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Preservação da Fertilidade Através da Vitrificação de Oócitos: Perspectivas Clínicas e Laboratoriais

Published: September 16, 2021 doi: 10.3791/61963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Summary

A criopreservação oócito é reconhecida por várias sociedades científicas internacionais como o padrão ouro para a preservação da fertilidade em mulheres pós-púbertas. Estratégias clínicas e laboratoriais adequadas garantem a máxima eficácia, eficiência e segurança dos tratamentos de preservação da fertilidade.

Abstract

A preservação da fertilidade feminina é crucial em um sistema de saúde multifuncional que cuida da qualidade de vida futura das pacientes. A criopreservação de oócito é reconhecida por várias sociedades científicas internacionais como o padrão ouro para a preservação da fertilidade em mulheres pós-púbertas, tanto para indicações médicas quanto não médicas. As principais indicações médicas são doenças oncológicas, doenças ginecológicas como endometriose grave, doenças sistêmicas que comprometem a reserva ovariana e condições genéticas envolvendo menopausa prematura. Este artigo descreve todo o trabalho clínico e laboratorial de um tratamento de preservação da fertilidade, delineando recomendações para aconselhamento objetivo e baseado em evidências. Além disso, foca-se na eficácia do procedimento e descreve as estratégias mais adequadas para explorar plenamente a reserva ovariana e maximizar o número de oócitos recuperados no menor tempo possível. A avaliação da reserva ovariana, a definição de um protocolo ideal de estimulação, bem como os procedimentos de recuperação de oócitos, desnudação e vitrificação foram detalhados, juntamente com abordagens para maximizar sua eficácia, eficiência e segurança.

Introduction

O desenvolvimento e implementação de um programa eficiente de criopreservação para oócitos humanos tem sido um avanço significativo na medicina reprodutiva. De acordo com evidências recentes, a vitrificação é a estratégia mais eficaz para criopreservar os oócitos de metafase II (MII), pois resulta em taxas de sobrevivência estatisticamente mais elevadas em comparação com o congelamento lento, independentemente da população do paciente (pacientes inférteis ou programa de doação de oócitos)1,2,3. As realizações notáveis da vitrificação oócica levaram os Comitês de Prática da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) e da Sociedade de Tecnologia Reprodutiva Assistida (SART) a pronunciar essa técnica como a mais eficaz para a preservação da fertilidade eletiva em mulheres pós-aubertas, tanto para indicações médicas quanto não médicas4,5,6. As indicações médicas para preservação da fertilidade incluem (i) câncer e doenças autoimunes que requerem terapias7, como radioterapia, quimioterapia citotóxica e terapia endócrina (cujo efeito prejudicial na reserva ovariana está associado à idade materna, bem como tipo e dose do tratamento); (ii) doenças ovarianas que requerem cirurgia repetida ou radical (como a endometriose)8; e (iii) condições genéticas (por exemplo, X-frágil) ou insuficiência ovariana prematura. Além disso, a preservação da fertilidade tornou-se uma opção valiosa para todas as mulheres que não realizaram seu objetivo parental por razões não médicas (também conhecidas como congelamento social).

Independentemente da indicação para a preservação da fertilidade e de acordo com as principais diretrizes internacionais sobre preservação da fertilidade, todos os pacientes dispostos a vitrifar seus oócitos devem receber aconselhamento adequado para serem informados sobre sua chance realista de sucesso, os custos, riscos e limitações do procedimento9,10,11,12,13. Mais importante, deve-se deixar claro que vitrificar uma coorte de oócitos MII não garante uma gravidez, mas que oferece uma maior chance de sucesso para o futuro tratamento de fertilização in vitro (FIV), se necessário14. Nesse sentido, a idade da mulher no momento da vitrificação do oócito é certamente o fator limitante mais importante15, pois a idade materna avançada (AMA; >35 anos) é a principal causa da infertilidade feminina16. Além de uma redução progressiva da reserva ovariana, a AMA está associada a um comprometimento da competência do oócito devido a vias fisiológicas defeituosas, como metabolismo, regulação epigenética, pontos de verificação do ciclo celular e segregação média17. Portanto, o número razoável de ovos para vitrify depende principalmente da idade materna. Em mulheres com menos de 36 anos, pelo menos 8-10 oócitos MII18 são necessários para maximizar a chance de sucesso. Em geral, quanto maior o número de oócitos vitrificados, maior é a probabilidade de sucesso. Portanto, a adaptação da estimulação ovariana de acordo com marcadores de reserva ovariana, como os níveis de hormônio anti-Mülleriano (AMH) ou a contagem de folículos antral (AFC) é crucial para explorar totalmente a reserva ovariana no menor tempo possível.

A segurança de todo o procedimento é a outra questão fundamental na inscrição de pacientes para preservação da fertilidade. Os médicos devem empregar as melhores estratégias para minimizar os riscos e prevenir (i)síndrome de hiperestimulação ovariana (OHSS) usando abordagens seguras, como o protocolo antagonista do hormônio liberador de gonadotrophin (GnRH), seguido por um agonista gnrh gatilho19 e (ii) o remoto, ainda possível, riscos de hemorragia peritoneal, lesão nas estruturas pélvicas (ureter, intestino, apêndice, nervos) ou infecção pélvica durante a recuperação do oócito. Por fim, (iii) os regimes tradicionais de estimulação estão associados ao estradiol soro suprafisiológico e, portanto, não são recomendados em doenças sensíveis ao estrogênio, como o câncer de mama. Protocolos envolvendo inibidores de aromatase (como letrozol ou tamoxifen) são mais adequados nesses casos20,21. No ambiente laboratorial, o protocolo mais difundido para vitrificação de oócitos ainda é o primeiro descrito por Kuwayama e seus colegas2,23, que consiste em um procedimento passo a passo envolvendo a adição gradual de crioprotetores (CPAs). Na primeira fase (equilíbrio/desidratação), os oócitos são expostos em uma solução CPA contendo 7,5% v/v de etileno glicol e 7,5% v/v de sulfóxido de dimetil (DMSO), enquanto na segunda fase, osócitos são movidos para uma solução de vitrificação com 15% v/v de etileno glicol e 15% v/v DMSO, mais 0,5 mol/L sacarose. Após uma breve incubação no meio da vitrificação, os oócitos podem ser colocados em criodes específicos, abertos e finalmente mergulhados em nitrogênio líquido a -196 °C para serem armazenados até o uso.

Aqui, todo o trabalho clínico e laboratorial de um tratamento de preservação da fertilidade foi descrito por (i) delinear recomendações para aconselhamento objetivo e baseado em evidências, (ii) com foco no custo-efetividade do procedimento, e (iii) descrever as estratégias mais adequadas para explorar plenamente a reserva ovariana e maximizar o número de oócitos recuperados no menor tempo possível. A avaliação da reserva ovariana, a definição de um protocolo ideal de estimulação, bem como os procedimentos de recuperação de oócitos, desnudação e vitrificação serão detalhados, juntamente com abordagens para maximizar sua eficácia, eficiência e segurança. Como existem outros protocolos ou adaptações desse protocolo na literatura, os resultados representativos e as seções de discussão deste manuscrito só se aplicam a este procedimento.

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Protocol

1. Work-up e aconselhamento clínico

NOTA: No caso de pacientes que necessitam de preservação da fertilidade por razões oncológicas, certifique-se de que não há lista de espera para consulta de agendamento, e a consulta é fornecida o mais rápido possível.

  1. Examine o histórico médico e a documentação prévia e avalie o estado geral de saúde do paciente.
  2. Registo todas as informações (incluindo a aprovação do oncologista para se submeter à estimulação ovariana em caso de pacientes com câncer) em um banco de dados relacional.
  3. Fornecer ao paciente aconselhamento específico sobre a viabilidade do procedimento. Explique as etapas do procedimento (estimulação ovariana, recuperação de oócitos, vitrificação de oócitos), e informe-a sobre as chances realistas de sucesso (principalmente dependentes da idade materna e do número esperado de oócitos MII no momento da recuperação do oócito), bem como o custo e limitações do procedimento.
  4. Realizar ultrassom transvaginal para obter informações sobre a reserva ovariana (ou seja, AFC) e avaliar a acessibilidade dos ovários para coleta de óvulos.
  5. Solicite exames de sangue para avaliar o grupo sanguíneo e o fator Rhesus, triagem de coagulação (hemograma, protrombina, tromboplastina, fibrinogênio, proteína C, proteína S, anti-trombina III, homocisteína) e doenças infecciosas (Hepatite B, Hepatite C, HIV, Laboratório de Pesquisa de Doenças Venéreas/Treponema pallidum Hemagglutination Assay).
    NOTA: No caso de pacientes que acessam um programa de preservação da fertilidade por razões médicas não urgentes, uma avaliação mais abrangente pode incluir hormônio estimulante do folículo basal (FSH), hormônio luteinizador (LH), estradiol, AMH, exame de mama, teste papanicolaou, triagem genética de coagulação (fator V de Leiden e protrombina) e rastreamento de TOCHA (toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus).
  6. Solicite uma avaliação cardiológica (eletrocardiograma).
  7. Recomendo aconselhamento psicológico.

2. Protocolos controlados de estimulação ovariana para preservação da fertilidade

NOTA: Quando o tempo disponível antes de iniciar o tratamento do câncer é limitado, o protocolo de início aleatório (ou seja, iniciar a estimulação ovariana a qualquer momento durante o ciclo menstrual) é recomendado para a estimulação ovariana em pacientes oncológicos que são candidatos à preservação da fertilidade. Em um programa de preservação da fertilidade por razões médicas ou sociais não urgentes, a estimulação convencional a partir da fase folicular inicial é preferível, e a estimulação ovariana é iniciada com base no ciclo menstrual. As abordagens de estimulação ovariana controlada (COS) devem ser realizadas de acordo com as recentes diretrizes24da Sociedade Europeia de Reprodução e Embriologia Humana (ESHRE).

  1. Alfaiate cos de acordo com as características do paciente e marcadores de reserva ovariana, principalmente idade materna, ESF, AMH e AFC.
  2. Inicie o COS no dia 5 do ciclo menstrual usando FSH recombinante ou urinário com uma dose fixa de 150-300 UI/dia (protocolo antagonista).
    NOTA: Em uma população específica de pacientes com deficiência de LH ou resposta abaixo do oblícita, o LH adicional 75/150 UI/dia pode ser administrado de acordo com a resposta ovariana, os níveis de LH e o julgamento do ginecologista.
  3. Em pacientes com doenças sensíveis ao estrogênio, incluem gonadotropinas associadas a inibidores de aromatase (letrozole) desde o primeiro dia de estimulação até o dia 7 após a recuperação do oócito.
  4. Administre uma dose fixa de gonadotropinas por 4 dias.
  5. Monitore o crescimento folicular no dia 5 e depois a cada 2-3 dias; eventualmente, ajuste a dosagem de gonadotropina.
  6. Uma vez que pelo menos 3 folículos atinjam 17-18 mm de diâmetro, administre o gatilho para maturação final do oócito com um único bolus subcutâneo de agonista GnRH na dose de 0,5 mL.

3. Recuperação de oócito

  1. Preparando-se para a recuperação de oócitos
    1. Para materiais necessários, consulte a Tabela de Materiais, e mantenha pronto calçados e roupas de laboratório, máscara facial cirúrgica, capa de cabelo, luvas cirúrgicas, um marcador permanente não tóxico, pinças, gazes pequenas estéreis, estéril ou reutilizável, equipamento de cirurgia vaginal e desinfetante superficial. Garantir a disponibilidade de equipamentos de ressuscitação, medicamentos anestésicos para reversão, um kit preparado para o tratamento de choque anafilático e oxigênio na sala de cirurgia.
    2. Realizar o procedimento de recuperação de oócitos de acordo com as recomendações do Grupo de Trabalho ESHRE sobre Ultrassom em tecnologias de reprodução assistida (ART)25.
      1. Administre sedação ou anestesia geral, e antibióticos para profilaxia.
        NOTA: Neste protocolo, a sedação profunda foi alcançada através da administração do propofol (cuja dosagem é ajustada de acordo com o peso do paciente) e 50-100 μg de fentanil, 1000 mg de paracetamol e ventilação de máscara assistida com oxigênio.
      2. Realize a recuperação de oócitos usando uma unidade de aspiração composta por uma bomba de vácuo, um tubo de coleta conectado a uma agulha de 17 G single-lumen, e um tubo coletor de oócito. Durante a coleta, não exceda uma pressão de ~120 mmHg para evitar o risco de danos aos oócitos, como tirar as células cumulus ou fraturar a zona pellucida.
      3. Calibrar a temperatura da superfície de trabalho para garantir 37 °C na mídia cultural. Durante todo o procedimento, minimize a exposição ao oócito até mesmo a temperatura transitória que pode afetar sua competência de desenvolvimento.
      4. Ao final da recuperação do oócito, observe o paciente por 3-4 horas antes da alta.
  2. Operação teatro
    1. Antes de entrar na sala de cirurgia, identifique o paciente e confirme o tempo do gatilho de ovulação.
    2. Que o paciente deite sobre a mesa de cirurgia em uma posição ginecológica.
    3. Limpe a vagina/colo do útero antes da recuperação do oócito para minimizar a contaminação bacteriana.
    4. Realizar um ultrassom transvaginal preliminar para avaliar a posição dos ovários e as relações anatômicas com os diversos órgãos e vasos sanguíneos.
    5. Sob orientação de ultrassom, insira uma agulha de lúmen único através da parede vaginal e em um folículo ovariano, tomando cuidado para não ferir os órgãos ou vasos sanguíneos localizados entre a parede vaginal e o ovário.
    6. Comece a aspiração do folículo mais próximo e passando para os mais distais.
    7. Puna todos os folículos de diâmetro maior que 11-12 mm, realizando "movimentos de torção" da agulha para aspirar todo o fluido folicular, que é então liberado em um tubo estéril (fundo redondo de 14 mL) pré-aquecido no aquecedor de bloco da sala de operação.
    8. Imediatamente após a recuperação, veda e rotule o tubo com detalhes da identidade do paciente.
    9. Certifique-se de que o enfermeiro traga o tubo para o laboratório, onde é imediatamente examinado para a presença de complexos cumulus-oocyte (COCs).
    10. Instrua os embriologistas a informar o médico sobre o número total de COCs recuperados.
    11. Uma vez que o procedimento esteja completo para o primeiro ovário, lave a agulha com meio limpo e proceda com o segundo ovário usando o mesmo procedimento.
    12. Após a recuperação do oócito, avalie qualquer sangramento dos ovários ou vasos sanguíneos do paramétrio e fluido livre na bolsa de Douglas.
      NOTA: Para automatizar e melhorar a eficácia da rastreabilidade de gameto e embrião no nível clínico, foi implementado um sistema eletrônico de testemunha (EWS) no centro26. No entanto, este protocolo não menciona o EWS, para garantir a reprodutibilidade do protocolo em qualquer laboratório de FIV. Ainda assim, considere que todas as etapas do procedimento requerem um segundo operador (ou seja, uma testemunha) para garantir a rastreabilidade de gamete e embrião.

4. Laboratório de FIV

  1. Um dia antes do procedimento de recuperação de oócitos
    1. Preparar tubos de coleta de oócito (consulte a Tabela de Materiais).
      1. Dispense 1 mL de meio de FIV (consulte a Tabela de Materiais) em cada tubo de coleta de oócito (fundo redondo, 5 mL), e cubra com 0,2 mL de óleo mineral (consulte a Tabela de Materiais) para a cultura do embrião.
        NOTA: O número de tubos será definido de acordo com o número de folículos esperados para serem recuperados. Cada tubo pode conter até 4 COCs.
    2. Sele os tubos com a tampa (primeiro estalo). Rotule os tubos com detalhes do tipo de média e data de preparação. Incubar os tubos durante a noite a 37 °C em uma atmosfera controlada (6% CO2, 5% 02).
  2. No dia da recuperação do oócito
    1. Pré-aquecimento dos suprimentos plásticos a 37 °C (pratos de cultura estéril e pipetas Pasteur).
    2. Peça aos pacientes que confirmem sua identidade (nome completo e data de nascimento) e o tempo de ovulação. Anote na folha laboratorial que o procedimento de identificação (RG) foi realizado, e que o tempo do gatilho de ovulação foi confirmado.
    3. Tire os tubos de coleta de oócito da incubadora (logo antes do procedimento começar) e empurre a tampa para garantir o fechamento apertado. Rotule os tubos de coleta de oócitos com as informações do paciente. Coloque os tubos de coleta de oócito no aquecedor de bloco a 37 °C.
    4. Examine o fluido folicular nos pratos de cultura estéril pré-armados e identifique COCs. Uma vez identificados um ou mais COCs, enxágue-os duas vezes em duas gotas de média para remover o fluido folicular e a contaminação sanguínea.
    5. Transfira os COCs para os tubos de coleta de oócitos e anote o número de COCs no tubo. Solte as tampas dos tubos médios e incuba-as prontamente a 37 °C em uma atmosfera de 6% de CO2, 5% O2.
    6. Repita as etapas 7 a 9 de acordo com o número de oócitos recuperados. Atualize a folha de laboratório.
      NOTA: Certifique-se de que uma testemunha verifica se todos os blocos de aquecimento do tubo (incluindo os da sala de cirurgia) estão vazios e assina o fechamento do procedimento na folha de laboratório.
    7. Limpe a etapa de trabalho após a conclusão do procedimento.

5. Desnudação de oócito

  1. Pré-aquecimento 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES)-médio tamponado e hialuronidase (consulte a Tabela de Materiais) a 37 °C pelo menos 1 h antes de começar.
  2. Prepare uma placa de FIV de 4 poços (consulte a Tabela de Materiais) com 0,6 mL/poço de meio pré-equipado com hepes tampão (suplementada com 5% de albumina de soro humano [HSA]) coberta com 0,3 mL de óleo mineral para cultura de embriões, e quente a 37 °C por pelo menos 30 min.
  3. Rotule a placa de desnudação de oócito com detalhes da identidade do paciente.
  4. Imediatamente antes de iniciar o procedimento, adicione hialuronidase ao primeiro poço para obter uma concentração final de cerca de 20 UI/mL.
  5. Coloque um número limitado de COCs (até 6) no primeiro poço contendo a enzima para dispersar as células cumulus.
  6. Para melhorar a remoção enzimática das células cumulus e corona, realize a desmontagem de células cumulus ao pipetar os oócitos repetidamente através de uma pipeta Pasteur com um diâmetro interno de aproximadamente 250 μm por até 30 s. Após a dissociação celular inicial, transfira os oócitos para o segundo poço contendo apenas meio tamponado com HEPES, tomando o cuidado de transportar uma quantidade mínima da enzima.
  7. Realize uma desnudação adicional para remover as células corona usando pipetas desnuding com diâmetros internos decrescentes (170-145 μm). Utilize diâmetros inferiores (135μm) somente se estritamente necessário.
  8. Lave cuidadosamente os oócitos desnudos para lavar a enzima.
  9. Após a desnudação, examine os oócitos sob um microscópio invertido para avaliar sua integridade e estágio de maturação. Separar os oócitos MII dos imaturos (vesícula germinal e metafásico-I).
  10. Mova os oócitos MII para a área de vitrificação para realizar imediatamente a criopreservação. Atualize a folha de laboratório.

6. Vitrificação oócica

NOTA: Realize a vitrificação oócito preferencialmente dentro de 38 h de recuperação de oócito e imediatamente após a desnudação. O procedimento de vitrificação descrito aqui deve ser realizado à temperatura ambiente (RT) e usando uma pipeta stripper com diâmetro interno de 170 μm para não danificar oócitos durante a manipulação.

  1. Aproximadamente 30 minutos antes do procedimento, leve a solução de equilíbrio (ES) e a solução de vitrificação (VS) para RT (25-27 °C).
  2. Rotule corretamente os criodevices com o nome e identificação do paciente, identificação do tratamento, data de congelamento, número de oócitos e criobarcódigo.
  3. Encha um rack de resfriamento descartável até o topo com nitrogênio líquido fresco e inicie o processo de esterilização.
  4. Rotule a placa de vitrificação (consulte a Tabela de Materiais) com o nome e identificação do paciente. Peça a uma testemunha que verifique a identificação correta dos criodevices.
  5. Inverta cuidadosamente cada frasco duas vezes para misturar seu conteúdo antes de usar, e prepare a tampa de uma placa de Petri de 6 mm com uma gota de 30 μL de meio tamponado hepes (com 5% HSA) e uma gota adjacente de 30 μL de ES.
    NOTA: Coloque as gotas pouco antes de usar para limitar a evaporação média.
  6. Utilizando uma pipeta stripper de 170 μm de diâmetro, coloque os oócitos (até 9) na primeira gota com o menor volume possível de meio. Utilizando a pipeta de stripper, crie uma ponte de meio entre a gota n.1 e n.2 para obter um aumento gradual na concentração dos CPAs (Figura 1A).
  7. Incubar os oócitos na primeira queda por 3 minutos. Adicione uma terceira gota de 30 μL de ES (n.3). Após 3 min, transfira os oócitos para a segunda gota do ES, e crie uma ponte média entre as gotas n.3 e n.2(Figura 1B). Incubar os oócitos em queda n.3 por 3 min.
  8. Durante a incubação, adicione uma gota de 30 μL de ES para cada criodevice que será usado (se 9 oócitos forem criopreservados, coloque 3 gotas de ES com 3 oócitos em cada gota de ES). Mova os oócitos para uma solução ES pura, e deixe-os por 6-9 min (até recuperarem seu tamanho inicial após o encolhimento)(Figura 1C).
  9. Prepare um prato de poço central (60 x 15 mm) com 1 mL de VS. No final dos primeiros 6 minutos, transfira os oócitos para serem criopreservados na solução VS, liberando o mínimo possível. Deixe os oócitos em VS por 1 min, e lave-os cuidadosamente movendo-os da parte inferior para a parte superior do prato para remover o excesso de ES.
  10. Aproximadamente 10 s antes do fim do minuto de incubação, coloque o criodevice sob o microscópio, e ajuste o foco na marca preta (ou seja, a ponta do criodevice). Coloque os oócitos no criodevice ao lado da marca preta com a quantidade mínima de VS (Figura 2A).
  11. Mova a pipeta de stripper para longe dos oócitos e remova o excesso de meio VS(Figura 2B) para que os oócitos permaneçam cobertos por uma fina camada de meio(Figura 2C).
  12. Mergulhe rapidamente o criodevice em nitrogênio líquido, sacudindo-o rapidamente para remover bolhas de ar de sua superfície. Segure a tampa protetora do criodevice com pinças e encha-a com nitrogênio líquido; em seguida, insira o criodevice nele enquanto mantém as tiras de propileno em nitrogênio líquido.
  13. Armazene o criodevice em um visiotube previamente rotulado com as informações do paciente. Atualize a folha de laboratório.

7. Aquecimento do oócito

  1. Aproximadamente 30 minutos antes do procedimento, aqueça a solução de descongelamento (TS), a solução de diluição (DS) e a solução de lavagem (WS) para RT (25-27 °C). Inverta cuidadosamente cada frasco duas vezes para misturar seu conteúdo. Coloque 1 mL de TS em uma placa de Petri de poço central, e aqueça-a a 37 °C por pelo menos 1 h antes de iniciar o procedimento.
  2. Rotule todos os suprimentos plásticos com o nome e identificada do paciente e o tipo de solução. Peça a uma testemunha para confirmar as informações do paciente sobre o dispositivo criodevice.
  3. Para cada criodevice a ser aquecido, prepare uma placa de 6 poços com 200 μL de DS no primeiro poço e uma quantidade igual de WS no segundo e terceiro (chamado WS1 e WS2, respectivamente). Adicione salina tamponada de fosfato (PBS) ou água estéril na área fora dos poços para evitar a evaporação.
  4. Retire o prato TS da incubadora e coloque-o sob o microscópio. Ajuste o foco do microscópio para o centro da placa de Petri.
  5. Torça cuidadosamente e remova a tampa protetora do criodevice, mantendo as tiras de propileno em nitrogênio líquido. Transfira o criodevice de nitrogênio líquido para o TS o mais rápido possível para evitar o risco de desvitarificação e iniciar a contagem regressiva (1 min).
  6. Localize os oócitos focando na ponta do criodevice (ou seja, a marca preta). Usando uma pipeta de stripper, solte os oócitos do criodevice.
    NOTA: Tente não aspirar os oócitos do criodevice; liberte suavemente alguns meios de comunicação sobre eles até que eles se movam para o TS.
  7. Usando uma pipeta stripper de 170 μm de diâmetro, transfira os oócitos para DS com uma pequena quantidade de TS (para criar um gradiente), e deixe-os no DS por 3 minutos. Mova os oócitos para ws1 da mesma forma, e deixe-os por 5 minutos. Finalmente, transfira os oócitos para ws2 por 1 min.
  8. Transfira os oócitos para um meio de cultura de FIV pré-aquilibrado apropriado e incuba-os por 1h antes de prosseguir com a injeção intracytoplasmática de espermatozoides (ICSI). Atualize a folha de laboratório.

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Representative Results

Visão geral do programa de preservação da fertilidade no centro

Durante um período de 12 anos (2008-2020), 285 mulheres foram submetidas a pelo menos uma recuperação de oócitos, implicando a vitrificação de toda a coorte de ovos maduros coletados. A maioria dessas mulheres (n=250) foi submetida a uma única recuperação, e 35 foram submetidas a múltiplas recuperações. As razões para a recuperação de oócitos para vitrificação de óvulos são resumidas em 4 categorias: médica (exceto câncer), câncer, não médica e outras. Entre as 250 mulheres submetidas a uma única recuperação de oócito para vitrificação de óvulos, 8% tinham razões médicas além do câncer (10 endometriose, 3 mioma, 4 cistos ovarianos, 1 hidrosalpinx), 16% tinham câncer (31 câncer de mama, 3 câncer de ovário, 2 câncer colorretal, 2 linfoma de Hodgkin, 1 câncer de vulvar e 1 câncer cervical), 53% tinham razões não médicas e 23% tinham outras razões (43 ausência de esperma recuperado, 10 de risco para SSS, 4 infecções e 1 febre). Essa distribuição foi diferente entre os pacientes submetidos a múltiplas recuperações de oócitos para vitrificação de óvulos. Especificamente, 9% tinham razões médicas além do câncer (1 endometriose, 2 redução da reserva ovariana), 6% tinham câncer (2 câncer de mama), 80% tinham razões não médicas e 3% tinham outras razões (1 ausência de esperma recuperado). Nenhum dos pacientes submetidos a múltiplas recuperações de oócitos para vitrificação de óvulos aqueceu esses ovos, enquanto 78 das 250 mulheres submetidas a um único ciclo de vitrificação de óvulos voltaram a usar esses oócitos(Figura 3).

A Tabela 1 resume os dados das 250 mulheres submetidas a um único ciclo de vitrificação oócida agrupados de acordo com as razões relacionadas. Os pacientes com uma razão médica para a vitrificação dos óvulos e os pacientes submetidos à preservação da fertilidade por causa do câncer eram mais jovens (idade materna média < 35 anos) e apresentaram melhor reserva ovariana (AFCs mais altas) do que os pacientes com razões não médicas ou outras. No entanto, as taxas médias de maturação (número de oócitos MII/número de COCs recuperados) foram ligeiramente menores (72-73% versus 77-79%), de modo que o número de oócitos vitrificados em média foi semelhante nos 4 grupos (9-10 oócitos). É importante ressaltar que 9 em cada 40 pacientes oncológicos (22,5%) foram submetidos a um protocolo de estimulação ovariana de início aleatório porque tinham pouco tempo antes de iniciar a quimioterapia ou radioterapia. É interessante que aproximadamente metade dos pacientes com razões médicas que não sejam câncer (53%) e a maioria dos pacientes com outras razões para a vitrificação dos óvulos (76%) realmente retornaram para o aquecimento. Por outro lado, pouquíssimos pacientes submetidos à preservação da fertilidade para câncer (17,5%) ou razões não médicas (13%) usaram seus oócitos vitrificados para FIV. Destaca-se também o tempo entre vitrificação e aquecimento entre os pacientes que retornaram: em média, 283 dias em pacientes com motivos médicos diferentes do câncer, 132 dias em pacientes com outros motivos, 1264 dias em pacientes oncológicos e 1547 dias em pacientes com razões não médicas. Independentemente de todas essas diferenças relevantes, a taxa de sobrevivência foi semelhante (83-88%; em média, 8-11 oócitos foram aquecidos, e 7-9 oócitos sobreviveram) entre os pacientes dos 4 grupos, confirmando assim a eficácia e a segurança dos protocolos de vitrificação e aquecimento dos oócitos. Além disso, a taxa de sobrevivência é independente da vitrificação e da experiência do operador de aquecimento (Figura 4A,B). A Tabela 1 mostra as taxas de fertilização nos 4 grupos, que são ~70%, exceto para os pacientes com razões não médicas para vitrificação oócicica (~80%). No entanto, esses dados não são comparáveis devido a um pequeno tamanho amostral e ao viés do fator espermatozoide no resultado da fertilização27.

Figure 1
Figura 1: Configuração de gotícula média para criopreservação oócica. Para realizar gradualmente o equilíbrio, os oócitos são colocados pela primeira vez em uma queda de BS e misturados com (B) uma gota de ES. Após 3 min de incubação,(C) uma terceira gota de solução ES émisturada, e os oócitos são incubados por 6-9 min. Abreviaturas: HEPES = 4-(2-hidroxitila)-1-piperazineethanethanesulfonic ácido; BS = meio tamponado com HEPES; ES = solução de equilíbrio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Carregamento de oócito no dispositivo criopreservador. Os oócitos são colocados no criodevice em (A) uma única pequena gota de VS. (B) A pipeta de stripper é deslocada para longe dos oócitos, e(C) o excesso de VS é re-aspirado para deixar apenas uma camada fina em torno de cada oócito. Abreviação: VS = solução de vitrificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Ciclos de vitrificação oócito realizados no Centro GENERA de Medicina Reprodutiva de Roma (anos 2008-2020). Durante o período de 12 anos, 250 pacientes foram submetidos a uma única recuperação de oócito para vitrificação oócicica, enquanto 35 foram submetidos a ciclos múltiplos de recuperação de oócitos. As razões inerentes à vitrificação do oócito são mostradas na figura. Os pacientes que retornam para o aquecimento (n=78) pertencem apenas ao grupo de mulheres que se submeteram a um único ciclo de vitrificação oócida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Taxa média de sobrevivência por coorte de oócitos aquecidos. (A) Vitrificação e (B) aquecimento da experiência dos operadores. Cada paciente está incluído apenas para o primeiro ciclo de aquecimento. Diferenças estatisticamente significativas foram avaliadas por meio do teste Ude Mann-Whitney. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Morfologia oócica no início e no fim do procedimento de equilíbrio. Para determinar o resultado do procedimento de equilíbrio, pode ser útil anotar(A)morfologia oócito antes de iniciar o procedimento. (B) Observa-se um encolhimento acentuado do oócito após a primeira exposição à solução crioprotetora. O procedimento de equilíbrio pode ser considerado completo quando (C) o oócito recuperou seu volume inicial. Barras de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Razão para vitrificação oócida Outro médico além do câncer (n=19) Câncer (n=40) Não-médico (n=133) Outros (n=58)
Idade materna na recuperação de oócitos, média±SD 33,6±6,4 anos 34,6±5,9 anos 37,0±3,4 anos 38,2±4,3 anos
Basal FSH, médio±SD 7.5±4.2 IU/L 7.6±1.7 IU/L 7.8±4.1 UI/L 8.8±5.2 UI/L
AMH, ±SD média 1.8±1.7 ng/mL 1.9±0.2 ng/mL 2.2±2.4 ng/mL 3.0±2,5 ng/mL
AFC, média±SD 12,7±5.0 13.3±7.0 11.6±6.1 10.7±6.7
IMC, médio±SD 20.1±1.5 21,8±1.6 20.2±3.1 22,9±3,6
Duração da estimulação, média±SD 10.0±1.5 9.6±1.7 9.9±2.1 10.3±2.1
9/40, 22.5%
Início aleatório
COCs, total, média±SD 239 551 1493 592
12.6±5.3 13.8±9.1 11.2±7.1 10.2±8.5
Oócitos MII, total, médio±SD 167 400 1161 462
8.8±3.3 10.0±7.2 8.7±5.7 8.0±6.7
Taxa de maturação, média±SD 72,4±13,6% 72,1±19,6% 79,5±17,5% 77,4±22,2%
Pacientes retornando para o aquecimento, % total dos pacientes submetidos à vitrificação 10/19, 52.6% 7/40, 17.5% 17/133, 12.8% 44/58, 75.9%
Dias entre vitrificação e primeiro aquecimento, média±SD 283±225 1264±764 1547±709 132±203
Oócitos MII aquecidos, média total±SD 82 66 191 409
8.2±2.8 9.4±4.8 11.2±5.8 9.3±7.2
Oócitos MII sobreviventes, média total±SD 73 55 160 345
7.3±3.3 7.9±4.0 9.4±4.8 7.8±6.9
Taxa de sobrevivência, média±SD 87,6±18,1% 83,2±1,7% 85,4% ±14,5% 84,7±21,9%
Fator espermatozoide
N, n, % 5/10, 50% 4/7, 57% 13/17, 76% 13/44, 29%
MMF, n, % 3/10, 30% 3/7, 43% 3/17, 18% 17/44, 39%
OAT, n, % 2/10, 20% - 1/17, 6% 11/44, 25%
NOA, n, % - - - 3/44, 7%
Taxa de fertilização, média±SD 70,0±14,4% 70,0±17,0% 78,5±20,6% 71,0±24,3%

Tabela 1: Pacientes submetidos a um único ciclo de vitrificação de oócito. Abreviaturas: FSH = hormônio estimulante do folículo; AMH = hormônio anti-mülleriano; IMC = índice de massa corporal; COC = complexos de oócito cumulus; MII = metafase-II; N = normozoospermic; MMF = fator masculino moderado (1-2 defeitos espermatozoides); OAT = oligoasthenoteratozoospermic; NOA = azoospermia não obstrutiva (os espermatozoides foram coletados através da extração de espermatozoides testiculares).

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Discussion

Considerações clínicas

Embora estratégias emergentes, como a criopreservação do tecido ovariano e a maturação in vitro, tenham sido exploradas, a vitrificação oócida após a COS é a técnica padrão-ouro para a preservação da fertilidade. Nesse cenário, o número de oócitos recuperados e criopreservados deve ser maximizado no menor tempo possível, pois a maioria dos pacientes com câncer pode se beneficiar apenas de um ciclo ovariano antes de ter que iniciar seu tratamento contra o câncer. Assim, um protocolo adequado de estimulação ovariana é crucial para explorar plenamente a reserva ovariana e aumentar a chance cumulativa de um futuro nascimento vivo28, um resultado fortemente dependente da idade materna na recuperação de oócitos. Nesse sentido, ainda não foi proposta uma idade ideal para a vitrificação oócida para fins de preservação dafertilidade,e é necessário um consenso entre 35 anos18 ou 37 anos30,31. No entanto, a preservação da fertilidade deve ser acessível para todos os pacientes, incluindo mulheres com mais de 37 anos, desde que recebam aconselhamento adequado sobre as taxas de sucesso com base em sua idade.

O protocolo e a dose inicial dos medicamentos devem ser delineados de acordo com o julgamento do ginecologista e, o mais importante, com base no tempo disponível32,33. O início da estimulação convencional na fase folicular inicial é recomendado quando o tempo não é um problema. No entanto, se necessário, a abordagem de início aleatório é viável para minimizar atrasos no início de tratamentos médicos e câncer de urgência34,35. O desenvolvimento folicular tem sido relatado como um processo extremamente dinâmico, pois múltiplas ondas de recrutamento de folículos foram descritas ao longo de um único ciclo ovariano. Embora os mecanismos biológicos por trás desse fenômeno ainda precisem ser revelados, os oócitos competentes podem ser recuperados e criopreservados independentemente da fase do ciclo menstrual em que a ECO é iniciada36.

Neste centro, a estimulação ovariana é tipicamente realizada usando o protocolo antagonista GnRH e 150-300 UI/dia de recombinante-FSH ou gonadotropina da menopausa humana. Em populações específicas de pacientes com mais de 35 anos, com deficiência de LH, ou apresentando resposta subótima após cos padrão, lH pode ser adicionado durante o COS para aumentar o recrutamento e crescimento de folículos através de uma ação sinérgica com fator de crescimento semelhante à insulina 116,37,38. Além disso, o protocolo antagonista gnrh seguido por um gatilho agonista gnrh foi relatado como sendo um protocolo de estimulação curto, seguro e altamente conveniente para maximizar a resposta ovariana e minimizar o risco para o OHSS39. Em pacientes com doenças sensíveis ao estrogênio, como o câncer de mama, as gonadotropinas associadas a inibidores de aromatase, como o letrozol, são administradas20.

De fato, uma revisão recente mostrou que o letrozol envolve resposta ovariana semelhante à estimulação convencional sem complicações em termos de defeitos congênitos, recidiva da malignidade e aumento da mortalidade40. Da mesma forma, o tamoxifen pode ser usado durante a ESM no caso de tumores sensíveis ao estrogênio, que, como o letrozole, não mostraram impacto na competência do oócito41,42. No entanto, isso precisa ser confirmado em estudos maiores. Neste centro, o letrozol é administrado desde o primeiro dia de estimulação até o dia 7 após a recuperação de oócitos em caso de tumores sensíveis à estradiol. O risco para o SSS, que é a complicação mais importante do COS que também atrasaria ainda mais os tratamentos anticancerígenos, deve ser considerado, particularmente em pacientes jovens com AFCs elevados. Nestes casos, desencadear a ovulação com um agonista GnRH em vez de gonadotropina coriônica humana (hCG) provou ser benéfico. Outras questões que devem ser evitadas são (i) trombo-embolia, que requer a administração de heparina de baixo peso molecular durante a COS, e (ii) uma resposta ovariana reduzida após COS43. Para compensar este último, duas estimulações consecutivas em um único ciclo ovariano podem ser realizadas. Este novo protocolo de COS não convencional, conhecido como DuoStim, envolve estimulações de fase folicular e luteal e duas recuperações de oócitos em um curto período de tempo (~15 dias) e deve ser investigado para fins de preservação da fertilidade no futuro44,45,46.

Outras estratégias possíveis para a preservação da fertilidade nas mulheres são: (i) criopreservação de tecido ovariano, que é a única opção disponível para fêmeas pré-púbertas. Essa possibilidade é promissora para restaurar a atividade reprodutiva e endócrina e evitar atrasos no início do tratamento do câncer, já que não é necessária estimulação hormonal. No entanto, ainda é experimental e requer cirurgia laparoscópica com transplante posterior, e há o risco de retransmissão do câncer ortotópico. (ii) Criopreservação embrionária, que envolve uma maior taxa de sobrevivência após o aquecimento, mas atrasa o tratamento do câncer e requer que um parceiro ou doador masculino esteja envolvido, limitando também a futura autonomia reprodutiva da mulher47. Além disso, pode estar sujeito a limitações legais em alguns países. Considerando essas limitações, a vitrificação oótil é considerada a abordagem mais estabelecida e eticamente aceitável. Idealmente, todos os grandes hospitais, onde as mulheres afetadas pelo câncer em sua idade reprodutiva são tratadas, devem fornecer programas de preservação da fertilidade, e todo o processo deve ser gratuito para que esses pacientes garantam o acesso igualitário a este programa. Ainda assim, a criopreservação oócito deve ser realizada exclusivamente em centros com expertise suficiente para não afetar a competência oócito no processo48.

Passos críticos no protocolo de vitrificação e solução de problemas

Vitrificação é uma transição pseudo de segunda ordem (IUPAC Compêndio de Terminologia Química) que induz uma solidificação semelhante a vidro dentro das células que impedem a nucleação e o crescimento do cristal de gelo, o principal fator causal da lesão celular. Para alcançar a vitrificação adequada, é necessária uma combinação de pelo menos dois CPAs (tipicamente etileno glicol e DMSO como agentes permeadeirados e sacarose como agente não permeante) juntamente com uma taxa de resfriamento extremamente alta (>20.000 °C/min) obtida pela minimização dos volumes de carga ou pela exposição direta das amostras ao nitrogênio líquido (dispositivos abertos). Como os oócitos são as maiores células do corpo, eles contêm a maior quantidade de água. Portanto, são mais sensíveis a ferimentos congelantes do que embriões. Durante a criopreservação de oócito, danos às organelas intracelulares (por exemplo, o citoesqueleto ou fuso meiotico), alteração da permeabilidade da membrana, endurecimento da zona pellucida, ativação de oócito, alteração das vias bioquímicas e possivelmente morte celular podem ocorrer49. Por essa razão, deve-se assegurar um delicado equilíbrio entre múltiplos fatores para a preservação bem-sucedida da viabilidade oótida e da competência do desenvolvimento. Para alcançar a consistência na taxa de sobrevivência após a vitrificação e atingir os níveis de referência, todas as etapas cruciais do procedimento devem ser estritamente controladas.

CPAs, osmolalidade celular e taxas de resfriamento

Para aumentar a probabilidade de vitrificação, a viscosidade do médio (e, portanto, a concentração de CPA) deve ser maximizada. No entanto, a toxicidade dos CPAs deve ser sempre mantida sob controle50. Para isso, é fundamental minimizar tanto o tempo de exposição celular aos CPAs quanto os volumes de carregamento, e sempre trabalhar à temperatura ambiente (25-27 °C)51. Outros protocolos envolvem diferentes combinações de CPAs e criodevices e são realizados a 37 °C; no entanto, eles não foram descritos aqui. Assim, as notas, os resultados representativos e as seções de discussão deste manuscrito só se aplicam ao protocolo de vitrificação aqui detalhado.

Durante a criopreservação, os oócitos são expostos a soluções de CPA de maior concentração de osmólitos para promover a desidratação celular e o encolhimento citoplasmático. Durante o aquecimento, eles são expostos a soluções com diminuição da concentração de osmólise para restaurar o volume citoplasmático. Durante a vitrificação, os oócitos estão desidratados, e flutuações não intencionais no volume celular podem causar choque osmótico grave, comprometendo assim a sobrevivência e o potencial de desenvolvimento após o aquecimento52. Encontrar a taxa de resfriamento ideal é um aspecto fundamental para preservar a viabilidade celular, pois afeta a osmolalidade53 e o potencial de desenvolvimento celular54. Por exemplo, quando uma célula é exposta a taxas de resfriamento mais lentas do que as taxas ideais, ela pode ser amplamente exposta a condições hipertônicas que levam à morte celular.

Para alcançar a taxa de resfriamento ideal, os volumes de carregamento devem ser minimizados, a TR deve ser controlada para não afetar a velocidade do processo de equilíbrio, e as amostras devem ser diretamente expostas ao nitrogênio líquido. Uma forma de avaliar quando o equilíbrio foi realizado é anotar a morfologia do oócito (em particular, a largura do espaço perivitelino e a espessura da zona pellucida) antes do início do procedimento(Figura 5A). Após uma fase inicial de redução do volume celular(Figura 5B),espera-se que o oócito recupere seu volume inicial (Figura 5C). Embora o pH correto seja mantido durante o manuseio de oócitos sob a atmosfera do ar por causa dos zwitterions que tamponam as soluções de aquecimento da vitrificação, a osmolalidade média é, em vez disso, particularmente dependente da temperatura53. Portanto, o método de preparação do prato é fundamental para reduzir qualquer possível efeito prejudicial55.

A sobreposição de óleo é certamente fundamental para evitar a evaporação e evitar qualquer aumento da osmolalidade na mídia de FIV56. No entanto, não pode ser usado durante a realização dos procedimentos de vitrificação e aquecimento. Portanto, algumas dicas são importantes para os operadores: (i) preparar as gotículas o mais rápido possível e imediatamente antes do uso; (ii) considerar maiores volumes de gotículas para minimizar mudanças na osmolaridade (<30 μL não é recomendado); (iii) quando as condições ambientais não podem ser padronizadas, uma placa de 6 poços pode ser usada e a água estéril ou PBS pode ser adicionada ao reservatório adjacente para limitar a evaporação; (iv) preste atenção à data da primeira abertura do frasco de meio, pois a osmolalidade pode mudar se a garrafa for repetidamente aberta.

Aquecimento oócito e devitrificação oótica

O passo mais crucial que pode afetar a consistência na taxa de sobrevivência é definitivamente o processo de aquecimento57. Durante esta etapa, os CPAs são gradualmente removidos do oócito e diluídos para evitar qualquer efeito citotóxico potencial. A desvitarificação, ou seja, a formação de núcleos de gelo ou cristais de gelo durante o aquecimento de uma solução vitrificada ou acidentalmente durante a auditoria, transporte ou armazenamento em vapor, é um dos principais riscos de vitrificação58,59,60. Portanto, para evitar a desvitarificação e lesões durante o aquecimento, a diferença de temperatura entre a primeira e a última etapa do processo deve ser maximizada. Como mostrado por Seki e Mazur57 em oócitos murinos sujeitos à vitrificação e aquecimento em diferentes taxas, quanto mais rápido o aquecimento, maior a sobrevivência. O volume e a temperatura do TS são os principais fatores a serem controlados: O TS deve ser devidamente aquecido a 37 °C (pelo menos 1 h antes do procedimento), e o rack de nitrogênio líquido deve ser preenchido à borda de sua capacidade e colocado o mais próximo possível do estereomicroscópio. O operador deve ser o mais rápido possível durante a transferência do portador de criopreservação do nitrogênio líquido para o TS. Devido à alta eficiência da vitrificação, um protocolo universal de aquecimento pode ser usado independentemente do protocolo de congelamento envolvido, facilitando o gerenciamento de todos os ciclos de aquecimento, mesmo quando os oócitos são importados de um centro de FIV diferente61.

Dispositivos abertos e risco de contaminação

O emprego de sistemas abertos e a exposição direta das amostras ao nitrogênio líquido são necessários para alcançar as taxas de resfriamento e aquecimento extremamente altas que suportam a eficácia deste protocolo. Embora a vitrificação seja um procedimento que represente baixo risco de contaminação cruzada, pois envolve volumes muito pequenos e é realizada após várias lavagem de amostras que diluem qualquer carga viral putativa, é essencial adotar todas as medidas de precaução para aumentar sua segurança. Com base nas evidências atuais, os sistemas fechados não oferecem uma alternativa competitiva aos sistemas abertos, pelo menos para vitrificação oóica62,63. Para manter a eficácia dos sistemas de vitrificação abertos, minimizando os riscos associados ao contato direto com nitrogênio líquido, este último pode ser esterilizado por irradiação ultravioleta64,65. Alternativamente, podem ser utilizados tanques de armazenamento de vapor, que são conhecidos por apresentar um risco menor de contaminação do que os convencionais, mas provaram ser eficazes na preservação da viabilidade do oócito66,67.

Importância do monitoramento constante dos principais indicadores de desempenho para programas de vitrificação oócito

Em um laboratório de FIV, o monitoramento dos principais indicadores de desempenho (KPIs) é essencial para monitorar e melhorar constantemente os resultados68. Em geral, ao definir os KPIs para acompanhamento de processos e procedimentos, três áreas principais devem ser consideradas: estrutura, processo e resultado. Os KPIs estruturais medem a qualidade do laboratório de FIV, delineando as características dos recursos físicos e humanos. Um exemplo de KPI estrutural relacionado à instalação em um programa de criopreservação pode ser o número de criotanks em relação ao número total de procedimentos de TARV que requerem criopreservação realizados em um determinado período de tempo ou o número de crio-tanques relativos ao metro quadrado total da crioala. No entanto, os recursos humanos e, em particular, as habilidades do operador são de extrema importância ao lidar com um procedimento delicado, como a vitrificação. De fato, embora extremamente eficaz, a técnica de vitrificação é um procedimento desafiador envolvendo várias fases processuais com tempos rigorosos que devem ser estritamente controlados: uma quantidade muito pequena de um meio significativamente viscoso deve ser gerenciada por um período muito curto.

Nenhuma máquina de congelamento com ajuste de parâmetros de resfriamento específicos está envolvida no procedimento; portanto, a padronização dos detalhes do protocolo e do treinamento são essenciais. O processo manual tem rigorosos requisitos de habilidade que devem ser cumpridos para obter taxas de sobrevivência celular consistentes e altamente reprodutíveis. O treinamento específico deve ser fornecido a cada operador iniciante para torná-los proficientes no controle de todos os pontos críticos do procedimento, em particular, o tempo de exposição das amostras aos CPAs e o manuseio das células em um meio altamente viscoso. No entanto, segundo Dessolle e coautores,69 a curva de aprendizado para o procedimento de vitrificação não deve ser tão longa nem mesmo para os embriologistas juniores, pois a realização da proficiência é limitada principalmente por desafios de manipulação. Uma vez alcançada a expertise em vitrificação, o desempenho de cada operador individual deve ser verificado com precisão e regularidade através do uso de KPIs para avaliar regularmente a manutenção dos valores de competência estabelecidos pelos artigos de consenso70. Além disso, a confiança/competência do operador deve ser comparável para não afetar os resultados.

Os KPIs de processo medem o funcionamento do laboratório de FIV. Os protocolos e procedimentos de vitrificação e aquecimento devem ser conduzidos em tempo hábil, e as flutuações nas condições culturais devem ser minimizadas, prestando especial atenção à manutenção da osmolaridade e temperatura adequadas para a preservação não apenas da competência de desenvolvimento oócito, mas também da segurança do operador durante o manuseio de nitrogênio líquido. Exemplos de KPIs de processo são a porcentagem de lesões da equipe de laboratório enquanto lidam com nitrogênio líquido por número de procedimentos de FIV por ano, a porcentagem de gametas/embriões perdidos/danificados durante procedimentos de vitrificação/aquecimento e auditorias por número de procedimentos por ano.

Por fim, os KPIs de desfecho medem a eficácia do laboratório de FIV e geralmente referem-se à sobrevivência do oócito pós-guerra definida como a proporção de oócitos morfologicamente intactos no momento da ICSI (em caso de vitrificação de oócitos, o valor de competência deve ser >50% e o valor de referência é de 75%)70. Além disso, as taxas de fertilização (<10% menor do que os oócitos frescos inseminados no centro a partir de uma população de pacientes comparáveis), desenvolvimento de embriões (o mesmo que uma população de pacientes comparáveis usando oócitos frescos) e implantação (<10-30% menor do que uma população comparável de embriões frescos no centro) são aplicáveis como LPIs de desfecho para oócitos vitrificados70. Entretanto, os desfechos clínicos estão mais sujeitos a características específicas do casal do que aos procedimentos clínicos defeituosos71,72.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Nenhum

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

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Biologia Questão 175 Preservação da Fertilidade estimulação ovariana oócito metafase II vitrificação aquecimento Indicadores de Desempenho Chave (KPI)
Preservação da Fertilidade Através da Vitrificação de Oócitos: Perspectivas Clínicas e Laboratoriais
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Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).

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