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Medicine

Fruchtbarkeitserhaltung durch Eizellvitrifikation: Klinische und Laborperspektiven

Published: September 16, 2021 doi: 10.3791/61963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Summary

Die Kryokonservierung von Eizellen wird von mehreren internationalen wissenschaftlichen Gesellschaften als Goldstandard für die Erhaltung der Fruchtbarkeit bei postpubertären Frauen anerkannt. Geeignete klinische und Laborstrategien gewährleisten maximale Wirksamkeit, Effizienz und Sicherheit von Fruchtbarkeitserhaltungsbehandlungen.

Abstract

Die Erhaltung der weiblichen Fruchtbarkeit ist in einem multifunktionalen Gesundheitssystem, das sich um die zukünftige Lebensqualität der Patienten kümmert, von entscheidender Bedeutung. Die Kryokonservierung von Eizellen wird von mehreren internationalen wissenschaftlichen Gesellschaften als Goldstandard für die Erhaltung der Fruchtbarkeit bei postpubertären Frauen anerkannt, sowohl für medizinische als auch für nicht-medizinische Indikationen. Die wichtigsten medizinischen Indikationen sind onkologische Erkrankungen, gynäkologische Erkrankungen wie schwere Endometriose, systemische Erkrankungen, die die Eierstockreserve beeinträchtigen, und genetische Erkrankungen mit vorzeitiger Menopause. Dieses Papier beschreibt die gesamte klinische und Laboraufarbeitung einer Fruchtbarkeitserhaltungsbehandlung, indem es Empfehlungen für eine objektive und evidenzbasierte Beratung skizziert. Darüber hinaus konzentriert es sich auf die Wirksamkeit des Verfahrens und beschreibt die am besten geeigneten Strategien, um die Eierstockreserve vollständig auszuschöpfen und die Anzahl der in kürzester Zeit entnommenen Eizellen zu maximieren. Die Bewertung der Eierstockreserve, die Definition eines idealen Stimulationsprotokolls sowie die Verfahren zur Entnahme, Denudation und Vitrifikation von Eizellen wurden zusammen mit Ansätzen zur Maximierung ihrer Wirksamkeit, Effizienz und Sicherheit detailliert beschrieben.

Introduction

Die Entwicklung und Implementierung eines effizienten Kryokonservierungsprogramms für menschliche Eizellen war ein bedeutender Durchbruch in der Reproduktionsmedizin. Jüngsten Erkenntnissen zufolge ist die Vitrifikation die effektivste Strategie zur Kryokonservierung von Eizellen der Metaphase II (MII), da sie unabhängig von der Patientenpopulation (unfruchtbare Patientinnen oder Eizellspendeprogramm) zu statistisch höheren Überlebensraten im Vergleich zum langsamen Einfrieren führt1,2,3. Die bemerkenswerten Errungenschaften der Eizellvitrifikation veranlassten die Praxiskomitees der American Society for Reproductive Medicine (ASRM) und der Society for Assisted Reproductive Technology (SART), diese Technik als die effektivste für die elektive Fruchtbarkeitserhaltung bei postpubertären Frauen zu erklären, sowohl für medizinische als auch für nicht-medizinische Indikationen4,5,6. Medizinische Indikationen zur Erhaltung der Fruchtbarkeit umfassen (i) Krebs und Autoimmunerkrankungen, die Therapien7 wie Strahlentherapie, zytotoxische Chemotherapie und endokrine Therapie erfordern (deren schädliche Wirkung auf die Eierstockreserve mit dem Alter der Mutter sowie art und dosis der Behandlung verbunden ist); ii) Eierstockerkrankungen, die eine wiederholte oder radikale Operation erfordern (z. B. Endometriose)8; und (iii) genetische Erkrankungen (z. B. X-fragile) oder vorzeitiges Ovarialversagen. Darüber hinaus ist die Erhaltung der Fruchtbarkeit zu einer wertvollen Option für alle Frauen geworden, die ihr elterliches Ziel aus nicht-medizinischen Gründen nicht erreicht haben (auch bekannt als Social Freezing).

Unabhängig von der Indikation zur Erhaltung der Fruchtbarkeit und gemäß den wichtigsten internationalen Richtlinien zur Erhaltung der Fruchtbarkeit sollten alle Patientinnen, die bereit sind, ihre Eizellen zu vitrifizieren, eine angemessene Beratung erhalten, um über ihre realistischen Erfolgschancen, die Kosten, Risiken und Einschränkungen des Verfahrens informiert zu werden9,10,11,12,13. Am wichtigsten ist, dass klar sein sollte, dass die Vitrifizierung einer Kohorte von MII-Eizellen keine Schwangerschaft gewährleistet, sondern dass sie eine höhere Erfolgschance für die zukünftige In-vitro-Fertilisation (IVF) bietet, falls erforderlich14. In dieser Hinsicht ist das Alter der Frau zum Zeitpunkt der Vitrifizierung der Eizellen sicherlich der wichtigste limitierende Faktor15, da das fortgeschrittene mütterliche Alter (AMA; >35 Jahre) die Hauptursache für weibliche Unfruchtbarkeit ist16. Neben einer fortschreitenden Verringerung der Ovarialreserve ist AMA mit einer Beeinträchtigung der Eizellkompetenz aufgrund defekter physiologischer Wege wie Stoffwechsel, epigenetische Regulation, Zellzyklus-Checkpoints und meiotische Segregation verbunden17. Daher hängt die angemessene Anzahl der zu vitrifizierenden Eier hauptsächlich vom Alter der Mutter ab. Bei Frauen unter 36 Jahren sind mindestens 8-10 MII-Eizellen18 erforderlich, um die Erfolgschancen zu maximieren. Im Allgemeinen gilt: Je höher die Anzahl der vitrifizierten Eizellen, desto höher ist die Erfolgswahrscheinlichkeit. Daher ist die Anpassung der ovariellen Stimulation an ovariellen Reservemarkern wie Anti-Müller-Hormon (AMH) oder Antralfollikelzahl (AFC) entscheidend, um die Eierstockreserve in kürzester Zeit voll auszuschöpfen.

Die Sicherheit des gesamten Verfahrens ist das andere Schlüsselthema bei der Aufnahme von Patienten zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Kliniker sollten die besten Strategien anwenden, um die Risiken zu minimieren und (i) das ovarielle Hyperstimulationssyndrom (OHSS) zu verhindern, indem sie sichere Ansätze wie das Gonadotrophin-Releasing-Hormon (GnRH) -Antagonistenprotokoll verwenden, gefolgt von einem GnRH-Agonistenauslöser19 und (ii) den entfernten, aber möglichen Risiken von Peritonealblutungen, Verletzungen der Beckenstrukturen (Harnleiter, Darm, Blinddarm, Nerven) oder Beckeninfektionen während der Eizellentnahme. Schließlich (iii) traditionelle Stimulationsschemata sind mit supraphysiologischem Serumestradiol verbunden und werden daher bei östrogenempfindlichen Erkrankungen wie Brustkrebs nicht empfohlen. Protokolle mit Aromatasehemmern (wie Letrozol oder Tamoxifen) sind in diesen Fällen besser geeignet20,21. Im Labor ist das am weitesten verbreitete Protokoll zur Vitrifikation von Eizellen immer noch das von Kuwayama und Kollegen 2,23beschriebene Protokoll, das auseinemschrittweisen Verfahren besteht, bei dem Kryoprotektoren (CPAs) schrittweise hinzugefügt werden. In der ersten Phase (Gleichgewicht/Dehydratation) werden Eizellen in einer CPA-Lösung exponiert, die 7,5% v/v Ethylenglykol und 7,5% v/v Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält, während in der zweiten Phase Eizellen in eine Vitrifikationslösung mit 15% v/v Ethylenglykol und 15% v/v DMSO plus 0,5 mol/L Saccharose bewegt werden. Nach einer kurzen Inkubation im Medium der Vitrifikation können die Eizellen in speziell entwickelte, offene Kryodevices gelegt und schließlich bei -196 °C in flüssigen Stickstoff getaucht werden, um bis zur Verwendung gelagert zu werden.

Hier wurde die gesamte klinische und Laboraufarbeitung einer Fruchtbarkeitserhaltungsbehandlung beschrieben, indem (i) Empfehlungen für eine objektive und evidenzbasierte Beratung skizziert wurden, (ii) die Kosteneffizienz des Verfahrens im Mittelpunkt stand und (iii) die am besten geeigneten Strategien beschrieben wurden, um die Eierstockreserve vollständig auszuschöpfen und die Anzahl der in kürzester Zeit entnommenen Eizellen zu maximieren. Die Bewertung der Eierstockreserve, die Definition eines idealen Stimulationsprotokolls sowie die Verfahren zur Entnahme, Denudation und Vitrifikation von Eizellen werden zusammen mit Ansätzen zur Maximierung ihrer Wirksamkeit, Effizienz und Sicherheit detailliert beschrieben. Da andere Protokolle oder Anpassungen dieses Protokolls in der Literatur existieren, gelten die repräsentativen Ergebnisse und die Diskussionsabschnitte dieses Manuskripts nur für dieses Verfahren.

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Protocol

1. Aufarbeitung und klinische Beratung

HINWEIS: Im Falle von Patienten, die aus onkologischen Gründen eine Erhaltung der Fruchtbarkeit benötigen, stellen Sie sicher, dass es keine Warteliste für die Planung der Konsultation gibt und der Termin so schnell wie möglich zur Verfügung gestellt wird.

  1. Untersuchen Sie die Krankengeschichte und die vorherige Dokumentation und beurteilen Sie den allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten.
  2. Zeichnen Sie alle Informationen (einschließlich der Genehmigung des Onkologen zur Stimulation der Eierstöcke bei Krebspatienten) in einer relationalen Datenbank auf.
  3. Bieten Sie dem Patienten eine spezifische Beratung über die Machbarkeit des Verfahrens. Erklären Sie die Schritte des Verfahrens (Stimulation der Eierstöcke, Eizellentnahme, Vitrifikation der Eizellen) und informieren Sie sie über die realistischen Erfolgschancen (hauptsächlich abhängig vom Alter der Mutter und der erwarteten Anzahl von MII-Eizellen zum Zeitpunkt der Eizellentnahme) sowie die Kosten und Einschränkungen des Verfahrens.
  4. Führen Sie einen transvaginalen Ultraschall durch, um Informationen über die Eierstockreserve (z. B. AFC) zu erhalten und die Zugänglichkeit der Eierstöcke für die Eizellentnahme zu beurteilen.
  5. Fordern Sie Bluttests zur Beurteilung der Blutgruppe und des Rhesusfaktors, des Gerinnungsscreenings (Blutbild, Prothrombin, Thromboplastin, Fibrinogen, Protein C, Protein S, Antithromboin III, Homocystein) und Infektionskrankheiten (Hepatitis B, Hepatitis C, HIV, Venereal Disease Research Laboratory / Treponema pallidum Hemagglutination Assay) an.
    HINWEIS: Im Falle von Patienten, die aus nicht dringenden medizinischen Gründen auf ein Fruchtbarkeitserhaltungsprogramm zugreifen, kann eine umfassendere Beurteilung basalfollikelstimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), Östradiol, AMH, Brustuntersuchung, Papanicolaou-Test, genetisches Screening der Gerinnung (Faktor V von Leiden und Prothrombin) und TORCH-Screening (Toxoplasmose, Röteln, Cytomegalievirus) umfassen.
  6. Fordern Sie eine kardiologische Beurteilung (Elektrokardiogramm) an.
  7. Empfehlen Sie psychologische Beratung.

2. Kontrollierte Stimulationsprotokolle der Eierstöcke zur Erhaltung der Fruchtbarkeit

HINWEIS: Wenn die verfügbare Zeit vor Beginn der Krebsbehandlung begrenzt ist, wird das Random-Start-Protokoll (d. H. Beginn der ovariellen Stimulation zu jeder Zeit während des Menstruationszyklus) für die Stimulation der Eierstöcke bei onkologischen Patientinnen empfohlen, die Kandidaten für die Erhaltung der Fruchtbarkeit sind. In einem Fruchtbarkeitserhaltungsprogramm aus nicht dringenden medizinischen oder sozialen Gründen ist eine konventionelle Stimulation ab der frühen Follikelphase vorzuziehen, und die Stimulation der Eierstöcke wird basierend auf dem Menstruationszyklus begonnen. Ansätze zur kontrollierten Ovarialstimulation (COS) sollten gemäß den jüngsten Richtlinien der Europäischen Gesellschaft für menschliche Reproduktion und Embryologie (ESHRE)24durchgeführt werden.

  1. Passen Sie COS an die Eigenschaften der Patientin und die Reservemarker der Eierstöcke an, hauptsächlich an das Alter der Mutter, FSH, AMH und AFC.
  2. Beginnen Sie COS am Tag 5 des Menstruationszyklus mit rekombinantem oder harnärem FSH mit einer festen Dosis von 150-300 IE / Tag (Antagonistenprotokoll).
    HINWEIS: In einer bestimmten Patientenpopulation mit LH-Mangel oder schlecht-suboptimalem Ansprechen kann zusätzliche LH 75/150 IE / Tag entsprechend der Ovarialreaktion, dem LH-Spiegel und dem Urteil des Gynäkologen verabreicht werden.
  3. Bei Patienten mit östrogenempfindlichen Erkrankungen gehören Gonadotropine, die mit Aromatasehemmern (Letrozol) vom Tag 1 der Stimulation bis zum Tag 7 nach der Eizellentnahme assoziiert sind.
  4. Verabreichen Sie eine feste Dosis Gonadotropine für 4 Tage.
  5. Überwachen Sie das Follikelwachstum am Tag 5 und dann alle 2-3 Tage; Passen Sie schließlich die Gonadotropin-Dosierung an.
  6. Sobald mindestens 3 Follikel einen Durchmesser von 17-18 mm erreicht haben, verabreichen Sie den Auslöser für die endgültige Eizellreifung mit einem einzigen subkutanen Bolus des GnRH-Agonisten in der Dosis von 0,5 ml.

3. Eizellentnahme

  1. Vorbereitung auf die Eizellentnahme
    1. Für die erforderlichen Materialien, lesen Sie die Tabelle der Materialienund halten Sie Laborschuhe und -outfit, chirurgische Gesichtsmaske, Haarabdeckung, chirurgische Handschuhe, einen permanenten ungiftigen Marker, Pinzetten, sterile kleine Gazen, Einweg- oder wiederverwendbare Spekulum, vaginale chirurgische Geräte und Oberflächendesinfektionsmittel bereit. Stellen Sie die Verfügbarkeit von Wiederbelebungsgeräten, Anästhetika zur Umkehrung, einem für die Behandlung von anaphylaktischen Schocks vorbereiteten Kit und Sauerstoff im Operationssaal sicher.
    2. Führen Sie das Eizellentnahmeverfahren gemäß den Empfehlungen der ESHRE-Arbeitsgruppe für Ultraschall in assistierten Reproduktionstechnologien (ART)25 durch.
      1. Sedierung oder Vollnarkose und Antibiotika zur Prophylaxe verabreichen.
        HINWEIS: In diesem Protokoll wurde eine tiefe Sedierung durch die Gabe von Propofol (dessen Dosierung je nach Gewicht des Patienten angepasst wird) und 50-100 μg Fentanyl, 1000 mg Paracetamol und assistierte Maskenbeatmung mit Sauerstoff erreicht.
      2. Führen Sie die Eizellentnahme mit einer Aspirationseinheit durch, die aus einer Vakuumpumpe, einem Sammelrohr, das mit einer 17-G-Einlumennadel verbunden ist, und einem Eizellensammelschlauch besteht. Überschreiten Sie während der Entnahme nicht einen Druck von ~ 120 mmHg, um das Risiko einer Schädigung der Eizellen wie das Abstreifen der Kumuluszellen oder das Brechen der Zona pellucida zu vermeiden.
      3. Kalibrieren Sie die Arbeitsoberflächentemperatur, um 37 °C in den Nährmedien sicherzustellen. Minimieren Sie während des gesamten Verfahrens die Exposition der Eizellen gegenüber einer temperaturbeglichen Temperatur, die ihre Entwicklungskompetenz beeinträchtigen kann.
      4. Beobachten Sie die Patientin am Ende der Eizellentnahme 3-4 Stunden vor der Entlassung.
  2. Operationssaal
    1. Bevor Sie den Operationssaal betreten, identifizieren Sie den Patienten und bestätigen Sie den Zeitpunkt des Eisprungauslösers.
    2. Lassen Sie die Patientin in gynäkologischer Position auf dem Operationstisch liegen.
    3. Reinigen Sie die Vagina / den Gebärmutterhals vor der Eizellentnahme, um die bakterielle Kontamination zu minimieren.
    4. Führen Sie einen vorläufigen transvaginalen Ultraschall durch, um die Position der Eierstöcke und die anatomischen Beziehungen zu den verschiedenen Organen und Blutgefäßen zu beurteilen.
    5. Führen Sie unter Ultraschallführung eine Ein-Lumen-Nadel durch die Vaginalwand und in einen Eierstockfollikel ein, wobei Sie darauf achten, die Organe oder Blutgefäße zwischen der Vaginalwand und dem Eierstock nicht zu verletzen.
    6. Beginnen Sie mit der Aspiration vom nächsten Follikel aus und gehen Sie zu den distalsten über.
    7. Punktieren Sie alle Follikel mit einem Durchmesser von mehr als 11-12 mm und führen Sie "Drehbewegungen" der Nadel durch, um die gesamte Follikelflüssigkeit abzusaugen, die dann in ein steriles Rohr (runder Boden 14 ml) freigesetzt wird, das in der Blockheizung des Operationssaals vorgewärmt wird.
    8. Versiegeln und beschriften Sie den Schlauch unmittelbar nach der Entnahme mit Details zur Identität des Patienten.
    9. Stellen Sie sicher, dass die Krankenschwester die Röhre ins Labor bringt, wo sie sofort auf das Vorhandensein von Kumulus-Eizell-Komplexen (COCs) untersucht wird.
    10. Weisen Sie die Embryologen an, den Kliniker über die Gesamtzahl der abgerufenen COCs zu informieren.
    11. Sobald der Eingriff für den ersten Eierstock abgeschlossen ist, spülen Sie die Nadel mit sauberem Medium und fahren Sie mit dem zweiten Eierstock mit dem gleichen Verfahren fort.
    12. Bewerten Sie nach der Eizellentnahme blutungen aus den Eierstöcken oder Blutgefäßen des Parametriums und der freien Flüssigkeit im Beutel von Douglas.
      HINWEIS: Um die Wirksamkeit der Rückverfolgbarkeit von Gameten und Embryonen auf klinischer Ebene zu automatisieren und zu verbessern, wurde im Zentrum ein elektronisches Zeugensystem (EWS) implementiert26. Dennoch erwähnt dieses Protokoll nicht das EWS, um die Reproduzierbarkeit des Protokolls in jedem IVF-Labor zu gewährleisten. Bedenken Sie jedoch, dass alle Schritte des Verfahrens einen zweiten Bediener (d. H. Einen Zeugen) erfordern, um die Rückverfolgbarkeit von Gameten und Embryonen zu gewährleisten.

4. IVF-Labor

  1. Am Tag vor der Eizellentnahme
    1. Bereiten Sie Eizellensammelröhrchen vor (siehe Materialtabelle).
      1. Geben Sie 1 ml IVF-Medium (siehe Materialtabelle)in jedes Eizellensammelröhrchen (runder Boden, 5 ml) und bedecken Sie es mit 0,2 ml Mineralöl (siehe Materialtabelle)für die Embryokultur.
        HINWEIS: Die Anzahl der Röhrchen wird entsprechend der Anzahl der Follikel definiert, die voraussichtlich abgerufen werden. Jede Tube kann bis zu 4 COCs enthalten.
    2. Verschließen Sie die Schläuche mit der Kappe (erster Schnappschuss). Beschriften Sie die Röhrchen mit Angaben zur Art des Mediums und zum Herstellungsdatum. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei 37 °C in kontrollierter Atmosphäre (6% CO2, 5% 02).
  2. Am Tag der Eizellentnahme
    1. Die Kunststoffvorräte bei 37 °C vorwärmen (sterile Kulturschalen und Pasteur-Pipetten).
    2. Bitten Sie die Patientinnen, ihre Identität (vollständiger Name und Geburtsdatum) und den Zeitpunkt des Eisprungauslösers zu bestätigen. Kommentieren Sie auf dem Laborblatt, dass das Identifizierungsverfahren (ID) durchgeführt wurde und dass der Zeitpunkt des Eisprungauslösers bestätigt wurde.
    3. Nehmen Sie die Eizellensammelröhrchen aus dem Inkubator (kurz vor Beginn des Eingriffs) und drücken Sie die Kappe nach unten, um einen festen Verschluss zu gewährleisten. Beschriften Sie die Eizellentnahmeröhrchen mit den Informationen der Patientin. Legen Sie die Eizellensammelröhrchen bei 37 °C in die Blockheizung.
    4. Untersuchen Sie die Follikelflüssigkeit in den vorgewarmten sterilen Kulturschalen und identifizieren Sie COCs. Sobald ein oder mehrere COCs identifiziert sind, spülen Sie sie zweimal in zwei Tropfen Medium, um die Follikelflüssigkeit und die Blutkontamination zu entfernen.
    5. Übertragen Sie die COCs in die Eizellensammelröhrchen und kommentieren Sie die Anzahl der COCs auf der Tube. Lösen Sie die Kappen der Mediumröhrchen und inkubieren Sie sie umgehend bei 37 °C in einer Atmosphäre von 6%CO2,5%O2.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 7 bis 9 entsprechend der Anzahl der entnommenen Eizellen. Aktualisieren Sie das Laborblatt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass ein Zeuge überprüft, ob alle Röhrenerwärmungsblöcke (einschließlich der im Operationssaal) leer sind und den Abschluss des Verfahrens auf dem Laborblatt unterschreibt.
    7. Wischen Sie die Arbeitsphase nach Abschluss des Vorgangs ab.

5. Eizelldenudation

  1. Vorwarmes 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)-gepuffertes Medium und Hyaluronidase (siehe Materialtabelle)bei 37 °C mindestens 1 h vor Beginn.
  2. Bereiten Sie eine 4-Well-IVF-Platte (siehe Materialtabelle)mit 0,6 ml /Vertiefung vorgewärmtem HEPES-gepuffertem Medium (ergänzt mit 5% humanem Serumalbumin [HSA]) vor, das mit 0,3 ml Mineralöl für die Embryokultur bedeckt ist, und erwärmen Sie es bei 37 °C für mindestens 30 Minuten.
  3. Beschriften Sie die Eizelldenudationsplatte mit Details zur Identität der Patientin.
  4. Unmittelbar vor Beginn des Verfahrens hyaluronidase in die erste Vertiefung geben, um eine Endkonzentration von etwa 20 IE / ml zu erhalten.
  5. Legen Sie eine begrenzte Anzahl von COCs (bis zu 6) in die erste Vertiefung, die das Enzym enthält, um die Kumuluszellen zu dispergieren.
  6. Um die enzymatische Entfernung der Kumulus- und Koronazellen zu verbessern, führen Sie das von Kumuluszellen durch, indem Sie die Eizellen wiederholt durch eine Pasteur-Pipette mit einem Innendurchmesser von etwa 250 μm für bis zu 30 s pipettieren. Nachdem eine anfängliche Zelldissoziation beobachtet wurde, übertragen Sie die Eizellen in die zweite Vertiefung, die nur HEPES-gepuffertes Medium enthält, und achten Sie darauf, eine minimale Menge des Enzyms zu transportieren.
  7. Führen Sie eine weitere Denudation durch, um die Koronazellen zu entfernen, indem Sie Entwundungspipetten mit abnehmenden Innendurchmessern (170-145 μm) verwenden. Verwenden Sie niedrigere Durchmesser (135μm) nur, wenn dies unbedingt erforderlich ist.
  8. Waschen Sie die entzähten Eizellen vorsichtig, um das Enzym auszuwaschen.
  9. Untersuchen Sie nach der Denudation die Eizellen unter einem invertierten Mikroskop, um ihre Integrität und ihr Reifestadium zu beurteilen. Trennen Sie MII-Eizellen von den unreifen (Keimbläschen und Metaphase-I).
  10. Bewegen Sie die MII-Eizellen in den Vitrifikationsbereich, um sofort eine Kryokonservierung durchzuführen. Aktualisieren Sie das Laborblatt.

6. Vitrifikation der Eizellen

HINWEIS: Führen Sie die Eizellvitrifikation vorzugsweise innerhalb von 38 h nach der Eizellentnahme und unmittelbar nach der Denudation durch. Das hier beschriebene Vitrifikationsverfahren muss bei Raumtemperatur (RT) und unter Verwendung einer Stripperpipette mit einem Innendurchmesser von 170 μm durchgeführt werden, um Eizellen bei der Manipulation nicht zu beschädigen.

  1. Ca. 30 minuten vor dem Eingriff die Gleichgewichtslösung (ES) und die Vitrifikationslösung (VS) auf RT (25-27 °C) bringen.
  2. Beschriften Sie die Kryodevices ordnungsgemäß mit dem Namen und der ID der Patientin, der Behandlungs-ID, dem Datum des Einfrierens, der Anzahl der Eizellen und dem Kryobarcode.
  3. Füllen Sie ein Einweg-Kühlregal bis oben mit frischem flüssigem Stickstoff und starten Sie den Sterilisationsprozess.
  4. Beschriften Sie die Vitrifikationsplatte (siehe Materialtabelle)mit dem Namen und der ID des Patienten. Bitten Sie einen Zeugen, die korrekte ID der Kryodevices zu überprüfen.
  5. Kehren Sie jede Durchstechflasche vorsichtig zweimal um, um ihren Inhalt vor Gebrauch zu mischen, und bereiten Sie den Deckel einer 6 mm Petrischale mit einem Tropfen 30 μL HEPES-gepuffertes Medium (mit 5% HSA) und einem angrenzenden Tropfen von 30 μL ES vor.
    HINWEIS: Legen Sie Tropfen kurz vor dem Gebrauch, um die mittlere Verdunstung zu begrenzen.
  6. Legen Sie die Eizellen (bis zu 9) mit einer Stripperpipette mit einem Durchmesser von 170 μm in den ersten Tropfen mit einem möglichst kleinen Mediumsvolumen. Erzeugen Sie mit der Stripperpipette eine Mediumsbrücke zwischen dem Tropfen Nr. 1 und n.2, um eine allmähliche Erhöhung der Konzentration der CPAs zu erhalten (Abbildung 1A).
  7. Inkubieren Sie die Eizellen im ersten Tropfen für 3 Minuten. Fügen Sie einen dritten Tropfen 30 μL ES (n.3) hinzu. Nach 3 min die Eizellen in den zweiten ES-Tropfen geben und eine mittlere Brücke zwischen den Tropfen n.3 und n.2 schaffen (Abbildung 1B). Inkubieren Sie die Eizellen in Tropfen n.3 für 3 min.
  8. Fügen Sie während der Inkubation einen 30 μL-Tropfen ES für jedes kryodevice hinzu, das verwendet wird (wenn 9 Eizellen kryokonserviert werden sollen, legen Sie 3 Tropfen ES mit 3 Eizellen in jeden Tropfen ES). Bewegen Sie die Eizellen in reine ES-Lösung und lassen Sie sie für 6-9 Minuten (bis sie nach dem Schrumpfen ihre ursprüngliche Größe wiedererlangen) (Abbildung 1C).
  9. Bereiten Sie ein zentrales Brunnengericht (60 x 15 mm) mit 1 ml VS zu. Am Ende der ersten 6 Minuten werden die kryokonservierten Eizellen in die VS-Lösung übertragen und so wenig Medium wie möglich freigesetzt. Lassen Sie die Eizellen für 1 Minute in VS und waschen Sie sie vorsichtig, indem Sie sie von unten nach oben in der Schüssel bewegen, um den Überschuss an ES zu entfernen.
  10. Etwa 10 s vor dem Ende der Inkubationsminute legen Sie das Kryodevice unter das Mikroskop und stellen den Fokus auf die schwarze Markierung (dh die Spitze des Kryodevics) ein. Legen Sie die Eizellen auf das Kryodevic neben der schwarzen Markierung mit der minimalen Menge an VS (Abbildung 2A).
  11. Bewegen Sie die Stripperpipette von den Eizellen weg und entfernen Sie den Überschuss an VS-Medium (Abbildung 2B), so dass die Eizellen von einer dünnen Mediumschicht bedeckt bleiben (Abbildung 2C).
  12. Tauchen Sie das Kryodevic schnell in flüssigen Stickstoff und schütteln Sie es schnell, um Luftblasen von seiner Oberfläche zu entfernen. Halten Sie die Schutzkappe des Kryodevics mit einer Pinzette und füllen Sie sie mit flüssigem Stickstoff; Dann führen Sie das Kryodevic ein, während die Propylenstreifen in flüssigem Stickstoff gehalten werden.
  13. Bewahren Sie das Kryodevic in einer Visiotube auf, die zuvor mit den Informationen des Patienten beschriftet war. Aktualisieren Sie das Laborblatt.

7. Eizellerwärmung

  1. Ca. 30 minuten vor dem Eingriff die Auftaulösung (TS), die Verdünnungslösung (DS) und die Waschlösung (WS) auf RT (25-27 °C) erwärmen. Kehren Sie jede Durchstechflasche vorsichtig zweimal um, um ihren Inhalt zu mischen. 1 ml TS in eine zentrale Petrischale geben und bei 37 °C erwärmen, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen.
  2. Kennzeichnen Sie alle Kunststoffzubehörteile mit dem Namen und der ID des Patienten und der Art der Lösung. Bitten Sie einen Zeugen, die Informationen des Patienten über das Kryodevic zu bestätigen.
  3. Bereiten Sie für jedes zu erwärmende Kryodevice eine 6-Well-Platte mit 200 μL DS in der ersten Vertiefung und einer gleichen Menge WS in der zweiten und dritten (genannt WS1 bzw. WS2) vor. Fügen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder steriles Wasser im Bereich außerhalb der Brunnen hinzu, um eine Verdunstung zu verhindern.
  4. Nehmen Sie die TS-Schale aus dem Inkubator und legen Sie sie unter das Mikroskop. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops auf die Mitte der Petrischale ein.
  5. Drehen und entfernen Sie vorsichtig die Schutzkappe des Kryodevics, während die Propylenstreifen in flüssigem Stickstoff gehalten werden. Übertragen Sie das Kryodevic aus flüssigem Stickstoff so schnell wie möglich in das TS, um das Risiko einer Devitrifikation zu vermeiden und den Countdown (1 min) einzuleiten.
  6. Lokalisieren Sie die Eizellen, indem Sie sich auf die Spitze des Kryodevics (dh die schwarze Markierung) konzentrieren. Lösen Sie mit einer Stripperpipette die Eizellen aus dem Kryodevic.
    HINWEIS: Versuchen Sie, die Eizellen nicht aus dem Kryodevic zu aspirieren; Geben Sie vorsichtig einige Medien auf ihnen ab, bis sie in den TS übergehen.
  7. Übertragen Sie die Eizellen mit einer Stripperpipette mit einem Durchmesser von 170 μm mit einer kleinen Menge TS (um einen Gradienten zu erzeugen) auf DS und lassen Sie sie für 3 min im DS. Bewegen Sie die Eizellen ebenfalls zu WS1 und lassen Sie sie für 5 minuten. Zum Schluss die Eizellen für 1 min auf WS2 übertragen.
  8. Übertragen Sie die Eizellen in ein geeignetes vorgleiches IVF-Kulturmedium und inkubieren Sie sie für 1 h, bevor Sie mit der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) fortfahren. Aktualisieren Sie das Laborblatt.

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Representative Results

Überblick über das Fruchtbarkeitserhaltungsprogramm im Zentrum

Über einen Zeitraum von 12 Jahren (2008-2020) wurden 285 Frauen mindestens einer Eizellentnahme unterzogen, was die Vitrifizierung der gesamten Kohorte der gesammelten reifen Eizellen beinhaltete. Die meisten dieser Frauen (n = 250) wurden einer einzigen Entnahme unterzogen, und 35 wurden mehreren Abrufen unterzogen. Die Gründe für die Eizellentnahme zur Vitrifizierung von Eizellen sind in 4 Kategorien zusammengefasst: medizinisch (außer Krebs), Krebs, nicht medizinisch und andere. Unter den 250 Frauen, die sich einer einzigen Eizellentnahme zur Eivitrifikation unterzogen, hatten 8% andere medizinische Gründe als Krebs (10 Endometriose, 3 Myom, 4 Ovarialzysten, 1 Hydrosalpinx), 16% hatten Krebs (31 Brustkrebs, 3 Eierstockkrebs, 2 Darmkrebs, 2 Hodgkin-Lymphom, 1 Vulvakrebs e 1 Gebärmutterhalskrebs), 53% hatten nicht-medizinische Gründe und 23% hatten andere Gründe (43 Fehlende Spermien, 10 Risiko für OHSS, 4 Infektionen und 1 Fieber). Diese Verteilung war bei Patientinnen, die sich einer mehrfachen Eizellentnahme zur Vitrifizierung von Eizellen unterzogen, unterschiedlich. Insbesondere hatten 9% andere medizinische Gründe als Krebs (1 Endometriose, 2 reduzierte Eierstockreserve), 6% hatten Krebs (2 Brustkrebs), 80% hatten nicht-medizinische Gründe und 3% hatten andere Gründe (1 Fehlen von Spermien entnommen). Keine der Patientinnen, die sich einer mehrfachen Eizellentnahme zur Eivitrifikation unterzogen, erwärmte diese Eizellen, während 78 der 250 Frauen, die sich einem einzigen Eivitrifikationszyklus unterzogen, zurückkehrten, um diese Eizellen zu verwenden (Abbildung 3).

Tabelle 1 fasst die Daten der 250 Frauen zusammen, die sich einem einzelnen Eizellvitrifikationszyklus unterziehen, der nach den damit verbundenen Gründen gruppiert ist. Die Patientinnen mit einem medizinischen Grund für die Vitrifikation der Eizellen und die Patientinnen, die sich aufgrund von Krebs einer Fruchtbarkeitserhaltung unterzogen, waren jünger (mittleres Alter der Mutter < 35 Jahre) und zeigten eine bessere ovarielle Reserve (höhere AFCs) als die Patientinnen mit nicht-medizinischen oder anderen Gründen. Die mittleren Reiferaten (Anzahl der MII-Eizellen/Anzahl der entnommenen COCs) waren jedoch etwas niedriger (72-73% gegenüber 77-79%), so dass die Anzahl der im Durchschnitt verglasten Eizellen in den 4 Gruppen (9-10 Eizellen) ähnlich war. Wichtig ist, dass 9 von 40 onkologischen Patientinnen (22,5%) einem Random-Start-Ovarialstimulationsprotokoll unterzogen wurden, da sie vor Beginn der Chemo- oder Strahlentherapie nur eine begrenzte Zeit hatten. Interessant ist, dass etwa die Hälfte der Patienten mit anderen medizinischen Gründen als Krebs (53%) und die Mehrheit der Patienten mit anderen Gründen für die Vitrifikation der Eizellen (76%) tatsächlich zur Erwärmung zurückkehrten. Umgekehrt verwendeten nur sehr wenige Patientinnen, die sich einer Fruchtbarkeitserhaltung wegen Krebs (17,5%) oder nicht-medizinischen Gründen (13%) unterzogen hatten, ihre vitrifizierten Eizellen für IVF. Bemerkenswert ist auch die Zeit zwischen Vitrifikation und Erwärmung bei den zurückkehrenden Patienten: durchschnittlich 283 Tage bei Patienten mit anderen medizinischen Gründen als Krebs, 132 Tage bei Patienten mit anderen Gründen, 1264 Tage bei onkologischen Patienten und 1547 Tage bei Patienten mit nicht-medizinischen Gründen. Unabhängig von all diesen relevanten Unterschieden war die Überlebensrate zwischen den Patientinnen in den 4 Gruppen ähnlich (83-88%; im Durchschnitt wurden 8-11 Eizellen erwärmt und 7-9 Eizellen überlebten), was die Wirksamkeit und Sicherheit von Eizellverglasungs- und Erwärmungsprotokollen bestätigte. Darüber hinaus ist die Überlebensrate unabhängig von der Vitrifikation und der Erfahrung des Erwärmungsoperators (Abbildung 4A, B). Tabelle 1 zeigt die Befruchtungsraten in den 4 Gruppen, die ~70% betragen, mit Ausnahme der Patientinnen mit nicht-medizinischen Gründen für die Vitrifizierung der Eizellen (~80%). Diese Daten sind jedoch aufgrund eines geringen Stichprobenumfangs und der Verzerrung des Spermienfaktors auf das Befruchtungsergebnis nicht vergleichbar27.

Figure 1
Abbildung 1: Mittlere Tröpfchenkonfiguration für die Kryokonservierung von Eizellen. Um allmählich ein Gleichgewicht durchzuführen, werden die Eizellen zuerst in einen (A) Tropfen BS gelegt und mit (B) einem Tropfen ESgemischt. Nach 3 min Inkubation wird (C) ein dritter Tropfen ES-Lösunggemischt und die Eizellen werden für 6-9 min inkubiert. Abkürzungen: HEPES = 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure; BS = HEPES-gepuffertes Medium; ES = Gleichgewichtslösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Eizellbelastung auf Kryokonservierungsgerät. Die Eizellen werden auf dem Kryodevice in(A)einem einzigen kleinen Tropfen VS platziert. (B) Die Stripperpipette wird von den Eizellen wegverschoben, und (C) der Überschuss an VS wird erneut abgesaugt, um nur eine dünne Schicht um jede Eizelle zu hinterlassen. Abkürzung: VS = Vitrifikationslösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Vitrifikationszyklen der Eizellen, die am GENERA Zentrum für Reproduktionsmedizin in Rom durchgeführt wurden (Jahre 2008-2020). Über den Zeitraum von 12 Jahren wurden 250 Patientinnen einer einzigen Eizellentnahme zur Vitrifizierung von Eizellen unterzogen, während 35 mehrere Eizellentnahmezyklen durchliefen. Die inhärenten Gründe für die Vitrifikation der Eizellen sind in der Abbildung dargestellt. Die Zur Erwärmung zurückkehrenden Patientinnen (n=78) gehören nur zu der Gruppe der Frauen, die einen einzigen Eizellvitrifikationszyklus durchlaufen haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Mittlere Überlebensrate pro Kohorte erwärmter Eizellen. A) Erfahrung der Bediener mit Vitrifikation undB) Erwärmung. Jeder Patient ist nur für den ersten Erwärmungszyklus eingeschlossen. Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit dem Mann-Whitney U-Testbewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Zellmorphologie zu Beginn und am Ende des Gleichgewichtsverfahrens. Um das Ergebnis des Gleichgewichtsverfahrens zu bestimmen, kann es sinnvoll sein, die Eizellmorphologie (A) vor Beginn des Verfahrens zu kommentieren. (B) Nach der ersten Exposition gegenüber der Kryoprotektorenlösung wird eine starke Schrumpfung der Eizelle beobachtet. Das Gleichgewichtsverfahren kann als abgeschlossen angesehen werden, wenn (C) die Eizelle ihr ursprüngliches Volumen wiedererlangt hat. Maßstabsbalken = 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Grund für die Vitrifikation der Eizellen Andere medizinische Akte als Krebs (n=19) Krebs (n=40) Nicht-medizinisch (n=133) Sonstige (n=58)
Alter der Mutter bei der Entnahme der Eizellen, Mittelwert±SD 33.6±6.4 Jahre 34.6±5.9 Jahre 37.0±3.4 Jahre 38.2±4.3 Jahre
Basal fSH, mittel±SD 7,5±4,2 IE/L 7,6±1,7 IE/L 7,8±4,1 IE/L 8,8±5,2 IE/L
AMH, Mittelwert±SD 1,8±1,7 ng/ml 1,9±0,2 ng/ml 2,2±2,4 ng/ml 3,0±2,5 ng/ml
AFC, Mittelwert±SD 12.7±5.0 13.3±7.0 11.6±6.1 10.7±6.7
BMI, Mittelwert±SD 20.1±1.5 21.8±1.6 20.2±3.1 22.9±3.6
Dauer der Stimulation, Mittelwert±SD 10,0±1,5 9.6±1.7 9.9±2.1 10.3±2.1
9/40, 22.5%
Zufälliger Start
COCs, gesamt, mittel±SD 239 551 1493 592
12.6±5.3 13.8±9.1 11.2±7.1 10.2±8.5
MII-Eizellen, gesamt, mittel±SD 167 400 1161 462
8.8±3.3 10.0±7.2 8.7±5.7 8.0±6.7
Reifungsrate, Mittelwert±SD 72,4±13,6% 72,1±19,6% 79,5±17,5% 77,4±22,2%
Patienten, die zur Erwärmung zurückkehren, Gesamtprozent der Patienten, die sich einer Vitrifizierung unterzogen haben 10/19, 52.6% 7/40, 17.5% 17/133, 12.8% 44/58, 75.9%
Tage zwischen Vitrifikation und erster Erwärmung, mittlere ±SD 283±225 1264±764 1547±709 132±203
Erwärmte MII-Eizellen, Gesamtmittelwert±SD 82 66 191 409
8.2±2.8 9.4±4.8 11.2±5.8 9.3±7.2
Überlebte MII-Eizellen, Gesamtmittelwert±SD 73 55 160 345
7.3±3.3 7.9±4.0 9.4±4.8 7.8±6.9
Überlebensrate, Mittelwert±SD 87,6±18,1% 83,2±1,7% 85,4% ±14,5% 84,7±21,9%
Spermienfaktor
N, n, % 5/10, 50% 4/7, 57% 13/17, 76% 13/44, 29%
Geldmarktfonds, n, % 3/10, 30% 3/7, 43% 3/17, 18% 17/44, 39%
HAFER, n, % 2/10, 20% - 1/17, 6% 11/44, 25%
NOA, n, % - - - 3/44, 7%
Düngerate, Mittelwert±SD 70,0±14,4% 70,0±17,0% 78,5±20,6% 71,0±24,3%

Tabelle 1: Patientinnen, die sich einem einzigen Zyklus der Vitrifizierung von Eizellen unterziehen. Abkürzungen: FSH = follikelstimulierendes Hormon; AMH = Anti-Müller-Hormon; BMI = Body-Mass-Index; COC = Cumulus-Eizellkomplexe; MII = Metaphase-II; N = normozoospermisch; MMF = moderater männlicher Faktor (1-2 Spermiendefekte); OAT = oligoasthenoteratozoospermic; NOA = nicht-obstruktive Azoospermie (Spermien wurden durch Hodenspermienextraktion gesammelt).

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Discussion

Klinische Überlegungen

Obwohl neue Strategien wie die Kryokonservierung von Eierstockgewebe und die In-vitro-Reifung erforscht wurden, ist die Vitrifikation von Eizellen nach COS die Goldstandardtechnik zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. In diesem Szenario sollte die Anzahl der entnommenen und kryokonservierten Eizellen in kürzester Zeit maximiert werden, da die meisten Krebspatientinnen möglicherweise nur von einem Eierstockzyklus profitieren, bevor sie mit ihrer Krebsbehandlung beginnen müssen. Daher ist ein geeignetes Stimulationsprotokoll der Eierstöcke entscheidend, um die Eierstockreserve vollständig auszuschöpfen und die kumulative Chance auf eine zukünftige Lebendgeburt zu erhöhen28, ein Ergebnis, das stark vom Alter der Mutter bei der Eizellentnahme abhängt. In dieser Hinsicht wurde noch kein ideales Alter für die Vitrifikation von Eizellen zur Erhaltung der Fruchtbarkeit vorgeschlagen29, und ein Konsens ist zwischen entweder 35 Jahren18 oder 37 Jahren30,31erforderlich . Die Erhaltung der Fruchtbarkeit sollte jedoch für alle Patientinnen, einschließlich Frauen über 37 Jahre, zugänglich sein, sofern sie eine angemessene Beratung zu den Erfolgsraten auf der Grundlage ihres Alters erhalten.

Das Protokoll und die Anfangsdosis der Medikamente sollten nach dem Urteil des Gynäkologen und vor allem basierend auf der verfügbaren Zeit32,33beschrieben werden. Der Beginn der konventionellen Stimulation in der frühen Follikelphase wird empfohlen, wenn die Zeit kein Problem darstellt. Bei Bedarf ist jedoch der Random-Start-Ansatz möglich, um Verzögerungen bei der Behandlung dringender Krebs- / medizinischer Behandlungen zu minimieren34,35. Es wurde berichtet, dass die follikuläre Entwicklung ein äußerst dynamischer Prozess ist, da mehrere Wellen der Follikelrekrutierung während eines einzigen Eierstockzyklus beschrieben wurden. Obwohl die biologischen Mechanismen hinter diesem Phänomen noch enthüllt werden müssen, können kompetente Eizellen unabhängig von der Phase des Menstruationszyklus, in der COS begonnen wird, entnommen und kryokonserviert werden36.

In diesem Zentrum wird die ovarielle Stimulation typischerweise mit dem GnRH-Antagonistenprotokoll und 150-300 IE / Tag rekombinantem FSH oder humanmen Menopausalgonadotropin durchgeführt. In bestimmten Populationen von Patienten, die älter als 35 Jahre sind, mit LH-Mangel oder suboptimalem Ansprechen nach Standard-COS, kann LH während coS hinzugefügt werden, um die Rekrutierung und das Wachstum von Follikeln durch eine synergistische Wirkung mit insulinähnlichem Wachstumsfaktor1 16,37,38zu erhöhen . Darüber hinaus wurde berichtet, dass das GnRH-Antagonistenprotokoll, gefolgt von einem GnRH-Agonisten-Trigger, ein kurzes, sicheres und äußerst bequemes Stimulationsprotokoll ist, um die ovarielle Reaktion zu maximieren und das Risiko für OHSS39zu minimieren. Bei Patienten mit östrogenempfindlichen Erkrankungen wie Brustkrebs werden Gonadotropine, die mit Aromatasehemmern wie Letrozol assoziiert sind,verabreicht 20.

Tatsächlich zeigte eine kürzlich durchgeführte Überprüfung, dass Letrozol eine ähnliche ovarielle Reaktion wie die konventionelle Stimulation ohne Komplikationen in Bezug auf angeborene Defekte, Malignitätsrezidivs und erhöhte Mortalitätbeinhaltet 40. In ähnlicher Weise könnte Tamoxifen während coS bei östrogenempfindlichen Tumoren verwendet werden, die wie Letrozol keinen Einfluss auf die Eizellkompetenz zeigten41,42. Dies muss jedoch in größeren Studien bestätigt werden. In diesem Zentrum wird Letrozol von Tag 1 der Stimulation bis tag 7 nach Eizellentnahme bei östradiolempfindlichen Tumoren verabreicht. Das Risiko für OHSS, die wichtigste Komplikation von COS, die auch die Behandlung mit Krebs weiter verzögern würde, sollte insbesondere bei jungen Patienten mit hohen AFCs berücksichtigt werden. In diesen Fällen hat sich die Auslösung des Eisprungs mit einem GnRH-Agonisten anstelle von humanem Choriongadotropin (hCG) als vorteilhaft erwiesen. Andere Probleme, die verhindert werden müssen, sind (i) Thromboembolie, die die Verabreichung von niedermolekularem Heparin während COS erfordert, und (ii) eine reduzierte ovarielle Reaktion nach COS43. Um Letzteres zu kompensieren, können zwei aufeinanderfolgende Stimulationen in einem einzigen Eierstockzyklus durchgeführt werden. Dieses neuartige unkonventionelle COS-Protokoll, bekannt als DuoStim, beinhaltet follikuläre und luteale Phasenstimulationen und zwei Eizellentnahmen in einem kurzen Zeitrahmen (~ 15 Tage) und sollte in Zukunft zur Erhaltung der Fruchtbarkeit untersucht werden44,45,46.

Andere mögliche Strategien zur Erhaltung der Fruchtbarkeit bei Frauen sind: (i) Kryokonservierung von Eierstockgewebe, die die einzige Option für präpubertäre Frauen ist. Diese Möglichkeit ist vielversprechend, um die reproduktive und endokrine Aktivität wiederherzustellen und Verzögerungen beim Beginn der Krebsbehandlung zu vermeiden, da keine hormonelle Stimulation erforderlich ist. Es ist jedoch immer noch experimentell und erfordert eine laparoskopische Operation mit späterer Transplantation, und es besteht das Risiko einer orthotopen Krebs-Wiederübertragung. (ii) Kryokonservierung von Embryonen, die eine höhere Überlebensrate nach der Erwärmung mit sich bringt, aber die Krebsbehandlung verzögert und die Beteiligung eines männlichen Partners oder Spenders erfordert, wodurch auch die zukünftige reproduktive Autonomie einer Frau eingeschränkt wird47. Darüber hinaus kann es in einigen Ländern gesetzlichen Beschränkungen unterliegen. In Anbetracht dieser Einschränkungen gilt die Vitrifikation der Eizellen als der etablierteste und ethisch akzeptableste Ansatz. Im Idealfall sollten alle großen Krankenhäuser, in denen Frauen, die im gebärfähigen Alter von Krebs betroffen sind, Programme zur Erhaltung der Fruchtbarkeit anbieten, und der gesamte Prozess sollte für diese Patienten kostenlos sein, um einen gleichberechtigten Zugang zu diesem Programm zu gewährleisten. Dennoch muss die Kryokonservierung von Eizellen ausschließlich in Zentren durchgeführt werden, die über genügend Fachwissen verfügen, um die Eizellkompetenz im Prozess nicht zu beeinträchtigen48.

Kritische Schritte im Vitrifikationsprotokoll und Fehlerbehebung

Vitrifikation ist ein Pseudo-Phasenübergang zweiter Ordnung (IUPAC-Kompendium der chemischen Terminologie), der eine glasartige Erstarrung in den Zellen induziert, die die Keimbildung und das Wachstum von Eiskristallen, dem Hauptursfaktor für Zellverletzungen, verhindert. Um eine ordnungsgemäße Vitrifikation zu erreichen, ist eine Kombination aus mindestens zwei CPAs (typischerweise Ethylenglykol und DMSO als Permeationsmittel und Saccharose als nicht durchdringendes Mittel) sowie einer extrem hohen Abkühlrate (>20.000 °C/min) erforderlich, die entweder durch Minimierung der Ladevolumina oder durch direkte Exposition der Proben gegenüber flüssigem Stickstoff (offene Geräte) erreicht wird. Da Eizellen die größten Zellen des Körpers sind, enthalten sie die größte Menge an Wasser. Daher sind sie empfindlicher gegenüber Gefrierverletzungen als Embryonen. Während der Kryokonservierung von Eizellen können Schäden an intrazellulären Organellen (z. B. zytoskelett oder meiotische Spindel), Veränderung der Membranpermeabilität, Zona pellucida-Verhärtung, Eizellaktivierung, Veränderung der biochemischen Wege und möglicherweise Zelltod auftreten49. Aus diesem Grund muss ein empfindliches Gleichgewicht zwischen mehreren Faktoren sichergestellt werden, um die Lebensfähigkeit und Entwicklungskompetenz der Eizellen erfolgreich zu erhalten. Um eine konsistente Überlebensrate nach der Vitrifikation zu erreichen und die Benchmark-Werte zu erreichen, müssen alle entscheidenden Schritte des Verfahrens streng kontrolliert werden.

CPAs, Zellosmolalität und Abkühlraten

Um die Wahrscheinlichkeit einer Vitrifikation zu erhöhen, muss die Viskosität des Mediums (und damit die CPA-Konzentration) maximiert werden. Die Toxizität der CPAs sollte jedoch immer unter Kontrolle gehalten werden50. Zu diesem Zweck ist es entscheidend, sowohl die Zeit der Zellexposition gegenüber den CPAs als auch die Ladevolumina zu minimieren und immer bei Raumtemperatur (25-27 °C)51 zuarbeiten. Andere Protokolle beinhalten verschiedene Kombinationen von CPAs und Kryodenvices und werden bei 37 °C durchgeführt; sie wurden hier jedoch nicht beschrieben. Daher gelten die Anmerkungen, repräsentativen Ergebnisse und Diskussionsabschnitte dieses Manuskripts nur für das hier beschriebene Vitrifikationsprotokoll.

Während der Kryokonservierung werden die Eizellen CPA-Lösungen mit erhöhter Osmolytkonzentration ausgesetzt, um die Zelldehydrierung und zytoplasmatische Schrumpfung zu fördern. Während der Erwärmung werden sie Lösungen mit verminderter Osmolytkonzentration ausgesetzt, um das zytoplasmatische Volumen wiederherzustellen. Während der Vitrifikation werden die Eizellen dehydriert, und unbeabsichtigte Schwankungen des Zellvolumens können einen schweren osmotischen Schock verursachen, wodurch das Überleben und das Entwicklungspotenzial nach der Erwärmung beeinträchtigt werden52. Die Suche nach der optimalen Abkühlrate ist ein Schlüsselaspekt für die Erhaltung der Zelllebensfähigkeit, da sie die Osmolalität53 und das Zellentwicklungspotenzial54beeinflusst. Wenn eine Zelle beispielsweise Abkühlraten ausgesetzt ist, die langsamer als die optimalen Raten sind, kann sie weitgehend hypertonen Bedingungen ausgesetzt sein, die zum Zelltod führen.

Um die optimale Abkühlrate zu erreichen, sollten die Ladevolumina minimiert werden, RT sollte so gesteuert werden, dass die Geschwindigkeit des Gleichgewichtsprozesses nicht beeinträchtigt wird, und die Proben sollten direkt flüssigem Stickstoff ausgesetzt werden. Eine Möglichkeit, zu beurteilen, wann das Gleichgewicht erreicht wurde, besteht darin, die Morphologie der Eizelle (insbesondere die Breite des Periviltellinraums und die Dicke der Zona pellucida) vor Beginn des Verfahrens zu kommentieren (Abbildung 5A). Nach einer ersten Phase der Zellvolumenreduktion (Abbildung 5B) wird erwartet, dass die Eizelle ihr Ausgangsvolumen wiedererlangt (Abbildung 5C). Obwohl der korrekte pH-Wert während der Behandlung von Eizellen unter Luftatmosphäre aufgrund der Zwitterionen, die die Vitrifikations-Erwärmungslösungen puffern, aufrechterhalten wird, ist die mittlere Osmolalität stattdessen besonders abhängig von der Temperatur53. Daher ist die Methode der Zubereitung von Gerichten entscheidend, um mögliche schädliche Auswirkungen zu reduzieren55.

Ölüberlagerung ist sicherlich entscheidend, um Verdunstung zu verhindern und eine Erhöhung der Osmolalität in den IVF-Medien zu vermeiden56. Es kann jedoch nicht während der Vitrifikations- und Erwärmungsverfahren verwendet werden. Daher sind einige Tipps für die Bediener wichtig: (i) bereiten Sie die Tröpfchen so schnell wie möglich und unmittelbar vor dem Gebrauch vor; (ii) größere Tröpfchenvolumina in Betracht ziehen, um Verschiebungen der Osmolarität zu minimieren (<30 μL wird nicht empfohlen); (iii) wenn die Umgebungsbedingungen nicht standardisiert werden können, kann eine 6-Well-Platte verwendet werden, und steriles Wasser oder PBS kann dem angrenzenden Reservoir hinzugefügt werden, um die Verdunstung zu begrenzen; iv) achten Sie auf das Datum des ersten Öffnens der Durchstechflasche mit Medium, da sich die Osmolalität bei wiederholtem Öffnen der Flasche ändern kann.

Eizellerwärmung und Eizell devitrifikation

Der wichtigste Schritt, der die Konsistenz der Überlebensrate beeinflussen kann, ist definitiv der Erwärmungsprozess57. Während dieses Schritts werden CPAs allmählich aus der Eizelle entfernt und verdünnt, um eine mögliche zytotoxische Wirkung zu verhindern. Devitrifikation, nämlich die Bildung von Eiskernen oder Eiskristallen während der Erwärmung einer verglasten Lösung oder versehentlich während der Prüfung, des Transports oder der Lagerung in Dampf, ist eines der Hauptrisiken der Vitrifikation58,59,60. Um devitrifizierung und Verletzungen während der Erwärmung zu vermeiden, muss daher der Temperaturunterschied zwischen dem ersten und dem letzten Schritt des Prozesses maximiert werden. Wie Seki und Mazur57 in murinen Eizellen zeigen, die einer Vitrifizierung und Erwärmung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten ausgesetzt sind, gilt: Je schneller die Erwärmung, desto höher das Überleben. Volumen und Temperatur des TS sind die Hauptfaktoren, die es zu kontrollieren gilt: TS sollte ordnungsgemäß auf 37 °C erwärmt werden (mindestens 1 h vor dem Eingriff), und das Flüssigstickstoff-Rack sollte bis zum Rand seiner Kapazität gefüllt und so nah wie möglich am Stereomikroskop platziert werden. Der Bediener sollte so schnell wie möglich sein, während er den Kryokonservierungsträger vom flüssigen Stickstoff zum TS überträgt. Aufgrund der hohen Effizienz der Vitrifikation kann unabhängig vom Gefrierprotokoll ein universelles Erwärmungsprotokoll verwendet werden, das die Verwaltung aller Erwärmungszyklen erleichtert, auch wenn Eizellen aus einem anderen IVF-Zentrum importiert werden61.

Offene Geräte und Kontaminationsrisiko

Der Einsatz offener Systeme und die direkte Exposition der Proben gegenüber flüssigem Stickstoff sind erforderlich, um die extrem hohen Kühl- und Erwärmungsraten zu erreichen, die die Wirksamkeit dieses Protokolls unterstützen. Obwohl die Vitrifikation ein Verfahren ist, das ein geringes Risiko für Kreuzkontaminationen darstellt, da es sich um sehr kleine Volumina handelt und nach mehreren Probenwaschungen durchgeführt wird, die die mutmaßliche Viruslast verdünnen, ist es wichtig, alle Vorsichtsmaßnahmen zu ergreifen, um die Sicherheit zu erhöhen. Basierend auf aktuellen Erkenntnissen bieten geschlossene Systeme zumindest für die Vitrifikation von Eizellen keine wettbewerbsfähige Alternative zu offenen Systemen62,63. Um die Wirksamkeit offener Vitrifikationssysteme aufrechtzuerhalten und gleichzeitig die risiken des direkten Kontakts mit flüssigem Stickstoff zu minimieren, kann dieser durch ultraviolette Bestrahlung sterilisiert werden64,65. Alternativ können Dampfspeicher verwendet werden, von denen bekannt ist, dass sie ein geringeres Kontaminationsrisiko darstellen als herkömmliche, sich aber als wirksam bei der Erhaltung der Lebensfähigkeit der Eizellen erwiesen haben66,67.

Bedeutung der ständigen Überwachung von Key Performance Indicators für Eizellvitrifikationsprogramme

In einem IVF-Labor ist die Überwachung von Key Performance Indicators (KPIs) essentiell für die Überwachung und ständige Verbesserung der Ergebnisse68. Im Allgemeinen sollten bei der Definition von KPIs zur Überwachung von Prozessen und Verfahren drei Hauptbereiche berücksichtigt werden: Struktur, Prozess und Ergebnis. Strukturelle KPIs messen die Qualität des IVF-Labors, indem sie die Eigenschaften der physischen und personellen Ressourcen skizzieren. Ein Beispiel für einen strukturellen KPI in Bezug auf die Anlage in einem Kryokonservierungsprogramm könnte die Anzahl der Kryotanks im Verhältnis zur Gesamtzahl der ART-Verfahren, die eine Kryokonservierung erfordern, die in einem bestimmten Zeitraum durchgeführt werden, oder die Anzahl der Kryotanks im Verhältnis zu den Gesamtquadratmetern des Kryoraums sein. Die Humanressourcen und insbesondere die Fähigkeiten des Bedieners sind jedoch von größter Bedeutung, wenn es um ein heikles Verfahren wie die Vitrifikation geht. Obwohl die Vitrifikationstechnik äußerst effektiv ist, ist sie ein anspruchsvolles Verfahren mit mehreren Verfahrensphasen mit strengen Timings, die streng kontrolliert werden müssen: Eine sehr kleine Menge eines signifikant viskosen Mediums sollte über einen sehr kurzen Zeitraum verwaltet werden.

An dem Verfahren ist keine Gefriermaschine mit spezifischen Kühlparametereinstellungen beteiligt; Daher sind die Standardisierung von Protokolldetails und Schulungen unerlässlich. Der manuelle Prozess hat strenge Qualifikationsanforderungen, die erfüllt werden müssen, um konsistente und hoch reproduzierbare Zellüberlebensraten zu erhalten. Jedem Unerfahrenen sollte eine spezifische Schulung zur Verfügung stehen, damit er in der Lage ist, alle kritischen Punkte des Verfahrens zu kontrollieren, insbesondere die Expositionszeit der Proben gegenüber CPAs und den Umgang mit den Zellen in einem hochviskosen Medium. Laut Dessolle und Co-Autoren69 sollte die Lernkurve für das Vitrifikationsverfahren jedoch auch für Nachwuchsembryologen nicht so lang sein, da das Erreichen von Fähigkeiten hauptsächlich durch Manipulationsherausforderungen begrenzt ist. Sobald das Fachwissen in der Vitrifizierung erreicht ist, muss die Leistung jedes einzelnen Bedieners durch die Verwendung von KPIs genau und regelmäßig überprüft werden, um die Aufrechterhaltung der in den Konsenspapieren festgelegten Kompetenzwerte regelmäßig zu bewerten70. Darüber hinaus muss das Vertrauen/die Kompetenz des Bedieners vergleichbar sein, um die Ergebnisse nicht zu beeinträchtigen.

Prozess-KPIs messen, wie gut das IVF-Labor funktioniert. Vitrifikations- und Erwärmungsprotokolle und -verfahren sollten rechtzeitig durchgeführt werden, und Schwankungen der Kulturbedingungen sollten minimiert werden, indem besonderes Augenmerk auf die Aufrechterhaltung einer angemessenen Osmolarität und Temperatur gelegt wird, um nicht nur die Kompetenz der Eizellentwicklung, sondern auch die Sicherheit des Bedieners beim Umgang mit flüssigem Stickstoff zu erhalten. Beispiele für Prozess-KPIs sind der Prozentsatz der Verletzungen des Laborpersonals beim Umgang mit flüssigem Stickstoff pro Anzahl von IVF-Verfahren pro Jahr, der Prozentsatz der Gameten/ Embryonen, die während der Vitrifikation / Erwärmung verloren gehen / beschädigt wurden, und Audits pro Anzahl von Verfahren pro Jahr.

Schließlich messen Outcome-KPIs die Wirksamkeit des IVF-Labors und beziehen sich im Allgemeinen auf das Überleben von Eizellen nach dem Krieg, definiert als der Anteil morphologisch intakter Eizellen zum Zeitpunkt der ICSI (im Falle einer Vitrifizierung der Eizellen sollte der Kompetenzwert >50% und der Benchmark-Wert 75% betragen70% 70). Darüber hinaus sind die Befruchtungsraten (<10% niedriger als die frischen Eizellen, die im Zentrum aus einer vergleichbaren Patientenpopulation befruchtet wurden), die Embryonalentwicklung (die gleiche wie eine vergleichbare Patientenpopulation mit frischen Eizellen) und die Implantation (<10-30% niedriger als eine vergleichbare Population frischer Embryonen im Zentrum) als Ergebnis-KPIs für vitrifizierte Eizellen anwendbar70. Klinische Ergebnisse unterliegen jedoch eher paarspezifischen Merkmalen als fehlerhaften klinischen Verfahren71,72.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Nichts

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

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References

  1. Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
  2. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  3. Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
  4. Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
  5. Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
  6. Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
  7. Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
  8. Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
  9. Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
  10. Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1 (2016).
  11. Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
  12. Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
  13. Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, Suppl 6 160-170 (2013).
  14. Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
  15. Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
  16. Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94 (2019).
  17. Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327 (2018).
  18. Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
  19. Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
  20. Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049 (2019).
  21. Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
  22. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
  23. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  24. Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
  25. ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025 (2019).
  26. Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
  27. Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
  28. Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
  29. Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
  30. Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
  31. Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
  32. Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
  33. Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
  34. Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
  35. Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
  36. Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
  37. Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
  38. Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
  39. Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
  40. Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
  41. Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
  42. Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
  43. Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
  44. Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
  45. Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317 (2018).
  46. Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
  47. Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
  48. Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
  49. Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
  50. Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
  51. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reproductive Biomedicine Online. 9 (6), 680-691 (2004).
  52. Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268 (2014).
  53. Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
  54. Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
  55. Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
  56. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  57. Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
  58. Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
  59. Jin, B., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biololgy of Reproduction. 82 (2), 444-450 (2010).
  60. Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
  61. Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
  62. Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
  63. Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123 (2018).
  64. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  65. Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
  66. Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
  67. Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
  68. Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
  69. Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
  70. Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
  71. Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
  72. Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).

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Biologie Ausgabe 175 Fruchtbarkeitserhaltung Stimulation der Eierstöcke Eizelle II Vitrifikation Erwärmung Key Performance Indicators (KPI)
Fruchtbarkeitserhaltung durch Eizellvitrifikation: Klinische und Laborperspektiven
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Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).

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