Summary
Oocyte 냉동 보존은 후구형 여성의 불임 보존을위한 금 본위제로 여러 국제 과학 사회에 의해 인식된다. 적절한 임상 및 실험실 전략은 불임 보존 치료의 효능, 효율성 및 안전을 최대한 보장합니다.
Abstract
여성의 불임 을 보존하는 것은 환자의 미래의 삶의 질을 돌보는 다기능 의료 시스템에서 중요합니다. Oocyte 냉동 보존은 의료 및 비 의학 표시 모두에 대한 후구 여성의 불임 보존을위한 금 본위제로 여러 국제 과학 사회에 의해 인식된다. 주요 의학적 징후는 종양학 질환, 심한 자궁내막증과 같은 부인과 질환, 난소 보호구역을 손상시키는 전신 질환 및 조기 폐경과 관련된 유전적 상태입니다. 이 논문은 객관적이고 증거 기반 상담을 위한 권고사항을 요약하여 불임 보존 치료의 전체 임상 및 실험실 작동을 설명합니다. 또한 절차의 효과에 중점을 두고 난소 예비를 완전히 활용하고 가능한 한 짧은 시간에 검색된 난소 세포의 수를 최대화하는 가장 적절한 전략을 설명합니다. 난소 예비의 평가, 이상적인 자극 프로토콜의 정의뿐만 아니라 난소 검색, 비하 및 유리화 절차는 효능, 효율성 및 안전을 극대화하는 접근 방식과 함께 상세합니다.
Introduction
인간 난모세포에 대한 효율적인 냉동 보존 프로그램의 개발 및 구현은 생식 의학에서 중요한 돌파구였습니다. 최근 증거에 따르면, 유리화는 환자 집단(불임 환자 또는 난소세포 기증 프로그램)1,2,3과는 독립적으로 느린 동결에 비해 통계적으로 더 높은 생존율을 초래하기 때문에 전이형 II(MII) 난소류를 보존하는 가장 효과적인 전략이다. oocyte 진동의 놀라운 성과는 미국 생식 의학 학회 (ASRM)와 보조 생식 기술 협회 (SART)의 실천위원회가 후구 여성의 선택적 불임 보존에 가장 효과적이도록 발음하도록 이끌었습니다4,5,6. 불임 보존을 위한 의학 표시는 (i) 방사선 요법, 세포독성 화학요법 및 내분비 치료 (난소 예비에 해로운 효력이 모계 나이뿐만 아니라 치료의 유형 및 복용량과 연관되는) 와같은 치료를 필요로하는 (i) 암 및 자가 면역 질환을 포함합니다. (ii) 반복 또는 급진적 인 수술을 필요로하는 난소 질환 (자궁 내막증등)8; 및 (iii) 유전 적 상태 (예를 들어, X 연약) 또는 조기 난소 실패. 또한, 불임 보존은 비 의학적 이유 (사회적 동결로 도상)에 대한 부모의 목표를 달성하지 않은 모든 여성에게 가치있는 옵션이되었습니다.
불임 보존에 대한 표시와 불임 보존에 대한 주요 국제 지침에 따라, 그들의 난모세포에 대한 주요 국제 지침에 따라, 그들의 난모세포에 대한 모든 환자는 절차9,10,11,12,13의성공의 현실적인 기회, 비용, 위험 및 제한에 대해 통보할 적절한 상담을 받아야한다. 가장 중요한 것은, MII 난모세포의 코호트를 진동하는 것은 임신을 보장하지 않지만, 필요한 경우 체외 수정 (IVF) 치료에 미래의 성공의 더 높은 기회를 제공한다는 것을 분명히해야한다14. 이와 관련하여, 난낭체 진동시의 여성의 나이는 확실히 가장 중요한 제한 요인15 고급 모성 연령으로 (AMA; >35 년) 여성 불임의 주요원인이다 16. 난소 예비의 점진적 감소 외에, AMA는 신진 대사, 후성 유전학 조절, 세포 주기 체크포인트 및 메이오틱 분리17과같은 불완전한 생리적 경로로 인한 난소 세포의 능력의 손상과 관련이 있다. 따라서, 생체화하는 계란의 적당한 수는 주로 모성 나이에 달려 있습니다. 36 세 미만의 여성의 경우 성공 가능성을 최대화하기 위해 적어도 8-10 MII 난모세포18이 필요합니다. 일반적으로, 유리화 된 난모세포의 수가 높을수록 성공 가능성이 높습니다. 따라서, 항 뮐레리안 호르몬(AMH) 수준 또는 개미 여포 수(AFC)와 같은 난소 예비 마커에 따라 난소 자극을 조정하는 것은 가능한 한 짧은 시간에 난소 예비군을 완전히 활용하는 데 매우 중요합니다.
전체 절차의 안전은 불임 보존을 위해 환자를 등록할 때 다른 중요한 문제입니다. 임상의는 위험을 최소화하고 예방 (i)난소 과자극 증후군 (OHSS)을 방지하기 위해 최선의 전략을 채택해야 합니다 고나돌트로핀 방출 호르몬 (GnRH) 길항제 프로토콜과 같은 안전한 접근 법을 사용하여 GnRH 작용기 트리거19 및 (ii) 원격, 그러나 가능한, 복막 출혈의 위험, 골반 구조에 부상 (요관, 창자, 부록, 신경), 또는 oocyte 검색 하는 동안 골반 감염. 마지막으로, (iii) 자극을 위한 전통적인 식이요법은 초생리학적 혈청 estradiol과 연관되어 있기 때문에 유방암과 같은 에스트로겐 에스트로겐 에스트로겐 에민감한 질병에서는 권장되지 않습니다. 아로마타제 억제제(예: 레토졸 또는 타목시펜)를 포함하는 프로토콜은 이러한 경우20,21에서더 적합하다. 실험실 설정에서, oocyte 진동을 위한 가장 널리 퍼진 프로토콜은 여전히 Kuwayama와동료에의해 기술된 첫번째2,23입니다,극저온 보호제 (CPA)의 점진적인 추가를 관련시키는 단계적 절차로 이루어져 있습니다. 제1상(평형/탈수)에서, 난모세포는 7.5% v/v 에틸렌 글리콜 및 7.5% v 디메틸 설프리산화물(DMSO)을 함유한 CPA 용액에 노출되며, 2상에서는, 난소세포는 15% v/v 에틸렌 글리콜과 15% v/v DMSO, 0.5 mol/L 자당으로 바이트화 용액으로 이동됩니다. 생체화 의 매체에서 짧은 배양 후, 난소 세포는 특별히 설계, 열 극저온 장치에 배치하고 마지막으로 사용 될 때까지 저장 - 196 °C에서 액체 질소에 급락 할 수 있습니다.
여기서, 불임 보존 치료의 전체 임상 및 실험실 작업업은 (i) 객관적이고 증거 기반 상담을 위한 권고사항을 요약하고, (ii) 절차의 비용 효과에 초점을 맞추고, (iii) 난소 예비를 완전히 활용하고 가능한 한 짧은 시간에 회수된 난소 세포의 수를 최대화하는 가장 적합한 전략을 설명하는 것으로 설명하였다. 난소 예비의 평가, 이상적인 자극 프로토콜의 정의뿐만 아니라 난소 검색, 비하 및 유리화 절차는 효능, 효율성 및 안전을 극대화하는 접근 방식과 함께 자세히 설명될 것입니다. 이 프로토콜의 다른 프로토콜 또는 적응이 문헌에 존재하므로 이 원고의 대표 결과 및 토론 섹션은 이 절차에만 적용됩니다.
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Protocol
1. 업무 및 임상 상담
참고: 종양학적 이유로 불임 보존을 요구하는 환자의 경우, 일정 상담을 위한 대기자 명단이 없는지 확인하고 가능한 한 빨리 약속이 제공됩니다.
- 병력 및 이전 문서를 검사하고 환자의 전반적인 건강 상태를 평가합니다.
- 관계형 데이터베이스에 모든 정보(암 환자의 경우 난소 자극을 받기 위한 종양 전문의의 승인 포함)를 기록합니다.
- 환자에게 절차의 타당성에 대한 구체적인 상담을 제공합니다. 절차의 단계 (난소 자극, 난소 처리 검색, oocyte vitrification)를 설명하고, 성공의 현실적인 기회에 대해 그녀에게 알려 (주로 모성 나이및 oocyte 검색 시 MII 난마세포의 예상 수에 따라 달라), 절차의 비용과 한계.
- 난소 보호구역(즉, AFC)에 대한 정보를 얻고 계란 수집을 위한 난소의 접근성을 평가하기 위해 질 초음파를 수행합니다.
- 혈액그룹과 류서인자, 응고 스크리닝(혈액수, 프로트롬빈, 혈전세포증, 피브리노겐, 단백질 C, 단백질 S, 항혈암비III, 호모시스테인), 및 전염병(B형 간염, C형 간염, HIV, 정맥암병 연구소/Treponemapallidum Hemagis)를 평가하도록 혈액 검사를 요청합니다.
참고: 비 긴급한 의학적 이유로 불임 보존 프로그램에 접근하는 환자의 경우, 보다 포괄적인 평가에는 기저 여포 자극 호르몬(FSH), 루테인화 호르몬(LH), 에스트라디올, AMH, 유방 검사, 파파니콜라우 검사, 응고의 유전자 검진(레이덴 및 프롬빈의 인자 V), 및 토치(세포바이러스) 및 스토치(세포바이러스)가 포함될 수 있습니다. - 심장 검사(심전도)를 요청하십시오.
- 심리 상담을 추천합니다.
2. 불임 보존을 위한 통제된 난소 자극 프로토콜
참고: 암 치료를 시작하기 전에 사용할 수 있는 시간이 제한되면, 임의 시작 프로토콜(즉, 생리주기 동안 언제든지 난소 자극시작)은 불임 보존 후보인 종양학 환자의 난소 자극에 권장됩니다. 비긴급한 의학적 이유 또는 사회적 이유로 불임 보존 프로그램에서, 초기 여포 단계에서 시작되는 기존의 자극이 바람직하며, 난소 자극은 생리주기에 기초하여 시작된다. 통제된 난소 자극 (COS) 접근은 인간 재생산과 발생학의 최근 유럽 사회에 따라 수행되어야 합니다 (ESHRE) 지침24.
- 환자의 특성과 난소 예비 마커에 따라 COS를 조정, 주로 모성 나이, FSH, AMH, 및 AFC.
- 150-300 IU/일의 고정 용량으로 재조합 또는 오줌 FSH를 사용하여 생리 주기의 5 일째에 COS를 시작합니다 (길항 프로토콜).
참고: LH 결핍 또는 비최적 반응이 없는 특정 환자 집단에서는 난소 반응, LH 수준 및 산부인과 의사의 판단에 따라 LH 75/150 IU/day를 추가로 투여할 수 있습니다. - 에스트로겐에 민감한 질병을 가진 환자에서는, 난소 제거 후에 7 일까지 자극의 1 일에서 aromatase 억제제 (letrozole)와 관련되었던 생식선 호르몬을 포함합니다.
- 4 일 동안 생식선 호르몬의 고정 된 복용량을 관리.
- 5일째에 여포 성장을 모니터링한 다음 2-3일마다 모니터링합니다. 결국, 생식 샘 호르몬 복용량을 조정.
- 일단 적어도 3 여포직경 17-18 mm에 도달하면, 0.5 mL의 복용량에 GnRH 작용제의 단일 피하 볼루스와 최종 난소 세포 성숙을 위한 트리거를 관리합니다.
3. 오사이클 리트리버
- 난소 검색 준비
- 필요한 재료의 경우, 재료의 테이블을참조하고, 준비 실험실 신발과 의상, 수술 용 면 마스크, 헤어 커버, 수술 장갑, 영구 무독성 마커, 핀셋, 멸균 작은 거즈, 일회용 또는 재사용 가능한 speculum, 질 수술 장비 및 표면 소독제를 유지합니다. 소생 장비, 반전을 위한 마취제, 아나필락시성 쇼크 치료를 위해 준비된 키트, 수술실에서산소의 가용성을 보장합니다.
- 보조 생식 기술(ART)25에서초음파에 대한 ESHRE 워킹 그룹의 권고에 따라 난소 화물 회수 절차를 수행한다.
- 예방을 위한 식증 또는 전신 마취 및 항생제를 관리하십시오.
참고 : 이 프로토콜에서, 깊은 체양은 프로포폴 (환자의 체중에 따라 투여량이 조정되는) 및 펜타닐의 50-100 μg, 1000 mg의 파라세타몰 및 산소로 보조 마스크 환기를 관리함으로써 달성되었습니다. - 진공 펌프, 17G 단일 루멘 바늘에 연결된 수집 튜브 및 난소 세포 수집 튜브로 구성된 흡인 유닛을 사용하여 난소 리찰을 수행합니다. 수집 하는 동안, 적혈구를 벗겨 또는 zona 펠루치다를 골절 등 난모 세포의 손상의 위험을 피하기 위해 ~120 mmHg의 압력을 초과 하지 마십시오.
- 작업 표면 온도를 보정하여 배양 매체에서 37°C를 보장합니다. 전체 절차 동안 발달 능력에 영향을 줄 수 있는 일시적인 온도에도 난구노출을 최소화합니다.
- 난동성 검색의 끝에서, 방전하기 전에 3-4 시간 동안 환자를 관찰한다.
- 예방을 위한 식증 또는 전신 마취 및 항생제를 관리하십시오.
- 운영 극장
- 수술실에 들어가기 전에 환자를 식별하고 배란 트리거 시간을 확인합니다.
- 환자가 부인과 위치에서 수술대에 누워 있다.
- 세균 오염을 최소화하기 위해 난소 제거 전에 질 /자궁 경부를 정화합니다.
- 다양한 장기 및 혈관과의 난소 및 해부학 적 관계의 위치를 평가하기 위해 예비 질 초음파를 수행하십시오.
- 초음파 지침에 따라, 질 벽을 통해 난소 여포에 단일 루멘 바늘을 삽입, 질 벽과 난소 사이에있는 장기 또는 혈관을 다치게하지 않도록주의.
- 가장 가까운 여포에서 포부를 시작하고 가장 단면으로 이동합니다.
- 11-12mm보다 큰 직경의 모든 여포를 천자하여 바늘의 "비틀기 움직임"을 수행하여 전체 여포 액을 흡인시킨 다음 수술실의 블록 히터에서 예열된 멸균 튜브(원형 하단 14mL)로 방출됩니다.
- 검색 직후 환자의 신원에 대한 세부 사항으로 튜브를 밀봉하고 라벨을 부착하십시오.
- 간호사가 튜브를 실험실로 가져와야하며, 여기서 즉시 적수-난낭 복합체(COC)의 존재를 위해 가려져 있는지 확인하십시오.
- 배아학자들에게 검색된 COC의 총 수에 대해 임상의에게 알리라고 지시한다.
- 첫 번째 난소에 대한 절차가 완료되면 깨끗한 배지로 바늘을 플러시하고 동일한 절차를 사용하여 두 번째 난소로 진행합니다.
- 난소 검색 후, 파라메륨의 난소 또는 혈관에서 출혈과 더글러스의 파우치에 있는 액체를 평가하십시오.
참고: 임상 수준에서 게임테 및 배아 추적성의 효과를 자동화하고 개선하기 위해,중앙(26)에서전자 목격 시스템(EWS)이 구현되었다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜은 어떤 IVF 실험실에서 프로토콜의 재현성을 보장하기 위해 EWS를 언급하지 않습니다. 그럼에도 불구하고 절차의 모든 단계는 게임테 및 배아 추적성을 보장하기 위해 두 번째 연산자 (즉 증인)가 필요하다는 것을 고려하십시오.
4. IVF 실험실
- 난막화물 검색 절차 전날
- 난구 수집 튜브를 준비합니다(재료표참조).
- 각 난소량 수집 튜브(원형 바닥, 5mL)에서 IVF 배지 1mL(재료의 표참조)를 분배하고, 배아 배양을 위한 0.2mL의 미네랄 오일(재료표참조)으로 커버한다.
참고: 튜브 수는 회수될 것으로 예상되는 여포 수에 따라 정의됩니다. 각 튜브에는 최대 4개의 COC가 포함될 수 있습니다.
- 각 난소량 수집 튜브(원형 바닥, 5mL)에서 IVF 배지 1mL(재료의 표참조)를 분배하고, 배아 배양을 위한 0.2mL의 미네랄 오일(재료표참조)으로 커버한다.
- 캡(첫 번째 스냅)으로 튜브를 밀봉합니다. 중간 유형과 준비 날짜의 세부 사항으로 튜브에 라벨을 지정합니다. 제어 된 분위기 (6 % CO2,5 % 02)에서37 °C에서 하룻밤 동안 튜브를 배양합니다.
- 난구 수집 튜브를 준비합니다(재료표참조).
- 난소 화물 검색 당일
- 플라스틱 소모품을 37°C(멸균 배양 접시 및 파스퇴르 파이펫)로 미리 데우습니다.
- 환자에게 자신의 신원 (전체 이름과 생년월일)과 배란 트리거의 시간을 확인하도록 요청하십시오. 검사장에 식별(ID) 절차가 완료되었으며 배란 트리거 의 시간이 확인되었다는 것을 진단합니다.
- 오사이클 수집 튜브를 인큐베이터에서 꺼내서(절차가 시작되기 직전에) 캡을 밀어 밀어 단단히 닫습니다. 난낭 수집 튜브에 환자의 정보를 라벨로 지정합니다. 난낭 수집 튜브를 블록 히터에 37°C로 놓습니다.
- 예온멸균 배양접시에서 여포액을 검사하고 COC를 식별합니다. 하나 이상의 COC가 확인되면, 여포액과 혈액 오염을 제거하기 위해 중간 두 방울로 두 번 헹구십시오.
- COC를 난소 수집 튜브로 옮기고 튜브의 COC 수에 추가됩니다. 중간 튜브의 캡을 느슨하게하고 6 % CO2,5 % O2의분위기에서 37 °C에서 신속하게 배양하십시오.
- 검색된 난모세포의 수에 따라 7~9단계를 반복합니다. 실험실 시트를 업데이트합니다.
참고: 증인이 모든 튜브 온난화 블록(작동 극장의 블록 포함)이 비어 있는지 확인하고 실험실 시트의 절차 종료에 서명합니다. - 절차가 완료된 후 작업 단계를 지워보냅니다.
5. 오사이클리 비하
- Prewarm 4-(2-하이드록세틸)-1-파이프라진에탄황포닉산(HEPES)-완충된 배지 및 히알루로니다제(재료의 표참조)는 시작하기 전에 최소 1h로.
- 4웰 IVF 플레이트(재료의 표참조)를 0.6mL/웰에 예동된 HEPES 버퍼링 배지(5% 인간 혈청 알부민[HSA]로 보충)로 준비하여 배아 배양을 위한 미네랄 오일0.3mL로 덮여 있고, 37°C에서 30분 이상 따뜻하게 드실 수 있다.
- 환자의 정체성에 대한 세부 사항으로 난소 성소 소명 판에 라벨을 부착하십시오.
- 시술을 시작하기 직전에, 첫 번째 웰에 히알루로니다아제를 추가하여 약 20 IU/mL의 최종 농도를 얻습니다.
- 적혈구를 분산시키는 효소를 함유하는 첫 번째 우물에 제한된 수의 COC(최대 6개)를 배치한다.
- 적수와 코로나 세포의 효소 제거를 강화하기 위해 최대 30s의 내직경이 약 250 μm인 파스퇴르 파이펫을 통해 난미세포를 반복적으로 피펫하여 적수 세포의 제거를 수행합니다. 초기 세포 해리가 관찰된 후, 난소세포를 HEPES 버퍼링 배지만 함유하는 제2웰로 이송하여 최소한의 양의 효소를 이월하는 주의를 기울인다.
- 내지름(170-145 μm)을 감소시키는 피펫을 데칭하여 코로나 세포를 제거하기 위해 추가 반출을 수행한다. 필요한 경우에만 낮은 직경(135μm)을 사용합니다.
- 탈모한 난토를 조심스럽게 씻어 효소를 씻어내세요.
- 부인 후, 그들의 무결성과 성숙의 단계를 평가하기 위해 반전 된 현미경의 밑에 난모세포를 검사합니다. 미숙한 것들 (발아 소포 및 메타 상-I)에서 MII 난모를 분리합니다.
- MII 난모를 유리화 영역으로 이동하여 냉동 보존을 즉시 수행합니다. 실험실 시트를 업데이트합니다.
6. 오키테 바이트로피화
참고: 난소세포 리원산38h 내및 반출 직후의 난소성 진동을 수행하는 것이 바람직하다. 여기에 설명된 진동 절차는 실온(RT)에서 수행되어야 하며, 조작 시 난모를 손상시키지 않도록 내경 170μm의 스트리퍼 파이펫을 사용하여 달성되어야 한다.
- 시술 전에 약 30분, 평형 용액(ES) 및 유리화 용액(VS)을 RT(25-27°C)로 가져온다.
- 환자의 이름과 ID, 치료 ID, 동결 날짜, 난모세포 수 및 냉동 고리 코드로 냉동 장치에 적절하게 레이블을 지정합니다.
- 일회용 냉각 랙을 신선한 액체 질소로 위로 채우고 멸균 공정을 시작합니다.
- 환자의 이름과 ID로 유리화 플레이트(재료 표참조)에 라벨을 부착합니다.
- 각 유리병을 두 번 반결하여 사용 전에 내용물의 혼합을 하고, HEPES 버퍼링 된 매체 (5 % HSA)의 30 μL 1 방울과 ES30 μL의 1 방울로 6mm 페트리 접시의 뚜껑을 준비하십시오.
참고: 중간 증발을 제한하기 위해 사용하기 직전에 방울을 놓습니다. - 170 μm 직경 스트리퍼 파이펫을 사용하여 첫 번째 낙하에 난모세포(최대 9개)를 가능한 가장 작은 부피로 놓습니다. 스트리퍼 파이펫을 사용하여, 낙하 n.1과 n.2 사이의 배지의 다리를 만들어 CPA(도1A)의농도가 점진적으로 증가한다.
- 첫 번째 드롭에서 3분간 난미를 배양합니다. ES(n.3)의 30 μL의 세 번째 방울을 추가합니다. 3분 후, 난소세포를 ES의 두 번째 낙하로 옮기고, 낙하 n.3과 n.2(도1B)사이에중간 다리를 만듭니다. 3 분 동안 드롭 n.3에 난모세포를 배양.
- 인큐베이션 동안 사용할 각 저온 장치에 대해 30 μL 방울을 추가하십시오(9개의 난낭을 냉동 보존하는 경우 ES 의 각 방울에 3 방울의 ES 방울을 놓습니다). 난모를 순수 ES 용액으로 이동시키고 6-9분 동안 둡니다(수축 후 초기 크기를 복구할 때까지)(그림 1C).
- VS 1mL로 중앙 웰 디쉬(60 x 15mm)를 준비합니다. 처음 6분 이내, 난귀체를 VS 용액으로 전송하여 가능한 한 적은 배지를 방출합니다. 난모를 VS에 1분 동안 두고, 아래에서 위로 이동하여 ES의 과잉을 제거하여 조심스럽게 씻으십시오.
- 잠복분이 끝나기 전에 약 10초, 냉동장치를 현미경 아래에 놓고 블랙 마크(즉, 극저온 장치의 끝)에 초점을 조정한다. 최소VS(그림 2A)의검은 색 마크 옆에 난미장치를 놓습니다.
- 스트리퍼 파이펫을 난모세포로부터 멀리 이동시키고, 난소세포가 중간층(도2C)에의해 덮여 있도록 VS배지(도 2B)의초과를 제거한다.
- 액체 질소에 냉동 장치를 빠르게 급락, 빠르게 표면에서 기포를 제거하기 위해 흔들어. 냉동 장치의 보호 캡을 핀셋으로 잡고 액체 질소로 채웁니다. 그런 다음 프로틸렌 스트립을 액체 질소에 보관하면서 냉동 장치를 삽입합니다.
- 이전에 환자의 정보로 표시된 visiotube에 냉동 장치를 저장합니다. 실험실 시트를 업데이트합니다.
7. 오사이클 온난화
- 시술 전에 약 30분, 해동 용액(TS), 희석용액(DS), 세척용액(WS)을 RT(25-27°C)로 데워주세요. 각 유리병을 두 번 조심스럽게 반전하여 내용을 혼합합니다. 중앙 우물 페트리 접시에 TS 의 1 mL을 배치하고 절차를 시작하기 전에 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 따뜻하게.
- 모든 플라스틱 소모품을 환자의 이름과 ID 및 솔루션 유형으로 라벨을 지정합니다. 증인에게 냉동 장치에 대한 환자의 정보를 확인하도록 요청하십시오.
- 각 저온 장치를 데우려면 첫 번째 우물에서 200 μL의 DS가 있는 6웰 플레이트와 두 번째 및 세 번째 우물에서 동일한 양의 WS(WS1 및 WS2라고 명명됨)를 준비합니다. 인산염 완충식식염(PBS) 또는 멸균수를 우물 외부 부위에 첨가하여 증발을 방지합니다.
- 인큐베이터에서 TS 접시를 꺼내 현미경 아래에 놓습니다. 현미경의 초점을 페트리 접시의 중심으로 조정합니다.
- 프로틸렌 스트립을 액체 질소에 보관하면서 극저온 장치의 보호 캡을 조심스럽게 비틀고 제거합니다. 냉동 질소에서 TS로 극저온 장치를 가능한 한 빨리 전송하여 탈착 위험을 피하고 카운트다운(1분)을 시작합니다.
- 냉동 장치 끝(즉, 검은 자국)에 초점을 맞추어 난모를 국한합니다. 스트리퍼 파이펫을 사용하여 냉동 장치에서 난모를 놓습니다.
참고 : 냉동 장치에서 난모를 흡인하지 않으려고; TS로 이동할 때까지 일부 미디어를 부드럽게 공개합니다. - 170 μm 직경 스트리퍼 파이펫을 사용하여, 약간의 양의 TS (그라데이션을 만들기 위해)로 오사이클을 DS로 전송하고 3 분 동안 DS에 둡니다. 난모를 WS1로 이동하여 5분 동안 둡니다. 마지막으로, 1 분 동안 WS2로 난모를 전송합니다.
- 난소체를 적절한 선형화 된 IVF 배양 매체로 옮기고, 내트라피토프라심 정자 주입 (ICSI)을 진행하기 전에 1 시간 동안 배양하십시오. 실험실 시트를 업데이트합니다.
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Representative Results
센터의 불임 보존 프로그램 개요
12년 기간(2008-2020년) 동안 285명의 여성이 수집된 성숙한 계란의 전체 코호트의 병용을 수반하는 적어도 하나의 난낭화물 검색을 시행했습니다. 이들 여성의 대부분(n=250)은 단일 검색을 거쳤으며 35명이 여러 번 검색을 거쳤습니다. 계란 유리화에 대한 난소 세포 검색을 받는 이유는 의료 (암 제외), 암, 비 의료 및 기타 4 가지 범주로 요약됩니다. 계란 유리화를 위한 단 하나 난낭 검색을 겪고 있는 250명의 여자 중, 8%는 암 이외의 의학적 이유가 있었습니다 (10 자궁내막증, 3명의 근종, 4개의 난소 낭종, 1하이드로살핀스), 16%는 암 (31유방암, 3개의 난소암, 2개의 대장암, 2호지킨 림프종, 1vgkin의 림프종, 1vvar 암 e 1 자궁 경부암), 53%는 비의 이유가 있고, 23%는 그밖 이유를 가지고 있었습니다 (43의 결석, 10S) 및 10S 감염에 대한 그밖 이유가 있었습니다( 43의 결석, 10S 의 감염에 대한. 이 분포는 계란 유리화를 위한 다중 난피질 검색을 겪고 있는 환자 중 달랐다. 구체적으로, 9%는 암(자궁내막증 1개, 난소 보호구역 2개), 암(2유방암), 80%는 비의학적 이유가 있었고, 3%는 다른 이유(1명의 정자 부재)를 가졌다. 계란 유리화를 위한 다중 난피질 검색을 겪고 있는 환자 중 누구도 그 계란을 따뜻하게 하지 않았고, 단일 계란 유리화 주기를 겪고 있는 250명의 여성 중 78명이 그 난소세포(그림3)를사용하기 위해 돌아왔다.
표 1은 관련 이유에 따라 클러스터된 단일 난피테 진동 주기를 겪고 있는 250명의 여성의 데이터를 요약합니다. 난자 유리화의 의학적 이유를 가진 환자와 암 때문에 불임 보존을 겪고 있는 환자는 더 젊었으며(평균 모성 연령 < 35세)였으며 비의료 또는 기타 이유로 환자보다 더 나은 난소 예비군(더 높은 AfFC)을 보였다. 그러나 평균 성숙율(MII 난소/COC 수)은 약간 낮았다(72-73% 대 77-79%), 4개 그룹(9-10 난구)에서 평균 진동이 유사하였다. 중요한 것은, 종양학 환자 40명 중 9명(22.5%)이 화학요법 또는 방사선 요법을 시작하기 전에 제한된 시간을 가졌기 때문에 무작위 시작 난소 자극 프로토콜을 시행했습니다. 암 이외의 의학적 이유로 환자의 약 절반(53%)과 계란 진동에 대한 다른 이유를 가진 환자의 대다수(76%)가 실제로 온난화로 돌아왔다는 것은 흥미롭습니다. 반대로, 암에 대한 불임 보존을 받은 환자는 거의 없습니다 (17.5%) 또는 비 의학 이유 (13%) IVF를 위해 그들의 유리화 된 oocytes를 사용했습니다. 또한 놀라운 것은 반환 된 환자 중 유리화와 온난화 사이에 경과 된 시간입니다 : 평균적으로, 암 이외의 의학적 이유로 환자에서 283 일, 다른 이유로 환자에서 132 일, 종양학 환자에서 1264 일, 비 의학적 이유로 환자에서 1547 일. 이러한 모든 관련 차이에 관계없이 생존율은 4군에서 환자 들 사이에서 평균 83-88%(83-88%; 평균 8-11개의 난낭이 따뜻해졌고, 7-9난소가 살아남았으며, 이로 인해 난구 진동및 온난화 프로토콜의 효능과 안전성을 확인하였다. 더욱이, 생존율은 진동과 온난화 연산자의경험(그림 4A,B)과무관하다. 표 1은 오낭 진동(~80%)에 대한 비의학적 이유가 있는 환자를 제외하고 ~ 70%인 4군에서 수정률을 나타낸다. 그러나, 이들 데이터는 작은 샘플 크기와 수정결과(27)에정자 인자의 편견 때문에 비교할 수 없다.
그림 1: 난마화물 냉동 보존을위한 중간 물방울 구성. 점차적으로 평형을 수행하기 위해, 난모세포는 먼저 BS의(A)방울에 배치되고(B)ES의 한 방울과 혼합된다. 인큐베이션 3분 후,(C)ES 용액의 세 번째 방울이혼합되고, 난소세포는 6-9분 동안 배양된다. 약어: HEPES = 4-(2-하이드록세틸)-1-파이프라진에탄황포닉산; BS = HEPES 버퍼링 배지; ES = 평형 솔루션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 냉동 보존 장치에 오사이클로로드. 난모세포는 냉동 장치에 배치(A)VS의 단일 작은 드롭. (B)스트리퍼 파이펫은 난모세포에서 멀리 이동하고( C)VS의 과잉은 각 난소 주위에 단지 얇은 층을 두고 재 흡착된다. 약어: VS = 진동 솔루션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 로마생식의학제네라센터에서 수행된 오사이클바이스 주기(2008년~2020년). 12 년 기간 동안, 250 명의 환자는 oocyte 유리화를 위한 단일 난피테 검색을 받았고 35명은 여러 난구 화물 검색 주기를 겪었습니다. 오키테 진동에 대한 고유의 이유가 그림에 표시됩니다. 온난화 (n =78)를 위해 돌아오는 환자는 단일 난소 진동 주기를 겪은 여성 그룹에만 속합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 따뜻해 진 난모세포의 코호트 당 평균 생존율. (A)진동 및(B)온난화 작업자의 경험. 각 환자는 첫 번째 온난화 주기에만 포함됩니다. 통계적으로 유의한 차이는 Mann-Whitney U-test를사용하여 평가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 평형 절차의 시작과 끝에 있는 오퀴트 형태. 평형 절차의 결과를 결정하기 위해, 절차를 시작하기 전에(A)oocyte 형태에 알리는 것이 유용할 수 있다. (B)난소세포의 급격한 수축은 냉동 보호제 용액에 처음 노출된 후 관찰된다. (C)난소가 초기 볼륨을 회수했을 때 평형 절차는 완전한 것으로 간주될 수 있다. 스케일 바 = 25 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
| 오마세포 진동의 이유 | 암 이외의 의료 (n=19) | 암 (n=40) | 비의료 (n=133) | 기타(n=58) |
| 난마화물 검색에서 모성 나이, 평균±SD | 33.6±6.4년 | 34.6±5.9년 | 37.0±3.4년 | 38.2±4.3년 |
| 기초 FSH, 평균±SD | 7.5±4.2 IU/L | 7.6±1.7 IU/L | 7.8±4.1 IU/L | 8.8.8±5.2 IU/L |
| AMH, 평균±SD | 1.8±1.7 ng/mL | 1.9±0.2 ng/mL | 2.2±2.4 ng/mL | 3.0±2.5 ng/mL |
| AFC, 평균±SD | 12.7±5.0 | 13.3±7.0 | 11.6±6.1 | 10.7±6.7 |
| BMI, 평균±SD | 20.1±1.5 | 21.8±1.6 | 20.2±3.1 | 22.9±3.6 |
| 자극의 지속 시간, 평균±SD | 10.0±1.5 | 9.6±1.7 | 9.9±2.1 | 10.3±2.1 |
| 9/40, 22.5% | ||||
| 임의 시작 | ||||
| COC, 총, 평균±SD | 239 | 551 | 1493 | 592 |
| 12.6±5.3 | 13.8±9.1 | 11.2±7.1 | 10.2±8.5 | |
| MII 난소, 총, 평균±SD | 167 | 400 | 1161 | 462 |
| 8.8.8±3.3 | 10.0±7.2 | 8.7±5.7 | 8.0±6.7 | |
| 성숙율, 평균±SD | 72.4±13.6% | 72.1±19.6% | 79.5±17.5% | 77.4±22.2% |
| 온난화를 위해 돌아오는 환자, 진동을 겪은 환자의 총 % | 10/19, 52.6% | 7/40, 17.5% | 17/133, 12.8% | 44/58, 75.9% |
| 유리화와 첫 온난화 사이의 일, 의미±SD | 283±225 | 1264±764 | 1547±709 | 132±203 |
| 따뜻한 MII 난모세포, 총 평균±SD | 82 | 66 | 191 | 409 |
| 8.2±2.8 | 9.4±4.8 | 11.2±5.8 | 9.3±7.2 | |
| 살아남은 MII 난소, 총 평균±SD | 73 | 55 | 160 | 345 |
| 7.3±3.3 | 7.9±4.0 | 9.4±4.8 | 7.8.8±6.9 | |
| 생존율, 평균±SD | 87.6±18.1% | 83.2±1.7% | 85.4%±14.5% | 84.7±21.9% |
| 정자 인자 | ||||
| N, n, % | 5/10, 50% | 4/7, 57% | 13/17, 76% | 13/44, 29% |
| MMF, n, % | 3/10, 30% | 3/7, 43% | 3/17, 18% | 17/44, 39% |
| OAT, n, % | 2/10, 20% | - | 1/17, 6% | 11/44, 25% |
| NOA, n, % | - | - | - | 3/44, 7% |
| 수정 속도, 평균±SD | 70.0±14.4% | 70.0±17.0% | 78.5±20.6% | 71.0±24.3% |
표 1: 난소 진동의 단일 주기를 겪고 있는 환자. 약어: FSH = 모낭 자극 호르몬; AMH = 안티 뮐레리안 호르몬; BMI = 체질량 지수; COC = 적정 한 난낭 복합체; MII = 메타페이오-II; N = 노모주정자; MMF = 중간 남성 인자 (1-2 정자 결함); OAT = 올리고아테노테라토주정자, NOA = 비 폐쇄성 azoospermia (정자는 고환 정자 추출을 통해 수집되었다).
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Discussion
임상 고려 사항
난소 조직 냉동 보존 및 체외 성숙과 같은 새로운 전략이 탐구되었지만 COS 후 난소 의 진동은 불임 보존을위한 금 표준 기술입니다. 이 시나리오에서는 대부분의 암 환자가 암 치료를 시작하기 전에 한 난소 주기에서만 이익을 얻을 수 있기 때문에 검색되고 냉동 보존된 난모세포의 수를 가능한 한 짧은 시간에 최대화해야 합니다. 따라서, 적절한 난소 자극 프로토콜은 난소 예비를 완전히 활용하고 미래의 살아있는 출생28의누적 기회를 증가시키는 것이 중요합니다. 이와 관련하여, 불임 보존 목적을 위한 난낭성 진동에 대한 이상적인 연령은 아직29세이며,35세18세 또는37세 30세,31년사이에 합의가 필요하다. 그러나, 불임 보존은 그들의 나이에 근거를 둔 성공률에 적당한 상담을 주어지는 주어진 37 세 이상의 여자를 포함하여 모든 환자를 위해 접근할 수 있어야 합니다.
약물의 프로토콜 및 시작 복용량은 산부인과 의사의 판단에 따라 설명되어야하며 가장 중요한 것은 사용 가능한32,33에따라 설명해야합니다. 초기 여포 단계에서 기존의 자극을 시작하는 것은 시간이 문제가되지 않을 때 권장됩니다. 그러나 필요한 경우, 무작위 개시 접근법은 긴급 암/의료 치료 개시지연을 최소화할 수있다(34,35). 여포 발달은 단 하나 난소 주기 내내 여포 모집의 다중 파도가 기술되었기 때문에 극단적으로 역동적인 과정으로 보고되었습니다. 이 현상의 뒤에 생물학적 기계장치는 아직도 공개될 필요가 있더라도, 유능한 난모세포는 COS가 시작되는 생리 주기의 단계의 단계와 독립적으로 회수되고 냉동보존될 수 있습니다36.
이 센터에서, 난소 자극은 전형적으로 GnRH 길항제 프로토콜 및 재조합-FSH 또는 인간 갱년기 생식선 호르몬의 150-300 IU/day를 사용하여 수행됩니다. 35세 이상의 환자의 특정 인구에서 LH 결핍증또는 표준 COS 후 최적이 아닌 반응을 보이는 경우, LH는 COS 중에 인슐린과 같은 성장인자 1116,37,38을통한 시너지 작용을 통해 여포의 모집 및 성장을 증가시킬 수 있다. 더욱이, GnRH 작용제 프로토콜에 이어 GnRH 작용제 트리거가 나방 반응을 극대화하고 OHSS39의위험을 최소화하기 위해 짧고 안전하며 매우 편리한 자극 프로토콜로 보고되었다. 유방암과 같은 에스트로겐에 민감한 질환을 가진 환자에서는, 레트로졸과 같은 아로마타제 억제제와 관련된 생식선도트로핀을투여한다 20.
실제로, 최근 검토는 letrozole선천적인 결함의 관점에서 합병증없이 기존의 자극과 유사한 난소 반응을 포함 것으로 나타났다, 악성 재발, 증가 사망률40. 유사하게, 타목시펜은 에스트로겐에 민감한 종양의 경우 COS 중에 사용될 수 있는데, 이는 레트로졸과 마찬가지로 오낭능력(41,42)에영향을 미치지 않았다. 그러나, 이것은 더 큰 연구에서 확인 될 필요가. 이 센터에서, 레트로졸은 에스트라디올에 민감한 종양의 경우 난소 제거 후 7일까지 자극의 1일째부터 투여된다. 또한 더 항암 처리를 연기할 COS의 가장 중요한 합병증인 OHSS를 위한 리스크는, 특히 높은 AfCs를 가진 젊은 환자에서, 고려되어야 합니다. 이러한 경우에, 인간의 융기 생식선 호르몬 대신 GnRH 작용제로 배란을 트리거 (hCG) 유익한 것으로 입증 되었습니다. 예방해야 할 다른 문제는 COS 동안 저분자 중량 헤파린의 투여를 필요로 하는 (i) 혈전 색전증, (ii) COS43후 감소된 난소 반응이다. 후자를 보완하기 위해 단일 난소 주기에서 두 번의 연속 자극이 수행될 수 있습니다. DuoStim으로 알려진 이 새로운 비전통적인 COS 프로토콜은 짧은 기간(~15일)에 여포 및 황체 상 자극과 2개의 난소세포 회수를 수반하며 향후44,45,46에서불임 보존 목적을 위해 조사되어야 한다.
여성의 불임 보존을 위한 그밖 가능한 전략은: (i) 난소 조직 냉동 보존, prepubertal 여성에 사용할 수 있는 유일한 선택권입니다. 이 가능성은 호르몬 자극이 필요하지 않기 때문에 생식 및 내분비 활동을 복원하고 암 치료를 시작하는 지연을 피하기 위한 유망합니다. 그러나, 그것은 여전히 실험 하 고 나중에 이식복강경 수술을 필요로, 그리고 치열 하 항성 암 재전송에 대 한 위험이 있다. (ii) 온난화 후 생존율이 높아지는 배아 냉동 보존은 암 치료를 지연시키고 남성 파트너 또는 기증자가 참여하도록 요구하므로 여성의 미래 생식자율성(47)을제한한다. 또한 일부 국가에서는 법적 제한의 대상이 될 수 있습니다. 이러한 한계를 고려할 때, 오낭성 바이트로화는 가장 확립되고 윤리적으로 수용 가능한 접근 법으로 간주됩니다. 이상적으로, 그들의 생식 나이에 있는 암에서 영향을 받은 여자가 취급되는 모든 중요한 병원은, 불임 보존을 위한 프로그램을 제공해야 하고, 이 프로그램에 동등한 접근을 보장하기 위하여 이 환자를 위한 전체 프로세스는 무료로 되어야 합니다. 그럼에도 불구하고 난소극 보존은프로세스 48에서난소 세포 능력에 영향을 미치지 않을 충분한 전문 지식을 갖춘 센터에서만 수행해야 합니다.
바이트화 프로토콜 및 문제 해결의 중요한 단계
바이트화는 세포 내 유리와 같은 고형화를 유도하는 의사 2차 상 전이(IUPAC Compendium)로, 세포 손상의 주요 원인인 얼음 결정 핵형성 및 성장을 방지한다. 적절한 유리화를 달성하기 위해서는 최소 2개의 CPU(일반적으로 에틸렌 글리콜 및 DMSO를 침투제로 또는 육박제로 삼는 제자 및 자당)의 조합이 필요하며, 매우 높은 냉각속도(>20,000°C/min)는 적재량을 최소화하거나 액체 질소(개방형 장치)에 대한 시료를 직접 노출하여 달성합니다. 난모세포는 신체의 가장 큰 세포이기 때문에 가장 많은 양의 물을 함유하고 있습니다. 따라서, 그들은 배아 보다 동결 부상에 더 민감. 난파르리 보존 동안, 세포 내 세포세포(예를 들어, 세포골격 또는 메이오능 스핀들), 막 투과성 변경, 조나 펠루치다 경화, oocyte 활성화, 생화학적 경로의 변경, 세포 사멸가능성이 49개발생할 수 있다. 이러한 이유로, oocyte 생존력과 발달 능력의 성공적인 보존을 위해 여러 요인 사이의 섬세한 균형을 보장해야합니다. 진동 후 생존율의 일관성을 달성하고 벤치마크 수준에 도달하기 위해서는 절차의 모든 중요한 단계를 엄격하게 제어해야 합니다.
CPA, 세포 진동 및 냉각 속도
유리화 의 확률을 증가하려면 매체의 점도 (따라서 CPA 농도)를 극대화해야합니다. 그러나, CPA의 독성은 항상 제어 하에 보관되어야한다50. 이를 위해, CPA및 적재량에 대한 세포 노출 시간을 최소화하고, 항상 실온(25-27°C)51에서작업하는 것이 중요하다. 다른 프로토콜은 CPA와 냉동 장치의 상이한 조합을 포함하고 37 °C에서 수행됩니다; 그러나, 그들은 여기에 설명되지 않았습니다. 따라서 이 원고의 노트, 대표 결과 및 토론 섹션은 여기에 자세히 설명된 유리화 프로토콜에만 적용됩니다.
냉동 보존 동안, 난모세포는 세포 탈수 및 세포 질 수축을 촉진하기 위해 증가 된 삼투압 농도의 CPA 솔루션에 노출됩니다. 온난화 하는 동안, 그들은 세포질 볼륨을 복원 하는 감소 된 삼투압 농도 솔루션에 노출 됩니다. 진동하는 동안, 난소세포는 탈수되고, 세포 부피의 의도하지 않은 변동은 심한 삼투성 충격을 유발하여52를온난화한 후 생존 및 발달 잠재력을 손상시킬 수 있다. 최적의 냉각 속도를 찾는 것은진동(53) 및 세포 발달잠재력(54)에영향을 미치기 때문에 세포 생존가능성을 보존하기 위한 핵심 적인 측면이다. 예를 들어, 세포가 최적의 속도보다 느린 냉각 속도에 노출되면 세포 사멸로 이어지는 고온 조건에 광범위하게 노출될 수 있습니다.
최적의 냉각 속도를 달성하기 위해 적재량을 최소화하고, 평형 공정의 속도에 영향을 미치지 않도록 RT를 제어해야 하며, 샘플은 액체 질소에 직접 노출되어야 합니다. 평형을 달성할 때 평가하는 한 가지 방법은 절차의 시작 전에 oocyte의 형태(특히, 인식 공간의 폭 및 조나 펠루치다의 두께)에 음송하는것이다(도 5A). 세포 부피 감소(도5B)의초기 단계 후, 난모세포는 초기 부피(도5C)를회복할 것으로 예상된다. 기체 온난화 용액을 버퍼링하는 zwitterions로 인해 공기 대기 하에서 오낭 처리 중에 올바른 pH가 유지되지만, 중간 진동은 특히 온도53에의존한다. 따라서, 접시 준비 방법은 가능한 해로운효과(55)를감소시키는 데 매우 중요하다.
오일 오버레이는 증발을 방지하고 IVF 미디어56의진동 증가를 피하기 위해 확실히 중추적 인 역할을합니다. 그러나, 그것은 유리화 및 온난화 절차를 수행 하는 동안 사용할 수 없습니다. 따라서 운영자에게 몇 가지 팁이 중요합니다: (i) 가능한 한 빨리 그리고 사용하기 직전에 물방울을 준비합니다. (ii) 삼투압의 변화를 최소화하기 위해 더 많은 양의 물방울을 고려하십시오 (<30 μL은 권장되지 않습니다); (iii) 환경 조건이 표준화될 수 없는 경우, 6웰 플레이트를 사용할 수 있고, 멸균물 또는 PBS를 인접한 저수지에 첨가하여 증발을 제한할 수 있다. (iv) 병이 반복적으로 열리면 진동이 변할 수 있기 때문에 배지 바이알의 첫 번째 개통 날짜에 주의를 기울입니다.
오세포 온난화 및 오낭제 탈피
생존율의 일관성에 영향을 미칠 수있는 가장 중요한 단계는 확실히 온난화 과정(57)입니다. 이 단계 동안, CPA는 오피티에서 점차적으로 제거되고 잠재적인 세포 독성 효과를 방지하기 위해 희석됩니다. 기형화, 즉 유리화 용액의 온난화 시 또는 증기에서 의한 감사, 운송 또는 저장 중에 얼음 핵 또는 얼음 결정의 형성은 유리화58,59,60의주요 위험 중 하나입니다. 따라서 온난화 시 탈착 및 부상을 방지하기 위해서는 공정의 첫 번째 단계와 마지막 단계 사이의 온도 차이를 극대화해야 합니다. 세키와마주르(57)가 다른 속도로 진동과 온난화를 받는 뮤린 난우낭에서 보여준 바와 같이, 온난화가 빨라질수록 생존율이 높아집니다. TS의 부피 및 온도는 제어하는 주요 요인입니다: TS는 37°C(시술 전에 적어도 1시간)로 따뜻하게 해야 하며, 액체 질소 랙은 용량의 가장자리에 채워져 스테레오현미경에 최대한 가깝게 배치되어야 합니다. 작업자는 액체 질소에서 TS로 냉동 보존 캐리어를 전송하는 동안 가능한 한 빨리 해야 합니다. 생체화의 높은 효율 때문에, 보편적 온난화 프로토콜은 관련된 동결 프로토콜에 관계없이 사용될 수 있으며, 다른 IVF센터(61)에서난모세포가 수입되는 경우에도 모든 온난화 주기의 관리가 더 용이하게 된다.
개방형 장치 및 오염 위험
개방형 시스템의 고용과 액체 질소에 대한 시료의 직접 노출은 이 프로토콜의 효과를 지원하는 매우 높은 냉각 및 온난화 율을 달성하는 데 필요합니다. 유리화는 교차 오염에 대한 위험이 낮은 절차이지만, 매우 적은 양을 포함하고 어떤 putative 바이러스 부하를 희석 여러 샘플 세척 후 수행되기 때문에, 그것의 안전을 높이기 위해 모든 예방 조치를 채택하는 것이 필수적이다. 현재의 증거에 따르면, 폐쇄 된 시스템은 적어도 oocyte 진동62,63에대한 개방 시스템에 대한 경쟁력있는 대안을 제공하지 않습니다. 액체 질소와의 직접 접촉과 관련된 위험을 최소화하면서 개방 유리화 시스템의 효과를 유지하기 위해 후자는 자외선 조사64,65에의해 멸균될 수 있다. 대안적으로, 증기 저장 탱크는 종래의 오염 위험을 낮추는 것으로 알려져 있지만 난구 생존가능성66,67을보존하는 데 효과적인 것으로 입증된 것으로 알려져 있다.
오키테 진동 프로그램에 대한 주요 성과 지표의 지속적인 모니터링의 중요성
IVF 실험실에서는 주요 성과 지표(KPI)의 모니터링이68을모니터링하고 지속적으로 개선하는 데 필수적입니다. 일반적으로 프로세스 및 절차를 모니터링하기 위해 KPI를 정의할 때 구조, 프로세스 및 결과라는 세 가지 주요 영역을 고려해야 합니다. 구조 KPI는 물리적 및 인적 자원의 특성을 요약하여 IVF 실험실의 품질을 측정합니다. 냉동보존 프로그램의 시설과 관련된 구조KPI의 예로는 주어진 기간에 냉동 보존을 요구하는 총 ART 절차 수 또는 냉동실의 총 제곱미터에 비해 냉동 탱크의 수에 비해 냉동 탱크의 수가 있을 수 있습니다. 그러나, 인적 자원, 특히, 운영자 기술은 진동과 같은 섬세한 절차를 다룰 때 가장 중요합니다. 사실, 비록 매우 효과적이지만, 유리화 기술은 엄격하게 제어해야 엄격한 타이밍과 여러 절차 단계를 포함하는 도전적인 절차입니다 : 상당히 점성 매체의 매우 적은 양은 매우 짧은 기간 동안 관리되어야한다.
특정 냉각 매개 변수 설정이 있는 동결 기계는 프로시저에 관여하지 않습니다. 따라서 프로토콜 세부 정보 및 교육의 표준화가 필수적입니다. 수동 프로세스는 일관되고 매우 재현 가능한 세포 생존율을 얻기 위해 충족되어야 하는 엄격한 기술 요구 사항이 있습니다. 특정 교육은 각 초보자 연산자가 절차의 모든 중요 지점을 제어하는 데 능숙하게 하기 위해 제공되어야 하며, 특히 샘플의 CPA에 대한 노출 시간 및 고점성 배지에서 세포를 처리하는 데 능숙하게 만들어야 합니다. 그러나, Dessolle 및 공동 저자에 따르면,69 시험 절차에 대한 학습 곡선은 숙련도의 성취가 주로 조작 과제에 의해 제한되기 때문에 주니어 배아학자에게도 그렇게 길어서는 안된다. 시험운용에 대한 전문지식이 달성되면, 각 사업자의 성과는 KPI를 사용하여 정확하고 정기적으로 검증되어야 하며, 합의논문(70)에의해 확립된 역량 가치의 유지관리를 정기적으로 평가해야 한다. 또한, 결과에 영향을 미치지 않도록 작업자의 신뢰/역량을 비교할 수 있어야 합니다.
프로세스 KPI는 IVF 실험실이 얼마나 잘 작동하는지 측정합니다. 진동및 온난화 프로토콜 및 절차는 적시에 수행되어야 하며, 액체 질소를 취급하면서 통신력뿐만 아니라 작업자의 안전을 보존하기 위해 적절한 진동과 온도를 유지하는 데 특별한 주의를 기울여 문화 조건의 변동을 최소화해야 합니다. 프로세스 KPI의 예로연간 IVF 절차 수당 액체 질소를 처리하는 동안 실험실 직원 부상의 비율, 진동/온난화 절차 중 분실/손상된 게임테스/배아의 비율, 연간 절차 수당 감사 등이 있습니다.
마지막으로, 결과 KPI는 IVF 실험실의 효과를 측정하고 일반적으로 ICSI 시 형태학적 으로 손상되지 않은 난모세포의 비율로 정의된 후온 난소 생존을 지칭한다(난낭성 진동의 경우 역량 가치는 >50% 및 벤치마크 값은75%여야한다. 또한, 비료(<10% 유사한 환자 집단으로부터 중앙에 수정된 신선한 난피세포보다 낮음), 배아 발달(신선한 난소체를 이용한 유사한 환자 집단과 동일), 이식(<10-30% 중앙에 있는 신선한 배아의 비교인구보다 낮음) 및 이식(<10-30% 중앙에 있는 신선한 배아의 비교인구보다 낮음) 및 이식(<10-30% 중앙에 있는 신선한 배아의 비교인구보다 낮음) 결과KPI가 진동성 난수에 대한 결과로 적용된다. 그러나, 임상 결과는 결함이 있는 임상절차(71,72)보다커플 특이적 특성에 더 가깝다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
없음
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection | |||
| Equipment | |||
| Hot plate | IVF TECH | ||
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermometer | |||
| Test tube Warmer | |||
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Vacuum Pump | Cook | K-MAR-5200 | |
| Consumables | |||
| CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| Ovum Aspiration Needle (Single lumen) | Cook | K-OSN-1730-B-60 | |
| Primaria Dish | Corning | 353803 | Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish |
| Round- bottom tubes | Falcon | 352001 | Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap |
| Round- bottom tubes | Falcon | 352003 | Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap |
| Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | |
| Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE |
| Denudation | |||
| Equipment | |||
| CO2 incubator | Eppendorf | Galaxy 14S | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl |
| Human Serum Albumin | thermoFisher Scietific | 9988 | |
| Hyaluronidase | Fujifilm Irvine Scientific | 90101 | 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF |
| IVF culture dish (60 x 15mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
| Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | 1 mL for pasteur pipettes |
| Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE |
| stripping pipette tips (140 µm) | Cook | K-FPIP-1140-10BS-6 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| stripping pipette tips (130 µm ) | Cook | K-FPIP-1130-10BS-7 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification | |||
| Equipment | |||
| Electronic Timer | |||
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
| Human Serum Albumin | Fujifilm Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
| Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
| stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification Freeze kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90133-so | 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL) |
| Vitrifit | Coopersurgical Origio | 42782001A | VitriFit Box |
| Warming | |||
| Equipment | |||
| Electronic Timer | |||
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
| k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
| Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Consumables | |||
| Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
| CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
| IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
| IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
| Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
| SAtripping pipette tips (300µm) | Cook | K-FPIP-1300-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
| Vitrification Thaw kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90137-so | 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL) |
References
- Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
- Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
- Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
- Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
- Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
- Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
- Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
- Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1 (2016).
- Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
- Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
- Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, Suppl 6 160-170 (2013).
- Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
- Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
- Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94 (2019).
- Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327 (2018).
- Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
- Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
- Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049 (2019).
- Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
- ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025 (2019).
- Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
- Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
- Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
- Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
- Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
- Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
- Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
- Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
- Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
- Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
- Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
- Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
- Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
- Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
- Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
- Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
- Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
- Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
- Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
- Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317 (2018).
- Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
- Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
- Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
- Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
- Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
- Fuller, B., Paynter, S.
- Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268 (2014).
- Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
- Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
- Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
- Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
- Jin, B., et al.
- Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
- Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
- Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
- Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123 (2018).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
- Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
- Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
- Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
- Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
- Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
- Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
- Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).
