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Préservation de la fertilité par vitrification des ovocytes : perspectives cliniques et de laboratoire

Published: September 16, 2021 doi: 10.3791/61963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Summary

La cryoconservation des ovocytes est reconnue par plusieurs sociétés scientifiques internationales comme la norme d’or pour la préservation de la fertilité chez les femmes postpubères. Des stratégies cliniques et de laboratoire appropriées garantissent une efficacité, une efficience et une sécurité maximales des traitements de préservation de la fertilité.

Abstract

La préservation de la fertilité féminine est cruciale dans un système de santé multifonctionnel qui prend soin de la qualité de vie future des patients. La cryoconservation des ovocytes est reconnue par plusieurs sociétés scientifiques internationales comme la référence en matière de préservation de la fertilité chez les femmes postpubères, tant pour des indications médicales que non médicales. Les principales indications médicales sont les maladies oncologiques, les maladies gynécologiques telles que l’endométriose sévère, les maladies systémiques compromettant la réserve ovarienne et les conditions génétiques impliquant une ménopause prématurée. Cet article décrit l’ensemble du bilan clinique et de laboratoire d’un traitement de préservation de la fertilité en décrivant des recommandations pour des conseils objectifs et fondés sur des preuves. En outre, il se concentre sur l’efficacité de la procédure et décrit les stratégies les plus appropriées pour exploiter pleinement la réserve ovarienne et maximiser le nombre d’ovocytes prélevés dans les plus brefs délais. L’évaluation de la réserve ovarienne, la définition d’un protocole de stimulation idéal, ainsi que les procédures de prélèvement d’ovocytes, de dénudation et de vitrification ont été détaillées ainsi que des approches visant à maximiser leur efficacité, leur efficience et leur innocuité.

Introduction

Le développement et la mise en œuvre d’un programme efficace de cryoconservation des ovocytes humains ont été une percée importante en médecine de la reproduction. Selon des preuves récentes, la vitrification est la stratégie la plus efficace pour cryoconserver les ovocytes de la métaphase II (MII), car elle entraîne des taux de survie statistiquement plus élevés par rapport à la congélation lente, indépendamment de la population de patients (patients infertiles ou programme de don d’ovocytes)1,2,3. Les réalisations remarquables de la vitrification ovocytaire ont conduit les comités de pratique de l’American Society for Reproductive Medicine (ASRM) et de la Society for Assisted Reproductive Technology (SART) à déclarer que cette technique était la plus efficace pour la préservation élective de la fertilité chez les femmes postpubères, tant pour les indications médicales que non médicales4,5,6. Les indications médicales pour la préservation de la fertilité comprennent (i) le cancer et les maladies auto-immunes qui nécessitent des thérapies7 telles que la radiothérapie, la chimiothérapie cytotoxique et la thérapie endocrinienne (dont l’effet néfaste sur la réserve ovarienne est associé à l’âge maternel ainsi qu’au type et à la dose du traitement); ii) les maladies de l’ovaire nécessitant une chirurgie répétée ou radicale (comme l’endométriose)8; et (iii) des affections génétiques (p. ex., X-fragile) ou une insuffisance ovarienne prématurée. En outre, la préservation de la fertilité est devenue une option précieuse pour toutes les femmes qui n’ont pas atteint leur objectif parental pour des raisons non médicales (également connu sous le nom de gel social).

Quelle que soit l’indication pour la préservation de la fertilité et conformément aux principales directives internationales sur la préservation de la fertilité, tous les patients désireux de vitrifier leurs ovocytes doivent recevoir des conseils appropriés pour être informés de leurs chances réalistes de succès, des coûts, des risques et des limites de la procédure9,10 , 11,12,13. Plus important encore, il devrait être clair que la vitrification d’une cohorte d’ovocytes MII n’assure pas une grossesse, mais qu’elle offre une plus grande chance de succès pour le futur traitement de fécondation in vitro (FIV), si nécessaire14. À cet égard, l’âge de la femme au moment de la vitrification ovocytaire est certainement le facteur limitant le plus important15 car l’âge maternel avancé (AMA; >35 ans) est la principale cause d’infertilité féminine16. Outre une réduction progressive de la réserve ovarienne, l’AMA est associée à une altération de la compétence ovocytaire due à des voies physiologiques défectueuses telles que le métabolisme, la régulation épigénétique, les points de contrôle du cycle cellulaire et la ségrégation méiotique17. Par conséquent, le nombre raisonnable d’ovules à vitrifier dépend principalement de l’âge de la mère. Chez les femmes de moins de 36 ans, au moins 8 à 10 ovocytes MII18 sont nécessaires pour maximiser les chances de succès. En général, plus le nombre d’ovocytes vitrifiés est élevé, plus la probabilité de succès est élevée. Par conséquent, l’adaptation de la stimulation ovarienne en fonction de marqueurs de réserve ovarienne tels que les niveaux d’hormone anti-müllérienne (AMH) ou le nombre de follicules antraux (AFC) est cruciale pour exploiter pleinement la réserve ovarienne dans les plus brefs délais.

La sécurité de l’ensemble de la procédure est l’autre question clé lors de l’inscription de patients pour la préservation de la fertilité. Les cliniciens devraient employer les meilleures stratégies pour minimiser les risques et prévenir (i) le syndrome d’hyperstimulation ovarienne (SHO) en utilisant des approches sûres telles que le protocole d’antagoniste de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) suivi d’un déclencheur agoniste de la GnRH19 et (ii) les risques éloignés, mais possibles, de saignement péritonéal, de lésion des structures pelviennes (uretère, intestin, appendice, nerfs) ou d’infection pelvienne lors du prélèvement d’ovocytes. Enfin, (iii) les schémas thérapeutiques traditionnels de stimulation sont associés à l’œstradiol sérique supraphysiologique et ne sont donc pas recommandés dans les maladies sensibles aux œstrogènes telles que le cancer du sein. Les protocoles impliquant des inhibiteurs de l’aromatase (tels que le létrozole ou le tamoxifène) sont plus appropriés dans ces cas20,21. En laboratoire, le protocole le plus répandu pour la vitrification ovocytaire est encore celui décrit pour la première fois par Kuwayama et ses collègues2,23, qui consiste en une procédure par étapes impliquant l’ajout progressif de cryoprotecteurs (CPA). Dans la première phase (équilibre/déshydratation), les ovocytes sont exposés dans une solution de CPA contenant 7,5 % v/v d’éthylène glycol et 7,5 % v/v de diméthylsulfoxyde (DMSO), tandis que dans la deuxième phase, les ovocytes sont déplacés vers une solution de vitrification avec 15 % v/v d’éthylène glycol et 15 % v/v de DMSO, plus 0,5 mol/L de saccharose. Après une courte incubation dans le milieu de la vitrification, les ovocytes peuvent être placés dans des cryodispositifs ouverts spécialement conçus et finalement plongés dans de l’azote liquide à -196 °C pour être conservés jusqu’à utilisation.

Ici, l’ensemble du bilan clinique et de laboratoire d’un traitement de préservation de la fertilité a été décrit en (i) décrivant des recommandations pour un conseil objectif et fondé sur des preuves, (ii) en se concentrant sur le rapport coût-efficacité de la procédure et (iii) en décrivant les stratégies les plus appropriées pour exploiter pleinement la réserve ovarienne et maximiser le nombre d’ovocytes prélevés dans les plus brefs délais. L’évaluation de la réserve ovarienne, la définition d’un protocole de stimulation idéal, ainsi que les procédures de prélèvement d’ovocytes, de dénudation et de vitrification seront détaillées ainsi que des approches visant à maximiser leur efficacité, leur efficience et leur innocuité. Comme d’autres protocoles ou adaptations de ce protocole existent dans la littérature, les résultats représentatifs et les sections de discussion de ce manuscrit ne s’appliquent qu’à cette procédure.

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Protocol

1. Travail et counseling clinique

REMARQUE: Dans le cas de patients nécessitant une préservation de la fertilité pour des raisons oncologiques, assurez-vous qu’il n’y a pas de liste d’attente pour planifier la consultation et que le rendez-vous est fourni dès que possible.

  1. Examinez les antécédents médicaux et la documentation antérieure et évaluez l’état de santé général du patient.
  2. Enregistrer toutes les informations (y compris l’approbation de l’oncologue pour subir une stimulation ovarienne en cas de patientes atteintes de cancer) dans une base de données relationnelle.
  3. Fournir au patient des conseils spécifiques sur la faisabilité de la procédure. Expliquez les étapes de la procédure (stimulation ovarienne, prélèvement d’ovocytes, vitrification ovocytaire) et informez-la des chances réalistes de succès (principalement en fonction de l’âge maternel et du nombre prévu d’ovocytes MII au moment du prélèvement d’ovocytes), ainsi que du coût et des limites de la procédure.
  4. Effectuer une échographie transvaginale pour obtenir des informations sur la réserve ovarienne (c.-à-d. AFC) et pour évaluer l’accessibilité des ovaires pour la collecte d’ovules.
  5. Demander des tests sanguins pour évaluer le groupe sanguin et le facteur rhésus, le dépistage de la coagulation (numération globulaire, prothrombine, thromboplastine, fibrinogène, protéine C, protéine S, anti-thrombine III, homocystéine) et les maladies infectieuses (hépatite B, hépatite C, VIH, laboratoire de recherche sur les maladies vénériennes / test d’hémagglutination Treponema pallidum).
    REMARQUE: Dans le cas de patients accédant à un programme de préservation de la fertilité pour des raisons médicales non urgentes, une évaluation plus complète peut inclure l’hormone folliculo-stimulante basale (FSH), l’hormone lutéinisante (LH), l’œstradiol, l’AMH, l’examen des seins, le test Papanicolaou, le dépistage génétique de la coagulation (facteur V de Leiden et prothrombine) et le dépistage TORCH (toxoplasmose, rubéole, cytomégalovirus).
  6. Demander une évaluation cardiologique (électrocardiogramme).
  7. Recommander des conseils psychologiques.

2. Protocoles de stimulation ovarienne contrôlée pour la préservation de la fertilité

REMARQUE: Lorsque le temps disponible avant de commencer le traitement du cancer est limité, le protocole de démarrage aléatoire (c.-à-d. commencer la stimulation ovarienne à tout moment pendant le cycle menstruel) est recommandé pour la stimulation ovarienne chez les patientes oncologiques qui sont candidates à la préservation de la fertilité. Dans un programme de préservation de la fertilité pour des raisons médicales non urgentes ou sociales, une stimulation conventionnelle commençant au début de la phase folliculaire est préférable, et la stimulation ovarienne est commencée en fonction du cycle menstruel. Les approches de stimulation ovarienne contrôlée (COS) doivent être réalisées conformément aux récentes lignes directrices de la Société européenne de reproduction humaine et d’embryologie (ESHRE)24.

  1. Adapter le COS en fonction des caractéristiques de la patiente et des marqueurs de la réserve ovarienne, principalement l’âge maternel, la FSH, l’AMH et l’AFC.
  2. Commencez le COS le jour 5 du cycle menstruel en utilisant la FSH recombinante ou urinaire avec une dose fixe de 150-300 UI / jour (protocole antagoniste).
    REMARQUE: Dans une population spécifique de patientes présentant un déficit en LH ou une réponse sous-optimale médiocre, une augmentation de LH 75/150 UI / jour peut être administrée en fonction de la réponse ovarienne, des taux de LH et du jugement du gynécologue.
  3. Chez les patients atteints de maladies sensibles aux œstrogènes, inclure les gonadotrophines associées aux inhibiteurs de l’aromatase (létrozole) du jour 1 de la stimulation jusqu’au jour 7 après le prélèvement des ovocytes.
  4. Administrer une dose fixe de gonadotrophines pendant 4 jours.
  5. Surveiller la croissance folliculaire le jour 5, puis tous les 2-3 jours; finalement, ajustez la dose de gonadotrophine.
  6. Une fois qu’au moins 3 follicules atteignent 17-18 mm de diamètre, administrer le déclencheur de maturation finale des ovocytes avec un seul bolus sous-cutané d’agoniste de la GnRH à la dose de 0,5 mL.

3. Prélèvement d’ovocytes

  1. Préparation au prélèvement d’ovocytes
    1. Pour le matériel requis, reportez-vous à la Table des matériauxet gardez prêts les chaussures et la tenue de laboratoire, le masque chirurgical, la housse de cheveux, les gants chirurgicaux, un marqueur permanent non toxique, une pince à épier, de petites gazes stériles, du spéculum jetable ou réutilisable, de l’équipement de chirurgie vaginale et un désinfectant de surface. Assurer la disponibilité de l’équipement de réanimation, des médicaments anesthésiques pour l’inversion, d’une trousse préparée pour le traitement du choc anaphylactique et de l’oxygène dans la salle d’opération.
    2. Effectuer la procédure de prélèvement d’ovocytes conformément aux recommandations du groupe de travail de l’ESHRE sur les ultrasons dans les technologies de procréation assistée (ART)25.
      1. Administrer une sédation ou une anesthésie générale et des antibiotiques pour la prophylaxie.
        REMARQUE: Dans ce protocole, une sédation profonde a été obtenue en administrant du propofol (dont la posologie est ajustée en fonction du poids du patient) et 50 à 100 μg de fentanyl, 1000 mg de paracétamol et une ventilation assistée du masque avec de l’oxygène.
      2. Effectuer le prélèvement d’ovocytes à l’aide d’une unité d’aspiration composée d’une pompe à vide, d’un tube collecteur relié à une aiguille mono-lumen de 17 G et d’un tube collecteur d’ovocytes. Pendant le prélèvement, ne pas dépasser une pression d’environ 120 mmHg pour éviter le risque d’endommagement des ovocytes tels que le décapage des cellules du cumulus ou la fracturation de la zone pellucide.
      3. Calibrer la température de la surface de travail pour assurer une température de 37 °C dans le milieu de culture. Pendant toute la procédure, minimisez l’exposition des ovocytes à une température même transitoire qui peut affecter leurs compétences développementales.
      4. À la fin du prélèvement d’ovocytes, observez la patiente pendant 3-4 heures avant la sortie.
  2. Salle d’opération
    1. Avant d’entrer dans la salle d’opération, identifiez la patiente et confirmez l’heure du déclenchement de l’ovulation.
    2. Demandez à la patiente de s’allonger sur la table d’opération en position gynécologique.
    3. Nettoyer le vagin / col de l’utérus avant le prélèvement d’ovocytes pour minimiser la contamination bactérienne.
    4. Effectuer une échographie transvaginale préliminaire pour évaluer la position des ovaires et les relations anatomiques avec les différents organes et vaisseaux sanguins.
    5. Sous guidage échographique, insérez une aiguille à une seule lumière à travers la paroi vaginale et dans un follicule ovarien, en prenant soin de ne pas blesser les organes ou les vaisseaux sanguins situés entre la paroi vaginale et l’ovaire.
    6. Commencez l’aspiration à partir du follicule le plus proche et passez aux follicules les plus distaux.
    7. Perforer tous les follicules d’un diamètre supérieur à 11-12 mm, en effectuant des « mouvements de torsion » de l’aiguille pour aspirer tout le liquide folliculaire, qui est ensuite libéré dans un tube stérile (fond rond 14 mL) préchauffé dans le bloc chauffant de la salle d’opération.
    8. Immédiatement après la récupération, scellez et étiquetez le tube avec des détails sur l’identité du patient.
    9. Assurez-vous que l’infirmière apporte le tube au laboratoire, où il est immédiatement dépisté pour la présence de complexes cumulus-ovocytes (COC).
    10. Demandez aux embryologistes d’informer le clinicien du nombre total de COC récupérés.
    11. Une fois la procédure terminée pour le premier ovaire, rincez l’aiguille avec un milieu propre et procédez au deuxième ovaire en utilisant la même procédure.
    12. Après le prélèvement d’ovocytes, évaluer tout saignement des ovaires ou des vaisseaux sanguins du paramètre et du liquide libre dans la poche de Douglas.
      NOTE: Pour automatiser et améliorer l’efficacité de la traçabilité des gamètes et des embryons au niveau clinique, un système de témoin électronique (EWS) a été mis en place dans le centre26. Néanmoins, ce protocole ne mentionne pas l’EWS, pour assurer la reproductibilité du protocole dans tout laboratoire de FIV. Néanmoins, considérez que toutes les étapes de la procédure nécessitent un deuxième opérateur (c’est-à-dire un témoin) pour assurer la traçabilité des gamètes et des embryons.

4. Laboratoire de FIV

  1. La veille de la procédure de prélèvement d’ovocytes
    1. Préparer des tubes collecteurs d’ovocytes (voir la Table des matériaux).
      1. Distribuer 1 mL de milieu de FIV (voir la Table des matériaux)dans chaque tube de prélèvement d’ovocytes (fond rond, 5 mL), et couvrir avec 0,2 mL d’huile minérale (voir la Table des matériaux)pour la culture d’embryons.
        NOTE: Le nombre de tubes sera défini en fonction du nombre de follicules qui devraient être récupérés. Chaque tube peut contenir jusqu’à 4 COC.
    2. Scellez les tubes avec le capuchon (premier bouton-pression). Étiquetez les tubes avec des détails sur le type de milieu et la date de préparation. Incuber les tubes pendant la nuit à 37 °C dans une atmosphère contrôlée (6% CO2,5% 02).
  2. Le jour du prélèvement d’ovocytes
    1. Pré-pré-pré-déformation des approvisionnements en plastique à 37 °C (plats de culture stériles et pipettes Pasteur).
    2. Demandez aux patientes de confirmer leur identité (nom complet et date de naissance) et l’heure du déclenchement de l’ovulation. Annotez sur la feuille de laboratoire que la procédure d’identification (ID) a été accomplie et que le moment du déclenchement de l’ovulation a été confirmé.
    3. Retirez les tubes de prélèvement d’ovocytes de l’incubateur (juste avant le début de la procédure) et poussez le capuchon vers le bas pour assurer une fermeture étanche. Étiquetez les tubes de prélèvement d’ovocytes avec les informations de la patiente. Placez les tubes de prélèvement d’ovocytes dans le bloc chauffant à 37 °C.
    4. Examinez le liquide folliculaire dans les plats de culture stérile pré-avertis et identifiez les COC. Une fois qu’un ou plusieurs COC sont identifiés, rincez-les deux fois dans deux gouttes de milieu pour éliminer le liquide folliculaire et la contamination du sang.
    5. Transférer les COC dans les tubes de prélèvement d’ovocytes et annoter le nombre de COC sur le tube. Desserrer les bouchons des tubes moyens, et les incuber rapidement à 37 °C dans une atmosphère de 6% CO2,5%O2.
    6. Répétez les étapes 7 à 9 en fonction du nombre d’ovocytes prélevés. Mettez à jour la fiche de laboratoire.
      REMARQUE: Assurez-vous qu’un témoin vérifie que tous les blocs chauffants (y compris ceux de la salle d’opération) sont vides et signe la clôture de la procédure sur la feuille de laboratoire.
    7. Essuyez l’étape de travail après la fin de la procédure.

5. Dénudation des ovocytes

  1. Milieu tamponné à l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) préwarme et hyaluronidase (voir la table des matériaux)à 37 °C au moins 1 h avant le départ.
  2. Préparer une plaque de FIV à 4 puits (voir la Table des matériaux)avec 0,6 mL/puits de milieu tamponné HEPES pré-averti (complété par 5% d’albumine sérique humaine [HSA]) recouverte de 0,3 mL d’huile minérale pour la culture embryonnaire, et chaude à 37 °C pendant au moins 30 min.
  3. Étiquetez la plaque de dénudation des ovocytes avec les détails de l’identité de la patiente.
  4. Immédiatement avant de commencer la procédure, ajouter la hyaluronidase au premier puits pour obtenir une concentration finale d’environ 20 UI / mL.
  5. Placez un nombre limité de COC (jusqu’à 6) dans le premier puits contenant l’enzyme pour disperser les cellules du cumulus.
  6. Pour améliorer l’élimination enzymatique des cellules cumulus et corona, effectuez le décapage des cellules cumulus en pipetant les ovocytes à plusieurs reprises à travers une pipette Pasteur d’un diamètre intérieur d’environ 250 μm pendant 30 s. Après avoir observé une dissociation cellulaire initiale, transférer les ovocytes dans le deuxième puits contenant uniquement un milieu tamponné HEPES, en prenant soin de transporter une quantité minimale de l’enzyme.
  7. Effectuer une dénudation supplémentaire pour éliminer les cellules corona en utilisant des pipettes de dénudage avec des diamètres intérieurs décroissants (170-145 μm). Utilisez des diamètres inférieurs (135 μm) uniquement si cela est strictement nécessaire.
  8. Lavez soigneusement les ovocytes dénudés pour éliminer l’enzyme.
  9. Après la dénudation, examinez les ovocytes au microscope inversé pour évaluer leur intégrité et leur stade de maturation. Séparer les ovocytes MII des ovocytes immatures (vésicule germinale et métaphase-I).
  10. Déplacez les ovocytes MII vers la zone de vitrification pour effectuer immédiatement la cryoconservation. Mettez à jour la fiche de laboratoire.

6. Vitrification des ovocytes

REMARQUE: Effectuer la vitrification des ovocytes de préférence dans les 38 heures suivant le prélèvement d’ovocytes et immédiatement après la dénudation. La procédure de vitrification décrite ici doit être réalisée à température ambiante (RT) et en utilisant une pipette décapante d’un diamètre intérieur de 170 μm afin de ne pas endommager les ovocytes lors de la manipulation.

  1. Environ 30 minutes avant la procédure, porter la solution d’équilibrage (ES) et la solution de vitrification (VS) à RT (25-27 °C).
  2. Étiquetez correctement les cryodispositifs avec le nom et l’ID du patient, l’ID de traitement, la date de congélation, le nombre d’ovocytes et le code-barres du cryo.
  3. Remplissez une grille de refroidissement jetable jusqu’au sommet avec de l’azote liquide frais et commencez le processus de stérilisation.
  4. Étiquetez la plaque de vitrification (reportez-vous à la table des matériaux)avec le nom et la pièce d’identité du patient. Demandez à un témoin de vérifier l’ID correct des cryodispositifs.
  5. Inverser soigneusement chaque flacon deux fois pour mélanger son contenu avant utilisation, et préparer le couvercle d’une boîte de Petri de 6 mm avec une goutte de 30 μL de milieu tamponné HEPES (avec 5% HSA) et une goutte adjacente de 30 μL d’ES.
    REMARQUE: Placez les gouttes juste avant utilisation pour limiter l’évaporation du milieu.
  6. À l’aide d’une pipette décapante de 170 μm de diamètre, placez les ovocytes (jusqu’à 9) dans la première goutte avec le plus petit volume de milieu possible. À l’aide de la pipette de décapage, créer un pont de milieu entre la goutte n.1 et n.2 pour obtenir une augmentation progressive de la concentration des CPA (Figure 1A).
  7. Incuber les ovocytes dans la première goutte pendant 3 minutes. Ajouter une troisième goutte de 30 μL d’ES (n.3). Après 3 min, transférer les ovocytes dans la deuxième goutte d’ES, et créer un pont moyen entre les gouttes n.3 et n.2 (Figure 1B). Incuber les ovocytes en goutte n.3 pendant 3 min.
  8. Pendant l’incubation, ajoutez une goutte de 30 μL d’ES pour chaque cryodispositif qui sera utilisé (si 9 ovocytes doivent être cryoconservés, placez 3 gouttes de ES avec 3 ovocytes dans chaque goutte d’ES). Déplacez les ovocytes dans une solution ES pure et laissez-les pendant 6 à 9 minutes (jusqu’à ce qu’ils retrouvent leur taille initiale après le rétrécissement) (Figure 1C).
  9. Préparer un plat de puits central (60 x 15 mm) avec 1 mL de VS. À la fin des 6 premières minutes, transférer les ovocytes à cryoconserver dans la solution VS, en libérant le moins de milieu possible. Laissez les ovocytes dans VS pendant 1 min et lavez-les soigneusement en les déplaçant du bas vers le haut du plat pour éliminer l’excès de SE.
  10. Environ 10 s avant la fin de la minute d’incubation, placez le cryodispositif sous le microscope et ajustez la mise au point sur la marque noire (c.-à-d. la pointe du cryodispositif). Placer les ovocytes sur le cryodispositif à côté de la marque noire avec la quantité minimale de VS (Figure 2A).
  11. Éloignez la pipette du décapant des ovocytes et retirez l’excès de milieu VS (Figure 2B) afin que les ovocytes restent recouverts d’une fine couche de milieu (Figure 2C).
  12. Plongez rapidement le cryodispositif dans de l’azote liquide, en le secouant rapidement pour éliminer les bulles d’air de sa surface. Tenez le capuchon protecteur du cryodispositif avec une pince à épiler et remplissez-le d’azote liquide; puis insérez le cryodispositif à l’intérieur tout en gardant les bandes de propylène dans de l’azote liquide.
  13. Stockez le cryodispositif dans un visiotube préalablement étiqueté avec les informations du patient. Mettez à jour la fiche de laboratoire.

7. Réchauffement des ovocytes

  1. Environ 30 minutes avant l’intervention, réchauffer la solution de décongélation (TS), la solution de dilution (DS) et la solution de lavage (WS) à RT (25-27 °C). Inverser soigneusement chaque flacon deux fois pour mélanger son contenu. Placer 1 mL de TS dans une boîte de Petri de puits central et la réchauffer à 37 °C pendant au moins 1 h avant de commencer la procédure.
  2. Étiquetez toutes les fournitures en plastique avec le nom et l’identifiant du patient et le type de solution. Demandez à un témoin de confirmer les informations du patient sur le cryodispositif.
  3. Pour chaque cryodispositif à réchauffer, préparez une plaque de 6 puits avec 200 μL de DS dans le premier puits et une quantité égale de WS dans les deuxième et troisième puits (nommés WS1 et WS2, respectivement). Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou de l’eau stérile dans la zone à l’extérieur des puits pour éviter l’évaporation.
  4. Sortez la boîte TS de l’incubateur et placez-la sous le microscope. Ajustez la mise au point du microscope au centre de la boîte de Pétri.
  5. Tournez et retirez soigneusement le capuchon protecteur du cryodispositif, tout en conservant les bandes de propylène dans de l’azote liquide. Transférer le cryodispositif de l’azote liquide dans le TS le plus rapidement possible pour éviter le risque de dévitrification et lancer le compte à rebours (1 min).
  6. Localisez les ovocytes en se concentrant sur l’extrémité du cryodispositif (c’est-à-dire la marque noire). À l’aide d’une pipette décapante, libérez les ovocytes du cryodispositif.
    REMARQUE: Essayez de ne pas aspirer les ovocytes du cryodispositif; relâchez doucement des médias sur eux jusqu’à ce qu’ils se déplacent dans le TS.
  7. À l’aide d’une pipette décapante de 170 μm de diamètre, transférez les ovocytes dans DS avec une petite quantité de TS (pour créer un gradient) et laissez-les dans le DS pendant 3 min. Déplacez les ovocytes vers WS1 de même, et laissez-les pendant 5 min. Enfin, transférez les ovocytes à WS2 pendant 1 min.
  8. Transférer les ovocytes dans un milieu de culture de FIV prééquilibré approprié et les incuber pendant 1 h avant de procéder à une injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI). Mettez à jour la fiche de laboratoire.

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Representative Results

Aperçu du programme de préservation de la fertilité au centre

Sur une période de 12 ans (2008-2020), 285 femmes ont subi au moins un prélèvement d’ovocytes impliquant la vitrification de toute la cohorte d’ovules matures collectés. La plupart de ces femmes (n = 250) ont subi une seule récupération, et 35 ont subi plusieurs récupérations. Les raisons de subir un prélèvement d’ovocytes pour la vitrification des ovules sont résumées en 4 catégories: médical (sauf pour le cancer), cancer, non médical et autres. Parmi les 250 femmes subissant un seul prélèvement d’ovocytes pour la vitrification des ovules, 8 % avaient des raisons médicales autres que le cancer (10 endométrioses, 3 myomes, 4 kystes ovariens, 1 hydrosalpinx), 16 % avaient un cancer (31 cancer du sein, 3 cancers de l’ovaire, 2 cancer colorectal, 2 lymphomes de Hodgkin, 1 cancer de la vulve et 1 cancer du col de l’utérus), 53 % avaient des raisons non médicales et 23 % avaient d’autres raisons (43 absence de spermatozoïdes récupérés, 10 risque de SHO, 4 infections et 1 fièvre). Cette distribution était différente chez les patientes subissant plusieurs prélèvements d’ovocytes pour la vitrification des ovules. Plus précisément, 9 % avaient des raisons médicales autres que le cancer (1 endométriose, 2 réserves ovariennes réduites), 6 % avaient un cancer (2 cancers du sein), 80 % avaient des raisons non médicales et 3 % avaient d’autres raisons (1 absence de spermatozoïdes récupérés). Aucune des patientes subissant plusieurs prélèvements d’ovocytes pour la vitrification des ovules n’a réchauffé ces ovules, tandis que 78 des 250 femmes subissant un seul cycle de vitrification des ovules sont retournées utiliser ces ovocytes (Figure 3).

Le tableau 1 résume les données des 250 femmes subissant un seul cycle de vitrification ovocytaire regroupé selon les raisons connexes. Les patientes ayant une raison médicale pour la vitrification des ovules et les patientes subissant une préservation de la fertilité en raison d’un cancer étaient plus jeunes (âge maternel moyen < 35 ans) et présentaient une meilleure réserve ovarienne (APC plus élevé) que les patientes ayant des raisons non médicales ou autres. Cependant, les taux de maturation moyens (nombre d’ovocytes MII / nombre de COC récupérés) étaient légèrement inférieurs (72-73% contre 77-79%), de sorte que le nombre d’ovocytes vitrifiés en moyenne était similaire dans les 4 groupes (9-10 ovocytes). Fait important, 9 patientes oncologiques sur 40 (22,5%) ont subi un protocole de stimulation ovarienne à démarrage aléatoire parce qu’elles avaient peu de temps avant de commencer la chimiothérapie ou la radiothérapie. Il est intéressant de noter qu’environ la moitié des patients ayant des raisons médicales autres que le cancer (53%) et la majorité des patients ayant d’autres raisons de vitrification des œufs (76%) sont en fait revenus pour le réchauffement. Inversement, très peu de patients ayant subi une préservation de la fertilité pour un cancer (17,5%) ou pour des raisons non médicales (13%) ont utilisé leurs ovocytes vitrifiés pour la FIV. Le temps écoulé entre la vitrification et le réchauffement chez les patients qui sont revenus est également remarquable: en moyenne, 283 jours chez les patients ayant des raisons médicales autres que le cancer, 132 jours chez les patients ayant d’autres raisons, 1264 jours chez les patients oncologiques et 1547 jours chez les patients ayant des raisons non médicales. Indépendamment de toutes ces différences pertinentes, le taux de survie était similaire (83-88%; en moyenne, 8-11 ovocytes ont été réchauffés et 7-9 ovocytes ont survécu) entre les patients des 4 groupes, confirmant ainsi l’efficacité et la sécurité des protocoles de vitrification et de réchauffement des ovocytes. De plus, le taux de survie est indépendant de la vitrification et de l’expérience de l’opérateur de réchauffement(Figure 4A,B). Le tableau 1 montre les taux de fécondation dans les 4 groupes, qui sont d’environ 70%, à l’exception des patients ayant des raisons non médicales de vitrification ovocytaire (~80%). Cependant, ces données ne sont pas comparables en raison de la petite taille de l’échantillon et du biais du facteur spermatozoïde sur le résultat de la fécondation27.

Figure 1
Figure 1: Configuration des gouttelettes moyennes pour la cryoconservation des ovocytes. Pour effectuer progressivement l’équilibrage, les ovocytes sont d’abord placés dans une goutte(A)de BS et mélangés avec(B)une goutte d’ES. Après 3 min d’incubation, (C) une troisième goutte de solution ES est mélangée, et les ovocytes sont incubés pendant 6-9 min. Abréviations : HEPES = acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique; BS = milieu tamponné HEPES; ES = solution d’équilibre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Chargement des ovocytes sur un dispositif de cryoconservation. Les ovocytes sont placés sur le cryodispositif en (A) une seule petite goutte de VS. (B) La pipette décapante est déplacée loin des ovocytes, et (C) l’excès de VS est ré-aspiré pour ne laisser qu’une fine couche autour de chaque ovocyte. Abréviation : VS = solution de vitrification. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Cycles de vitrification des ovocytes réalisés au centre GENERA de médecine de la reproduction de Rome (années 2008-2020). Au cours de la période de 12 ans, 250 patientes ont subi un seul prélèvement d’ovocytes pour la vitrification des ovocytes, tandis que 35 ont subi plusieurs cycles de prélèvement d’ovocytes. Les raisons inhérentes à la vitrification ovocytaire sont montrées dans la figure. Les patientes revenant pour le réchauffement (n = 78) appartiennent uniquement au groupe de femmes qui ont subi un seul cycle de vitrification ovocytaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Taux de survie moyen par cohorte d’ovocytes réchauffés. (A) Vitrification et (B) expérience des opérateurs de réchauffement. Chaque patient n’est inclus que pour le premier cycle de réchauffement. Des différences statistiquement significatives ont été évaluées à l’aide du test Ude Mann-Whitney. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Morphologie des ovocytes au début et à la fin de la procédure d’équilibrage. Pour déterminer le résultat de la procédure d’équilibrage, il peut être utile d’annoter(A)la morphologie des ovocytes avant de commencer la procédure. (B) Un fort rétrécissement de l’ovocyte est observé après la première exposition à la solution cryoprotectrice. La procédure d’équilibrage peut être considérée comme terminée lorsque (C) l’ovocyte a retrouvé son volume initial. Barres d’échelle = 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Raison de la vitrification des ovocytes Médical autre que le cancer (n = 19) Cancer (n=40) Non médical (n=133) Autre (n=58)
Âge de la mère au moment du prélèvement d’ovocytes, DSD moyen± 33,6±6,4 ans 34,6±5,9 ans 37,0±3,4 ans 38,2±4,3 ans
FSH basale, DSE moyenne± 7,5±4,2 UI/L 7,6±1,7 UI/L 7,8±4,1 UI/L 8,8±5,2 UI/L
AMH, moyenne±SD 1,8±1,7 ng/mL 1,9±0,2 ng/mL 2,2±2,4 ng/mL 3,0±2,5 ng/mL
AFC, moyenne±SD 12.7±5.0 13.3±7.0 11.6±6.1 10,7±6,7
IMC, DSD moyenne± 20.1±1.5 21.8±1.6 20.2±3.1 22,9±3,6
Durée de la stimulation, moyenne±SD 10,0±1,5 9,6±1,7 9.9±2.1 10.3±2.1
9/40, 22.5%
Démarrage aléatoire
COCs, total, moyenne±SD 239 551 1493 592
12,6±5,3 13.8±9.1 11.2±7.1 10,2±8,5
Ovocytes MII, total, moyenne±SD 167 400 1161 462
8,8±3,3 10,0±7,2 8,7±5,7 8,0±6,7
Taux de maturation, moyenne±SD 72,4±13,6 % 72,1±19,6 % 79,5±17,5 % 77,4±22,2 %
Patients revenant pour le réchauffement, pourcentage total de patients ayant subi une vitrification 10/19, 52.6% 7/40, 17.5% 17/133, 12.8% 44/58, 75.9%
Jours entre la vitrification et le premier réchauffement, moyenne±SD 283±225 1264±764 1547±709 132±203
Ovocytes MII réchauffés, moyenne totale±SD 82 66 191 409
8,2±2,8 9.4±4.8 11,2±5,8 9.3±7.2
Ovocytes MII survivants, moyenne totale±SD 73 55 160 345
7.3±3.3 7,9±4,0 9.4±4.8 7,8±6,9
Taux de survie, moyenne±SD 87,6±18,1 % 83,2±1,7 % 85,4 %±14,5 % 84,7±21,9 %
Facteur de sperme
N, n, % 5/10, 50% 4/7, 57% 13/17, 76% 13/44, 29%
MMF, n, % 3/10, 30% 3/7, 43% 3/17, 18% 17/44, 39%
OAT, n, % 2/10, 20% - 1/17, 6% 11/44, 25%
NOA, n, % - - - 3/44, 7%
Taux de fécondation, moyenne±SD 70,0±14,4 % 70,0±17,0 % 78,5±20,6 % 71,0±24,3 %

Tableau 1 : Patients subissant un seul cycle de vitrification ovocytaire. Abréviations: FSH = hormone folliculo-stimulante; AMH = hormone anti-müllérienne; IMC = indice de masse corporelle; COC = complexes d’ovocytes cumulus; MII = métaphase-II; N = normozoospermique; MMF = facteur masculin modéré (1-2 défauts du sperme); OAT = oligoasthenoteratozoospermic; NOA = azoospermie non obstructive (les spermatozoïdes ont été prélevés par extraction testiculaire de spermatozoïdes).

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Discussion

Considérations cliniques

Bien que des stratégies émergentes, telles que la cryoconservation du tissu ovarien et la maturation in vitro, aient été explorées, la vitrification des ovocytes après COS est la technique de référence pour la préservation de la fertilité. Dans ce scénario, le nombre d’ovocytes prélevés et cryoconservés devrait être maximisé dans les plus brefs délais, car la plupart des patientes atteintes de cancer pourraient bénéficier uniquement d’un cycle ovarien avant de devoir commencer leur(s) traitement(s) contre le cancer. Ainsi, un protocole de stimulation ovarienne approprié est crucial pour exploiter pleinement la réserve ovarienne et augmenter les chances cumulées d’une future naissance vivante28, un résultat fortement dépendant de l’âge maternel au moment du prélèvement des ovocytes. À cet égard, un âge idéal pour la vitrification des ovocytes à des fins de préservation de la fertilité n’a pas encore été proposé29, et un consensus est nécessaire entre 35 ans18 ou 37 ans30,31. Cependant, la préservation de la fertilité devrait être accessible à tous les patients, y compris les femmes âgées de plus de 37 ans, à condition qu’elles reçoivent des conseils appropriés sur les taux de réussite en fonction de leur âge.

Le protocole et la dose initiale des médicaments doivent être décrits selon le jugement du gynécologue et surtout, en fonction du temps disponible32,33. Commencer la stimulation conventionnelle au début de la phase folliculaire est recommandé lorsque le temps n’est pas un problème. Cependant, si nécessaire, l’approche de démarrage aléatoire est réalisable pour minimiser les retards dans le début des traitements urgents contre le cancer / médicaux34,35. Le développement folliculaire a été rapporté comme un processus extrêmement dynamique car de multiples vagues de recrutement de follicules ont été décrites tout au long d’un seul cycle ovarien. Bien que les mécanismes biologiques à l’origine de ce phénomène doivent encore être dévoilés, des ovocytes compétents peuvent être récupérés et cryoconservés indépendamment de la phase du cycle menstruel dans laquelle le COS est commencé36.

Dans ce centre, la stimulation ovarienne est généralement réalisée en utilisant le protocole antagoniste de la GnRH et 150-300 UI / jour de FSH recombinante ou de gonadotrophine ménopausique humaine. Dans des populations spécifiques de patients âgés de plus de 35 ans, présentant un déficit en LH ou présentant une réponse sous-optimale après coS standard, la LH peut être ajoutée pendant le COS pour augmenter le recrutement et la croissance des follicules par une action synergique avec un facteur de croissance analogue à l’insuline1 16,37,38. De plus, le protocole d’antagoniste de la GnRH suivi d’un déclencheur d’agoniste de la GnRH a été rapporté comme ainsi un protocole de stimulation court, sûr et très pratique pour maximiser la réponse ovarienne et minimiser le risque de SHO39. Chez les patientes atteintes de maladies sensibles aux œstrogènes telles que le cancer du sein, des gonadotrophines associées à des inhibiteurs de l’aromatase, tels que le létrozole, sont administrées20.

En fait, une revue récente a montré que le létrozole implique une réponse ovarienne similaire à la stimulation conventionnelle sans complications en termes de malformations congénitales, de récidive maligne et de mortalité accrue40. De même, le tamoxifène pourrait être utilisé pendant le COS en cas de tumeurs sensibles aux œstrogènes, qui, comme le létrozole, n’ont montré aucun impact sur la compétenceovocytaire 41,42. Cependant, cela doit être confirmé dans des études plus vastes. Dans ce centre, le létrozole est administré à partir du jour 1 de la stimulation jusqu’au jour 7 après le prélèvement d’ovocytes en cas de tumeurs sensibles à l’œstradiol. Le risque de SHO, qui est la complication la plus importante du COS qui retarderait également les traitements anticancéreux, doit être pris en compte, en particulier chez les jeunes patients présentant des CFA élevés. Dans ces cas, le déclenchement de l’ovulation avec un agoniste de la GnRH au lieu de la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) s’est avéré bénéfique. D’autres problèmes qui doivent être évités sont (i) la thrombo-embolie, qui nécessite l’administration d’héparine de bas poids moléculaire pendant le COS, et (ii) une réponse ovarienne réduite après COS43. Pour compenser ce dernier, deux stimulations consécutives dans un seul cycle ovarien peuvent être effectuées. Ce nouveau protocole COS non conventionnel, connu sous le nom de DuoStim, implique des stimulations folliculaires et lutéales et deux prélèvements d’ovocytes dans un court laps de temps (~ 15 jours) et devrait être étudié à des fins de préservation de la fertilité à l’avenir44,45,46.

D’autres stratégies possibles pour la préservation de la fertilité chez les femmes sont: (i) la cryoconservation du tissu ovarien, qui est la seule option disponible pour les femmes prépubères. Cette possibilité est prometteuse pour restaurer l’activité reproductive et endocrinienne et éviter le retard dans le début du traitement du cancer car aucune stimulation hormonale n’est nécessaire. Cependant, il est encore expérimental et nécessite une chirurgie laparoscopique avec une transplantation ultérieure, et il existe un risque de retransmission du cancer orthotopique. (ii) La cryoconservation des embryons, qui implique un taux de survie plus élevé après le réchauffement, mais retarde le traitement du cancer et nécessite la participation d’un partenaire ou d’un donneur masculin, limitant ainsi également l’autonomie reproductive future d’une femme47. En outre, il peut être soumis à des limitations légales dans certains pays. Compte tenu de ces limites, la vitrification des ovocytes est considérée comme l’approche la plus établie et la plus acceptable sur le plan éthique. Idéalement, tous les grands hôpitaux, où les femmes atteintes d’un cancer en âge de procréer sont traitées, devraient offrir des programmes de préservation de la fertilité, et l’ensemble du processus devrait être gratuit pour ces patientes afin d’assurer un accès égal à ce programme. Néanmoins, la cryoconservation des ovocytes doit être effectuée uniquement dans des centres dotés d’une expertise suffisante pour ne pas affecter la compétence des ovocytes dans le processus48.

Étapes critiques du protocole de vitrification et du dépannage

La vitrification est une pseudo transition de phase de second ordre (IUPAC Compendium of Chemical Terminology) qui induit une solidification semblable à du verre à l’intérieur des cellules empêchant la nucléation et la croissance des cristaux de glace, le principal facteur causal des lésions cellulaires. Pour obtenir une vitrification adéquate, une combinaison d’au moins deux CPA est nécessaire (généralement de l’éthylène glycol et du DMSO en tant qu’agents pénétrés et du saccharose en tant qu’agent non perméant) ainsi qu’un taux de refroidissement extrêmement élevé (> 20 000 ° C / min) extrêmement élevé obtenu soit en minimisant les volumes de charge, soit en l’exposition directe des échantillons à l’azote liquide (dispositifs ouverts). Comme les ovocytes sont les plus grandes cellules du corps, ils contiennent la plus grande quantité d’eau. Par conséquent, ils sont plus sensibles aux blessures par congélation que les embryons. Au cours de la cryoconservation des ovocytes, des dommages aux organites intracellulaires (par exemple, le cytosquelette ou le fuseau méiotique), une altération de la perméabilité membranaire, un durcissement de la zone pellucide, une activation ovocytaire, une altération des voies biochimiques et éventuellement la mort cellulaire peuvent survenir49. Pour cette raison, un équilibre délicat entre de multiples facteurs doit être assuré pour une préservation réussie de la viabilité des ovocytes et de la compétence développementale. Pour obtenir une cohérence dans le taux de survie après vitrification et atteindre les niveaux de référence, toutes les étapes cruciales de la procédure doivent être strictement contrôlées.

CPA, osmolalité cellulaire et taux de refroidissement

Pour augmenter la probabilité de vitrification, la viscosité du milieu (et donc la concentration de CPA) doit être maximisée. Toutefois, la toxicité des CPA doit toujours être maîtrisée50. À cette fin, il est crucial de minimiser à la fois le temps d’exposition des cellules aux CPA et les volumes de chargement, et de toujours travailler à température ambiante (25-27 ° C)51. D’autres protocoles impliquent différentes combinaisons de CPA et de cryodispositifs et sont effectués à 37 °C; cependant, ils n’ont pas été décrits ici. Ainsi, les notes, les résultats représentatifs et les sections de discussion de ce manuscrit ne s’appliquent qu’au protocole de vitrification détaillé ici.

Pendant la cryoconservation, les ovocytes sont exposés à des solutions de CPA d’une concentration accrue d’osmolytes pour favoriser la déshydratation cellulaire et le rétrécissement cytoplasmique. Pendant le réchauffement, ils sont exposés à des solutions avec une concentration d’osmolyte réduite pour restaurer le volume cytoplasmique. Au cours de la vitrification, les ovocytes sont déshydratés et des fluctuations involontaires du volume cellulaire peuvent provoquer un choc osmotique sévère, compromettant ainsi la survie et le potentiel de développement après le réchauffement52. Trouver le taux de refroidissement optimal est un aspect clé pour préserver la viabilité cellulaire car il affecte l’osmolalité53 et le potentiel de développement cellulaire54. Par exemple, lorsqu’une cellule est exposée à des taux de refroidissement plus lents que les taux optimaux, elle peut être largement exposée à des conditions hypertoniques conduisant à la mort cellulaire.

Pour obtenir le taux de refroidissement optimal, les volumes de charge doivent être minimisés, la RT doit être contrôlée de manière à ne pas affecter la vitesse du processus d’équilibrage et les échantillons doivent être directement exposés à l’azote liquide. Une façon d’évaluer quand l’équilibrage a été accompli est d’annoter la morphologie de l’ovocyte (en particulier, la largeur de l’espace périvittelline et l’épaisseur de la zone pellucide) avant le début de la procédure (Figure 5A). Après une phase initiale de réduction du volume cellulaire (Figure 5B), l’ovocyte devrait retrouver son volume initial (Figure 5C). Bien que le pH correct soit maintenu lors de la manipulation des ovocytes sous atmosphère aérienne en raison des zwitterions tamponnant les solutions réchauffant la vitrification, l’osmolalité moyenne dépend particulièrement de la température53. Par conséquent, la méthode de préparation du plat est essentielle pour réduire tout effet néfaste possible55.

La superposition d’huile est certainement essentielle pour prévenir l’évaporation et éviter toute augmentation de l’osmolalité dans le milieu deFIV 56. Cependant, il ne peut pas être utilisé lors des procédures de vitrification et de réchauffement. Par conséquent, quelques conseils sont importants pour les opérateurs: (i) préparer les gouttelettes le plus rapidement possible et immédiatement avant utilisation; (ii) envisager de plus grands volumes de gouttelettes pour minimiser les changements d’osmolarité (<30 μL n’est pas recommandé); (iii) lorsque les conditions environnementales ne peuvent pas être normalisées, une plaque de 6 puits peut être utilisée et de l’eau stérile ou du PBS peut être ajouté au réservoir adjacent pour limiter l’évaporation; iv) faire attention à la date de la première ouverture du flacon de milieu car l’osmolalité peut changer si le flacon est ouvert à plusieurs reprises.

Réchauffement des ovocytes et dévitrification des ovocytes

L’étape la plus cruciale qui peut affecter la cohérence du taux de survie est certainement le processus de réchauffement57. Au cours de cette étape, les CPA sont progressivement retirés de l’ovocyte et dilués pour prévenir tout effet cytotoxique potentiel. La dévitrification, à savoir la formation de noyaux de glace ou de cristaux de glace lors du réchauffement d’une solution vitrifiée ou accidentellement lors de l’audit, du transport ou du stockage en vapeur, est l’un des principaux risques de la vitrification58,59,60. Par conséquent, pour éviter la dévitrification et les blessures pendant le réchauffement, la différence de température entre la première et la dernière étape du processus doit être maximisée. Comme le montrent Seki et Mazur57 dans les ovocytes murins soumis à la vitrification et au réchauffement à des rythmes différents, plus le réchauffement est rapide, plus la survie est élevée. Le volume et la température du TS sont les principaux facteurs à contrôler: le TS doit être correctement réchauffé à 37 ° C (au moins 1 h avant la procédure), et le rack d’azote liquide doit être rempli au bord de sa capacité et placé aussi près que possible du stéréomicroscope. L’opérateur doit être aussi rapide que possible lors du transfert du support de cryoconservation de l’azote liquide au TS. En raison de la grande efficacité de la vitrification, un protocole de réchauffement universel peut être utilisé quel que soit le protocole de congélation impliqué, ce qui facilite la gestion de tous les cycles de réchauffement, même lorsque les ovocytes sont importés d’un autre centre deFIV 61.

Dispositifs ouverts et risque de contamination

L’utilisation de systèmes ouverts et l’exposition directe des échantillons à l’azote liquide sont nécessaires pour atteindre les taux de refroidissement et de réchauffement extrêmement élevés qui soutiennent l’efficacité de ce protocole. Bien que la vitrification soit une procédure qui présente un faible risque de contamination croisée, car elle implique de très petits volumes et est effectuée après plusieurs lavages d’échantillons qui diluent toute charge virale putative, il est essentiel d’adopter toutes les mesures de précaution pour augmenter sa sécurité. Sur la base des preuves actuelles, les systèmes fermés n’offrent pas d’alternative compétitive aux systèmes ouverts au moins pour la vitrificationdes ovocytes 62,63. Pour maintenir l’efficacité des systèmes de vitrification ouverts tout en minimisant les risques associés au contact direct avec l’azote liquide, ce dernier pourrait être stérilisé par irradiation ultraviolette64,65. Alternativement, des réservoirs de stockage de vapeur pourraient être utilisés, qui sont connus pour présenter un risque de contamination plus faible que les réservoirs conventionnels, mais qui se sont révélés efficaces pour préserver la viabilité desovocytes 66,67.

Importance d’une surveillance constante des indicateurs de performance clés pour les programmes de vitrification des ovocytes

Dans un laboratoire de FIV, le suivi des indicateurs clés de performance (KPI) est essentiel pour le suivi et l’amélioration constante des résultats68. En général, lors de la définition des KPI pour le suivi des processus et des procédures, trois domaines principaux doivent être pris en compte : la structure, le processus et le résultat. Les KPI structurels mesurent la qualité du laboratoire de FIV en décrivant les caractéristiques des ressources physiques et humaines. Un exemple d’indicateur de performance clé structurel lié à l’installation dans un programme de cryoconservation pourrait être le nombre de cryorésauves par rapport au nombre total de procédures ART nécessitant une cryoconservation effectuée au cours d’une période donnée ou le nombre de cryo-réservoirs par rapport au nombre total de mètres carrés de la cryoroom. Cependant, les ressources humaines et, en particulier, les compétences des opérateurs sont de la plus haute importance lorsqu’il s’agit d’une procédure délicate telle que la vitrification. En fait, bien qu’extrêmement efficace, la technique de vitrification est une procédure difficile impliquant plusieurs phases procédurales avec des délais rigoureux qui doivent être strictement contrôlés: une très petite quantité d’un milieu significativement visqueux doit être gérée sur une très courte période.

Aucune machine de congélation avec réglage de paramètres de refroidissement spécifiques n’est impliquée dans la procédure; par conséquent, la normalisation des détails du protocole et de la formation est essentielle. Le processus manuel a des exigences de compétences strictes qui doivent être remplies pour obtenir des taux de survie cellulaire cohérents et hautement reproductibles. Une formation spécifique devrait être accordée à chaque opérateur novice afin de le rendre compétent dans le contrôle de tous les points critiques de la procédure, en particulier le temps d’exposition des échantillons aux CPA et la manipulation des cellules dans un milieu très visqueux. Cependant, selon Dessolle et ses coauteurs,69, la courbe d’apprentissage de la procédure de vitrification ne devrait pas être aussi longue, même pour les embryologistes débutants, car la réussite est principalement limitée par des défis de manipulation. Une fois l’expertise en vitrification acquise, la performance de chaque opérateur individuel doit être vérifiée avec précision et régulièrement par l’utilisation de KPI afin d’évaluer régulièrement le maintien des valeurs de compétence établies par les documents de consensus70. En outre, la confiance/la compétence de l’opérateur doit être comparable afin de ne pas affecter les résultats.

Les KPI de processus mesurent le fonctionnement du laboratoire de FIV. Les protocoles et procédures de vitrification et de réchauffement doivent être effectués en temps opportun, et les fluctuations des conditions de culture doivent être minimisées en accordant une attention particulière au maintien d’une osmolarité et d’une température adéquates pour préserver non seulement la compétence de développement des ovocytes, mais aussi la sécurité de l’opérateur lors de la manipulation de l’azote liquide. Des exemples d’indicateurs de performance clés de processus sont le pourcentage de blessures du personnel de laboratoire lors de la manipulation d’azote liquide par nombre de procédures de FIV par an, le pourcentage de gamètes / embryons perdus / endommagés pendant les procédures de vitrification / réchauffement et les audits par nombre de procédures par an.

Enfin, les KPI de résultat mesurent l’efficacité du laboratoire de FIV et se réfèrent généralement à la survie des ovocytes post-pré-évaluation définie comme la proportion d’ovocytes morphologiquement intacts au moment de l’ICSI (en cas de vitrification des ovocytes, la valeur de compétence doit être >50% et la valeur de référence est de 75%)70. En outre, les taux de fécondation (<10% inférieurs aux ovocytes frais inséminés au centre à partir d’une population de patients comparable), de développement embryonnaire (identique à une population de patients comparable utilisant des ovocytes frais) et d’implantation (<10 à 30% inférieurs à une population comparable d’embryons frais au centre) sont applicables en tant que KPI de résultat pour les ovocytes vitrifiés70. Cependant, les résultats cliniques sont plus soumis à des caractéristiques spécifiques au couple qu’à des procédures cliniquesdéfectueuses71,72.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Aucun

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

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References

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Biologie numéro 175 Préservation de la fertilité stimulation ovarienne ovocyte de métaphase II vitrification réchauffement indicateurs clés de performance (KPI)
Préservation de la fertilité par vitrification des ovocytes : perspectives cliniques et de laboratoire
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Maggiulli, R., Vaiarelli, A.,… More

Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).

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