C加热至少30分钟。
- 将卵母细胞识别板贴上患者身份详情的标签。
- 在开始手术之前，将透明质酶添加到第一口井中，以获得约 20 IU/mL 的最终浓度。
- 将数量有限的COC（最多6个）放在含有酶的第一口井中，以分散积积细胞。
- 为了增强积液和日冕细胞的酶去除，通过巴斯德移液器反复管道将积血细胞剥离，其内径约为 250 μm，最高可达 30 s。观察初始细胞分离后，将卵母细胞转移到仅含有 HEPES 缓冲介质的第二口井，小心地携带最少数量的酶。
- 使用内径不断减小的凹陷移液器（170-145 μm）进行进一步的除臭，以去除日冕细胞。只有在严格必要的情况下才使用直径较低的（135μm）。
- 小心地清洗凹陷的卵母细胞，以洗掉酶。
- 鉴定后，在倒置显微镜下检查卵母细胞，以评估其完整性和成熟阶段。将MII卵母细胞与未成熟细胞（老年囊泡和元相-I）分开。
- 将 MII 卵母细胞移到病毒化区域，立即进行低温保存。更新实验室表。
6. 卵母细胞化
注：执行卵母细胞化最好在卵母细胞检索后的 38 小时内和被鉴定后立即执行。这里描述的病毒化过程必须在室温 （RT） 下完成，并且使用内径为 170 μm 的脱衣舞移液器，以免在操作过程中损坏卵母细胞。
- 手术前约 30 分钟，将均衡溶液 （ES） 和病毒化解决方案 （VS） 带到 RT （25-27 °C）。
- 正确标记冷冻器件，标有患者的姓名和 ID、治疗 ID、冷冻日期、卵母细胞数量和冷冻条码。
- 用新鲜的液氮将一次性冷却架填充到顶部，并开始消毒过程。
- 将化验板（指 材料表）标上患者的姓名和身份证。请证人检查冷冻器的正确ID。
- 小心地倒置每个小瓶两次，在使用前混合其内容，并用一滴 30 μL 的 HEPES 缓冲介质（5% HSA）和 ES 的相邻 30 μL 的相邻滴水准备 6 mm Petri 盘的盖子。
注意：在使用前放置掉落以限制中等蒸发。 - 使用直径为 170 μm 的脱衣舞移液器，将卵母细胞（最多 9 个）放在第一滴中，最大介质体积最小。使用脱衣舞移液器，在滴 1 和 n.2 之间架起一座介质的桥梁，以逐步增加 CPU 的浓度（图 1A）。
- 在第一滴中孵育卵母细胞3分钟。添加 ES （n.3） 的第三滴 30 μL。3分钟后，将卵母细胞转移到ES的第二滴，并在滴n.3和n.2之间架起一座中等桥（图1B）。将卵母细胞在滴 n.3 中孵育 3 分钟。
- 在孵化过程中，为将要使用的每个低温切口添加一滴 30 μL 的 ES（如果要冷冻保存 9 个卵母细胞，则每滴 ES 中放置 3 滴 ES，每滴 ES 中加入 3 个卵母细胞）。将卵母细胞移入纯 ES 溶液中，并让它们保持 6-9 分钟（直到收缩后恢复初始大小）（图 1C）。
- 准备一个中央井盘（60 x 15毫米）与1mL的VS。在前 6 分钟结束时，将卵母细胞转移到 VS 解决方案中，释放出尽可能少的介质。将卵母细胞留在 VS 中 1 分钟，并小心清洗，将它们从底端移到盘的顶部，以去除 ES 的过量。
- 在孵化一分钟结束前大约10秒，将低温放在显微镜下，并调整对黑色标记（即低温的尖端）的聚焦。将卵母细胞放在黑色标记旁边的冰面上，最小VS量（图2A）。
- 将脱衣舞移液器移离卵母细胞，并去除VS介质（图2B）的过量，使卵母细胞保持被薄薄的中层覆盖（图2C）。
- 迅速将低温液注入液氮中，快速摇晃以去除表面的气泡。用钳子抓住低温的保护帽，用液氮填充：然后将低温加入其中，同时将丙烯条保持在液氮中。
- 将低温储存在以前标有患者信息的视网管中。更新实验室表。
7. 卵母细胞变暖
- 手术前约 30 分钟，将解冻溶液 （TS）、稀释溶液 （DS） 和洗涤液 （WS） 加热至 RT （25-27 °C）。小心地倒置每个小瓶两次，以混合其内容。将 1 mL 的 TS 放在中央井培养皿中，在 37 °C 下加热至少 1 小时，然后再开始手术。
- 将所有塑料用品标有患者的姓名、ID 和溶液类型。请证人确认患者关于低温的信息。
- 要加热每个低温，应在第一口井中准备一个 6 井板，第一口井中 200 μL 的 DS，在第二口和第三口井中准备同等数量的 WS（分别命名为 WS1 和 WS2）。在井外区域添加磷酸盐缓冲盐水（PBS）或无菌水，以防止蒸发。
- 将 TS 菜从孵化器中取出，放在显微镜下。将显微镜的聚焦调整到培养皿的中心。
- 小心地扭动和取下低温的保护盖，同时将丙烯条保持在液氮中。尽快将低温从液氮转移到 TS 中，以避免脱毒风险，并启动倒计时（1 分钟）。
- 通过聚焦低温（即黑色标记）的尖端来定位卵母细胞。使用脱衣舞移液器，将卵母细胞从低温中释放出来。
注意：尽量不要从低温中吸出卵母细胞：轻轻地释放一些媒体， 直到他们进入 Ts 。 - 使用直径为 170 μm 的脱衣舞移液器，将卵母细胞与少量 TS（创建梯度）转移到 DS，并将它们留在 DS 中 3 分钟。将卵母细胞移到 WS1 也一样，并离开它们 5 分钟。最后，将卵母细胞转移到WS21分钟。
- 将卵母细胞转移到适当的预平衡IVF培养介质中，在进行细胞内精子注射（ICSI）之前孵育1小时。更新实验室表。
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Representative Results
中心生育保护计划概述
在12年期间（2008-2020年），285名妇女至少接受了一次卵母细胞检索，使收集的成熟卵子全部被检出。这些妇女中的大多数（n=250）接受了一次检索，35名妇女接受了多次检索。接受卵母细胞检索的原因归纳为4类：医疗（癌症除外）、癌症、非医学等。在250名接受卵母细胞检索的250名妇女中，8%有癌症以外的医学原因（10例子宫内膜异位症、3例肌瘤、4例卵巢囊肿、1例水盐平），16%有癌症（31例乳腺癌， 3 卵巢癌，2 结肠直肠癌，2 霍奇金淋巴瘤，1 外阴癌 e 1 宫颈癌），53% 有非医疗原因，23% 有其他原因（43 缺乏精子检索，10 风险OHSS，4感染和1发烧）。这种分布在接受多次卵母细胞检索以进行卵子病毒化的患者中有所不同。具体来说，9%的人有癌症以外的医疗原因（1个子宫内膜异位症，2个卵巢储备减少），6%有癌症（2个乳腺癌），80%有非医疗原因，3%有其他原因（1个没有取回精子）。接受多次卵母细胞检索的卵子化患者中，没有一个为这些卵子加热，而在250名接受单卵细胞化周期的妇女中，有78人返回使用这些卵母细胞（图3）。
表1总结了250名妇女根据相关原因进行单卵母细胞化周期的数据。有卵子化医学原因的患者和因癌症而进行生育保护的患者较年轻（平均产妇年龄<35岁），并且比非医疗或其他原因的患者表现出更好的卵巢储备（高于AFC）。然而，平均成熟率（回收的MII卵母细胞数量/COC数量）略低（72-73%对77-79%），因此平均卵母细胞数量在4组（9-10卵母细胞）中相似。重要的是，40名内科患者中，有9名（22.5%）接受了随机启动卵巢刺激方案，因为他们在开始化疗或放射治疗之前时间有限。有趣的是，除了癌症之外，大约一半的有医学原因的患者（53%）和大多数有其他卵子病毒化原因的患者（76%）实际上返回了温暖。相反，极少数因癌症（17.5%）或非医疗原因（13%）而进行生育保护的患者使用其维他性卵母细胞进行试管婴儿。同样引人注目的是，在返回的患者中，在病毒化和变暖之间所经历的时间：除癌症外，平均有医疗原因的患者为283天，其他原因患者的为132天，肿瘤患者为1264天，非医疗原因的患者为1547天。尽管存在所有这些相关差异，但4组患者的存活率相似（83-88%：平均加热8-11个卵母细胞，存活7-9个卵母细胞），从而确认了卵母细胞化和加热协议的疗效和安全性。此外，存活率与病毒化和变暖操作者的经验无关（图4A，B）。表1显示4组的受精率，即+70%，但非医疗原因的卵母细胞化（+80%）除外。然而，这些数据是无法比较的，由于样本量小和精子因子的偏差，受精结果27。
图1： 卵母细胞冷冻保存的中滴配置。 为了逐渐进行平衡，卵母细胞首先被放置在一个（A）滴的BS和混合（B）一滴ES。 孵化3分钟后，（C）第三滴ES溶液混合， 卵母细胞孵育6-9分钟。缩写： HEPES = 4-（2-羟基乙基）-1-管道拉齐尼乙硫酸;BS = HEPES 缓冲介质;ES = 平衡解决方案。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：低温保存装置上的卵母细胞加载。卵母细胞被放置在（A）一小滴VS的低温上。（B） 脱衣舞移液器从卵母细胞移开，（C）过量的VS被重新吸气，在每个卵母细胞周围只留下一层薄薄的层。缩写：VS = 病毒化解决方案。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在罗马GENARA生殖医学中心（2008-2020年）进行的卵母细胞化周期。 在12年期间，250名患者接受了卵母细胞的单次检索，35名患者接受了多次卵母细胞检索周期。卵母细胞化的内在原因在图中显示。返回供暖的患者（n=78）只属于接受单卵母细胞化周期的妇女群体。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：每组热卵母细胞的平均存活率。 （A） 病毒化和（B） 加热操作员的经验。每个患者只包括第一个加热周期。使用曼-惠特尼 U测试评估了统计学上显著的差异。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：细胞形态在平衡过程的开始和结束。为了确定平衡程序的结果，在开始程序之前注释（A）卵母细胞形态可能是有用的。（B） 首次接触低温保护液后，观察到卵母细胞急剧收缩。当（C）卵母细胞恢复初始体积时，平衡程序可以被认为是完整的。刻度条 = 25 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
| 卵母细胞化的原因 | 癌症以外的医学 （n=19） | 癌症 （n=40） | 非医疗 （n=133） | 其他 （n=58） |
| 卵母细胞检索时的母体年龄， 平均±SD | 33.6±6.4岁 | 34.6±5.9岁 | 37.0±3.4 岁 | 38.2±4.3岁 |
| 基础 Fsh， 平均± | 7.5±4.2 IU/L | 7.6±1.7 IU/L | 7.8±4.1 IU/L | 8.8±5.2 IU/L |
| 阿姆， 平均± | 1.8±1.7 ng/mL | 1.9±0.2 ng/mL | 2.2±2.4 ng/mL | 3.0±2.5 ng/mL |
| 阿夫克， 平均± | 12.7±5.0 | 13.3±7.0 | 11.6±6.1 | 10.7±6.7 |
| Bmi， 平均± | 20.1±1.5 | 21.8±1.6 | 20.2±3.1 | 22.9±3.6 |
| 刺激持续时间，均值±SD | 10.0±1.5 | 9.6±1.7 | 9.9±2.1 | 10.3±2.1 |
| 9/40, 22.5% | ||||
| 随机启动 | ||||
| COC， 总计， 平均±SD | 239 | 551 | 1493 | 592 |
| 12.6±5.3 | 13.8±9.1 | 11.2±7.1 | 10.2±8.5 | |
| MII 卵母细胞， 总计， 平均±SD | 167 | 400 | 1161 | 462 |
| 8.8±3.3 | 10.0±7.2 | 8.7±5.7 | 8.0±6.7 | |
| 成熟率，平均±SD | 72.4±13.6% | 72.1±19.6% | 79.5±17.5% | 77.4±22.2% |
| 因变暖而返回的患者，接受病毒化的患者总数百分比 | 10/19, 52.6% | 7/40, 17.5% | 17/133, 12.8% | 44/58, 75.9% |
| 从病毒化到第一次变暖之间的天数， 平均± | 283±225 | 1264±764 | 1547±709 | 132±203 |
| 加热的MII卵母细胞，总平均±SD | 82 | 66 | 191 | 409 |
| 8.2±2.8 | 9.4±4.8 | 11.2±5.8 | 9.3±7.2 | |
| 幸存的 MII 卵母细胞，总平均±SD | 73 | 55 | 160 | 345 |
| 7.3±3.3 | 7.9±4.0 | 9.4±4.8 | 7.8±6.9 | |
| 生存率，平均±SD | 87.6±18.1% | 83.2±1.7% | 85.4%±14.5% | 84.7±21.9% |
| 精子因子 | ||||
| N， n， % | 5/10, 50% | 4/7, 57% | 13/17, 76% | 13/44, 29% |
| MMF， n， % | 3/10, 30% | 3/7, 43% | 3/17, 18% | 17/44, 39% |
| 燕麦， n， % | 2/10, 20% | - | 1/17, 6% | 11/44, 25% |
| 诺阿， n， % | - | - | - | 3/44, 7% |
| 施肥率，平均±SD | 70.0±14.4% | 70.0±17.0% | 78.5±20.6% | 71.0±24.3% |
表1：接受单周期卵母细胞化的患者。 缩写： FSH = 卵泡刺激激素;AMH = 抗穆勒激素;BMI = 身体质量指数;COC = 积木卵母细胞复合物;MII = 元相-II;N = 规范性;MMF = 中度男性因子（1-2 精子缺陷）;OAT = 寡头星体原子体;NOA = 非阻塞性偶发性精子（精子通过睾丸精子提取收集）。
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Discussion
临床考虑
虽然已经探索了卵巢组织冷冻保存和体外成熟等新兴策略，但COS后卵母细胞体质化是保存生育力的黄金标准技术。在这种情况下，应在最短的时间内最大限度地增加检索和冷冻保存的卵母细胞数量，因为大多数癌症患者在开始癌症治疗之前可能仅从一个卵巢周期中受益。因此，适当的卵巢刺激方案对于充分利用卵巢储备和增加未来活产28的累积机会至关重要，这一结果在很大程度上取决于卵母细胞检索时的母体年龄。在这方面，尚未提出为维持生育目的进行卵母细胞化的理想年龄，而须在35岁18岁或37岁至30岁、31岁之间达成共识。然而，所有患者，包括37岁以上的妇女，都应获得生育保护，只要根据她们的年龄对成功率给予适当的咨询。
药物的治疗方案和开始剂量应根据妇科医生的判断概述，最重要的是，根据可用的时间32，33。建议在时间不是问题时，在早期卵泡阶段开始常规刺激。然而，如果需要，随机启动的方法是可行的，以尽量减少延迟开始紧急癌症/医疗34，35。据报道，卵泡发育是一个极其动态的过程，因为在整个卵巢周期中描述了多波卵泡招募。虽然这种现象背后的生物机制仍有待揭开，但能够检索和冷冻保存的卵母细胞可以独立于开始COS的月经周期阶段。
在这个中心，卵巢刺激通常使用GnRH拮抗协议和150-300 IU/天重组-FSH或人类更年期戈纳多特罗平进行。在35岁以上的特定人群，LH缺乏症，或在标准COS后表现出不理想的反应，在COS期间可能添加LH，通过与胰岛素样生长因子116，37，38的协同作用来增加卵泡的招募和生长。此外，GnRH拮抗剂协议，其次是GnRH激动器触发器已报告是一个简短，安全和高度方便的刺激协议，以最大限度地提高卵巢反应和尽量减少OHSS39的风险。在雌激素敏感疾病，如乳腺癌的患者中，与芳香酶抑制剂（如莱罗佐尔）相关的戈纳多特罗平被施用20。
事实上，最近的一项审查显示，卵巢反应与常规刺激相似，在先天缺陷、恶性复发和死亡率增加方面没有并发症。同样，在COS中可能使用塔莫西芬来预防雌激素敏感肿瘤，这种肿瘤与莱罗佐尔一样，对卵母细胞能力41，42没有影响。然而，这需要在更大的研究中得到证实。在这个中心，Letrozole从刺激的第一天到卵母细胞检索后的第7天，以防雌二醇敏感肿瘤。应考虑OHSS的风险，这是COS最重要的并发症，也会进一步推迟抗癌治疗，特别是在AFC高的年轻患者中。在这些情况下，用GnRH激动剂而不是人类胆汁性腺激素（hCG）触发排卵已被证明是有益的。其他必须预防的问题是（i）血栓栓塞，这需要在COS期间管理低分子量肝素，（二）在COS43之后减少卵巢反应。为了补偿后者，可以在一个卵巢周期中连续进行两次刺激。这种新的非常规COS协议，被称为DuoStim，需要卵泡和叶酸相刺激和两个卵母细胞检索在短时间内（+15天），并应调查生育保存目的在未来44，45，46。
妇女生育保护的其他可能战略是：（i） 卵巢组织冷冻保存，这是供育前女性使用的唯一选择。这种可能性有望恢复生殖和内分泌活性，避免癌症治疗的延迟，因为不需要激素刺激。然而，它仍然是实验性的，需要腹腔镜手术与后期移植，并有矫形癌症再传播的风险。（二） 胚胎冷冻保存，在变暖后存活率较高，但延迟癌症治疗，要求男性伴侣或捐赠者参与，从而也限制了妇女未来的生殖自主性。此外，在一些国家，它可能受到法律限制。考虑到这些限制，卵母细胞化被认为是最成熟和合乎道德的方法。理想情况下，所有主要医院，凡是受癌症影响的育龄妇女，都应提供生育保护方案，整个过程应免费为这些患者提供，以确保平等获得这一方案。尽管如此，卵母细胞冷冻保存必须只在具有足够专业知识的中心进行，不能影响卵母细胞在过程中的能力。
电气化协议和故障排除的关键步骤
病毒化是一种伪二阶相位过渡（IUPAC化学术语简编），在细胞内诱导玻璃状凝固，防止冰晶核化和生长，这是细胞损伤的主要致病因素。为了实现适当的葡萄化，需要至少两个注册会计师（通常以乙二醇和 DMSO 作为渗透剂，蔗糖作为非渗透剂）以及极高的冷却率（> 20，000 °C/min），通过最大限度地减少装载量或将样品直接暴露在液氮（开放装置）中来实现。由于卵母细胞是人体最大的细胞，它们含有最多的水。因此，它们比胚胎对冷冻损伤更敏感。在卵母细胞冷冻保存期间，细胞内细胞（例如细胞骨架或细胞主轴）的损伤、膜渗透性改变、佐纳细胞硬化、卵母细胞活化、生化途径的改变，以及可能的细胞死亡都可能发生49。因此，必须确保多种因素之间的微妙平衡，才能成功地保持卵母细胞的生存能力和发展能力。为了在病毒化后实现存活率的一致性并达到基准水平，必须严格控制程序的所有关键步骤。
CPU、细胞渗透率和冷却率
为了增加变白的概率，必须最大限度地提高介质的粘度（因此 CPA 浓度）。然而，CPU的毒性应始终控制在50。为此，必须最大限度地减少细胞接触 CPU 的时间和加载量，并且始终在室温 （25-27 °C）51下工作。其他协议涉及 CPGA 和低温的不同组合，在 37 °C 下执行;然而，他们还没有在这里描述。因此，本手稿的笔记、代表性结果和讨论部分仅适用于此处详细介绍的文稿化协议。
在冷冻保存期间，卵母细胞暴露在细胞浓度增加的CPA溶液中，以促进细胞脱水和细胞质收缩。在变暖期间，它们暴露在溶液浓度降低的溶液中，以恢复细胞质体积。在玻璃化过程中，卵母细胞脱水，细胞体积的无意波动可引起严重的渗透性休克，从而在升温52后损害生存和发展潜力。找到最佳冷却率是保持细胞生存能力的关键方面，因为它影响渗透性53 和细胞发育潜力54。例如，当细胞暴露在冷却速率低于最佳速率时，它可能广泛暴露在导致细胞死亡的超音速条件下。
为了达到最佳冷却速率，应尽量减少负荷量，控制RT，以免影响平衡过程的速度，样品应直接暴露在液氮中。评估何时实现平衡的一种方法是在程序开始前注释卵母细胞的形态（特别是周边空间的宽度和佐纳颗粒的厚度）（图5A）。在细胞体积减少的初始阶段（图5B）后，卵母细胞有望恢复初始体积（图5C）。虽然正确的pH值在空气中的卵母细胞处理过程中保持，因为缓冲了振动加热溶液的zwitterions，但中等渗透性却特别依赖于温度53。因此，准备菜的方法对于减少任何可能的有害影响至关重要。
油覆盖肯定是防止蒸发和避免在试管婴儿介质56的渗透性增加的关键。但是，在执行病毒化和加热程序时不能使用它。因此，一些提示对操作员很重要：（i） 在使用前尽快准备液滴：（二） 考虑增加液滴量，以尽量减少渗透性的变化（不建议<30微升）;（三） 当环境条件不能标准化时，可使用6井板，并在相邻水库添加无菌水或PBS，以限制蒸发：（四） 注意介质小瓶第一次打开的日期，因为如果瓶子反复打开，渗透性可能会发生变化。
卵母细胞变暖和卵母细胞去活化
影响存活率一致性的最关键步骤肯定是变暖过程57。在此步骤中，CPU 逐渐从卵母细胞中去除并稀释，以防止任何潜在的细胞毒性效应。去病毒化，即在变暖溶液期间或在蒸汽中意外地形成冰核或冰晶，是五十八、五十九、六十度病毒化的主要风险之一。因此，为了防止在变暖过程中的去活化和伤害，必须最大限度地提高过程的第一步和最后一步之间的温差。如Seki和Mazur57在穆林卵母细胞中以不同的速度受到病毒化和变暖的影响所示，变暖越快，存活率越高。TS 的体积和温度是要控制的主要因素：TS 应适当加热至 37 °C（手术前至少 1 小时），液氮机架应填充到其容量边缘，并尽可能靠近立体显微镜。操作员应尽可能快地将低温保存载体从液氮转移到 TS。由于病毒化效率高，无论涉及的冷冻协议如何，都可以使用通用的变暖协议，即使卵母细胞从不同的IVF中心61进口，也更容易管理所有的变暖周期。
打开设备和污染风险
需要利用开放系统和将样品直接暴露在液氮中，才能达到支持本议定书有效性的极高冷却和变暖率。虽然病毒化是一种对交叉污染风险较低的程序，因为它涉及的体积非常小，并且经过几次样品清洗后进行，这些洗涤稀释了任何假定病毒载量，因此必须采取所有预防措施来提高其安全性。根据目前的证据，封闭系统不提供竞争替代开放系统至少卵母细胞化62，63。为了保持开放式化系统的有效性，同时尽量减少与液氮直接接触的风险，后者可能通过紫外线照射64，65进行灭菌。或者，蒸汽储存罐可能被使用，这是众所周知的，造成污染的风险比传统的较低，但已证明有效地保存卵母细胞的生存能力66，67。
持续监测卵母细胞化方案关键性能指标的重要性
在试管婴儿实验室中，对关键性能指标 （KPIs） 的监测对于监测和不断提高结果至关重要。一般来说，在为监测过程和程序确定 KPI 时，应考虑三个主要领域：结构、流程和结果。结构KPIs通过概述物理和人力资源的特点来衡量试管婴儿实验室的质量。与低温保存计划中的设施有关的结构 KPI 的一个例子可能是，与在给定时间段内进行冷冻保存的 ART 程序总数相比，冷冻罐的数量，或者相对于冷冻室总面积的冷冻罐数量。然而，人力资源，特别是操作员技能，在处理诸如电气化等微妙程序时至关重要。事实上，虽然非常有效，但病毒化技术是一个具有挑战性的程序，涉及几个程序阶段，其时间必须严格控制：在很短的时间内应管理极少量的明显粘性介质。
该过程不涉及具有特定冷却参数设置的冷冻机：因此，协议细节和培训的标准化至关重要。手动过程具有严格的技能要求，必须满足这些要求才能获得一致且高度可重复的细胞存活率。应向每个新手操作员提供具体培训，使他们能够熟练地控制程序的所有临界点，特别是样品暴露在 CIA 中的时间以及高粘度介质下的细胞处理。然而，根据Dessolle和合著者的说法，69 的玻璃化程序的学习曲线不应该那么长，即使是初级胚胎学家，因为熟练程度的成就主要受操纵挑战的限制。一旦在电气化方面获得专业知识，就必须通过使用 KPI 准确和定期验证每个操作员的绩效，以定期评估共识文件70所确立的能力值的维持情况。此外，经营者的信心/能力必须具有可比性，以免影响结果。
过程 KPIs 测量 IVF 实验室的工作效果。应及时进行葡萄干化和加热协议和程序，并特别注意保持足够的渗透和温度，以保持卵母细胞发育能力，并在处理液氮时保持操作者的安全性，从而最大限度地减少养殖条件的波动。过程 KPI 的例子包括实验室工作人员在每年处理每例试管婴儿程序时受伤的百分比、在病毒化/加热程序过程中丢失/损坏的游戏/胚胎百分比以及每年对每例程序的审计。
最后，结果KPI测量IVF实验室的有效性，一般指在ICSI时定义为形态完整卵母细胞的比例（在卵母细胞化的情况下，能力值应>50%，基准值为75%）70。此外，受精率（比中心从可比患者群体中授精的新鲜卵母细胞低<10%）、胚胎发育（与使用新鲜卵母细胞的可比患者群相同）和植入率（<比中心新胚胎的可比种群低10-30%）适用于紫外细胞70的结果KPIs。然而，临床结果更受夫妻特异性的影响，而不是有缺陷的临床程序71，72。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection | |||
| Equipment | |||
| Hot plate | IVF TECH | ||
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermometer | |||
| Test tube Warmer | |||
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Vacuum Pump | Cook | K-MAR-5200 | |
| Consumables | |||
| CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| Ovum Aspiration Needle (Single lumen) | Cook | K-OSN-1730-B-60 | |
| Primaria Dish | Corning | 353803 | Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish |
| Round- bottom tubes | Falcon | 352001 | Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap |
| Round- bottom tubes | Falcon | 352003 | Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap |
| Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | |
| Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE |
| Denudation | |||
| Equipment | |||
| CO2 incubator | Eppendorf | Galaxy 14S | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl |
| Human Serum Albumin | thermoFisher Scietific | 9988 | |
| Hyaluronidase | Fujifilm Irvine Scientific | 90101 | 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF |
| IVF culture dish (60 x 15mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
| Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | 1 mL for pasteur pipettes |
| Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE |
| stripping pipette tips (140 µm) | Cook | K-FPIP-1140-10BS-6 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| stripping pipette tips (130 µm ) | Cook | K-FPIP-1130-10BS-7 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification | |||
| Equipment | |||
| Electronic Timer | |||
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
| Human Serum Albumin | Fujifilm Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
| Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
| stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification Freeze kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90133-so | 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL) |
| Vitrifit | Coopersurgical Origio | 42782001A | VitriFit Box |
| Warming | |||
| Equipment | |||
| Electronic Timer | |||
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
| k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
| CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
| IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| SAtripping pipette tips (300µm) | Cook | K-FPIP-1300-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification Thaw kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90137-so | 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL) |
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