Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ufrivillig bevaring gjennom Oocyte Vitrification: Kliniske og laboratorieperspektiver

Published: September 16, 2021 doi: 10.3791/61963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Summary

Oocyte kryopreservering er anerkjent av flere internasjonale vitenskapelige samfunn som gullstandarden for fruktbarhet bevaring i postpubertal kvinner. Hensiktsmessige kliniske og laboratoriestrategier sikrer maksimal effekt, effektivitet og sikkerhet av fruktbarhet bevaring behandlinger.

Abstract

Bevaring av kvinnelig fruktbarhet er avgjørende i et multifunksjonelt helsevesen som tar vare på pasientenes fremtidige livskvalitet. Oocyte kryopreservering er anerkjent av flere internasjonale vitenskapelige samfunn som gullstandarden for fruktbarhet bevaring i postpubertal kvinner, for både medisinske og ikke-medisinske indikasjoner. De viktigste medisinske indikasjonene er onkologiske sykdommer, gynekologiske sykdommer som alvorlig endometriosis, systemiske sykdommer som kompromitterer eggstokkreservatet, og genetiske forhold som involverer for tidlig overgangsalder. Denne artikkelen beskriver hele det kliniske og laboratoriearbeid av en fertilitetsbevaringsbehandling ved å skissere anbefalinger for objektiv og evidensbasert rådgivning. Videre fokuserer den på effektiviteten av prosedyren og beskriver de mest hensiktsmessige strategiene for å utnytte eggstokkreservatet fullt ut og maksimere antall oocytter hentet på kortest mulig tid. Evalueringen av ovariereservatet, definisjonen av en ideell stimuleringsprotokoll, samt oocyttuthenting, benektelse og vitrifiseringsprosedyrer har blitt detaljert sammen med tilnærminger for å maksimere effekt, effektivitet og sikkerhet.

Introduction

Utvikling og implementering av et effektivt kryopreserveringsprogram for humane oocytter har vært et betydelig gjennombrudd i reproduktiv medisin. Ifølge nyere bevis er vitrifisering den mest effektive strategien for å kryopreservere metafase II (MII) oocytter, da det resulterer i statistisk høyere overlevelsesrater sammenlignet med langsom frysing, uavhengig av pasientpopulasjonen (ufruktbare pasienter eller oocyttdonasjonsprogram)1,2,3. De bemerkelsesverdige prestasjonene av oocytt vitrification førte til at Practice Committees of the American Society for Reproductive Medicine (ASRM) og Society for Assisted Reproductive Technology (SART) uttaler denne teknikken for å være den mest effektive for elektiv fruktbarhet bevaring hos postpubertal kvinner, for både medisinske og ikke-medisinskeindikasjoner 4,5,6. Medisinske indikasjoner for fruktbarhet bevaring inkluderer (i) kreft og autoimmune sykdommer som kreverterapier 7 som strålebehandling, cytotoksisk kjemoterapi, og endokrine terapi (hvis skadelige effekt på ovariereservatet er forbundet med mors alder samt type og dose av behandlingen); (ii) ovariesykdommer som krever gjentatt eller radikal kirurgi (som endometriosis)8; og (iii) genetiske tilstander (f.eks. X-skjøre) eller for tidlig ovarialsvikt. I tillegg har fruktbarhet bevaring blitt et verdifullt alternativ for alle kvinner som ikke har oppnådd sitt foreldremål av ikke-medisinske grunner (også kjent som sosial frysing).

Uavhengig av indikasjonen på fruktbarhet bevaring og i henhold til de store internasjonale retningslinjene for fruktbarhet bevaring, alle pasienter som er villige til å vitrify sine oocytter bør få passende rådgivning for å bli informert om deres realistiske sjanse for suksess, kostnader, risiko og begrensninger i prosedyren9,10,11,12,13. Viktigst, det bør være klart at vitrifisere en kohort av MII oocytter ikke sikrer en graviditet, men at det gir større sjanse for suksess for fremtidig in vitro befruktning (IVF) behandling, om nødvendig14. I denne forbindelse er kvinnens alder på tidspunktet for oocytt vitrifisering absolutt den viktigste begrensende faktoren15 som avansert mors alder (AMA, >35 år) er hovedårsaken til kvinnelig infertilitet16. Foruten en progressiv reduksjon i eggstokkreservatet, er AMA forbundet med en svekkelse av oocyttkompetanse på grunn av defekte fysiologiske veier som metabolisme, epigenetisk regulering, cellesykluskontrollpunkter og meiotisk segregering17. Derfor avhenger det rimelige antall egg å vitrify hovedsakelig av mors alder. Hos kvinner under 36 år kreves minst 8-10 MII oocytes18 for å maksimere sjansen for suksess. Generelt, jo høyere antall vitrified oocytter, jo høyere er sannsynligheten for suksess. Derfor er skreddersøm ovarian stimulering i henhold til ovariereservat markører som anti-Müllerian hormon (AMH) nivåer eller antral follicle count (AFC) avgjørende for å utnytte ovariereservatet på kortest mulig tid.

Sikkerheten til hele prosedyren er det andre sentrale problemet når du registrerer pasienter for fruktbarhet bevaring. Klinikere bør bruke de beste strategiene for å minimere risikoen og forhindre (i) ovariehyperstimuleringssyndrom (OHSS) ved å bruke sikre tilnærminger som gonadotrophinfrigjørende hormon (GnRH) antagonistprotokoll etterfulgt av en GnRH-agonistutløser19 og (ii) fjernkontrollen, likevel mulig, risiko for peritoneal blødning, skade på bekkenstrukturene (urinleder, tarm, vedlegg, nerver) eller bekkeninfeksjon under oocyttuthenting. Til slutt er (iii) tradisjonelle regimer for stimulering forbundet med supraphysiologic serum østradiol og anbefales derfor ikke i østrogenfølsomme sykdommer som brystkreft. Protokoller som involverer aromatasehemmere (som letrozol eller tamoxifen) er mer egnet i disse tilfellene20,21. I laboratorieinnstillingen er den mest utbredte protokollen for oocytt vitrifisering fortsatt den som først er beskrevet av Kuwayama og kolleger2,23, som består av en trinnvis prosedyre som involverer gradvis tilsetning av kryopreotektanter (CPAer). I den første fasen (likevekt/dehydrering) eksponeres oocytter i en CPA-løsning som inneholder 7,5 % v/v etylenglykol og 7,5 % v/v dimetylsulfoksid (DMSO), mens de er i andre fase, oocytter flyttes til en vitrifiseringsløsning med 15% v / v etylenglykol og 15% v / v DMSO, pluss 0,5 mol / L sukrose. Etter en kort inkubasjon i vitrifiseringsmediet kan oocyttene plasseres i spesielt designede, åpne kryodevices og til slutt dyppes i flytende nitrogen ved -196 °C som skal lagres til bruk.

Her har hele det kliniske og laboratoriearbeid av en fertilitetsbevaringsbehandling blitt beskrevet av (i) skissere anbefalinger for objektiv og evidensbasert rådgivning, (ii) med fokus på kostnadseffektiviteten av prosedyren, og (iii) beskrive de mest hensiktsmessige strategiene for å utnytte eggstokkreservatet fullt ut og maksimere antall oocytter hentet på kortest mulig tid. Evalueringen av eggstokkreservatet, definisjonen av en ideell stimuleringsprotokoll, samt oocyttuthenting, denudasjon og vitrifiseringsprosedyrer vil bli detaljert sammen med tilnærminger for å maksimere deres effekt, effektivitet og sikkerhet. Ettersom det finnes andre protokoller eller tilpasninger av denne protokollen i litteraturen, gjelder de representative resultatene og diskusjonsdelene i dette manuskriptet bare for denne prosedyren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Arbeid og klinisk rådgivning

MERK: Ved pasienter som krever fertilitetsbevaring av onkologiske grunner, må du sørge for at det ikke er noen venteliste for planlegging av konsultasjon, og avtalen er gitt så snart som mulig.

  1. Undersøke sykehistorien og tidligere dokumentasjon, og vurdere pasientens generelle helsetilstand.
  2. Registrer all informasjon (inkludert onkologens godkjenning for å gjennomgå eggstokkstimulering i tilfelle kreftpasienter) i en relasjonsdatabase.
  3. Gi pasienten spesifikk rådgivning om gjennomførbarheten av prosedyren. Forklar trinnene i prosedyren (ovariestimulering, oocyttuthenting, oocytt vitrifisering), og informer henne om de realistiske sjansene for suksess (hovedsakelig avhengig av mors alder og forventet antall MII oocytter på tidspunktet for oocyttuthenting), samt kostnaden og begrensningene ved prosedyren.
  4. Utfør transvaginal ultralyd for å få informasjon om eggstokkreservatet (dvs. AFC) og for å vurdere tilgjengeligheten av eggstokkene for eggsamling.
  5. Be om blodprøver for å vurdere blodgruppe og Rhesus-faktor, koagulasjonsscreening (blodtelling, protrombin, tromboplastin, fibrinogen, protein C, protein S, anti-trombin III, homocystein) og smittsomme sykdommer (Hepatitt B, Hepatitt C, HIV, Venereal Disease Research Laboratory/Treponema pallidum Hemagglutination Assay).
    MERK: Ved pasienter som får tilgang til et fruktbarhetsbevaringsprogram av ikke-akutte medisinske årsaker, kan en mer omfattende vurdering omfatte basal follikkelstimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH), østradiol, AMH, brystundersøkelse, Papanicolaou-test, genetisk screening av koagulasjon (faktor V av Leiden og protrombin) og TORCH-screening (toxoplasmose, rubella, cytomegalovirus).
  6. Be om en kardiologisk evaluering (elektrokardiogram).
  7. Anbefal psykologisk rådgivning.

2. Kontrollerte ovariestimuleringsprotokoller for bevaring av fruktbarhet

MERK: Når tiden som er tilgjengelig før du starter kreftbehandlingen er begrenset, anbefales random-start-protokollen (dvs. å starte eggstokkstimulering når som helst i menstruasjonssyklusen) for eggstokkstimulering hos onkologiske pasienter som er kandidater for fertilitetsbevaring. I en fruktbarhet bevaring program av ikke-presserende medisinske grunner eller sosiale årsaker, konvensjonell stimulering starter i tidlig follikulær fase er å foretrekke, og ovarie stimulering er startet basert på menstruasjonssyklusen. Kontrollert ovarial stimulering (COS) tilnærminger bør utføres i henhold til den nylige European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) retningslinjer24.

  1. Skreddersy COS i henhold til pasientens egenskaper og ovariereservatmarkører, hovedsakelig mors alder, FSH, AMH og AFC.
  2. Start COS på dag 5 av menstruasjonssyklusen ved hjelp av rekombinant eller urin FSH med en fast dose på 150-300 IE/dag (antagonistprotokoll).
    MERK: I en bestemt pasientpopulasjon med LH-mangel eller dårlig suboptimal respons kan ytterligere LH 75/150 IE/dag administreres i henhold til ovarialresponsen, LH-nivåene og gynekologens vurdering.
  3. Hos pasienter med østrogenfølsomme sykdommer, inkluderer gonadotropiner forbundet med aromatasehemmere (letrozol) fra dag 1 av stimulering til dag 7 etter oocyttuthenting.
  4. Administrer en fast dose gonadotropiner i 4 dager.
  5. Overvåk follikulær vekst på dag 5 og deretter hver 2-3 dager; til slutt justere gonadotropin dosering.
  6. Når minst 3 follikler når 17-18 mm i diameter, administrer avtrekkeren for endelig oocyttmodning med en enkelt subkutan bolus av GnRH-agonist i dosen på 0,5 ml.

3. Henting av Oocyte

  1. Forbereder henting av oocytt
    1. For materialer som kreves, se Materialtabellen, og hold klar laboratoriesko og antrekk, kirurgisk ansiktsmaske, hårdeksel, kirurgiske hansker, en permanent ikke-giftig markør, pinsett, sterile små gasbind, engangs- eller gjenbrukbart spekulum, vaginalt kirurgiutstyr og overflatedesinfeksjonsmiddel. Sørg for tilgjengeligheten av gjenopplivingsutstyr, bedøvelsesmidler for reversering, et sett forberedt for behandling av anafylaktisk sjokk og oksygen i operasjonsrommet.
    2. Utfør oocyttgjenvinningsprosedyren i henhold til anbefalingene fra ESHRE Working Group on Ultrasound i assistert reproduksjonsteknologi (ART)25.
      1. Administrer sedasjon eller generell anestesi, og antibiotika for profylakse.
        MERK: I denne protokollen ble dyp sedasjon oppnådd ved å administrere propofol (hvis dosering er justert i henhold til pasientens vekt) og 50-100 μg fentanyl, 1000 mg paracetamol og assistert maskeventilasjon med oksygen.
      2. Utfør oocyttgjenvinning ved hjelp av en aspirasjonsenhet som består av en vakuumpumpe, et oppsamlingsrør koblet til en 17 G enlumenål og et oocyttoppsamlingsrør. Under samlingen, ikke overstige et trykk på ~ 120 mmHg for å unngå risikoen for skade på oocytter som stripping av cumulus celler eller oppsprekking av zona pellucida.
      3. Kalibrer arbeidstemperaturen for å sikre 37 °C i kulturmediene. Under hele prosedyren minimerer du oocytteksponering for selv forbigående temperatur som kan påvirke deres utviklingskompetanse.
      4. På slutten av oocyttuthenting, observere pasienten i 3-4 timer før utskrivning.
  2. Operasjon teater
    1. Før du går inn i operasjonsrommet, identifiser pasienten og bekreft tidspunktet for eggløsningsutløseren.
    2. Få pasienten til å legge seg ned på operasjonsbordet i gynekologisk stilling.
    3. Rengjør skjeden/livmorhalsen før oocyttgjenvinning for å minimere bakteriell forurensning.
    4. Utfør en foreløpig transvaginal ultralyd for å vurdere eggstokkenes posisjon og de anatomiske forholdene til de ulike organene og blodkarene.
    5. Under ultralydveiledning, sett inn en enkelt lumen nål gjennom vaginalveggen og inn i en eggstokksekk, pass på at du ikke skader organene eller blodkarene som ligger mellom vaginalveggen og eggstokken.
    6. Start aspirasjon fra nærmeste follikkel og gå videre til de mest distale.
    7. Punkter alle follikler med en diameter større enn 11-12 mm, som utfører "vridningsbevegelser" av nålen for å aspirere hele follikulærvæsken, som deretter slippes ut i et sterilt rør (rund bunn 14 ml) forvarmes i blokkvarmeren i operasjonsrommet.
    8. Umiddelbart etter gjenfinning forsegler og merker du røret med detaljer om pasientens identitet.
    9. Forsikre deg om at sykepleieren bringer røret til laboratoriet, hvor det umiddelbart blir screenet for tilstedeværelse av cumulus-oocyttkomplekser (COCer).
    10. Instruere embryologene om å informere klinikeren om det totale antallet COCer som er hentet.
    11. Når prosedyren er fullført for den første eggstokken, skyll nålen med rent medium, og fortsett med den andre eggstokken ved hjelp av samme prosedyre.
    12. Etter oocyttuthenting, vurdere blødning fra eggstokkene eller blodårene i parametrium og fri væske i posen av Douglas.
      MERK: For å automatisere og forbedre effektiviteten av gamete og embryo sporbarhet på klinisk nivå, ble et elektronisk vitnesystem (EWS) implementert i sentrum26. Likevel nevner denne protokollen ikke EWS, for å sikre reproduserbarhet av protokollen i et IVF-laboratorium. Likevel bør du vurdere at alle trinnene i prosedyren krever en annen operatør (dvs. et vitne) for å sikre gamete og embryo sporbarhet.

4. IVF-laboratorium

  1. Dagen før oocyttgjenvinningsprosedyren
    1. Forbered oocyttoppsamlingsrør (se materialtabellen).
      1. Dispenser 1 ml IVF-medium (se materialtabellen) i hvert oocyttoppsamlingsrør (rund bunn, 5 ml) og dekk med 0,2 ml mineralolje (se materialtabellen) for embryokultur.
        MERK: Antall rør vil bli definert i henhold til antall follikler som forventes å bli hentet. Hvert rør kan inneholde opptil 4 COCer.
    2. Forsegle rørene med hetten (første trykk). Merk rørene med detaljer om typen medium og forberedelsesdato. Inkuber rørene over natten ved 37 °C i en kontrollert atmosfære (6 % CO2, 5 % 02).
  2. På dagen for oocytt-gjenfinningen
    1. Forvarm plastforsyningene ved 37 °C (sterile kulturretter og Pasteur pipetter).
    2. Be pasientene bekrefte sin identitet (fullt navn og fødselsdato) og tidspunktet for eggløsningsutløseren. Kommenter på laboratoriearket at identifikasjonsprosedyren (ID) er utført, og at tidspunktet for eggløsningsutløseren er bekreftet.
    3. Ta oocyttoppsamlingsrørene av inkubatoren (rett før prosedyren begynner), og trykk ned hetten for å sikre tett lukking. Merk oocyttoppsamlingsrørene med pasientens informasjon. Plasser oocyttoppsamlingsrørene i blokkvarmeren ved 37 °C.
    4. Undersøk follikulær væske i de forhåndsvarmede sterile kulturrettene, og identifiser COC-er. Når en eller flere COCer er identifisert, skyll dem to ganger i to dråper medium for å fjerne follikulær væske og blodforurensning.
    5. Overfør COC-ene til oocyttsamlingsrørene og kommenter antall COCer på røret. Løsne hettene på de mellomstore rørene, og inkuber dem straks ved 37 °C i en atmosfære på 6 % CO2, 5 % O2.
    6. Gjenta trinn 7 til 9 i henhold til antall oocytter som er hentet. Oppdater laboratoriearket.
      MERK: Forsikre deg om at et vitne kontrollerer at alle røroppvarmingsblokkene (inkludert de i operasjonssalen) er tomme og signerer lukkingen av prosedyren på laboratoriearket.
    7. Tørk av arbeidsstadiet etter at prosedyren er fullført.

5. Oocyte benektelse

  1. Prewarm 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES)-bufret medium og hyaluronidase (se materialtabellen) ved 37 °C minst 1 time før start.
  2. Forbered en 4-brønns IVF-plate (se materialtabellen) med 0,6 ml/brønn med forhåndsvarslet HEPES-bufret medium (supplert med 5% humant serumalbumin [HSA]) dekket med 0,3 ml mineralolje for embryokultur, og varm ved 37 °C i minst 30 minutter.
  3. Merk oocytt denudasjonsplaten med detaljer om pasientens identitet.
  4. Umiddelbart før du starter prosedyren, legg hyaluronidase til den første brønnen for å oppnå en endelig konsentrasjon på ca. 20 IE / ml.
  5. Plasser et begrenset antall COCer (opptil 6) i den første brønnen som inneholder enzymet for å spre cumuluscellene.
  6. For å forbedre enzymatisk fjerning av cumulus og koronaceller, utfør stripping av cumulusceller ved å pipettere oocyttene gjentatte ganger gjennom en Pasteur pipette med en indre diameter på ca. 250 μm i opptil 30 s. Etter at innledende celledissosiasjon er observert, overfør oocyttene til den andre brønnen som bare inneholder HEPES-bufret medium, og pass på å overføre en minimumsmengde av enzymet.
  7. Utfør ytterligere denudasjon for å fjerne koronacellene ved å bruke denuding pipetter med avtagende indre diametre (170-145 μm). Bruk lavere diametre (135 μm) bare hvis det er strengt nødvendig.
  8. Vask forsiktig de denuderte oocyttene for å vaske ut enzymet.
  9. Etter denudasjon, undersøk oocyttene under et invertert mikroskop for å vurdere deres integritet og modningsstadium. Skill MII oocytter fra de umodne (germinal vesicle og metafase-I).
  10. Flytt MII-oocyttene til vitrifiseringsområdet for umiddelbart å utføre kryopreservering. Oppdater laboratoriearket.

6. Oocyte vitrifisering

MERK: Utfør oocytt vitrifisering fortrinnsvis innen 38 timer etter oocyttuthenting og umiddelbart etter denudasjon. Vitrifiseringsprosedyren som er beskrevet her, må utføres ved romtemperatur (RT) og ved å bruke en stripperpipette med en indre diameter på 170 μm for ikke å skade oocytter under manipulering.

  1. Ca. 30 min før prosedyren, ta med likevektsløsningen (ES) og vitrifiseringsløsningen (VS) til RT (25-27 °C).
  2. Merk kryodevicene riktig med pasientens navn og ID, behandlings-ID, frysingsdato, antall oocytter og kryobarkode.
  3. Fyll et engangs kjølestativ opp til toppen med friskt flytende nitrogen, og start steriliseringsprosessen.
  4. Merk vitrifiseringsplaten (se materialtabellen) med pasientens navn og ID. Be et vitne sjekke riktig ID for kryodevicene.
  5. Snu forsiktig hvert hetteglass to ganger for å blande innholdet før bruk, og fest lokket på en 6 mm Petri-tallerken med en dråpe 30 μL HEPES-bufret medium (med 5% HSA) og en tilstøtende dråpe på 30 μL ES.
    MERK: Plasser fallene like før bruk for å begrense middels fordampning.
  6. Bruk en stripperpipette med en diameter på 170 μm, plasser oocyttene (opptil 9) i første dråpe med minst mulig volum medium. Bruk stripperpipetten til å opprette en mediumbro mellom fall n.1 og n.2 for å oppnå en gradvis økning i konsentrasjonen av CPA-ene (figur 1A).
  7. Inkuber oocyttene i første dråpe i 3 minutter. Tilsett en tredje dråpe 30 μL ES (n.3). Etter 3 min overfører du oocyttene til den andre dråpen av ES, og oppretter en middels bro mellom fall n.3 og n.2 (Figur 1B). Inkuber oocyttene i drop n.3 i 3 min.
  8. Under inkubasjonen, legg til en 30 μL dråpe ES for hver kryodevice som skal brukes (hvis 9 oocytter skal kryopreserveres, plasser 3 dråper ES med 3 oocytter i hver dråpe ES). Flytt oocyttene til ren ES-løsning, og la dem stå i 6-9 min (til de gjenoppretter sin opprinnelige størrelse etter krymping) (Figur 1C).
  9. Forbered en sentral brønnrett (60 x 15 mm) med 1 ml VS. På slutten av de første 6 min, overfør oocyttene som skal kryopreservert i VS-løsningen, og frigjør så lite medium som mulig. La oocyttene stå i VS i 1 min, og vask dem forsiktig ved å flytte dem fra bunnen til toppen av parabolen for å fjerne overskuddet av ES.
  10. Omtrent 10 s før slutten av inkubasjonsminuttet, plasser kryodevicen under mikroskopet, og juster fokuset på det svarte merket (dvs. spissen av kryodevicen). Plasser oocyttene på kryodevicen ved siden av det svarte merket med minimumsmengden VS (figur 2A).
  11. Flytt stripperpipetten bort fra oocyttene, og fjern overskuddet av VS-medium (figur 2B) slik at oocyttene forblir dekket av et tynt mediumlag (Figur 2C).
  12. Dypp raskt kryodevicet i flytende nitrogen, rist det raskt for å fjerne luftbobler fra overflaten. Hold beskyttelseshetten på kryodevicen med pinsett, og fyll den med flytende nitrogen; Sett deretter kryodevicet inn i det mens du holder propylenstrimlene i flytende nitrogen.
  13. Oppbevar kryodevicen på en visiotube som tidligere var merket med pasientens informasjon. Oppdater laboratoriearket.

7. Oocyte oppvarming

  1. Ca. 30 min før prosedyren, varm opp opptiningsoppløsningen (TS), fortynningsløsningen (DS) og vaskeoppløsningen (WS) til RT (25-27 °C). Snu forsiktig hvert hetteglass to ganger for å blande innholdet. Plasser 1 ml TS i en sentral petriskål, og varm den opp ved 37 °C i minst 1 time før du starter prosedyren.
  2. Merk alle plastforsyninger med pasientens navn og ID og type løsning. Be et vitne bekrefte pasientens opplysninger om kryodevice.
  3. For hver kryodevice som skal varmes opp, lag en 6-brønns plate med 200 μL DS i den første brønnen og like mye WS i andre og tredje (henholdsvis WS1 og WS2). Tilsett fosfatbufret saltvann (PBS) eller sterilt vann i området utenfor brønnene for å forhindre fordampning.
  4. Ta TS-retten ut av inkubatoren, og legg den under mikroskopet. Juster mikroskopets fokus til midten av Petri-parabolen.
  5. Vri forsiktig og fjern beskyttelseshetten på kryodevicen, samtidig som propylenstrimlene holdes i flytende nitrogen. Overfør kryodevicet fra flytende nitrogen til TS så raskt som mulig for å unngå risikoen for devitrifisering og initiere nedtellingen (1 min).
  6. Lokaliser oocyttene ved å fokusere på spissen av kryodevice (dvs. det svarte merket). Bruk en stripperpipette, slipp oocyttene fra kryodevice.
    MERK: Prøv å ikke aspirere oocyttene fra kryodevice; slipp forsiktig noen medier på dem til de beveger seg inn i TS.
  7. Bruk en stripperpipette med en diameter på 170 μm, overfør oocyttene til DS med litt TS (for å skape en gradient), og la dem ligge i DS i 3 minutter. Flytt oocyttene til WS1 på samme måte, og la dem stå i 5 minutter. Til slutt overfører du oocyttene til WS2 i 1 min.
  8. Overfør oocyttene til et passende forhåndsoverveid IVF-kulturmedium, og inkuber dem i 1 time før du fortsetter med intracytoplasmisk sædinjeksjon (ICSI). Oppdater laboratoriearket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oversikt over fruktbarhet bevaring programmet på senteret

Over en 12-årsperiode (2008-2020) gjennomgikk 285 kvinner minst en oocyttuthenting som medførte vitrifisering av hele kohorten av modne egg samlet. De fleste av disse kvinnene (n = 250) gjennomgikk en enkelt gjenfinning, og 35 gjennomgikk flere gjenfinninger. Årsakene til å gjennomgå oocyttuthenting for egg vitrifisering er oppsummert i 4 kategorier: medisinsk (unntatt kreft), kreft, ikke-medisinsk og andre. Blant de 250 kvinnene som gjennomgikk en enkelt oocyttuthenting for egg vitrifisering, hadde 8% andre medisinske årsaker enn kreft (10 endometriosis, 3 myoma, 4 ovariecyster, 1 hydrosalpinx), 16% hadde kreft (31 brystkreft, 3 ovariekreft, 2 kolorektal kreft, 2 Hodgkins lymfom, 1 vulvarkreft e 1 livmorhalskreft), 53% hadde ikke-medisinske årsaker, og 23% hadde andre grunner (43 fravær av sæd hentet, 10 risiko for OHSS, 4 infeksjoner og 1 feber). Denne fordelingen var forskjellig blant pasienter som gjennomgikk flere oocyttuthentinger for egg vitrifisering. Spesielt hadde 9% andre medisinske årsaker enn kreft (1 endometriosis, 2 redusert ovariereservat), 6% hadde kreft (2 brystkreft), 80% hadde ikke-medisinske grunner, og 3% hadde andre grunner (1 fravær av sæd hentet). Ingen av pasientene som gjennomgikk flere oocyttuthentinger for egg vitrifisering varmet disse eggene, mens 78 av de 250 kvinnene som gjennomgikk en enkelt egg vitrifisering syklus returnert for å bruke disse oocytter (Figur 3).

Tabell 1 oppsummerer dataene til de 250 kvinnene som gjennomgår en enkelt oocytt vitrifiseringssyklus gruppert etter relaterte årsaker. Pasientene med en medisinsk årsak til egg vitrification og pasientene gjennomgår fruktbarhet bevaring på grunn av kreft var yngre (gjennomsnittlig mors alder < 35 år) og viste en bedre ovarial reserve (høyere AFCs) enn pasienter med ikke-medisinsk eller andre grunner. Imidlertid var gjennomsnittlig modningsrate (antall MII oocytter / antall COCer hentet) litt lavere (72-73% versus 77-79%), slik at antall oocytter vitrified i gjennomsnitt var lik i de 4 gruppene (9-10 oocytter). Viktigst, 9 av 40 onkologiske pasienter (22,5%) gjennomgikk en tilfeldig start ovarial stimuleringsprotokoll fordi de hadde begrenset tid før de startet kjemo- eller strålebehandling. Det er interessant at omtrent halvparten av pasientene med andre medisinske årsaker enn kreft (53 %) og de fleste pasienter med andre årsaker til egg vitrifisering (76 %) faktisk kom tilbake for oppvarming. Omvendt, svært få pasienter som gjennomgikk fruktbarhet bevaring for kreft (17,5%) eller ikke-medisinske grunner (13%) brukte sine vitrified oocytter for IVF. Også bemerkelsesverdig er tiden gått mellom vitrifisering og oppvarming blant pasientene som kom tilbake: i gjennomsnitt 283 dager hos pasienter med andre medisinske årsaker enn kreft, 132 dager hos pasienter med andre grunner, 1264 dager hos onkologiske pasienter og 1547 dager hos pasienter med ikke-medisinske årsaker. Uavhengig av alle disse relevante forskjellene var overlevelsesraten lik (83-88%; i gjennomsnitt ble 8-11 oocytter oppvarmet, og 7-9 oocytter overlevde) mellom pasientene i de 4 gruppene, og bekreftet dermed effekten og sikkerheten til oocytt vitrifisering og oppvarmingsprotokoller. Videre er overlevelsesraten uavhengig av vitrifisering og oppvarmingsoperatørens erfaring (Figur 4A,B). Tabell 1 viser befruktningsgraden i de 4 gruppene, som er ~70%, bortsett fra pasienter med ikke-medisinske årsaker til oocytt vitrifisering (~80%). Disse dataene er imidlertid ikke sammenlignbare på grunn av en liten prøvestørrelse og forspenningen av sædfaktoren på befruktningsresultatet27.

Figure 1
Figur 1: Middels dråpekonfigurasjon for oocytt kryopreservering. For gradvis å utføre likevekt plasseres oocytter først i en (A) dråpe BS og blandes med (B) en dråpe ES. Etter 3 min inkubasjon, (C) blandes en tredje dråpe ES-løsning, og oocytter inkuberes i 6-9 min. Forkortelser: HEPES = 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre; BS = HEPES-bufret medium; ES = likevektsløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oocytt lasting på kryopreserveringsanordning. Oocyttene plasseres på kryodevicen i (A) en liten dråpe VS. (B) Stripperpipetten flyttes bort fra oocyttene, og (C) overskuddet av VS aspireres på nytt for å etterlate bare et tynt lag rundt hver oocytt. Forkortelse: VS = vitrifiseringsløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Oocytt vitrification sykluser utført på GENERA senter for reproduktiv medisin i Roma (år 2008-2020). I løpet av 12-års perioden gjennomgikk 250 pasienter en enkelt oocyttuthenting for oocytt vitrifisering, mens 35 gjennomgikk flere oocyttgjenvinningssykluser. De iboende årsakene til oocytt vitrifisering er vist i figuren. Pasientene som kommer tilbake for oppvarming (n = 78) tilhører bare gruppen kvinner som gjennomgikk en enkelt oocytt vitrifiseringssyklus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Gjennomsnittlig overlevelsesrate per kohort av oppvarmede oocytter. (A) Vitrifisering og (B) oppvarming operatørens erfaring. Hver pasient er bare inkludert for den første oppvarmingssyklusen. Statistisk signifikante forskjeller ble vurdert ved hjelp av Mann-Whitney U-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Oocyttmorfologi i begynnelsen og slutten av likevektsprosedyren. For å bestemme utfallet av likevektsprosedyren, kan det være nyttig å kommentere (A) oocyttmorfologi før du starter prosedyren. (B) En kraftig krymping av oocytten observeres etter første eksponering for kryopreotektantløsningen. Likevektsprosedyren kan betraktes som fullført når (C) oocytten har gjenopprettet sitt opprinnelige volum. Skalastenger = 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Årsak til oocytt vitrifisering Annen medisin enn kreft (n=19) Kreft (n=40) Ikke-medisinsk (n=133) Annet (n=58)
Mors alder ved oocyttuthenting, middelverdi±SD 33.6±6.4 år 34.6±5.9 år 37.0±3.4 år 38.2±4.3 år
Basal FSH, gjennomsnitt±SD 7.5±4.2 IE/L 7.6±1.7 IE/L 7.8±4.1 IE/L 8.8±5.2 IE/L
AMH, middelverdi±SD 1.8±1.7 ng/ml 1.9±0.2 ng/ml 2.2±2.4 ng/ml 3.0±2.5 ng/ml
AFC, middelverdi±SD 12.7±5.0 13.3±7.0 11.6±6.1 10.7±6.7
BMI, middelverdi±SD 20.1±1.5 21.8±1.6 20.2±3.1 22.9±3.6
Varighet av stimulering, middelverdi±SD 10.0±1.5 9.6±1.7 9.9±2.1 10.3±2.1
9/40, 22.5%
Tilfeldig start
COCer i alt, gjennomsnitt±SD 239 551 1493 592
12.6±5.3 13.8±9.1 11.2±7.1 10.2±8.5
MII oocytter, totalt, gjennomsnitt±SD 167 400 1161 462
8.8±3.3 10.0±7.2 8.7±5.7 8.0±6.7
Modningsrate, middelverdi±SD 72,4 ±13,6 % 72,1 ±19,6 % 79,5 ±17,5 % 77,4 ±22,2 %
Pasienter som kom tilbake for oppvarming, totalt % av pasientene som gjennomgikk vitrifisering 10/19, 52.6% 7/40, 17.5% 17/133, 12.8% 44/58, 75.9%
Dager mellom vitrifisering og første oppvarming, middelverdi±SD 283±225 1264±764 1547±709 132±203
Oppvarmede MII-oocytter, totalt gjennomsnitt±SD 82 66 191 409
8.2±2.8 9.4±4.8 11.2±5.8 9.3±7.2
Overlevde MII-oocytter, totalt gjennomsnitt±SD 73 55 160 345
7.3±3.3 7.9±4.0 9.4±4.8 7.8±6.9
Overlevelsesrate, middelverdi±SD 87,6 ±18,1 % 83,2 ±1,7 % 85,4 %±14,5 % 84,7 ±21,9 %
Sædfaktor
N, n, % 5/10, 50% 4/7, 57% 13/17, 76% 13/44, 29%
MMF, n, % 3/10, 30% 3/7, 43% 3/17, 18% 17/44, 39%
OAT, n, % 2/10, 20% - 1/17, 6% 11/44, 25%
NOA, n, % - - - 3/44, 7%
Befruktningsrate, gjennomsnitt±SD 70,0±14,4 % 70,0 ±17,0 % 78,5 ±20,6 % 71,0 ±24,3 %

Tabell 1: Pasienter som gjennomgår en enkelt syklus med oocytt vitrifisering. Forkortelser: FSH = follikkel stimulerende hormon; AMH = anti-Müllerian hormon; BMI = kroppsmasseindeks; COC = cumulus oocyttkomplekser; MII = metafase-II; N = normozoospermisk; MMF = moderat mannlig faktor (1-2 sædfeil); OAT = oligoasthenoteratozoospermisk; NOA = ikke-obstruktiv azoospermia (sæd ble samlet inn gjennom testikkel sædutvinning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kliniske hensyn

Selv om nye strategier, som ovarian vev kryopreservering og in vitro modning, har blitt utforsket, oocyte vitrification etter COS er gull standard teknikk for fruktbarhet bevaring. I dette scenariet bør antall oocytter som hentes og kryopreserveres maksimeres på kortest mulig tid, da de fleste kreftpasienter kan ha nytte av en eggstokksyklus før de må starte kreftbehandlingen(e). Dermed er en riktig ovariestimuleringsprotokoll avgjørende for å utnytte eggstokkreservatet fullt ut og øke den kumulative sjansen for en fremtidig levende fødsel28, et resultat som er sterkt avhengig av mors alder ved oocyttuthenting. I denne forbindelse er det ikke foreslått en ideell alder for oocytt vitrifisering for fruktbarhet bevaring formål ennå29, og det kreves konsensus mellom enten 35 år18 eller 37 år30,31. Imidlertid, fruktbarhet bevaring bør være tilgjengelig for alle pasienter, inkludert kvinner eldre enn 37 år, forutsatt at de får riktig rådgivning om suksessrater basert på deres alder.

Protokollen og startdosen av medisiner bør skisseres i henhold til gynekologens vurdering og viktigst, basert på tiden som er tilgjengelig32,33. Å starte konvensjonell stimulering i tidlig follikulær fase anbefales når tiden ikke er et problem. Men om nødvendig er random-start tilnærmingen mulig for å minimere forsinkelser i å starte akutt kreft / medisinske behandlinger34,35. Follikulær utvikling har blitt rapportert å være en ekstremt dynamisk prosess ettersom flere bølger av follikkelrekruttering har blitt beskrevet gjennom en enkelt eggstokksyklus. Selv om de biologiske mekanismene bak dette fenomenet fortsatt må avdukes, kan kompetente oocytter hentes og kryopreserveres uavhengig av fasen av menstruasjonssyklusen der COS startes36.

I dette senteret utføres eggstokkstimulering vanligvis ved hjelp av GnRH antagonistprotokollen og 150-300 IE / dag med rekombinant-FSH eller menneskelig menopausal gonadotropin. I spesifikke populasjoner av pasienter eldre enn 35 år, med LH-mangel, eller viser suboptimal respons etter standard COS, kan LH legges til under COS for å øke rekrutteringen og veksten av follikler gjennom en synergisk handling med insulinlignende vekstfaktor 116,37,38. Videre har GnRH-antagonistprotokollen etterfulgt av en GnRH-agonistutløser blitt rapportert å være en kort, sikker og svært praktisk stimuleringsprotokoll for å maksimere eggstokkresponsen og minimere risikoen for OHSS39. Hos pasienter med østrogenfølsomme sykdommer som brystkreft, administreres gonadotropiner forbundet med aromatasehemmere, som letrozol,20.

Faktisk viste en nylig gjennomgang at letrozol innebærer lignende ovarial respons som konvensjonell stimulering uten komplikasjoner når det gjelder medfødte feil, malignitet tilbakefall og øktdødelighet 40. På samme måte kan tamoksifen brukes under COS i tilfelle østrogenfølsomme svulster, som, som letrozol, ikke viste noen innvirkning på oocyttkompetanse41,42. Dette må imidlertid bekreftes i større studier. I dette senteret administreres letrozol fra dag 1 av stimulering opp til dag 7 etter oocyttuthenting i tilfelle østradiolfølsomme svulster. Risikoen for OHSS, som er den viktigste komplikasjonen av COS som også vil forsinke kreftbehandlinger ytterligere, bør vurderes, spesielt hos unge pasienter med høy AFC. I disse tilfellene har utløsende eggløsning med en GnRH-agonist i stedet for menneskelig chorionisk gonadotropin (hCG) vist seg å være gunstig. Andre problemer som må forebygges er (i) trombo-embolisme, som krever administrering av lavmolekylær heparin under COS, og (ii) redusert eggstokkrespons etter COS43. For å kompensere for sistnevnte, kan to påfølgende stimuleringer i en enkelt eggstokksyklus utføres. Denne nye ukonvensjonelle COS-protokollen, kjent som DuoStim, innebærer follikulære og luteale fasestimuleringer og to oocyttuthentinger på kort tid (~ 15 dager) og bør undersøkes for fruktbarhet bevaring formål i fremtiden44,45,46.

Andre mulige strategier for fruktbarhet bevaring hos kvinner er: (i) ovarievev kryopreservering, som er det eneste alternativet tilgjengelig for prepubertal kvinner. Denne muligheten er lovende for å gjenopprette reproduktiv og endokrine aktivitet og unngå forsinkelse i å starte kreftbehandling, da ingen hormonell stimulering er nødvendig. Imidlertid er det fortsatt eksperimentelt og krever laparoskopisk kirurgi med senere transplantasjon, og det er risiko for ortotopisk krefttransmisjon. (ii) Embryo cryopreservation, som innebærer en høyere overlevelsesrate etter oppvarming, men forsinker kreftbehandling og krever at en mannlig partner eller donor er involvert, og begrenser dermed også en kvinnes fremtidige reproduktive autonomi47. Videre kan det være underlagt juridiske begrensninger i noen land. Tatt i betraktning disse begrensningene, anses oocytt vitrifisering som den mest etablerte og etisk akseptable tilnærmingen. Ideelt sett bør alle store sykehus, hvor kvinner som er rammet av kreft i sin reproduktive alder, gi programmer for fruktbarhet bevaring, og hele prosessen bør være gratis for disse pasientene for å sikre lik tilgang til dette programmet. Likevel må oocytt kryopreservering utføres utelukkende i sentre med nok kompetanse til ikke å påvirke oocyttkompetanse i prosessen48.

Kritiske trinn i vitrifiseringsprotokollen og feilsøking

Vitrifisering er en pseudo andreordens faseovergang (IUPAC Compendium of Chemical Terminology) som induserer en glasslignende størkning inne i cellene som forhindrer iskrystallkjernedannelse og vekst, den viktigste årsaksfaktoren for celleskade. For å oppnå riktig vitrifisering kreves en kombinasjon av minst to CPA-er (vanligvis etylenglykol og DMSO som gjennomtrengende midler og sukrose som ikke-gjennomtrengende middel) sammen med en ekstremt høy kjølehastighet (>20 000 ° C / min) oppnådd enten ved å minimere lastevolumer eller ved direkte eksponering av prøvene til flytende nitrogen (åpne enheter). Siden oocytter er de største cellene i kroppen, inneholder de den største mengden vann. Derfor er de mer følsomme for fryseskader enn embryoer. Under oocytt kryopreservering, skade på intracellulære organeller (f.eks. cytoskeleton eller meiotisk spindel), endring av membranpermeabilitet, zona pellucida herding, oocyttaktivering, endring av biokjemiske veier og muligens celledød kan forekomme49. Av denne grunn må en delikat balanse mellom flere faktorer sikres for vellykket bevaring av oocytt levedyktighet og utviklingskompetanse. For å oppnå konsistens i overlevelsesraten etter vitrifisering og nå referansenivåene, må alle de avgjørende trinnene i prosedyren kontrolleres nøye.

CPA-er, celle osmolalitet og kjølehastigheter

For å øke sannsynligheten for vitrifisering må viskositeten til mediet (og derfor CPA-konsentrasjonen) maksimeres. CPA-enes toksisitet bør imidlertid alltid holdes under kontroll50. For dette formål er det avgjørende å minimere både tidspunktet for celleeksponering for CPA-ene og lastevolumene, og alltid jobbe ved romtemperatur (25-27 °C)51. Andre protokoller involverer forskjellige kombinasjoner av CPA og kryodevices og utføres ved 37 °C; De er imidlertid ikke beskrevet her. Dermed gjelder notatene, de representative resultatene og diskusjonsdelene i dette manuskriptet bare for vitrifiseringsprotokollen som er beskrevet her.

Under kryopreservering blir oocyttene utsatt for CPA-løsninger med økt osmolytkonsentrasjon for å fremme celledehydrering og cytoplasmatisk krymping. Under oppvarming blir de utsatt for løsninger med redusert osmolytkonsentrasjon for å gjenopprette det cytoplasmatiske volumet. Under vitrifisering blir oocyttene dehydrert, og utilsiktede svingninger i cellevolumet kan forårsake alvorlig osmotisk sjokk, og dermed kompromittere overlevelses- og utviklingspotensialet etter oppvarming52. Å finne den optimale kjølehastigheten er et viktig aspekt for å bevare celle levedyktighet da det påvirker osmolaliteten53 og celleutviklingspotensialet54. For eksempel, når en celle blir utsatt for kjølehastigheter langsommere enn de optimale prisene, kan den bli mye utsatt for hypertoniske forhold som fører til celledød.

For å oppnå optimal kjølehastighet bør lastevolumene minimeres, RT bør kontrolleres for ikke å påvirke likevektsprosessens hastighet, og prøver bør være direkte utsatt for flytende nitrogen. En måte å vurdere når likevekt er oppnådd er å kommentere oocyttens morfologi (spesielt bredden på perivitellinerommet og tykkelsen på zona pellucida) før begynnelsen av prosedyren (Figur 5A). Etter en innledende fase med reduksjon av cellevolum (figur 5B) forventes oocytten å gjenopprette det opprinnelige volumet (figur 5C). Selv om riktig pH opprettholdes under oocytthåndtering under luftatmosfære på grunn av zwitterions som bufrer vitrifiseringsoppvarmingsløsningene, er middels osmolalitet i stedet spesielt avhengig av temperatur53. Derfor er metoden for parabolforberedelse avgjørende for å redusere enhver mulig skadelig effekt55.

Oljeoverlegg er absolutt avgjørende for å forhindre fordampning og unngå økning i osmolalitet i IVF media56. Det kan imidlertid ikke brukes mens du utfører vitrifiserings- og oppvarmingsprosedyrene. Derfor er noen tips viktige for operatører: (i) forberede dråpene så raskt som mulig og umiddelbart før bruk; (ii) vurdere større mengder dråper for å minimere skift i osmolaritet (<30 μL anbefales ikke); (iii) når miljøforholdene ikke kan standardiseres, kan en 6-brønns plate brukes, og sterilt vann eller PBS kan legges til det tilstøtende reservoaret for å begrense fordampning; (iv) vær oppmerksom på datoen for den første åpningen av hetteglasset med medium, da osmolalitet kan endres hvis flasken åpnes gjentatte ganger.

Oocyte oppvarming og oocytt devitrification

Det mest avgjørende trinnet som kan påvirke konsistensen i overlevelsesraten er definitivt oppvarmingsprosessen57. I løpet av dette trinnet fjernes CPA-er gradvis fra oocytten og fortynnes for å forhindre potensiell cytotoksisk effekt. Devitrifisering, nemlig dannelsen av iskjerner eller iskrystaller under oppvarming av en vitrifisert løsning eller ved et uhell under revisjon, transport eller lagring i damp, er en av de viktigste risikoene for vitrifisering58,59,60. Derfor, for å forhindre devitrifisering og skade under oppvarming, må temperaturforskjellen mellom første og siste trinn i prosessen maksimeres. Som vist av Seki og Mazur57 i murine oocytter utsatt for vitrifisering og oppvarming i forskjellige priser, jo raskere oppvarming, jo høyere overlevelse. Volum og temperatur på TS er de viktigste faktorene å kontrollere: TS bør varmes riktig til 37 °C (minst 1 time før prosedyren), og det flytende nitrogenstativet skal fylles til kanten av kapasiteten og plasseres så nært som mulig til stereomikroskopet. Operatøren bør være så rask som mulig mens kryopreserveringsbæreren overføres fra flytende nitrogen til TS. På grunn av den høye effektiviteten av vitrifisering, kan en universell oppvarmingsprotokoll brukes uavhengig av fryseprotokollen som er involvert, noe som gjør styringen av alle oppvarmingssyklusene enklere selv når oocytter importeres fra et annet IVF-senter61.

Åpne enheter og risiko for kontaminering

Ansettelsen av åpne systemer og direkte eksponering av prøvene for flytende nitrogen er nødvendig for å oppnå de ekstremt høye kjøle- og oppvarmingshastighetene som støtter effektiviteten av denne protokollen. Selv om vitrifisering er en prosedyre som utgjør lav risiko for krysskontaminering, fordi det innebærer svært små volumer og utføres etter flere prøvevasker som fortynner enhver putativ virusbelastning, er det viktig å vedta alle forholdsregler for å øke sikkerheten. Basert på nåværende bevis tilbyr lukkede systemer ikke et konkurransedyktig alternativ til åpne systemer i det minste for oocytt vitrification62,63. For å opprettholde effektiviteten av åpne vitrifiseringssystemer samtidig som risikoen forbundet med direkte kontakt med flytende nitrogen minimeres, kan sistnevnte steriliseres ved ultrafiolett bestråling64,65. Alternativt kan damplagringstanker brukes, som er kjent for å utgjøre en lavere risiko for forurensning enn konvensjonelle, men har vist seg å være effektive for å bevare oocytt levedyktighet66,67.

Viktigheten av konstant overvåking av viktige ytelsesindikatorer for oocytt vitrifiseringsprogrammer

I et IVF-laboratorium er overvåking av viktige ytelsesindikatorer (KPI-er) avgjørende for overvåking og kontinuerlig forbedring av resultatene68. Generelt, når du definerer KPI-er for overvåkingsprosesser og prosedyrer, bør tre hovedområder vurderes: struktur, prosess og utfall. Strukturelle KPI-er måler kvaliteten på IVF-laboratoriet ved å skissere egenskapene til fysiske og menneskelige ressurser. Et eksempel på en strukturell KPI relatert til anlegget i et kryopreserveringsprogram kan være antall kryotanke i forhold til det totale antallet ART-prosedyrer som krever kryopreservering utført i en gitt tidsperiode eller antall kryotanker i forhold til de totale kvadratmeterne i kryorommet. Men menneskelige ressurser og spesielt operatørferdigheter er av største betydning når man arbeider med en delikat prosedyre som vitrifisering. Faktisk, selv om den er ekstremt effektiv, er vitrifiseringsteknikken en utfordrende prosedyre som involverer flere prosedyrefaser med strenge timinger som må kontrolleres strengt: En svært liten mengde av et betydelig viskøs medium bør administreres over en svært kort periode.

Ingen frysemaskin med spesifikk innstilling for kjøleparametere er involvert i prosedyren; Derfor er standardisering av protokolldetaljer og opplæring viktig. Den manuelle prosessen har strenge ferdighetskrav som må oppfylles for å oppnå konsistente og svært reproduserbare celleoverlevelsesrater. Spesifikk opplæring bør gis til hver nybegynneroperatør for å gjøre dem dyktige til å kontrollere alle kritiske punkter i prosedyren, spesielt eksponeringstiden for prøvene til CPA og håndtering av cellene i et svært viskøs medium. Men ifølge Dessolle og medforfattere bør69 læringskurven for vitrifiseringsprosedyren ikke være så lang selv for junior embryologer, da oppnåelsen av ferdighet hovedsakelig er begrenset av manipulasjonsutfordringer. Når kompetanse innen vitrifisering er oppnådd, må ytelsen til hver enkelt operatør verifiseres nøyaktig og regelmessig gjennom bruk av KPI-er for regelmessig å vurdere vedlikehold av kompetanseverdier fastsatt av konsensuspapir70. Videre må operatørtillit/kompetanse være sammenlignbar for ikke å påvirke utfallet.

Prosess-KPI-er måler hvor godt IVF-laboratoriet fungerer. Vitrifiserings- og oppvarmingsprotokoller og prosedyrer bør gjennomføres i tide, og svingninger i kulturforhold bør minimeres ved å være spesielt oppmerksom på å opprettholde tilstrekkelig osmolaritet og temperatur for bevaring av ikke bare oocytt utviklingskompetanse, men også av operatørsikkerhet mens du håndterer flytende nitrogen. Eksempler på prosess-KPI-er er prosentandelen av laboratoriepersonellskader under håndtering av flytende nitrogen per antall IVF-prosedyrer per år, prosentandelen gameter/embryoer tapt/skadet under vitrifiserings-/oppvarmingsprosedyrer, og revisjoner per antall prosedyrer per år.

Til slutt måler utfalls-KPI-er effektiviteten til IVF-laboratoriet og refererer generelt til etterkrigende oocyttoverlevelse definert som andelen morfologisk intakte oocytter på tidspunktet for ICSI (i tilfelle oocyttvitrifisering, bør kompetanseverdien være >50% og referanseverdien er 75%)70. I tillegg er befruktningsgraden (<10% lavere enn de friske oocyttene inseminert i sentrum fra en sammenlignbar pasientpopulasjon), embryoutvikling (det samme som en sammenlignbar pasientpopulasjon ved hjelp av friske oocytter) og implantasjon (<10-30% lavere enn en sammenlignbar populasjon av friske embryoer i sentrum) gjelder som utfall KPIer for vitrified oocytter70. Kliniske resultater er imidlertid mer utsatt for parspesifikke egenskaper enn feil kliniske prosedyrer71,72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cobo, A., Diaz, C. Clinical application of oocyte vitrification: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Fertility and Sterility. 96 (2), 277-285 (2011).
  2. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  3. Nagy, Z. P., Anderson, R. E., Feinberg, E. C., Hayward, B., Mahony, M. C. The Human Oocyte Preservation Experience (HOPE) Registry: evaluation of cryopreservation techniques and oocyte source on outcomes. Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).
  4. Practice Committees of American Society for Reproductive, M., & Society for Assisted Reproductive, T. Mature oocyte cryopreservation: a guideline. Fertility and Sterility. 99 (1), 37-43 (2013).
  5. Lee, S. J., et al. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation in cancer patients. Journal of Clinical Oncology. 24 (18), 2917-2931 (2006).
  6. Nakayama, K., Ueno, N. T. American Society of Clinical Oncology recommendations on fertility preservation should be implemented regardless of disease status or previous treatments. Journal of Clinical Oncology. 24 (33), 5334-5335 (2006).
  7. Martinez, F. Update on fertility preservation from the Barcelona International Society for Fertility Preservation-ESHRE-ASRM 2015 expert meeting: indications, results and future perspectives. Human Reproduction. 32 (9), 1802-1811 (2017).
  8. Lantsberg, D., Fernando, S., Cohen, Y., Rombauts, L. The role of fertility preservation in women with endometriosis: a systematic review. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 27 (2), 362-372 (2020).
  9. Anderson, R. A., et al. Cancer treatment and gonadal function: experimental and established strategies for fertility preservation in children and young adults. Lancet Diabetes & Endocrinology. 3 (7), 556-567 (2015).
  10. Lambertini, M., et al. Cancer and fertility preservation: international recommendations from an expert meeting. BMC Medicine. 14, 1 (2016).
  11. Kim, S. J., Kim, S. K., Lee, J. R., Suh, C. S., Kim, S. H. Oocyte cryopreservation for fertility preservation in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biomedicine Online. 40 (6), 827-834 (2020).
  12. Loren, A. W., et al. Fertility preservation for patients with cancer: American Society of Clinical Oncology clinical practice guideline update. Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2500-2510 (2013).
  13. Peccatori, F. A., et al. Cancer, pregnancy and fertility: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 24, Suppl 6 160-170 (2013).
  14. Dondorp, W. J., De Wert, G. M. Fertility preservation for healthy women: ethical aspects. Human Reproduction. 24 (8), 1779-1785 (2009).
  15. Cil, A. P., Bang, H., Oktay, K. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertilility and Steriityl. 100 (2), 492-499 (2013).
  16. Ubaldi, F. M., et al. Advanced maternal age in IVF: still a challenge? The present and the future of its treatment. Frontiers in Endocrinology. 10, 94 (2019).
  17. Cimadomo, D., et al. Impact of maternal age on oocyte and embryo competence. Frontiers in Endocrinology. 9, 327 (2018).
  18. Cobo, A., et al. Oocyte vitrification as an efficient option for elective fertility preservation. Fertility and Sterility. 105 (3), 755-764 (2016).
  19. Devroey, P., Polyzos, N. P., Blockeel, C. An OHSS-Free Clinic by segmentation of IVF treatment. Human Reproduction. 26 (10), 2593-2597 (2011).
  20. Sonigo, C., et al. Impact of letrozole supplementation during ovarian stimulation for fertility preservation in breast cancer patients. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology X. 4, 100049 (2019).
  21. Marklund, A., et al. Efficacy and safety of controlled ovarian stimulation using GnRH antagonist protocols for emergency fertility preservation in young women with breast cancer-a prospective nationwide Swedish multicenter study. Human Reproduction. 35 (4), 929-938 (2020).
  22. Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73-80 (2007).
  23. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  24. Bosch, E., et al. ESHRE guideline: ovarian stimulation for IVF/ICSI(dagger). Human Reproduction Open. 2020 (2), (2020).
  25. ESHRE Working Group on Ultrasound in ART. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up(dagger). Human Reproduction Open. 2019 (4), 025 (2019).
  26. Rienzi, L., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during IVF. Reproductive Biomedicine Online. 31 (4), 516-522 (2015).
  27. Mazzilli, R., et al. Effect of the male factor on the clinical outcome of intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation aneuploidy testing: observational longitudinal cohort study of 1,219 consecutive cycles. Fertility and Sterility. 108 (6), 961-972 (2017).
  28. Polyzos, N. P., et al. Cumulative live birth rates according to the number of oocytes retrieved after the first ovarian stimulation for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection: a multicenter multinational analysis including approximately 15,000 women. Fertility and Steriityl. 110 (4), 661-670 (2018).
  29. Alteri, A., Pisaturo, V., Nogueira, D., D'Angelo, A. Elective egg freezing without medical indications. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 647-652 (2019).
  30. Mesen, T. B., Mersereau, J. E., Kane, J. B., Steiner, A. Z. Optimal timing for elective egg freezing. Fertility and Steriityl. 103 (6), 1551-1556 (2015).
  31. Doyle, J. O., et al. Successful elective and medically indicated oocyte vitrification and warming for autologous in vitro fertilization, with predicted birth probabilities for fertility preservation according to number of cryopreserved oocytes and age at retrieval. Fertility and Sterility. 105 (2), 459-466 (2016).
  32. Rienzi, L., et al. Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertility and Sterility. 90 (5), 1692-1700 (2008).
  33. Ubaldi, F. M., et al. Reduction of multiple pregnancies in the advanced maternal age population after implementation of an elective single embryo transfer policy coupled with enhanced embryo selection: pre- and post-intervention study. Human Reproduction. 30 (9), 2097-2106 (2015).
  34. Cakmak, H., Katz, A., Cedars, M. I., Rosen, M. P. Effective method for emergency fertility preservation: random-start controlled ovarian stimulation. Fertility and Sterility. 100 (6), 1673-1680 (2013).
  35. Moravek, M. B., et al. Long-term outcomes in cancer patients who did or did not pursue fertility preservation. Fertility and Sterility. 109 (2), 349-355 (2018).
  36. Vaiarelli, A., Venturella, R., Vizziello, D., Bulletti, F., Ubaldi, F. M. Dual ovarian stimulation and random start in assisted reproductive technologies: from ovarian biology to clinical application. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 29 (3), 153-159 (2017).
  37. Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Ubaldi, N., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. What is new in the management of poor ovarian response in IVF. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 30 (3), 155-162 (2018).
  38. Venturella, R., et al. State of the art and emerging drug therapies for female infertility. Gynecological Endocrinology. 35 (10), 835-841 (2019).
  39. Venturella, R., et al. A modern approach to the management of candidates for assisted reproductive technology procedures. Minerva Ginecologica. 70 (1), 69-83 (2018).
  40. Ferreiro, E., de Uralde, B. L., Abreu, R., Garcia-Velasco, J. A., Munoz, E. Aromatase inhibitors for ovarian stimulation in patients with breast cancer. Current Drug Targets. 21 (9), 910-921 (2020).
  41. Oktay, K., et al. Letrozole reduces estrogen and gonadotropin exposure in women with breast cancer undergoing ovarian stimulation before chemotherapy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (10), 3885-3890 (2006).
  42. Meirow, D., et al. Tamoxifen co-administration during controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization in breast cancer patients increases the safety of fertility-preservation treatment strategies. Fertility and Steriity. 102 (2), 488-495 (2014).
  43. Friedler, S., Koc, O., Gidoni, Y., Raziel, A., Ron-El, R. Ovarian response to stimulation for fertility preservation in women with malignant disease: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Steriity. 97 (1), 125-133 (2012).
  44. Tsampras, N., Gould, D., Fitzgerald, C. T. Double ovarian stimulation (DuoStim) protocol for fertility preservation in female oncology patients. Human Fertility. 20 (4), 248-253 (2017).
  45. Vaiarelli, A., et al. Double stimulation in the same ovarian cycle (DuoStim) to maximize the number of oocytes retrieved from poor prognosis patients: a multicenter experience and SWOT analysis. Frontiers in Endocrinology. 9, 317 (2018).
  46. Cimadomo, D., et al. Luteal phase anovulatory follicles result in the production of competent oocytes: intra-patient paired case-control study comparing follicular versus luteal phase stimulations in the same ovarian cycle. Human Reproduction. 33 (8), 1442-1448 (2018).
  47. Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Oocyte versus embryo cryopreservation for fertility preservation in cancer patients: guaranteeing a women's autonomy. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 32 (8), 1195-1196 (2015).
  48. Oktay, K., Harvey, B. E., Loren, A. W. Fertility preservation in patients with cancer: ASCO clinical practice guideline update summary. JCO Oncology Practice. 14 (6), 381-385 (2018).
  49. Iussig, B., et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 98 (5), 550-558 (2019).
  50. Best, B. P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
  51. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reproductive Biomedicine Online. 9 (6), 680-691 (2004).
  52. Konc, J., Kanyo, K., Kriston, R., Somoskoi, B., Cseh, S. Cryopreservation of embryos and oocytes in human assisted reproduction. BioMed Research International. 2014, 307268 (2014).
  53. Erstad, B. L. Osmolality and osmolarity: narrowing the terminology gap. Pharmacotherapy. 23 (9), 1085-1086 (2003).
  54. Sunde, A., et al. Time to take human embryo culture seriously. Human Reproduction. 31 (10), 2174-2182 (2016).
  55. Swain, J. E., Cabrera, L., Xu, X., Smith, G. D. Microdrop preparation factors influence culture-media osmolality, which can impair mouse embryo preimplantation development. Reproductive Biomedicine Online. 24 (2), 142-147 (2012).
  56. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  57. Seki, S., Mazur, P. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 59 (1), 75-82 (2009).
  58. Karlsson, J. O. A theoretical model of intracellular devitrification. Cryobiology. 42 (3), 154-169 (2001).
  59. Jin, B., et al. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biololgy of Reproduction. 82 (2), 444-450 (2010).
  60. Mazur, P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics. 17 (1), 53-92 (1990).
  61. Parmegiani, L., et al. "Universal Warming" protocol for vitrified oocytes to streamline cell exchange for transnational donation programs: a multi-center study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (6), 1379-1385 (2020).
  62. Vajta, G., Rienzi, L., Ubaldi, F. M. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reproductive Biomedicine Online. 30 (4), 325-333 (2015).
  63. Cai, H., et al. Open versus closed vitrification system of human oocytes and embryos: a systematic review and meta-analysis of embryologic and clinical outcomes. Reproductive Biology & Endocrinology. 16 (1), 123 (2018).
  64. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  65. Parmegiani, L., et al. Efficiency of aseptic open vitrification and hermetical cryostorage of human oocytes. Reproductive Biomedicine Online. 23 (4), 505-512 (2011).
  66. Cobo, A., et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertility and Sterility. 94 (5), 1903-1907 (2010).
  67. Eum, J. H., et al. Long-term liquid nitrogen vapor storage of mouse embryos cryopreserved using vitrification or slow cooling. Fertility and Sterility. 91 (5), 1928-1932 (2009).
  68. Fabozzi, G., et al. Which key performance indicators are most effective in evaluating and managing an in vitro fertilization laboratory. Fertility and Sterility. 114 (1), 9-15 (2020).
  69. Dessolle, L., et al. Learning curve of vitrification assessed by cumulative summation test for learning curve (LC-CUSUM). Fertility and Sterility. 92 (3), 943-945 (2009).
  70. Alpha Scientists In Reproductive Medicine. The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting. Reproductive Biomedicine Online. 25 (2), 146-167 (2012).
  71. Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Human Reproduction Update. 18 (5), 536-554 (2012).
  72. Edgar, D. H., Archer, J., Bourne, H. The application and impact of cryopreservation of early cleavage stage embryos in assisted reproduction. Human Fertility. 8 (4), 225-230 (2005).

Tags

Biologi Utgave 175 Bevaring av fruktbarhet ovariestimulering metafase II oocytt vitrifisering oppvarming viktige ytelsesindikatorer (KPI)
Ufrivillig bevaring gjennom Oocyte Vitrification: Kliniske og laboratorieperspektiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggiulli, R., Vaiarelli, A.,… More

Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter