Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Сохранение фертильности посредством витрификации ооцитов: клинические и лабораторные перспективы

Published: September 16, 2021 doi: 10.3791/61963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Summary

Криоконсервация ооцитов признана несколькими международными научными обществами золотым стандартом сохранения фертильности у постпубертатных женщин. Соответствующие клинические и лабораторные стратегии обеспечивают максимальную эффективность, результативность и безопасность методов лечения бесплодия.

Abstract

Сохранение женской фертильности имеет решающее значение в многофункциональной системе здравоохранения, которая заботится о будущем качестве жизни пациентов. Криоконсервация ооцитов признана несколькими международными научными обществами золотым стандартом сохранения фертильности у постпубертатных женщин, как по медицинским, так и по немедицинским показаниям. Основными медицинскими показаниями являются онкологические заболевания, гинекологические заболевания, такие как тяжелый эндометриоз, системные заболевания, ставящие под угрозу овариальный резерв, и генетические состояния, связанные с преждевременной менопаузой. В этой статье описывается вся клиническая и лабораторная работа по лечению сохранения фертильности путем изложения рекомендаций по объективному и основанному на фактических данных консультированию. Кроме того, основное внимание уделяется эффективности процедуры и описываются наиболее подходящие стратегии для полного использования овариального резерва и максимизации количества ооцитов, извлеченных в кратчайшие сроки. Оценка овариального резерва, определение идеального протокола стимуляции, а также процедуры извлечения, денудации и витрификации ооцитов были подробно описаны вместе с подходами к максимизации их эффективности, действенности и безопасности.

Introduction

Разработка и внедрение эффективной программы криоконсервации ооцитов человека стала значительным прорывом в репродуктивной медицине. Согласно последним данным, витрификация является наиболее эффективной стратегией криоконсервации метафазных II (MII) ооцитов, поскольку она приводит к статистически более высоким показателям выживаемости по сравнению с медленным замораживанием, независимо от популяции пациентов (бесплодных пациентов или программы донорства ооцитов)1,2,3. Замечательные достижения витрификации ооцитов привели к тому, что практические комитеты Американского общества репродуктивной медицины (ASRM) и Общества вспомогательных репродуктивных технологий (SART) объявили этот метод наиболее эффективным для выборного сохранения фертильности у женщин в постпубертатном периоде, как по медицинским, так и по немедицинским показаниям4,5,6. Медицинские показания для сохранения фертильности включают (i) рак и аутоиммунные заболевания, которые требуюттерапии 7, такой как лучевая терапия, цитотоксическая химиотерапия и эндокринная терапия (чье пагубное влияние на овариальный резерв связано с возрастом матери, а также с типом и дозой лечения); ii) заболевания яичников, требующие повторного или радикальногохирургического вмешательства (например, эндометриоз)8; и iii) генетические условия (например, X-хрупкий) или преждевременная недостаточность яичников. Кроме того, сохранение фертильности стало ценным вариантом для всех женщин, которые не достигли своей родительской цели по немедицинским причинам (также известным как социальное замораживание).

Независимо от показаний к сохранению фертильности и в соответствии с основными международными руководящими принципами по сохранению фертильности, все пациенты, желающие витрифицировать свои ооциты, должны получить соответствующую консультацию, чтобы быть информированными об их реальных шансах на успех, стоимости, рисках и ограничениях процедуры9,10, 11,12,13. Самое главное, должно быть ясно, что витрифицирование когорты ооцитов МИИ не обеспечивает беременность, но что она предлагает более высокие шансы на успех для будущего лечения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), при необходимости14. В связи с этим возраст женщины на момент витрификации ооцитов, безусловно, является важнейшим ограничивающим фактором15, так как преклонный возраст матери (АМА; >35 лет) является основной причиной женского бесплодия16. Помимо прогрессирующего снижения овариального резерва, АМА связана с ухудшением компетентности ооцитов из-за дефектных физиологических путей, таких как метаболизм, эпигенетическая регуляция, контрольные точки клеточного цикла и мейотическая сегрегация17. Поэтому разумное количество яйцеклеток для витры в основном зависит от возраста матери. У женщин моложе 36 лет требуется не менее 8-10 МИИ ооцитов18, чтобы максимизировать шансы на успех. В целом, чем выше количество витрифицированных ооцитов, тем выше вероятность успеха. Поэтому адаптация стимуляции яичников в соответствии с маркерами овариального резерва, такими как уровень антимюллерова гормона (AMH) или количество антральных фолликулов (AFC), имеет решающее значение для полного использования овариального резерва в кратчайшие сроки.

Безопасность всей процедуры является другим ключевым вопросом при регистрации пациентов для сохранения фертильности. Клиницисты должны использовать лучшие стратегии для минимизации рисков и предотвращения (i)синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) с использованием безопасных подходов, таких как протокол антагониста гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), за которым следует триггер агониста ГнРГ19 и (ii) отдаленные, но возможные, риски перитонеального кровотечения, повреждения тазовых структур (мочеточник, кишечник, аппендикс, нервы) или тазовой инфекции во время извлечения яйцеклеток. Наконец, (iii) традиционные схемы стимуляции связаны с супрафизиологическим сывороточным эстрадиолом и, следовательно, не рекомендуются при эстроген-чувствительных заболеваниях, таких как рак молочной железы. Протоколы с участием ингибиторов ароматазы (таких как летрозол или тамоксифен) более подходят в этих случаях20,21. В лабораторных условиях наиболее распространенным протоколом витрификации ооцитов по-прежнему является тот, который впервые описан Куваямой и его коллегами2,23,который состоит из поэтапной процедуры, включающей постепенное добавление криопротекторов (CPA). В первой фазе (равновесие/обезвоживание) ооциты подвергают воздействию в растворе CPA, содержащем 7,5% v/v этиленгликоля и 7,5% v/v диметилсульфоксида (DMSO), в то время как во второй фазе ооциты перемещают в раствор витрификации с 15% v/v этиленгликолем и 15% v/v DMSO, плюс 0,5 моль/л сахарозы. После короткой инкубации в среде витрификации ооциты могут быть помещены в специально разработанные открытые криодевицы и, наконец, погружены в жидкий азот при -196 °C для хранения до использования.

Здесь вся клиническая и лабораторная работа по лечению сохранения фертильности была описана путем (i) изложения рекомендаций по объективному и основанному на фактических данных консультирования, (ii) сосредоточения внимания на экономической эффективности процедуры и (iii) описания наиболее подходящих стратегий для полного использования овариального резерва и максимизации количества ооцитов, извлеченных в кратчайшие сроки. Оценка овариального резерва, определение идеального протокола стимуляции, а также процедуры извлечения, денудации и витрификации ооцитов будут подробно описаны вместе с подходами к максимизации их эффективности, действенности и безопасности. Поскольку в литературе существуют другие протоколы или адаптации этого протокола, репрезентативные результаты и разделы обсуждения этой рукописи применяются только к этой процедуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Разработка и клиническое консультирование

ПРИМЕЧАНИЕ: В случае пациентов, нуждающихся в сохранении фертильности по онкологическим причинам, убедитесь, что нет списка ожидания для назначения консультации, и запись на прием предоставляется как можно скорее.

  1. Изучите историю болезни и предыдущую документацию и оцените общее состояние здоровья пациента.
  2. Запишите всю информацию (включая согласие онколога на стимуляцию яичников у больных раком) в реляционную базу данных.
  3. Предоставьте пациенту конкретную консультацию о целесообразности процедуры. Объясните этапы процедуры (стимуляция яичников, извлечение ооцитов, витрификация ооцитов) и сообщите ей о реальных шансах на успех (в основном зависящих от возраста матери и ожидаемого количества ооцитов MII на момент извлечения ооцитов), а также о стоимости и ограничениях процедуры.
  4. Выполнить трансвагинальное УЗИ для получения информации о овариальном резерве (т.е. АФК) и оценить доступность яичников для забора яйцеклеток.
  5. Запросить анализы крови для оценки группы крови и резус-фактора, скрининга свертываемость крови (анализ крови, протромбин, тромбопластин, фибриноген, белок C, белок S, антитромбин III, гомоцистеин) и инфекционные заболевания (гепатит В, гепатит С, ВИЧ, Исследовательская лаборатория венерических заболеваний / Treponema pallidum Hemagglutination Assay).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае пациентов, обращающихся к программе сохранения фертильности по несрочной медицинской помощи, более всесторонняя оценка может включать базальный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), эстрадиол, АМГ, обследование молочной железы, тест Папаниколау, генетический скрининг коагуляции (фактор V Лейдена и протромбин) и скрининг TORCH (токсоплазмоз, краснуха, цитомегаловирус).
  6. Закажите кардиологическое обследование (электрокардиограмму).
  7. Рекомендуем психологическую консультацию.

2. Контролируемые протоколы стимуляции яичников для сохранения фертильности

ПРИМЕЧАНИЕ: Когда время, доступное до начала лечения рака, ограничено, протокол случайного запуска (т. Е. Начало стимуляции яичников в любое время в течение менструального цикла) рекомендуется для стимуляции яичников у онкологических пациентов, которые являются кандидатами на сохранение фертильности. В программе сохранения фертильности по несрочным медицинским или социальным причинам предпочтительнее обычная стимуляция, начинающаяся в ранней фолликулярной фазе, а стимуляция яичников начинается на основе менструального цикла. Подходы контролируемой стимуляции яичников (COS) должны выполняться в соответствии с недавними руководящими принципами Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (ESHRE)24.

  1. Адаптируйте COS в соответствии с характеристиками пациента и маркерами овариалистного резерва, в основном материнского возраста, ФСГ, АМГ и АФК.
  2. Начинают КОС на 5 день менструального цикла с использованием рекомбинантного или мочевого ФСГ с фиксированной дозой 150-300 МЕ/сут (протокол антагониста).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конкретной популяции пациентов с дефицитом ЛГ или плохим неоптимальным ответом может быть введен дополнительный ЛГ 75/150 МЕ / день в соответствии с реакцией яичников, уровнями ЛГ и суждением гинеколога.
  3. У пациентов с эстроген-чувствительными заболеваниями включают гонадотропины, связанные с ингибиторами ароматазы (летрозол) с 1-го дня стимуляции до 7-го дня после извлечения ооцитов.
  4. Вводят фиксированную дозу гонадотропинов в течение 4 дней.
  5. Контролировать рост фолликулов на 5 день и затем каждые 2-3 дня; в конце концов, скорректируйте дозировку гонадотропина.
  6. Как только по меньшей мере 3 фолликула достигнут 17-18 мм в диаметре, вводят триггер для окончательного созревания ооцитов одним подкожным болюсом агониста ГнРГ в дозе 0,5 мл.

3. Извлечение ооцитов

  1. Подготовка к извлечению ооцитов
    1. Для необходимых материалов обратитесь к Таблице материалов и держите наготовелабораторную обувь и снаряжение, хирургическую маску для лица, чехол для волос, хирургические перчатки, постоянный нетоксиченный маркер, пинцет, стерильную мелкую марлю, одноразовое или многоразовое зеркало, оборудование для хирургии влагалища и дезинфицирующее средство для поверхности. Обеспечить наличие в операционной реанимационного оборудования, обезболивающих препаратов для реверса, набора, подготовленного для лечения анафилактического шока, кислорода.
    2. Выполнить процедуру извлечения ооцитов в соответствии с рекомендациями Рабочей группы ESHRE по ультразвуку в технологиях вспомогательной репродукции (ВРТ)25.
      1. Назначают сидацию или общую анестезию, а также антибиотики для профилактики.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе глубокая сакация была достигнута путем применения пропофола (дозировка которого корректируется в соответствии с весом пациента) и 50-100 мкг фентанила, 1000 мг парацетамола и вспомогательной маски с кислородом.
      2. Выполните извлечение ооцитов с помощью аспирационного блока, состоящего из вакуумного насоса, коллекторной трубки, соединенной с однопросветной иглой 17 G, и трубки, собирающей ооциты. Во время сбора не превышайте давление ~ 120 мм рт.ст., чтобы избежать риска повреждения ооцитов, такого как удаление кучевых клеток или разрыв зоны пеллюцидов.
      3. Откалибруют температуру рабочей поверхности для обеспечения 37 °C в культуральная среда. В течение всей процедуры минимизируйте воздействие ооцитов даже на переходную температуру, которая может повлиять на их компетентность в развитии.
      4. В конце извлечения яйцеклеток наблюдают за пациентом в течение 3-4 ч до выписки.
  2. Операционный зал
    1. Перед входом в операционную определите пациентку и подтвердите время срабатывания овуляции.
    2. Ложитесь пациенткой на операционный стол в гинекологическом положении.
    3. Очистите влагалище / шейку матки перед извлечением ооцитов, чтобы свести к минимуму бактериальное загрязнение.
    4. Выполните предварительное трансвагинальное УЗИ для оценки положения яичников и анатомических отношений с различными органами и кровеносными сосудами.
    5. Под ультразвуковым контролем введите однопросветную иглу через стенку влагалища и в фолликул яичника, заботясь о том, чтобы не повредить органы или кровеносные сосуды, расположенные между стенкой влагалища и яичниками.
    6. Начните аспирацию от ближайшего фолликула и переходите к самым дистальным.
    7. Прокалывают все фолликулы диаметром более 11-12 мм, выполняя «скручивающие движения» иглы для аспирации всей фолликулярной жидкости, которая затем выпускается в стерильную трубку (круглое дно 14 мл), предварительно нагретую в блок-нагреватель операционной.
    8. Сразу после извлечения запечатайте и наклейте на трубку этикетку с подробными сведениями о личности пациента.
    9. Убедитесь, что медсестра приносит трубку в лабораторию, где она немедленно проверяется на наличие кучевых-ооцитарных комплексов (КОК).
    10. Попросите эмбриологов проинформировать клинициста об общем количестве извлеченных КОК.
    11. Как только процедура будет завершена для первого яичники, промойте иглу чистой средой и приступайте ко второму яичнику, используя ту же процедуру.
    12. После извлечения ооцитов оцените любое кровотечение из яичников или кровеносных сосудов параметриума и свободной жидкости в мешочках Дугласа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для автоматизации и повышения эффективности прослеживаемости гамет и эмбрионов на клиническом уровне в центре26внедрена электронная система наблюдения (EWS). Тем не менее, в этом протоколе не упоминается EWS, чтобы обеспечить воспроизводимость протокола в любой лаборатории ЭКО. Тем не менее, учтите, что все этапы процедуры требуют второго оператора (т.е. свидетеля) для обеспечения прослеживаемости гамат и эмбрионов.

4. Лаборатория ЭКО

  1. За день до процедуры извлечения ооцитов
    1. Подготовьте пробирки для сбора ооцитов (см. Таблицу материалов).
      1. Дозировать 1 мл среды ЭКО (см. Таблицу материалов)в каждую трубку для сбора ооцитов (круглое дно, 5 мл) и покрыть 0,2 мл минерального масла (см. Таблицу материалов) для культивирования эмбрионов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество трубок будет определено в соответствии с количеством фолликулов, которые, как ожидается, будут извлечены. Каждая трубка может содержать до 4 КОК.
    2. Запечатайте трубки колпачком (первая защелка). Маркировка туб с подробными сведениями о типе среды и дате приготовления. Инкубируют трубки в течение ночи при 37 °C в контролируемой атмосфере (6% CO2,5% 02).
  2. В день забора ооцитов
    1. Предварительно прогреть пластик при 37 °C (стерильные культуральные блюда и пипетки Пастера).
    2. Попросите пациенток подтвердить свою личность (ФИО и дату рождения) и время запуска овуляции. Аннотировать на лабораторном листе, что процедура идентификации (ID) была выполнена, и что время запуска овуляции было подтверждено.
    3. Сняте трубки для сбора ооцитов из инкубатора (непосредственно перед началом процедуры) и опустите колпачок, чтобы обеспечить плотное закрытие. Пометьте трубки для сбора ооцитов информацией о пациенте. Поместите трубки для сбора ооцитов в блок-нагреватель при 37 °C.
    4. Исследуйте фолликулярную жидкость в предварительной стерильной культуре посуды и выявляйте КОК. Как только один или несколько КОК идентифицированы, промойте их дважды в двух каплях среды, чтобы удалить фолликулярную жидкость и загрязнение крови.
    5. Перенесите КОК в пробирки для сбора ооцитов и аннотируют количество КОК на трубке. Ослабьте колпачки средних трубок и быстро инкубируют их при 37 °C в атмосфере 6% CO2,5% O2.
    6. Повторите шаги с 7 по 9 в зависимости от количества извлеченных ооцитов. Обновите лабораторный лист.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что свидетель проверяет, что все блоки подогрева труб (включая те, которые находятся в операционной) пусты, и подписывает закрытие процедуры на лабораторном листе.
    7. Протрите рабочую стадию после завершения процедуры.

5. Денудация ооцитов

  1. Дожимная 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновая кислота (HEPES)-буферная среда и гиалуронидаза (см. Таблицу материалов)при 37 °C не менее чем за 1 ч до начала.
  2. Подготовьте 4-скважинную пластину ЭКО (см. Таблицу материалов)с 0,6 мл / скважину предварительно располованной hePES-буферной среды (дополненной 5% сывороточного альбумина человека [HSA]), покрытую 0,3 мл минерального масла для культивирование эмбрионов, и прогрейте при 37 °C в течение не менее 30 минут.
  3. Пометьте пластину денудации ооцитов с подробными сведениями о личности пациента.
  4. Непосредственно перед началом процедуры добавляют гиалуронидазу в первую скважину для получения конечной концентрации около 20 МЕ/мл.
  5. Поместите ограниченное количество КОК (до 6) в первую скважину, содержащую фермент для диспергирования кучевых клеток.
  6. Чтобы усилить ферментативное удаление кучевых и коронных клеток, выполняют удаление кучевых клеток путем многократного пипетирования ооцитов через пипетку Пастера с внутренним диаметром примерно 250 мкм на срок до 30 с. После того, как наблюдается начальная диссоциация клеток, переносят ооциты во вторую скважину, содержащую только HEPES-буферную среду, заботясь о переносе минимального количества фермента.
  7. Выполняют дальнейшую денудацию для удаления коронных клеток с помощью оголенных пипеток с уменьшающимися внутренними диаметрами (170-145 мкм). Используйте меньшие диаметры (135 мкм) только в случае строгой необходимости.
  8. Тщательно промыть оголенные ооциты, чтобы вымыть фермент.
  9. После денудации исследуют ооциты под инвертным микроскопом, чтобы оценить их целостность и стадию созревания. Отделить ооциты МИИ от незрелых (зародышевый жизикул и метафаза-I).
  10. Переместите ооциты MII в область витрификации, чтобы немедленно выполнить криоконсервацию. Обновите лабораторный лист.

6. Витрификация ооцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводят витрификацию ооцитов предпочтительно в течение 38 ч после извлечения ооцитов и сразу после денудации. Описанная здесь процедура витрификации должна выполняться при комнатной температуре (RT) и с использованием пипетки стриппера с внутренним диаметром 170 мкм, чтобы не повредить ооциты во время манипуляции.

  1. Примерно за 30 мин до процедуры доведите раствор равновесия (ES) и раствор для витрификации (VS) до RT (25-27 °C).
  2. Правильно маркируйте криоустройства именем и удостоверением личности пациента, идентификатором лечения, датой замораживания, количеством ооцитов и криобаркодом.
  3. Заполните одноразовую охлаждающую стойку до верха свежим жидким азотом и начните процесс стерилизации.
  4. Наклейте на пластину витрификации (см. Таблицу материалов)имя и удостоверение личности пациента. Попросите свидетеля проверить правильность идентификации криоустройств.
  5. Тщательно переверняйте каждый флакон дважды, чтобы перемешать его содержимое перед использованием, и приготовьте крышку чашки Петри 6 мм с одной каплей 30 мкл hePES-буферной среды (с 5% HSA) и одной смежной каплей 30 мкл ES.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите капли непосредственно перед использованием, чтобы ограничить испарение среды.
  6. Используя пипетку стриппера диаметром 170 мкм, поместите ооциты (до 9) в первую каплю с наименьшим возможным объемом среды. Используя пипетку стриппера, создайте мост среды между каплей n.1 и n.2 для получения постепенного увеличения концентрации CPA(рисунок 1A).
  7. Инкубировать ооциты в первой капле в течение 3 минут. Добавьте третью каплю 30 мкл ES (n.3). Через 3 мин перенесите ооциты во вторую каплю ЭС и создайте средний мост между каплями n.3 и n.2(рисунок 1B). Инкубируют ооциты в капле n.3 в течение 3 мин.
  8. Во время инкубации добавьте одну каплю ЭС 30 мкл на каждое криодержание, которое будет использоваться (если необходимо криоконсервировать 9 ооцитов, поместите 3 капли ЭС с 3 ооцитами в каждую каплю ЭС). Переместите ооциты в чистый раствор ЭС и оставьте их на 6-9 мин (до тех пор, пока они не восстановят свой первоначальный размер после усадки)(рисунок 1С).
  9. Приготовьте блюдо из центрального колодца (60 х 15 мм) с 1 мл ВС. В конце первых 6 мин перенесите криоконсервированную яйцеклетку в раствор VS, высвобождая как можно меньше среды. Оставьте оциты в VS на 1 мин и тщательно вымойте их, переместив их снизу вверх посуды, чтобы удалить избыток ЭС.
  10. Примерно за 10 с до конца минуты инкубации поместите криодержа под микроскоп и отрегулируйте фокус на черную метку (т.е. кончик криодержа). Поместите ооциты на криополуча рядом с черной меткой с минимальным количеством VS(рисунок 2A).
  11. Отодвините пипетку стриппера подальше от ооцитов и удалите избыток среды VS(рисунок 2B)так, чтобы ооциты оставались покрытыми тонким слоем среды(рисунок 2C).
  12. Быстро погружайте криодержание в жидкий азот, быстро встряхивая его, чтобы удалить пузырьки воздуха с его поверхности. Задержите пинцетом защитный колпачок криоборца, и заполните его жидким азотом; затем вставьте в него криополице, сохраняя пропиленовые полоски в жидком азоте.
  13. Храните криодерживище в визиотрубе, предварительно помеченном информацией о пациенте. Обновите лабораторный лист.

7. Согревание ооцитов

  1. Примерно за 30 мин до процедуры нагрейте размораживающий раствор (TS), раствор для разведения (DS) и моющий раствор (WS) до RT (25-27 °C). Осторожно переверяйте каждый флакон дважды, чтобы перемешать его содержимое. Поместите 1 мл TS в центральную колодезную чашку Петри и разогрейте ее при 37 °C в течение не менее 1 ч перед началом процедуры.
  2. Маркировка всех пластиковых материалов с именем и удостоверением личности пациента и типом раствора. Попросите свидетеля подтвердить информацию пациента о криодевице.
  3. Для каждого криопрогреваемого криодержа подготовьте 6-скважинную пластину с 200 мкл DS в первой скважине и равным количеством WS во второй и третьей (названных WS1 и WS2 соответственно). Добавьте фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS) или стерильную воду в область за пределами скважин, чтобы предотвратить испарение.
  4. Выньте блюдо TS из инкубатора и поместите его под микроскоп. Отрегулируйте фокус микроскопа к центру чашки Петри.
  5. Осторожно скрутите и снимите защитный колпачок криодетизы, сохраняя при этом пропиленовые полоски в жидком азоте. Как можно быстрее перенесите криодерживатель из жидкого азота в ТС, чтобы избежать риска девитрификации и инициировать обратный отсчет (1 мин).
  6. Локализуйте ооциты, фокусируясь на кончике криополиции (т.е. черной метке). Используя пипетку-стриппер, освободите ооциты из криодержа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не аспирировать ооциты из криодержиссы; осторожно выпускайте некоторые медиа на них, пока они не перейдут в ТС.
  7. Используя пипетку стриппера диаметром 170 мкм, переведите ооциты в ДС с небольшим количеством TS (для создания градиента) и оставьте их в DS на 3 мин. Переместите ооциты в WS1 аналогично и оставьте их на 5 минут. Наконец, перенесите ооциты в WS2 в течение 1 мин.
  8. Переведите ооциты в соответствующую предварительно уравновешенную культурическую среду ЭКО и инкубируют их в течение 1 ч, прежде чем приступить к интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). Обновите лабораторный лист.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Обзор программы сохранения фертильности в центре

За 12-летний период (2008-2020 гг.) 285 женщин подверглись по крайней мере одному извлечению ооцитов, влекущего за собой витрификацию всей когорты собранных зрелых яйцеклеток. Большинство из этих женщин (n = 250) подверглись однократному извлечению, а 35 подверглись многократному извлечению. Причины прохождения забора ооцитов для витрификации яйцеклеток сведены к 4 категориям: медицинские (кроме рака), онкологические, немедицинские и другие. Среди 250 женщин, перенесших однократное извлечение ооцитов для витрификации яйцеклеток, 8% имели медицинские причины, отличные от рака (10 эндометриоз, 3 миомы, 4 кисты яичника, 1 гидросальпинкс), 16% имели рак (31 рак молочной железы, 3 рака яичников, 2 колоректального рака, 2 лимфомы Ходжкина, 1 рак вульвы и 1 рак шейки матки), 53% имели немедицинские причины и 23% имели другие причины (43 отсутствия сперматозоидов, 10 риска СГЯ, 4 инфекции и 1 лихорадка). Это распределение было различным среди пациентов, перенесших множественный забор ооцитов для витрификации яйцеклеток. В частности, у 9% были медицинские причины, отличные от рака (1 эндометриоз, 2 сниженных овариальных резерва), у 6% был рак (2 рака молочной железы), у 80% были немедицинские причины, а у 3% были другие причины (1 отсутствие извлеченной спермы). Ни один из пациентов, перенесших множественный забор яйцеклеток для витрификации яйцеклеток, не согрел эти яйцеклетки, в то время как 78 из 250 женщин, проходящих один цикл витрификации яйцеклеток, вернулись к использованию этих ооцитов(рисунок 3).

В таблице 1 обобщены данные 250 женщин, проходящих один цикл витрификации ооцитов, сгруппированные в соответствии с соответствующими причинами. Пациентки с медицинской причиной витрификации яйцеклеток и пациенты, перенесшие сохранение фертильности из-за рака, были моложе (средний возраст матери < 35 лет) и показали лучший овариальный резерв (более высокие AFCs), чем пациенты с немедицинскими или другими причинами. Однако средние показатели созревания (количество ооцитов MII/количество извлеченных КОК) были несколько ниже (72-73% против 77-79%), так что количество оципированных ооцитов в среднем было одинаковым в 4 группах (9-10 ооцитов). Важно отметить, что 9 из 40 онкологических пациенток (22,5%) прошли протокол стимуляции яичников случайным образом, потому что у них было ограниченное время до начала химио- или лучевой терапии. Интересно, что примерно половина пациентов с медицинскими причинами, отличные от рака (53%), и большинство пациентов с другими причинами витрификации яйцеклеток (76%) фактически вернулись для потепления. И наоборот, очень немногие пациенты, которые подверглись сохранению фертильности по поводу рака (17,5%) или немедицинских причин (13%), использовали свои витрифицированные ооциты для ЭКО. Также примечательно время, прошедшее между витрификацией и потеплением среди вернувшихся пациентов: в среднем 283 дня у пациентов с медицинскими причинами, отличными от рака, 132 дня у пациентов с другими причинами, 1264 дня у онкологических больных и 1547 дней у пациентов с немедицинскими причинами. Несмотря на все эти соответствующие различия, выживаемость была одинаковой (83-88%; в среднем 8-11 ооцитов нагревались, а 7-9 ооцитов выживали) между пациентами в 4 группах, тем самым подтверждая эффективность и безопасность протоколов витрификации и согревания ооцитов. Кроме того, выживаемость не зависит от витрификации и опыта оператора нагрева(рисунок 4A,B). В таблице 1 приведены показатели оплодотворения в 4 группах, которые составляют ~70%, за исключением пациентов с немедицинской причиной витрификации ооцитов (~80%). Однако эти данные несопоставимы из-за небольшого размера выборки и смещения фактора спермы на исход оплодотворения27.

Figure 1
Рисунок 1:Средняя конфигурация капель для криоконсервации ооцитов. Для постепенного выполнения уравновешивания ооциты сначала помещают в(А)каплю БС и смешивают с(В)каплей ЭС. После 3 мин инкубации(С)смешивают третью каплю раствораЭС, а яйцеклетки инкубируют в течение 6-9 мин. Сокращения: HEPES = 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота; BS = HEPES-буферизованный носитель; ES = решение для уравновешивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Нагрузка ооцитов на криоконсервационном устройстве. Ооциты помещаются на криодержевну в(А)одной маленькой капле ВС. (B)Пипетка стриппера смещается от ооцитов, и (C)избыток VS повторно аспирируется, чтобы оставить только тонкий слой вокруг каждой яйцеклетки. Аббревиатура: VS = раствор для витрификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Циклы витрификации ооцитов, выполненные в центре репродуктивной медицины GENERA Рима (2008-2020 гг.). За 12-летний период 250 пациентов прошли одно извлечение ооцитов для витрификации ооцитов, в то время как 35 подверглись множественным циклам извлечения ооцитов. На рисунке показаны врожденные причины витрификации ооцитов. Пациенты, возвращающиеся для согревания (n=78), относятся только к группе женщин, прошедших единый цикл витрификации ооцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Средняя выживаемость на когорту подогретых ооцитов. (A)Опыт операторов по витрификации и(B)обогрева. Каждый пациент включается только на первый цикл потепления. Статистически значимые различия оценивались с помощью U-тестаМанна-Уитни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Морфология ооцитов в начале и конце процедуры уравновешивания. Чтобы определить результат процедуры уравновешивания, может быть полезно аннотировать(А)морфологию ооцитов перед началом процедуры. (В)Резкое усадка ооцита наблюдается после первого воздействия раствора криопротектора. Процедура уравновешивания может считаться завершенной, когда(C)яйцеклетка восстановила свой первоначальный объем. Шкала = 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Причина витрификации ооцитов Медицинские, кроме рака (n=19) Рак (n=40) Немедицинский (n=133) Другое (n=58)
Возраст матери при извлечении ооцитов, среднее ±SD 33.6±6.4 лет 34.6±5.9 лет 37.0±3.4 лет 38.2±4.3 лет
Базальный ФСГ, средне±SD 7.5±4.2 МЕ/л 7.6±1.7 МЕ/л 7.8±4.1 МЕ/л 8,8±5,2 МЕ/л
AMH, среднее ±SD 1,8±1,7 нг/мл 1,9±0,2 нг/мл 2,2±2,4 нг/мл 3,0±2,5 нг/мл
AFC, среднее ±SD 12.7±5.0 13.3±7.0 11.6±6.1 10,7±6,7
ИМТ, средний±SD 20.1±1.5 21.8±1.6 20.2±3.1 22.9±3.6
Продолжительность стимуляции, средняя ±SD 10,0±1,5 9.6±1.7 9.9±2.1 10.3±2.1
9/40, 22.5%
Случайный старт
КОК, всего, средне±SD 239 551 1493 592
12.6±5.3 13.8±9.1 11.2±7.1 10.2±8.5
Ооциты МИИ, общие, средне±SD 167 400 1161 462
8.8±3.3 10,0±7,2 8.7±5.7 8,0±6,7
Скорость созревания, средне±SD 72.4±13.6% 72.1±19.6% 79.5±17.5% 77,4±22,2%
Пациенты, возвращающиеся для согревания, всего % пациентов, перенесших витрификацию 10/19, 52.6% 7/40, 17.5% 17/133, 12.8% 44/58, 75.9%
Дни между витрификацией и первым потеплением, среднее ±SD 283± 225 283 225 гг. 1264 ±764 гг. 1547±709 гг. 132 ±203 г.
Подогретые ооциты МИИ, общее среднее ±SD 82 66 191 409
8.2±2.8 9.4±4.8 11.2±5.8 9.3±7.2
Выжившие ооциты МИИ, общее среднее ±SD 73 55 160 345
7.3±3.3 7.9±4.0 9.4±4.8 7.8±6.9
Выживаемость, средняя ±SD 87.6±18.1% 83.2±1.7% 85.4%±14.5% 84.7±21.9%
Фактор спермы
Н, н, % 5/10, 50% 4/7, 57% 13/17, 76% 13/44, 29%
ММФ, н,% 3/10, 30% 3/7, 43% 3/17, 18% 17/44, 39%
ОАТ, н,% 2/10, 20% - 1/17, 6% 11/44, 25%
NOA, н,% - - - 3/44, 7%
Коэффициент оплодотворения, средне±SD 70.0±14.4% 70.0±17.0% 78.5±20.6% 71.0±24.3%

Таблица 1: Пациенты, проходящие единый цикл витрификации ооцитов. Сокращения: ФСГ = фолликулостимулирующий гормон; AMH = антимюллеров гормон; ИМТ = индекс массы тела; COC = кучевые ооцитарные комплексы; MII = метафаза-II; N = нормозооспермический; ММФ = умеренный мужской фактор (1-2 дефекта спермы); ОАТ = олигоастенотооспермический; NOA = необструктивная азооспермия (сперматозоиды были собраны путем извлечения сперматозоидов яичек).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Клинические соображения

Хотя новые стратегии, такие как криоконсервация ткани яичников и созревание in vitro, были изучены, витрификация ооцитов после COS является золотым стандартом для сохранения фертильности. В этом сценарии количество извлеченных и криоконсервированных ооцитов должно быть максимизировано в кратчайшие сроки, поскольку большинство больных раком могут извлечь выгоду исключительно из одного цикла яичников, прежде чем им придется начать лечение рака. Таким образом, правильный протокол стимуляции яичников имеет решающее значение для полного использования овариального резерва и увеличения кумулятивной вероятности будущего живорождений28,что сильно зависит от возраста матери при извлечении ооцитов. В связи с этим идеальный возраст для витрификации ооцитов с целью сохранения фертильности еще не предложен29лет, и консенсус требуется между 35годами 18 или 37годами 30,31. Однако сохранение фертильности должно быть доступно для всех пациентов, включая женщин старше 37 лет, при условии, что им предоставляются надлежащие консультации по показателям успеха в зависимости от их возраста.

Протокол и начальная доза медикаментов должны быть изложены по решению гинеколога и самое главное, исходя из времени, имеемого в наличии32,33. Начинать обычную стимуляцию в ранней фолликулярной фазе рекомендуется, когда время не является проблемой. Однако, при необходимости, возможен случайный подход, чтобы свести к минимуму задержки в начале срочного лечения рака / медицинскоголечения 34,35. Сообщалось, что развитие фолликулов является чрезвычайно динамичным процессом, поскольку в течение одного цикла яичников было описано несколько волн рекрутмента фолликулов. Хотя биологические механизмы, лежащие в основе этого явления, все еще нуждаются в раскрытии, компетентные ооциты могут быть извлечены и криоконсервированы независимо от фазы менструального цикла, в которой НАЧИНАЕТСЯ COS36.

В этом центре стимуляция яичников обычно выполняется с использованием протокола антагониста ГнРГ и 150-300 МЕ / день рекомбинантного ФСГ или человеческого менопаузального гонадотропина. В конкретных популяциях пациентов старше 35 лет, с дефицитом ЛГ или демонстрирующих субоптимальный ответ после стандартного COS, ЛГ может быть добавлен во время COS для увеличения набора и роста фолликулов за счет синергетического действия с инсулиноподобным фактором роста 116,37,38. Кроме того, протокол антагониста ГнРГ, за которым следует триггер агониста ГнРГ, как сообщается, является коротким, безопасным и очень удобным протоколом стимуляции для максимизации ответа яичников и минимизации риска для СГЯ39. Пациентам с эстроген-чувствительными заболеваниями, такими как рак молочной железы, гонадотропины, связанные с ингибиторами ароматазы, такими как летрозол, вводят20.

Фактически, недавний обзор показал, что летрозол включает в себя аналогичную реакцию яичников, как и обычная стимуляция, без осложнений с точки зрения врожденных дефектов, рецидива злокачественных новообразований и повышенной смертности40. Аналогичным образом, тамоксифен может быть использован во время COS в случае эстроген-чувствительных опухолей, которые, как и летрозол, не показали влияния на компетентность ооцитов41,42. Однако это необходимо подтвердить в более крупных исследованиях. В этом центре летрозол вводят с 1-го дня стимуляции до 7-го дня после извлечения ооцитов при эстрадиол-чувствительных опухолях. Следует учитывать риск развития СГЯ, который является наиболее важным осложнением COS, которое также еще больше задержит противоопухолевое лечение, особенно у молодых пациентов с высоким уровнем AFC. В этих случаях запуск овуляции агонистом ГнРГ вместо хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) оказался полезным. Другими проблемами, которые необходимо предотвратить, являются (i) тромбоэмболия, которая требует введения низкомолекулярного гепарина во время COS, и (ii) снижение реакции яичников после COS43. Чтобы компенсировать последнее, могут быть выполнены две последовательные стимуляции в одном цикле яичников. Этот новый нетрадиционный протокол COS, известный как DuoStim, влечет за собой стимуляцию фолликулярной и лютеиновой фазы и два извлечения ооцитов в короткие сроки (~ 15 дней) и должен быть исследован с целью сохранения фертильности в будущем44,45,46.

Другими возможными стратегиями сохранения фертильности у женщин являются: (i) криоконсервация ткани яичника, которая является единственным вариантом, доступным для препубертатных женщин. Эта возможность является многообещающей для восстановления репродуктивной и эндокринной активности и избежания задержки в начале лечения рака, поскольку гормональная стимуляция не требуется. Тем не менее, он все еще экспериментальный и требует лапароскопической хирургии с последующей трансплантацией, и существует риск ретрансляции ортотопического рака. ii) криоконсервация эмбрионов, которая предполагает более высокую выживаемость после потепления, но задерживает лечение рака и требует участия партнера или донора-мужчины, тем самым также ограничивая будущую репродуктивную автономиюженщины 47. Кроме того, в некоторых странах на него могут распространяться правовые ограничения. Учитывая эти ограничения, витрификация ооцитов считается наиболее устоявшимся и этически приемлемым подходом. В идеале все крупные больницы, где лечатся женщины, страдающие от рака в репродуктивном возрасте, должны предоставлять программы сохранения фертильности, и весь процесс должен быть бесплатным для этих пациентов, чтобы обеспечить равный доступ к этой программе. Тем не менее, криоконсервация ооцитов должна выполняться исключительно в центрах с достаточным опытом, чтобы не влиять на компетентность ооцитов в процессе48.

Критические шаги в протоколе витрификации и устранении неполадок

Витрификация представляет собой псевдофазный фазовый переход второго порядка (IUPAC Compendium of Chemical Terminology), который индуцирует стеклоподобное затвердевание внутри клеток, предотвращающее зародывание и рост кристаллов льда, основной причинный фактор повреждения клеток. Для достижения надлежащей витрификации требуется комбинация, по меньшей мере, двух CPA (обычно этиленгликоль и DMSO в качестве пронизывающих агентов и сахароза в качестве непроникающего агента) наряду с чрезвычайно высокой скоростью охлаждения (>20 000 °C/мин), достигаемой либо путем минимизации объемов нагрузки, либо путем прямого воздействия образцов на жидкий азот (открытые устройства). Поскольку ооциты являются крупнейшими клетками организма, они содержат наибольшее количество воды. Поэтому они более чувствительны к морозным травмам, чем эмбрионы. Во время криоконсервации ооцитов может произойти повреждение внутриклеточных органелл (например, цитоскелета или мейотического веретена), изменение проницаемости мембраны, затвердевание пеллюцидной зоны, активация ооцитов, изменение биохимических путей и, возможно, гибель клеток49. По этой причине для успешного сохранения жизнеспособности и компетентности в развитии необходимо обеспечить тонкий баланс между несколькими факторами. Для достижения последовательности в выживаемости после витрификации и достижения контрольных уровней все важнейшие этапы процедуры должны строго контролироваться.

CPA, осмоляльность клеток и скорость охлаждения

Чтобы увеличить вероятность витрификации, вязкость среды (и, следовательно, концентрация CPA) должна быть максимальной. Однако токсичность CPA всегда должна держаться под контролем50. С этой целью крайне важно минимизировать как время воздействия клеток на CPA, так и объемы нагрузки, и всегда работать при комнатной температуре (25-27 °C)51. Другие протоколы включают различные комбинации CPA и криодевиц и выполняются при 37 °C; однако они не были описаны здесь. Таким образом, примечания, репрезентативные результаты и разделы обсуждения этой рукописи относятся только к протоколу витрификации, подробно описанного здесь.

Во время криоконсервации ооциты подвергаются воздействию растворов CPA повышенной концентрации осмолита, способствующих обезвоживанию клеток и цитоплазматическому усадке. Во время согревания их подвергают воздействию растворов со сниженной концентрацией осмолита для восстановления цитоплазматического объема. Во время витрификации ооциты обезвоживаются, а непреднамеренные колебания объема клеток могут вызвать сильный осмотический шок, тем самым ставя под угрозу выживаемость и потенциал развития после потепления52. Нахождение оптимальной скорости охлаждения является ключевым аспектом для сохранения жизнеспособности клеток, поскольку оно влияет на осмоляльность53 и потенциал развития клеток54. Например, когда клетка подвергается воздействию скорости охлаждения медленнее, чем оптимальные, она может подвергаться интенсивному воздействию гипертонических состояний, приводящих к гибели клеток.

Для достижения оптимальной скорости охлаждения объемы нагрузки должны быть сведены к минимуму, RT должен контролироваться таким образом, чтобы не влиять на скорость процесса уравновешивания, а образцы должны непосредственно подвергаться воздействию жидкого азота. Одним из способов оценки того, когда было достигнуто равновесие, является аннотирование морфологии ооцита (в частности, ширина перивителлинового пространства и толщина пеллюцидной зоны) до начала процедуры(рисунок 5А). После начальной фазы уменьшения объема клеток(рисунок 5B)ожидается, что яйцеклетка восстановит свой первоначальный объем(рисунок 5C). Хотя правильный рН поддерживается во время обработки ооцитов в воздушной атмосфере из-за цвиттерионов, буферизующих растворы витрификации-нагревания, осмоляльность среды вместо этого особенно зависит от температуры53. Поэтому способ приготовления блюда имеет решающее значение для уменьшения любого возможного пагубного воздействия55.

Наложение масла, безусловно, имеет решающее значение для предотвращения испарения и предотвращения любого увеличения осмоляльности в среде ЭКО56. Однако его нельзя использовать при выполнении процедур витрификации и согревания. Поэтому для операторов важны некоторые советы: (i) подготовить капли как можно быстрее и непосредственно перед использованием; ii) рассмотреть большие объемы капель для сведения к минимуму сдвигов осмолярности (<30 мкл не рекомендуется); iii) когда условия окружающей среды не могут быть стандартизировано, может быть использована плита из 6 скважин, а стерильная вода или PBS могут быть добавлены в соседний резервуар для ограничения испарения; (iv) обращать внимание на дату первого вскрытия флакона со средой, так как осмоляльность может измениться, если флакон многократно открыть.

Согревание ооцитов и девитрификация ооцитов

Наиболее важным шагом, который может повлиять на постоянство в выживаемости, безусловно, является процесс потепления57. На этом этапе CPA постепенно удаляются из ооцита и разбавляются, чтобы предотвратить любой потенциальный цитотоксический эффект. Девитрификация, а именно образование ядер льда или кристаллов льда при нагревании остеклованного раствора или случайно при аудите, транспортировке или хранении в парах, является одним из основных рисков витрификации58,59,60. Поэтому, чтобы предотвратить девитрификацию и травмирование во время потепления, разница в температуре между первым и последним этапами процесса должна быть максимальной. Как показали Секи и Мазур57 в мышиных ооцитах, подверженных витрификации и прогреву с разной скоростью, чем быстрее потепление, тем выше выживаемость. Объем и температура ТС являются основными факторами для контроля: ТС следует правильно прогреть до 37 °C (не менее чем за 1 ч до процедуры), а стойку с жидким азотом заполнить до края ее вместимости и разместить как можно ближе к стереомикроскопу. Оператор должен быть как можно быстрее при переносе носителя криоконсервации с жидкого азота на ТС. Из-за высокой эффективности витрификации универсальный протокол потепления может использоваться независимо от протокола замораживания, что облегчает управление всеми циклами потепления, даже когда ооциты импортируются из другого центра ЭКО61.

Открытые устройства и риск загрязнения

Использование открытых систем и прямое воздействие жидкого азота на образцы необходимы для достижения чрезвычайно высоких скоростей охлаждения и нагрева, которые поддерживают эффективность этого протокола. Хотя витрификация является процедурой, которая представляет собой низкий риск перекрестного загрязнения, поскольку она включает в себя очень небольшие объемы и проводится после нескольких промывок образцов, которые разбавляют любую мнимую вирусную нагрузку, важно принять все меры предосторожности для повышения ее безопасности. Основываясь на современных данных, закрытые системы не предлагают конкурентоспособную альтернативу открытым системам, по крайней мере, для витрификации ооцитов62,63. Для поддержания эффективности систем открытой витрификации при минимизации рисков, связанных с непосредственным контактом с жидким азотом, последний может быть стерилизован ультрафиолетовым облучением64,65. В качестве альтернативы могут использоваться резервуары для хранения паров, которые, как известно, представляют меньший риск загрязнения, чем обычные, но доказали свою эффективность в сохранении жизнеспособности ооцитов66,67.

Важность постоянного мониторинга ключевых показателей эффективности программ витрификации ооцитов

В лаборатории ЭКО мониторинг ключевых показателей эффективности (KPI) имеет важное значение для мониторинга и постоянного улучшения результатов68. В целом, при определении KPI для процессов и процедур мониторинга следует учитывать три основные области: структуру, процесс и результат. Структурные KPI измеряют качество лаборатории ЭКО, излагая характеристики физических и человеческих ресурсов. Примером структурного KPI, относящегося к объекту в программе криоконсервации, может быть количество криотанков относительно общего числа процедур ВРТ, требующих криоконсервации, проводимой в данный период времени, или количество криотанков относительно общего квадратного метра криорума. Тем не менее, человеческие ресурсы и, в частности, навыки оператора имеют первостепенное значение при работе с деликатной процедурой, такой как витрификация. На самом деле, хотя и чрезвычайно эффективный, метод витрификации является сложной процедурой, включающей несколько процедурных этапов со строгими сроками, которые должны строго контролироваться: очень небольшое количество значительно вязкой среды должно управляться в течение очень короткого периода.

В процедуре не задействована морозильная машина с настройкой определенных параметров охлаждения; поэтому стандартизация деталей протокола и подготовка кадров имеют важное значение. Ручной процесс имеет строгие требования к навыкам, которые должны быть выполнены для получения последовательных и высоко воспроизводимых показателей выживаемости клеток. Каждому начинающему оператору должна быть организована специальная подготовка, чтобы они умели контролировать все критические точки процедуры, в частности, время воздействия образцов на CPA и обработку клеток в высоковязкой среде. Однако, по словам Дессоле и соавторов,69 кривая обучения для процедуры витрификации не должна быть такой длинной даже для младших эмбриологов, поскольку достижение мастерства в основном ограничено проблемами манипуляции. После того, как опыт в области витрификации был достигнут, производительность каждого отдельного оператора должна быть точно и регулярно проверяться с использованием KPI для регулярной оценки поддержания значений компетентности, установленных в консенсусных документах70. Кроме того, доверие/компетентность оператора должны быть сопоставимы, чтобы не влиять на результаты.

KPI процесса измеряют, насколько хорошо работает лаборатория ЭКО. Протоколы и процедуры витрификации и согревания должны проводиться своевременно, а колебания условий культивирования должны быть сведены к минимуму путем уделения особого внимания поддержанию адекватной осмолярности и температуры для сохранения не только компетентности в развитии ооцитов, но и безопасности оператора при обращении с жидким азотом. Примерами КПХ процессов являются процент травм лабораторного персонала при обращении с жидким азотом на количество процедур ЭКО в год, процент гамет / эмбрионов, потерянных / поврежденных во время процедур витрификации / согревания, и аудиты на количество процедур в год.

Наконец, KPI результатов измеряют эффективность лаборатории ЭКО и обычно относятся к выживаемости яйцеклеток после войны, определяемой как доля морфологически интактных ооцитов во время ИКСИ (в случае витрификации ооцитов значение компетентности должно быть >50%, а эталонное значение составляет 75%)70. Кроме того, показатели оплодотворения (<10% ниже, чем свежие ооциты, осемененные в центре из сопоставимой популяции пациентов), развития эмбрионов (такой же, как у сопоставимой популяции пациентов, использующих свежие ооциты) и имплантации (<10-30% ниже, чем сопоставимая популяция свежих эмбрионов в центре) применимы в качестве результатовых KPI для витрифицированных ооцитов70. Тем не менее, клинические исходы в большей области зависят от специфических для пары характеристик, чем от ошибочных клинических процедур71,72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Никакой

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
  2. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  3. Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
  4. Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
  5. Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
  6. Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
  7. Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
  8. Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
  9. Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
  10. Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1 (2016).
  11. Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
  12. Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
  13. Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, Suppl 6 160-170 (2013).
  14. Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
  15. Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
  16. Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94 (2019).
  17. Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327 (2018).
  18. Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
  19. Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
  20. Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049 (2019).
  21. Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
  22. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
  23. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  24. Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
  25. ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025 (2019).
  26. Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
  27. Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
  28. Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
  29. Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
  30. Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
  31. Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
  32. Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
  33. Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
  34. Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
  35. Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
  36. Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
  37. Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
  38. Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
  39. Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
  40. Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
  41. Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
  42. Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
  43. Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
  44. Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
  45. Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317 (2018).
  46. Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
  47. Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
  48. Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
  49. Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
  50. Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
  51. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reproductive Biomedicine Online. 9 (6), 680-691 (2004).
  52. Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268 (2014).
  53. Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
  54. Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
  55. Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
  56. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  57. Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
  58. Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
  59. Jin, B., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biololgy of Reproduction. 82 (2), 444-450 (2010).
  60. Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
  61. Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
  62. Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
  63. Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123 (2018).
  64. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  65. Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
  66. Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
  67. Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
  68. Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
  69. Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
  70. Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
  71. Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
  72. Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).

Tags

Биология Выпуск 175 Сохранение фертильности стимуляция яичников метафаза II яйцеклетки витрификация потепление Ключевые показатели эффективности (KPI)
Сохранение фертильности посредством витрификации ооцитов: клинические и лабораторные перспективы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggiulli, R., Vaiarelli, A.,… More

Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter