Extracellulära glutamat-utlöst systemisk kalcium signalering är avgörande för induktion av växt försvar svar på mekanisk sårning och växtätande attack i växter. Denna artikel beskriver en metod för att visualisera den rumsliga och tidsmässiga dynamiken hos båda dessa faktorer med Arabidopsis thaliana växter som uttrycker kalcium- och glutamatkänsliga fluorescerande biosensorer.
Växter reagerar på mekaniska påfrestningar som sår och växtätande genom att inducera försvarssvar både i de skadade och i de distala oskadade delarna. Vid sårning av ett blad sker en ökning av cytosolisk kalciumjonkoncentration (Ca2 + signal) på sårplatsen. Denna signal överförs snabbt till oskadade löv, där försvarssvar aktiveras. Vår senaste forskning visade att glutamat som läcker från de sårade cellerna i bladet till apoplasten runt dem fungerar som en sårsignal. Detta glutamat aktiverar glutamatreceptorliknande Ca2 + genomsläppliga kanaler, vilket sedan leder till långdistans Ca2 + signalutbredning i hela växten. De rumsliga och tidsmässiga egenskaperna hos dessa händelser kan fångas med realtidsavbildning av levande växter som uttrycker genetiskt kodade fluorescerande biosensorer. Här introducerar vi en växtomfattande avbildningsmetod i realtid för att övervaka dynamiken hos både Ca2+ -signalerna och förändringar i apoplastiskt glutamat som uppstår som svar på sårning. Detta tillvägagångssätt använder ett brett fält fluorescensmikroskop och transgena Arabidopsis växter som uttrycker gröna fluorescerande protein (GFP) -baserade Ca2 + och glutamat biosensorer. Dessutom presenterar vi metodik för att enkelt framkalla sårinducerad, glutamat-utlöst snabb och långdistans Ca2 + signalutbredning. Detta protokoll kan också tillämpas på studier om andra växtspänningar för att hjälpa till att undersöka hur systemisk signalering av anläggningar kan vara involverade i deras signal- och svarsnätverk.
Växter kan inte fly från biotiska påfrestningar, t.ex. insekter som matar på dem, så de har utvecklat sofistikerade stressavkänning och signaltransduktionssystem för att upptäcka och sedan skydda sig mot utmaningar som växtätande1. Vid sår eller växtätare attack initierar växter snabba försvarssvar inklusive ackumulering av fytohormone jasmonic syra (JA) inte bara på den skadade platsen utan också i oskadade distala organ2. Denna JA utlöser sedan båda försvarssvaren i de direkt skadade vävnaderna och inducerar förebyggande försvar i de oskadade delarna av växten. I Arabidopsisupptäcktes ackumuleringen av JA som inducerats genom sårning i distala, intakta löv inom bara några minuter efter skador någon annanstans i växten vilket tyder på att en snabb och långdistanssignal överförs från det såradebladet 3. Flera kandidater, såsom Ca2+, reaktiva syrearter (ROS) och elektriska signaler, har föreslagits att fungera som dessa långdistanssårsignaler i växter4,5.
Ca2+ är ett av de mest mångsidiga och allestädes närvarande andra budbärarelementen i eukaryota organismer. I växter orsakar larvtuggning och mekanisk sårning drastiska ökningar av cytosolic Ca2 + koncentrationen ([Ca2 +]cyt) både i det sårade bladet och i ovävda avlägsna blad6,7. Denna systemiska Ca2 + signal tas emot av intracellulära Ca2 +-avkänningsproteiner, vilket leder till aktivering av nedströms försvarssignaleringsvägar, inklusive JA biosyntes8,9. Trots många sådana rapporter som stöder vikten av Ca2 + signaler i växt sår svar, information om rumsliga och tidsmässiga egenskaper hos Ca2 + signaler framkallas genom sårning är begränsad.
Realtidsavbildning med genetiskt kodade Ca2+-indikatorer är ett kraftfullt verktyg för att övervaka och kvantifiera den rumsliga och tidsmässiga dynamiken hos Ca2+-signaler. Hittills har versioner av sådana sensorer utvecklats som möjliggör visualisering av Ca2 + signaler på nivån för en enda cell, till vävnader, organ och till och med hela växter10. Den första genetiskt kodade biosensorn för Ca2+ som används i växter var det bioluminescerande proteinet aequorin som härrör från maneterna Aequorea victoria11. Även om detta chemiluminescent protein har använts för att upptäcka Ca2 + förändringar som svar på olika påfrestningar iväxter 12,13,14,15,16,17,18, det är inte väl lämpat för realtidsavbildning på grund av den extremt låga luminescent signalen den producerar. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserade Ca2+ indikatorer, såsom gula kamelonerna, har också framgångsrikt använts för att undersöka dynamiken i en rad Ca2 + signaleringshändelser i växter19,20,21,22,23,24. Dessa sensorer är kompatibla med bildframställningsmetoder och består oftast av Ca2 + bindande proteinkalmodulin (CaM) och en CaM-bindande peptid (M13) från en myosin ljuskedjekinas, alla smälta mellan två fluorforproteiner, i allmänhet ett cyanfluorescerande protein (CFP) och en gul fluorescerande proteinvariant (YFP)10. Ca2+ bindning till CaM främjar interaktionen mellan CaM och M13 vilket leder till en konformationsförändring av sensorn. Denna förändring främjar energiöverföring mellan den gemensamma fiskeripolitiken och YFP, vilket ökar YFP:s fluorescensintensitet samtidigt som fluorescensutsläppen från den gemensamma fiskeripolitiken minskar. Övervakningen av denna övergång från den gemensamma fiskeripolitiken till YFP-fluorescensen ger sedan ett mått på ökningen på Ca2+-nivå. Förutom dessa FRET-sensorer är en fluorescerande protein (FP)-baserade Ca2 + biosensorer, såsom GCaMP och R-GECO, också kompatibla med växtavbildningsmetoder och används ofta för att studera [Ca2 +]cytförändringar på grund av deras höga känslighet och användarvänlighet25,26,27,28,29,30. GCaMPs innehåller en enda cirkulärt permuterad (cp) GFP, återigen smält till CaM och M13-peptiden. Den Ca2+beroende interaktionen mellan CaM och M13 orsakar en konformationell förändring i sensorn som främjar en förändring i protoneringstillståndet för cpGFP, vilket förbättrar dess fluorescerande signal. Således, när Ca2 + nivåer stiger, ökar cpGFP-signalen.
För att undersökadynamiken hos Ca 2 + signaler som genereras som svar på mekanisk sårning eller växtätare utfodring, har vi använt transgena Arabidopsis thaliana växter som uttrycker en GCaMP variant, GCaMP3, och ett brett fält fluorescensmikroskop6. Detta tillvägagångssätt har lyckats visualisera snabb överföring av en långdistans Ca2 + signal från sårplatsen på ett blad till hela växten. Således upptäcktes en ökning av [Ca2 +]cyt omedelbart på sårplatsen men denna Ca2 + signal spreds sedan till de närliggande bladen genom vaskulaturen inom några minuter efter sådd. Dessutom fann vi att överföringen av denna snabba systemiska sårsignal avskaffas i Arabidopsis växter med mutationer i två glutamat receptor-liknande gener, glutamat receptorn som (GLR), GLR3.3 och GLR3.66. GLR verkar fungera som aminosyra gated Ca2 + kanaler involverade i olika fysiologiska processer, inklusivesårrespons 3,pollenrör tillväxt31,rotutveckling32,kallrespons 33, och medfödd immunitet34. Trots denna välförståeliga, breda fysiologiska funktion hos GLR, är information om deras funktionella egenskaper, såsom deras ligand specificitet, jon selektivitet och subcellulär lokalisering, begränsade35. Nyligen genomförda studier rapporterade dock att GLR3.3 och GLR3.6 är lokaliserade i phloem respektive xylem. Växt GLR har likheter med jonotropa glutamatreceptorer (iGluR)36 hos däggdjur, som aktiveras av aminosyror, såsom glutamat, glycin och D-serin i däggdjurens nervsystem37. Vi visade faktiskt att tillämpningen av 100 mM glutamat, men inte andra aminosyror, på sårplatsen inducerar en snabb, långdistans Ca2 + signal i Arabidopsis, vilket indikerar att extracellulär glutamat sannolikt fungerar som en sårsignal i växter6. Detta svar avskaffas i glr3.3/glr3.6 mutant tyder på att glutamat kan agera genom en eller båda av dessa receptorliknande kanaler och faktiskt, AtGLR3.6 visade sig nyligen vara gated av dessa nivåer av glutamat38.
I växter, förutom dess roll som en strukturell aminosyra, glutamat har också föreslagits som en viktig utvecklingsregulator39; dess rumsliga och tidsmässiga dynamik är dock dåligt förstådd. Precis som för Ca2 +har flera genetiskt kodade indikatorer för glutamat utvecklats för att övervaka dynamiken hos denna aminosyra i levande celler40,41. iGluSnFR är en GFP-baserad glutamatbiosensor med en enda FP bestående av cpGFP och ett glutamatbindande protein (GltI) från Escherichia coli42,43. Den konformationsmässiga förändringen av iGluSnFR, som induceras av glutamatbindning till GltI, resulterar i ett förbättrat GFP-fluorescensutsläpp. För att undersöka om extracellulär glutamat fungerar som en signalmolekyl i växtsårsrespons, kopplade vi iGluSnFR-sekvensen med den grundläggande chitinassignalpeptidutsöndringssekvensen (CHIB-iGluSnFR) för att lokalisera denna biosensor i det apoplastiska utrymmet6. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde avbildning av eventuella förändringar i den apoplastiska glutamatkoncentrationen ([Glu]apo) med hjälp av transgena Arabidopsis-växter som uttrycker denna sensor. Vi upptäckte snabba ökningar i iGluSnFR signalen på sårplatsen. Dessa data stöder tanken att glutamat läcker ut ur de skadade cellerna /vävnaderna till apoplasten vid sårning och fungerar som en skadesignal som aktiverar GLR och leder till långdistans Ca 2 + -signalen i växter6.
Här beskriver vi en växtomfattande realtidsavbildningsmetod med genetiskt kodade biosensorer för att övervaka och analyseradynamiken hos långdistans Ca 2 + och extracellulära glutamatsignaler som svar på sår6. Tillgången till fluorescensmikroskopi och transgena växter som uttrycker genetiskt kodade biosensorer ger ett kraftfullt, men ändå lätt implementerat tillvägagångssätt för att upptäcka snabbt överförda långdistanssignaler, såsom Ca2 + vågor.
Systemisk signalering är viktigt för växter att reagera på lokaliserade externa miljöstimulanser och sedan behålla sin homeostas på en hel anläggningsnivå. Även om de inte är utrustade med ett avancerat nervsystem som djur, använder de snabb kommunikation både inom och mellan organ baserat på faktorer som mobila elektriska (och eventuellt hydrauliska) signaler och förökningsvågor av ROS och Ca2 + 46,47. Protokollet som beskrivs ovan t…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 och 18H05491) till MT, National Science Foundation (IOS1557899 och MCB2016177) och National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G och 80NSSC19K0126) till SG.
Arabidopsis expressing GCaMP3 | Saitama University | ||
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR | Saitama University | ||
GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | ||
L-Glutamate | FUJIFILM Wako | 072-00501 | Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH]. |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation | ||
Murashige and Skoog (MS) medium | FUJIFILM Wako | 392-00591 | composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH. |
Nikon SMZ25 stereomicroscope | Nikon | ||
NIS-Elements AR analysis | Nikon | ||
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) | Nikon | ||
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Square plastic Petri dish | Simport | D210-16 |