Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

יצירה והרכבה של נוקלאוקפסידים ספציפיים לווירוסים של הנגיף הסינכרוני הנשימתי

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/62010
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

Summary

לניתוח מכני מעמיק של סינתזת RNA של הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אנו מדווחים על פרוטוקול של ניצול הפוספופרוטאין המלווה (P) לצורך דו-קיום של הנוקליאופרוטאין (N0)נטול ה- RNA להרכבה במבחנה של הגרעינים הספציפיים לנגיף (NCs).

Abstract

השימוש בתבנית RNA אותנטית הוא קריטי כדי לקדם את הידע הבסיסי של סינתזת RNA ויראלית שיכולה להנחות הן גילוי מכני והן פיתוח מבחנים בוירולוגיה. תבנית ה- RNA של וירוסי RNA שליליים (NNS) שאינם מוגנים, כגון הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אינה מולקולת RNA בלבד אלא קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין עטוף נוקלאופרטאין (N). למרות החשיבות של תבנית RNA אותנטית, הדור וההרכבה של קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין כזה נשארים מתוחכמים ודורשים הבהרת עומק. האתגר העיקרי הוא כי N RSV overexpressed נקשר באופן לא ספציפי RNAs הסלולר כדי ליצור חלקיקים אקראיים דמויי nucleocapsid (NCLPs). כאן, הקמנו פרוטוקול כדי להשיג N ללא RNA (N0)תחילה על ידי שיתוף הבעה N עם phosphoprotein מלווה (P), ולאחר מכן הרכבת N0 עם אוליגוס RNA עם רצף RNA ספציפי RSV כדי להשיג נוקליקופסידים ספציפיים לנגיף (NCs). פרוטוקול זה מראה כיצד להתגבר על הקושי בהכנת מתחם ריבונוקלאופרוטאין ויראלי מאתגר באופן מסורתי.

Introduction

וירוסי RNA שליליים (NNS) שאינם מוגנים כוללים פתוגנים אנושיים משמעותיים רבים, כגון כלבת, אבולה ווירוס סינסיטיאלי נשימתי (RSV)1,2. RSV הוא הגורם המוביל למחלות בדרכי הנשימה כגון ברונכיוליטיס ודלקת ריאות אצל ילדים צעירים ומבוגרים ברחבי העולם3. נכון לעכשיו, אין חיסונים יעילים או טיפולים אנטי ויראליים זמינים כדי למנוע או לטפל RSV4. כחלק ממחזור החיים, הגנום RSV משמש כתבנית לשכפול על ידי פולימראז RNA תלוי RSV לייצר אנטיגנום, אשר בתורו פועל כתבנית כדי ליצור גנום צאצאים. הן הגנום והן האנטיגנום RNAs הם עטופים לחלוטין על ידי נוקלאופרוטין (N) כדי ליצור את nucleocapsids (NCs)3. מכיוון שה- NCs משמשים כתבניות הן עבור שכפול והן עבור שעתוק על-ידי פולימראז RSV, הרכבת NC נכונה חיונית עבור הפולימראז כדי לקבל גישה לתבניות עבור סינתזת RNA5. מעניין, בהתבסס על ניתוחים מבניים של פולימראז נגיפי NNS, הוא שיערו כי מספר חלבוני N להתיר באופן חולף מן NCs כדי לאפשר את הגישה של פולימראז rebind ל- RNA לאחר סינתזת RNA6,7,8,9,10,11,12.

נכון לעכשיו, מבחני פולמור RNA RSV הוקמה באמצעות פולימראז RSV מטוהר על תבניות RNA עירום קצר13,14. עם זאת, הפעילויות של פולימראז RSV אינן מגיעות אופטימלית, כפי שנצפה במוצרים שאינם מעובדים וביטול שנוצר על ידי פולימראז RSV בעת שימוש בתבניות RNA עירום. חוסר NC עם RNA ספציפי לנגיף הוא מחסום עיקרי להבנה מכנית נוספת של סינתזת RNA RSV. לכן, שימוש בתבנית RNA אותנטית הופך לצורך קריטי כדי לקדם את הידע הבסיסי של סינתזת RNA RSV. המבנים הידועים של חלקיקים דמויי nucleocapsid (NCLPs) מ RSV ווירוסי RNA NNS אחרים מגלים כי RNAs ב- NCLPs הם או RNAs הסלולר אקראי או ממוצע RNAs גנומי ויראלי15,16,17,18,19. יחד, המשוכה העיקרית היא ש- N נקשר באופן לא ספציפי ל- RNAs סלולריים כדי ליצור NCLP כאשר N מתרשם יתר על ה- 0 בתאים המארחים.

כדי להתגבר על משוכה זו, הקמנו פרוטוקול כדי להשיג RNA חינם (N0)הראשון להרכיב N0 עם RNA גנומי ויראלי אותנטי לתוך NCLPs20. העיקרון של פרוטוקול זה הוא להשיג כמות גדולה של N ללא רנ"א רקומביננטי (N0)על ידי שיתוף להביע N עם מלווה, תחום N-מסוף של RSV פוספופרוטאין (PNTD). N0P מטוהר יכול להיות מגורה והרכיב לתוך NCLPs על ידי הוספת אוליגוס RNA ספציפי RSV, ובמהלך תהליך ההרכבה, המלווה PNTD נעקר על תוספת של אוליגוס RNA.

כאן, אנו מפרטים פרוטוקול עבור הדור וההרכבה של NCs ספציפיים RNA RSV. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השיבוט המולקולרי, הכנת החלבון, הרכבת במבחנה ואימות ההרכבה המורכבת. אנו מדגישים את אסטרטגיית השיבוט כדי ליצור מבנים דו-סיסטרוניים לדו-קיום חלבונים לשיבוט מולקולרי. להכנת חלבונים, אנו מתארים את ההליכים של תרבית התא, מיצוי החלבון וטיהור קומפלקס החלבון. לאחר מכן אנו דנים בשיטה להרכבה במבחנה של NCs ספציפיים RNA RSV. לבסוף, אנו משתמשים כרומטוגרפיה אי-הכללת גודל (SEC) ומיקרוסקופ אלקטרוני כתם שלילי (EM) כדי לאפיין לדמיין ותמחה את NCLPs התאספו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיבוט מולקולרי

הערה: שיבוט עצמאי ליגאז (LIC) שימש להכנת RSV דו סיסטרוני דו-קיום לבנות פלסמיד. LIC היא שיטה שפותחה בתחילת שנות התשעים, המשתמשת בפעילות האקסו 3'-5 ' של פולימראז ה- T4 DNA כדי ליצור overhangs עם משלימות בין הווקטור לבין להוסיף DNA21,22. המבנים נעשו באמצעות DNA וקטורי 2BT-10, אשר מורכב 10x התג שלו במסוף N של מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF)(איור 1).

  1. בצע ליניאריזציה של וקטורים LIC באמצעות עיכול SSPI.
    1. שלב 10 μL של מאגר SSPI 10X, 4 μL של אנזים SSPI בריכוז של 5 U / μL, נפח שווה ערך של 5 מיקרוגרם של DNA miniprep וקטורית, ו ddH סטרילי2O עד 100 μL.
    2. דגירה את העיכול במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. להפעיל את העיכול על 1.0% ג'ל agarose להפקת DNA וקטור.
    4. השתמש בערכת מיצוי ג'ל לביצוע מיצוי וטיהור. להשעות את הנפח הסופי של DNA וקטור ב 30 μL של ddH2O ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. הכן את מוסיף ה- DNA עבור N1-391 ו- P1-126 באמצעות פריימר קדימהN 1-391, N1-391 פריימר הפוך, P1-126 קדימה פריימר, ו P1-126 קדם הפוך (טבלה 1).
    הערה: יש חפיפה מספקת עם הווקטור הליניארי כדי להבטיח טמפרטורת התכה של בין 55 °C (60 °F) ו 60 °C (60 °F). עבור פריימר הפוך, יש חפיפה מספקת עם הגדיל המשלים ההפוך של הווקטור הליניארי מאותה סיבה.
    1. בצע הגברה PCR של תוסף ה- DNA באמצעות התנאים בטבלה 2 ובטבלה 3.
    2. חלץ את תוסף הדנ"א המוגבר. הפעל את מוצרי PCR מהשלב הקודם על ג'ל agarose 1.0%, ולאחר מכן לחלץ ולטהר את הרצועות על ידי מיצוי ג'ל. להשעות את הנפח הסופי של DNA שחולצו ב 15 μL של ddH2O.
  3. T4 טיפול פולימראז DNA של וקטור ולהכניס DNA (טבלה 4).
    הערה: יש לבצע את הטיפול בנפרד עבור ה- DNA הווקטורי וה- DNA של הכנס.
    1. דגירה את התערובת במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חום להשבית את הפולימראז ב 75 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחסן את תערובת התגובה ב -20 מעלות צלזיוס.
  4. אנאל וקטור LIC וקטור הכנס.
    1. הגדר שליטה שלילית עם 2 μL של DNA וקטורי LIC ו 2 μL של ddH סטרילי2O.
    2. לשלב 2 μL של הכנס DNA ו 2 μL של DNA וקטור LIC מן התגובות הקודמות T4 DNA פולימראז בצינור 0.2 מ"ל.
    3. בצע את תגובת חישול בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    4. להרוות את התגובה עם 1.3 μL של EDTA בריכוז של 25 מ"מ.
    5. להפוך את התגובה לתוך 100 μL של E. coli Top10 תאים מוסמכים צלחת אותם על צלחת בחירת אמפילין23,24.
  5. זהה את המבנים החיוביים.
    1. הכינו את פתרון המיני-פרזיפ של הפלסמיד. זה יכול להיעשות באמצעות קטיף מושבה וחיסון במדיה LB. בדרך כלל, 3 מושבות מספיקות.
    2. דגירה את התערובת לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. צנטריפוגה את התערובת ב 4,560 x g במשך 10 דקות ולזרוק את supernatant.
    4. Resuspend כדורי ב 250 μL של מאגר P1 ולהכין minipreps פלסמיד באמצעות ערכת miniprep ספין.
    5. בצע ניתוח עיכול של מוצר miniprep באמצעות AseI או אנזימי הגבלה אחרים.
    6. לטעון דגימות על 0.8% ג'ל agarose ולהפעיל את פלסמיד מתעכל. לנתח את הג'ל תחת מנורת UV.
    7. השתמש בשירות רצף כדי לאמת את רצף המוצר החיובי.
  6. השג את תוסף הדנ"א הדו-קיום.
    1. בצע PCR כדי להשיג N1-391 ו P1-126 באמצעות 2BT-10 N שנבנה בעבר1-391 ו 2BT-10 P1-126 כתבניות.
    2. בצע את PCR 1st כדי להשיג N1-391 מ 2BT-10 N1-391 לבנות באמצעות תנאי PCR בטבלה 2 וטבלה 3 עם N1-391 פריימר קדימה פריימר הפוך 5'-GTGAAGATCCTGGCTTGGGGGGGGCG
      CGCCGCGATCGCGGATCC-3'.
    3. בצע את PCR2 nd כדי להשיג P1-126 מ 2BT-10 P1-126 לבנות באמצעות פריימר קדימה: 5'-CCGCCGGCATGCATCAGCCAGGATTCACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 וה-P1-126 הפוך פריימר (השתמש בתנאי PCR בטבלה 2 וטבלה 3).
    4. לבסוף, לבצע PCR חפיפה על המוצרים המעורבים של 2 תגובות PCR הקודם למזג N1-391 ו P1-126. השתמש בפריימריז קדימהN 1-391 וב-P1-126 הפוך פריימר. השתמש בתנאי PCR בטבלה 5 ובטבלה 6.
  7. הצטרף לווקטור ולתווסף הדנ"א.
    1. טפל במוצר PCR החופף עם פולימראז DNA T4 בעקבות הפרוטוקול בשלב 1.3.
    2. אנאל וקטור LIC ומוצר PCR בעקבות הפרוטוקול בשלב 1.4.
    3. זהה את המבנים החיוביים הבאים לפרוטוקול בשלב 1.5.

2. ביטוי חלבון וטיהור

הערה: השתמש E. coli עבור המבנה הדו-סיסטרוני של דו-קיום של N ו P. תרבות התאים ב 37 °C (69 °F), אבל לבצע את הביטוי בטמפרטורה מופחתת (16 °C (60 °F) לילה. לטהר את קומפלקס החלבון באמצעות שילוב של כרומטוגרפיה של עמודת קובלט, החלפת יון והדרת גודל (איור 2).

  1. השתמש בזן E. coli BL21(DE3) לייצור חלבונים. לגדול 4 L תרביות תא ב 37 °C (LB במרק לוריא) בינוני עד OD600 מגיע 0.6.
  2. להוריד את הטמפרטורה ל 16 °C (66 °F). שעה לאחר מכן, לגרום לביטוי עם 0.5 מ"מ איזופרופיל 1-thio - D-galactopyranoside (IPTG) לילה.
  3. צנטריפוגה התאים ב 4,104 x g במשך 25 דקות ולאחר מכן להשליך את supernatant.
  4. Resuspend כדורי התא ב 200 מ"ל של מאגר תמוגה A (50 מ"מ נתרן פוספט, pH 7.4, 500 מ"מ NaCl, 5 mM imidazole, 10% גליצרול, ו 0.2% NP40). השתמש 50 מ"ל של מאגר תמוגה כדי resuspend כדורי התא מ 1 L של תרבות התא.
  5. Lyse התאים על ידי sonication במשך 15 דקות, 3 שניות על, ו 3 שניות את. ואז תאי צנטריפוגה ב 37,888 x g במשך 40 דקות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול על ידי הקפאת התאים לפני sonication במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
  6. טען את supernatant לתוך עמודת כבידה קובלט (קוטר x אורך: 2.5 ס"מ x 10 ס"מ) עם ~ 10mL של חרוזים מראש שווה עם 5-10 עמודות נפחים (CV) של מאגר תמוגה.
  7. לשטוף את העמודה עם 5 קורות חיים של חיץ B (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 10% גליצרול, ו 5 mM imidazole) ו 5 קורות חיים של חיץ C (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 10% גליצרול, ו 5 mM imidazole).
  8. אלוט את החלבון מן החרוזים באמצעות 2 קורות חיים של חיץ D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, ו 250 mM imidazole).
  9. לדלל את החלבון eluted 5x עם חיץ QA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% גליצרול) עבור עמודת Q.
  10. לשטוף את 5 מ"ל של עמודת Q עם מאגר QA כדי לאיזוי העמודה, ולאחר מכן לטעון את המדגם מדולל לתוך העמודה Q באמצעות משאבה peristaltic (למשל, ארנב).
  11. טען את עמודת ה-Q למכונת HPLC יחד עם מאגר QA ומאגר QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% גליצרול). הגדר את קצב הזרימה כ- 1 מ"ל/דקה.
  12. הפעל את התוכנית "שטיפת משאבה" כדי לשטוף את המכונה עם מאגר QB ואחריו מאגר QA (1-2 קורות פנים / כל אחד). הגדר את זרימת המערכת ל- 3 מ"ל/דקה.
  13. הגדר את UV1 כדי 280 ננומטר ו UV2 כדי 260 ננומטר. השתמש צלחת 96 עמוק היטב כדי לאסוף את השברים.
  14. חלבונים Elute באמצעות שיפוע צעד של סוכן elution (מאגר QB) החלת 3-4 קורות חיים של כל ריכוז, להגדיל את האחוז על ידי 5% בכל פעם החל 0% QB. קומפלקס חלבון N0P ייצא במאגר 15% QB.
  15. לאחר כל החלבון הוא eluted, לשטוף את הטור עם 100% QB Buffer (2 קורות חיים).
  16. לבודד את החלבון על ידי סינון ג'ל Superdex 200 להגדיל 10/300 עמודה GL (קוטר x אורך: 1.0 ס"מ x 30 ס"מ) ואת שיווי משקל עם חיץ E (20 מ"מ HEPES pH 7.4 ו 200 mM NaCl).
  17. נתח שברים המכילים חלבונים לפי SDS-PAGE.

3. הרכבה במבחנה של NC ספציפי לנגיף

הערה: ההרכבה במבחנה של NC ספציפי RSV (N:RNA) בוצעה על ידי דגירה של מתחם N0P מוכן עם אוליגוס RNA. לאחר מכן, נעשה שימוש בכרומטוגרפיה של ה-SEC כדי להפריד את קומפלקס ההרכבהמה-N 0P ומה-RNA העודף(איור 2).

  1. מערבבים ומדגרים את קומפלקס N0P המטוהר עם אוליגו RNA עם יחס מולקולרי של 1:1.5 בטמפרטורת החדר למשך שעה, בדרך כלל 1 מ"ל של החלבון N0P עם ריכוז של 1 מ"ג / מ"ל מספיק לשלב הבא. הגדר את דגימת הבקרה, המכילה רק את אותה כמות של חלבון N0P.
  2. מראש להשוות את סינון הג'ל Superdex 200 להגדיל 10/300 GL עמודה עם המאגר E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl).
  3. צנטריפוגה המדגם עם 21,130 x g במשך 15 דקות, להסיר כל משקעים לטעון את supernatant לעמודה SEC.
  4. השווה את תמונות הכרומטוגרפיה של ה- SEC של מדגם הרכבת N:RNA ודגימת בקרת N0P, שלב את יחס A260/A280 כדי לזהות אילו פסגות הן N-RNA המורכב, N0P ו- RNA חינם.
  5. לאסוף את שברי השיא, להפעיל את ג'ל SDS-PAGE, או לעשות רשתות.
  6. עבור הרכבה N-RNA קומפלקס, לאסוף את כל השברים של שיא N-RNA, לעשות את החילוץ RNA ולהפעיל את ג'ל Urea-PAGE כדי לבדוק שוב את אורך RNA ספציפי, אשר זהה מעורב דגירה בשלב הראשון.

4. ביצוע רשתות כתמים שליליות

הערה: מיקרוסקופ אלקטרוני כתם שלילי (EM) היא שיטה שבה המולקולות נספגות לסרט פחמן ולאחר מכן מוטבעות בשכבה של אטומי מתכת כבדה. כתם שלילי EM מייצר ניגודיות תמונה גבוהה, מה שהופך אותו קל לראות וליישר בחישוב את החלקיקים. יתרון נוסף הוא שספיחת החלקיקים לסרט פחמן בדרך כלל גורם למולקולות לדבוק ברשת עם מעט אוריינטציות מועדפות. כאשר המולקולות נמצאות בכיוון דומה, קל להפריד אותן למחלקות נפרדות מבחינה מבנית. כתם שלילי EM היא אפוא הטכניקה המתאימה להנחות הכנת מדגם25,26 (איור 3).

  1. מיקרוגל או חום 5 מל של ddH2O ב זכוכית קטנה באמצעות תנור טונגסטן עד שהוא רותח.
  2. שוקלים 37.5 מ"ג של אורניל formate ומוסיפים 5 מ"ל של ddH מחומם2O כדי להפוך 0.75% אורניל formate כתם פתרון. מערבבים תחת מכוסה מכוסה רדיד אלומיניום כדי להגן מפני אור.
  3. מוסיפים 4 μL של 10 M NaOH לפתרון הכתמים וממשיכים לבחוש במשך 15 דקות, מוגן מפני האור.
  4. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מ"מ למבחנה.
  5. השתמש פריקה זוהרת כדי להפוך את רשתות EM מצופה פחמן מתמשך הידרופילי27.
    הערה: הרשתות ממוקמות בתוך תא המחובר לספק כוח. כאשר מתח גבוה מוחל, הגז בתוך התא מיינן, ואת היונים טעונים שלילית להפקיד על רשתות הפחמן כדי להפוך אותם הידרופילי.
  6. חותכים ומקפלים רצועת פארפילם. Pipet 2 טיפות של 40 μL של החיץ בצד אחד של parafilm, ו pipet עוד 2 טיפות של 40 μL של פתרון כתמים לצד השני.
  7. כדי להפוך את רשתות פחמן EM, להחיל 3 μL של דגימת חלבון במשך 1 דקה.
  8. למחוק את הרשתות נגד נייר סופג.
    הערה: הרשתות נשטפות 2x עם חיץ, ו 1x עם 0.75% uranyl formate כתם פתרון נמחק לאחר כל צעד.
  9. החזק את משטח הרשת בירידה השנייה של 0.75% פתרון הכתמת אורניל formate במשך 30 שניות.
  10. כתם את הרשת נגד נייר סופג כדי להסיר תמיסת כתם עודף ולאפשר לרשת להתייבש באוויר.
  11. אחסן את הרשתות בתיבת הרשת לפני הדימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טיהור חלבון N0P נטול RNA
עם פרוטוקול זה, ניתן להשיג קומפלקס RSV N0P הטרודימרי מסיס בקנה מידה גדול. האורך המלא של חלק N ו- N מסוף של חלבוני P באו לידי ביטוי במשותף עם 10X His-Tag על חלבון N ב E. coli. N 0 Pטוהרבאמצעות כרומטוגרפיה של אי-הכללת קובלט, חילופי יון וגודל. N0P מכיל הן N באורך מלא והן N מסוף P אבל לא הכיל RNA הסלולר מבוסס על ספיגת UV A260/ A280 יחס20 (איור 4).

הרכבה של N-RNA ובדיקה עם כתם שלילי
לאחר מכן הוכחנו כי N0P מטוהר יכול להיות מגורה ומורכב לתוך חלקיקים דמויי Nuceloplasmid (NCLPs) על ידי דגירה עם אוליגוס RNA ספציפי. NCLPs הורכבו על ידי דגירה N0P עם אוליגוס RNA עם יחס של 1:1.5 בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת ולאחר מכן לרוץ דרך עמוד סינון הג'ל. כאשר קומפלקס N:RNA נוצר, הוא מראה שלוש פסגות: פסגתרחוב 1 היא N:RNA,הפסגה השנייה היא N0P, והשיאהשלישי הוא RNA חופשי עודף. החלק הגבוה ביותר של פסגת N:RNA יוצר את רשתות הכתמים השליליות לבדיקה עם EM20 (איור 5).

Figure 1
איור 1. האיור של קונסטרוקציות פלסמיד. A. המבנה של RSV N1-391; B. המבנה של RSV P1-126; ג. המבנה הדו-סיסטרוני לדו-קיום של N1-391 ו- P1-126. הגן הראשון RSV N1-391, הגן השני RSV P1-126, הגן העמיד לאנטיביוטיקה (AmpR), והאמריקנים מודגשים בקופסאות צהובות, ציאן, ורודות וכתומות, בהתאמה. לסיכום, מוסיף הגן של RSV N1-391 ו- RSV P1-126 בנויים בנפרד ומורכבים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. תרשים הזרימה של טיהור קומפלקס החלבון N1-391P1-126. הוא מתאר את החיסון ואת הגידולים בקנה מידה גדול של תרבות התא E. coli וקצירת התא על ידי צנטריפוגה. ואחריו תמוגה של תאים, דגימות החלבון מטוהרות על ידי הכרומטוגרפיה של גודל הזיקה (כלומר, עמודת Co2+ ), כרומטוגרפיה של חילופי יון (כלומר, עמודת Q) ולכירומטוגרפיה של גודל סינון ג'ל (SEC). דגימות החלבון מנותחות עוד יותר על ידי ג'ל SDS-PAGE. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. הכנת רשתות EM כתם שלילי להדמיה. א. זוהר פולט את הרשתות. B. ההליך עבור רשתות כתמים שליליות מוצג. פינצטה משמשים להרים רשת, ואחריו החלת דגימת החלבון במשך 1 דקה. הרשתות נמחקות בנייר סופג. הרשת נשטפת פעמיים עם חיץ ופעמיים עם פתרון הכתמת אורניל 0.75%. הרשתות מוחזקות בירידה השנייה של פתרון הכתמים למשך 30 שניות. הרשתות נמחקות לאחר כל שטיפה ומיובשות באוויר לאחר הכתמה הסופית. ג. הרשתות מאוחסנות בתיבת הרשת לצורך דימות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. תוצאות מייצגות של ההזדווגות של מתחם N1-391P1-126. A. פרופיל ה-SEC של N1-391P1-126. B. פרופיל ה-SEC של ההרכבה N1-391P1-126 עם RNA. ג. ג'ל SDS-PAGE מציג את חלבון N רק עבור קומפלקס N-RNA ואת הרצועות עבור חלבוני N ו- P של N1-391P1-126 קומפלקס. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. תמונות מייצגות של N-RNA. A ו-B הן תמונות כתם EM שליליות מייצגות של N-RNA משיא N1-391-RNA באיור 4. מתחמי ה-N-RNA מוכתמים באמצעות ההליך המתואר באיור 3. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פריימטרים
N1-391 קדימה 5'-טקטקאטקאטקאטקטגקטגאג-3'
N1-391 הפוך 5'-TTATCCACTTקטקטגטקטג'קהג'יגה-גטקטג-3'
P1-126 קדימה 5'-טקטקאטקאטקאטגאגאגAAAGGGCGCCCGAG-3'
P1-126 הפוך 5'-TTATCCACTTCCAATATATTACTTCGTTCCTCGC-3'

שולחן 1. רצפי פריימר.

הגברה PCR של תוסף DNA
15 μL מאגר תגובת פולימראז Pfu 10x
3 מיקרומטר פריימר קדמי (ריכוז 100 מיקרומטר)
3 מיקרומטר פריימר הפוך (ריכוז 100 מיקרומטר)
15 μL תערובת dNTP בריכוז של 2.5 מ"מ
6 מיקרומטר DNA פלסמיד מכיל את הגן של N או P (100ng / μL)
7 μL DMSO
3 מיקרומטר פולימראז Pfu ב 2.5U / μL
עוצמת קול למילוי עד 150 μL DDH סטרילי2O

שולחן 2. הגברה PCR של ריאגנטים הכנס DNA.

אמפריציה PCR של הכנסת DNA
צעד זמן טמפרטורה מחזורים
דנטורציה 4 דקות. 95 מעלות צלזיוס 1
דנטורציה 45 שניות. 95 מעלות צלזיוס 30
חישול שלושים שניות. 62 מעלות צלזיוס
הרחבה* 90 שניות. 72 מעלות צלזיוס
סיומת עשר דקות. 72 מעלות צלזיוס 1
אחז ∞ 4ºC 1
תערובת 150 μL ניתן להפעיל בשלוש תגובות PCR נפרדות (3 x 50μL).
*עבור פולימראז ה-DNA של Pfu, 1 kb/min היא המהירות המומלצת לשלב ההארכה. כאן, הן האורכים של הגן N1-391 או הגן P1-126 קצרים מ 1.5 Kb.
לכן, 90 שניות שימשו לשלב ההרחבה.

שולחן 3. PCR הגברה של תוכנית תרמוציקלינג הכנס DNA.

T4 טיפול פולימראז DNA
10 x חוצץ 2 מיקרומטר
וקטור/הכנס דנ"א (0.1 pmol וקטור או 0.2 pmol להוסיף) 5 μL
dNTP* ב-25 מ"מ 2 מיקרומטר
DTT ב-100 מ"מ μL אחד
T4 פולימראז DNA (LIC מוסמך) 0.4 μL (1.25 U)
DDH סטרילי2O 9.6 מיקרו-ל
*dGTP שימש לווקטור, ו- dCTP שימש ל- DNA של הכנס.

שולחן 4. T4 טיפול פולימראז DNA.

PCR חופף
15 μL מאגר תגובת פולימראז 10 X Pfu
3 מיקרומטר פריימר קדמי (100 מיקרומטר)
3 מיקרומטר פריימר הפוך (100 מיקרומטר)
15 μL dNTP מיקס (2.5 מ"מ)
3 מיקרומטר DNA מ PCR עגול1 המכילים את הגן N1-391 (100 ng / μL )
3 מיקרומטר DNA מ PCR עגול1 המכילים את הגן P1-126 (100 ng / μL )
7 μL DMSO
3 מיקרומטר פפו פולימראז (2.5 U/μL)
עוצמת קול למילוי עד 150 μL DDH סטרילי2O

שולחן 5. חפיפה בין ריאגנטים של PCR.

PCR חופף
צעד זמן טמפרטורה מחזורים
דנטורציה 4 דקות. 95 °C (69 °F) 1
דנטורציה 45 שניות. 95 °C (69 °F) 30
חישול שלושים שניות. 62 °C (62 °F)
הרחבה* 2 דקות. 72 °C (69 °F)
סיומת עשר דקות. 72 °C (69 °F) 1
אחז ∞ 4 °C (69 °F) 1
תערובת 150 μL ניתן להפעיל בשלוש תגובות PCR נפרדות (3 x 50 μL).
*עבור פולימראז ה-DNA של Pfu, 1 kb/min היא המהירות המומלצת לשלב ההארכה. כאן, האורך הכולל של הגן N1-391 ו P1-126 הוא קצר יותר מ 2.0 Kb. לכן, 2 דקות שימשו לשלב ההרחבה.

שולחן 6. תוכנית תרמוציקללינג של PCR חופפת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המבנים הידועים דמויי nucleocapsid חלקיקים (NCLP) של וירוסי RNA שליליים (NNS) ללא סגמנטים מראים כי NCLPs התאספו הם N מורכב עם RNAs הסלולר המארח כאשר overexpressed במערכות ביטוי חיידקי או אוקריוטי15,16,17,18,19. מחקרים קודמים ניסו לקבל את N חינם RNA עם מגוון רחב של שיטות, כגון עיכול RNase A, שטיפת מלח גבוהה, או התאמת מאגרי pH שונים כדי להסיר את RNAs הסלולר לא ספציפי28,29. עם זאת, לא ניתן להשתמש בהצלחה באף אחת מהשיטות לעיל עבור ההרכבה של NCs הספציפיים לווירוסים. כדי להשיג את RSV N ללא RNA, ניסינו גם שילוב של שיטות, כולל עיכול RNase A, מלח גבוה (1.5M NaCl) לשטוף, התאמת pH חיץ מ pH 5.0 כדי pH 9.0, denaturation חלבון renaturation. לאחר ניסויים כושלים רבים, עדיין לא הצלחנו לקבל N ללא RNA עם השיטות לעיל. נדון בקצרה בניסיונות ובסיבות האפשריות.

שיטה אחת להשגת N ללא RNA היא לעכל רנ"א תאי מארח ב- NCLPs שהורכבו עם RNase A.  ב VSV, הדגירה של NCLP מטוהרים עם RNase A בריכוז הסופי של 1mg/ml ב 37 °C (70 °F) עבור 1 h הוסר לחלוטין RNA מן NC28. מטוהרים ריק אוליגומרי N היה אז דגירה עם פולי-A (250-nt או יותר) ביחס טוחנת של 1:5 בנוכחות מעכבי RNase. ניתוח של RNA מבודד N:poly-A מחדש הראה כי RNA היה כ 90 nt אורך. זה הציע כי RNA מחוץ לגרעין הוא רגיש לעיכול לא ספציפי על ידי RNase A מזוהם מהשלב הקודם. האסטרטגיה של RNase עיכול כדי להסיר RNA לא היה מוצלח כאשר הוחל על RSV. ייתכן שהסיבה לכך היא שתי סיבות. ראשית, RNase A מזוהם יעכל את RNA ספציפי RSV, אשר לאחר מכן יהיה דגירה והרכיב עם N. שנית, היעילות של עיכול RNase A נמוכה בהרבה ב- RSV. הסיבה לכך היא שה- RNAs מתאספים באופן שונה בווירוסי NNS שונים. מבני הגביש הידועים של N:RNA מראים כי RNA נקשר מחוץ ל- NC ב- VSV, אך בתוך ה- NC ב- RSV30,31. התצורה של כריכת RNA פנימה של NC עלולה להוביל ליעילות נמוכה עבור RNase A לגישה ולעיכול.

שיטה נוספת כדי לקבל N ללא RNA היא להפוך את החיתוך שחתך הן את מוטיב N-מסוף (N-arm) ואת מוטיב C-מסוף (C-arm) של N. עם זאת, לא ניתן להשתמש ב- N קטוע זה ללא RNA כדי להרכיב עם RNA לתוך NC יציב מכיוון ש- N-arm של N מקופל ליחד המשנה השכן שלו על-ידי אינטראקציה עם קבוצת המחשבים C-terminal (CTD) של תת-יחידה N התקדימית. זרוע C המורחבת ממוקמת ל- CTD של תת-הקבוצה הבאה של N31.

שיטה נוספת כדי לקבל N ללא RNA היא להכין מוטציה N. לדוגמה, התוצאה שהתקבלה על ידי Galloux et al. הראה כי RSV RNA חינם N0P קומפלקס ניתן להשיג על ידי דו קיום של K170A/ R185A כפול N מוטנט עם N-terminus של P בחיידקים32. עם זאת, יש לו שתי בעיות פוטנציאליות עבור אפיונים מבניים נוספים. סוגיה אחת היא היציבות הנמוכה של קומפלקס מוטנטים זה בריכוזים גבוהים. הבעיה השנייה היא שמתחם המוטנטים איבד את יכולת האיגוד של ה-RNA, שלא ניתן להשתמש בה בשלב הבא של ההרכבה.

למרות האתגרים העצומים, הקמנו ואופטימיזציה של הפרוטוקול כדי להשיג NCs ספציפיים לנגיף באמצעות דו-קיום של N עם מלווה P. לאחרונה, שיטה מוצלחת נוספת היא לעשות קידוד בניית היתוך כימרי עבור P1-50-TEV-N1-405-8xHis עבור MeV33,34. N0P ניתן להשיג לאחר מחשוף פרוטאז TEV. הטוהר של N0P תלוי ביעילות של מחשוף TEV, אשר לחתוך את היתוך כימרי בין חלבון N ו- P.

במקום להשתמש בשיטת ההיתוך הכימרי, עיצבנו מבנה דו-קיום דו-סיסטרוני. באופן ספציפי, מבניהדו-קיוםשל קומפלקס N 0 P תוכננו והונדסו בשתי מסגרות קריאה פתוחות, הכוללות את האורך המלא של N (1-391) עם תג 10x שלו ב- N-terminal ב- ORF הראשון, ופפטידים N-terminal (1-126) מ- P ב- ORF20השני . בקצרה, ההליך הכולל של טיהור N0P הוא לטהר את N מתויגים N0P ו- N-RNA מדגימות תמוגה הסלולר עם חרוזי קובלט, להסיר את RNA לא ספציפי N:cell RNA קומפלקס עם עמודת Q, ולקבל קומפלקס N0P טהור עם העמודה SEC. בשלב ה-SEC, ניתן לפקח על היחס של A260/A280 ולבדוק פעמיים עם מיצוי RNA משברי השיא של N0P.

באופן קולקטיבי, בפרוטוקול זה, הצעדים הקריטיים ביותר הם האסטרטגיה לתכנן את בנייתדו-קיוםשל קומפלקס N 0 P ושימוש בעמודת זיקה וחילופי יון סדרה כדי להפריד את קומפלקס N0P ללא RNA ממתחמי ה- RNA האחרים של N-cell. היעילות של אסטרטגיית הדו-קיום כדי לקבל N0P מורכב הוא נמוך יחסית; סביב 50% חלבון N הוא עדיין N-cell RNA קומפלקס. הפרוטוקול עשוי להיות מיושם גם עבור מקבל RNA חינם N0P והרכבה עם RNA ספציפי עם N כדי לקבל N:RNA קומפלקס של וירוסים אחרים NNS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

תוכניות המחקר במעבדת ליאנג באמורי נתמכות על ידי המכון הלאומי האמריקאי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת מספר הפרס R01GM130950, וקרן הסטארט-אפ למחקר בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי. המחבר מכיר בחברי מעבדת ליאנג לתמיכה מועילה ודיון ביקורתי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose SIgma A9539-500G making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore UFC901024 concentrate the protein sample
Ampicillin sodium GOLD BIOTECHNOLOGY 5118.111317A antibiotic for cell culture
AseI NEB R0526S making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads Gold Bio H-310-500 For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater CORNING 6885-DB Heate the sample
dCTP Invitrogen 10217016 making construct using LIC method
dGTP Invitrogen 10218014 making construct using LIC method
Glycerol Sigma G5516-4L making solution
HEPES Sigma H3375-100G making solution
HiTrap Q HP Sigma GE29-0513-25 Protein purification
Imidazole Sigma I5513-100G making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) GOLD BIOTECHNOLOGY 1116.071717A induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes VWR 47730-598 for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor SpectraLab MSX-XL-2020 sonicator for lysing cell
Negative stain grids Electron Microscopy Sciences CF400-Cu-TH For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R eppendorf M1282-0000 Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385-1L making solution
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480L PCR
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 Purify DNA
SSPI-HF NEB R3132S making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL Sigma GE29-0915-96 Protein purification
T4 DNA polymerase Sigma 70099-3 making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge Fisher Scientific 36-101-0816 Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride Sigma T3253-250G making solution
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22451 making negative stain solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
  2. Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
  3. Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
  4. Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
  5. Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
  6. Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
  7. Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
  8. Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
  9. Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
  10. Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
  11. Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
  12. Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
  13. Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
  14. Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
  15. Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
  16. Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
  17. Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
  18. Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
  19. Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
  20. Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
  21. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  22. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  23. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  24. Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
  25. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  26. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
  27. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
  28. Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
  29. Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
  30. Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
  31. Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
  32. Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
  33. Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
  34. Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).

Tags

ביוכימיה סוגיה 173 דור הרכבה וירוס סינסיטיאלי נשימתי (RSV) ספציפי לנגיף RNA נוקלאוקפסיד (NC) מלווה ריבונוקלאופרוטאין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, Y., Ogilvie, C., Raghavan, A.,… More

Gao, Y., Ogilvie, C., Raghavan, A., Von Hoffmann, C., Liang, B. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (173), e62010, doi:10.3791/62010 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter