Summary
Los embriones/larvas de pez cebra se desarrollan externamente y son ópticamente transparentes. La bioacumulación de microplásticos en peces en etapas tempranas de la vida se evalúa fácilmente con microperlas etiquetadas fluorescentemente.
Abstract
Como nuevo tipo de contaminante ambiental, el microplástico se ha encontrado ampliamente en el medio acuático y representa una gran amenaza para los organismos acuáticos. La bioacumulación de los microplásticos juega un papel clave en sus efectos tóxicos; sin embargo, como partículas, sus bioacumulaciones son diferentes de muchos otros contaminantes. Aquí se describe un método factible para determinar visualmente la acumulación y distribución de microplásticos en embriones o larvas de pez cebra utilizando microplásticos fluorescentes. Los embriones se exponen a diferentes concentraciones (0,1, 1 y 10 mg/L) de microplásticos fluorescentes con un diámetro de 500 nm durante 120 h. Se muestra en los resultados que los microplásticos pueden bioacumularse en embriones/larvas de pez cebra de una manera dependiente de la concentración. Antes de la eclosión, se encuentra una fuerte fluorescencia alrededor del corion embrionario; mientras que en las larvas de pez cebra, el saco vitelino, el pericardio y el tracto gastrointestinal son los principales sitios acumulados de microplásticos. Los resultados demuestran la absorción e internalización de microplásticos en el pez cebra en etapas tempranas de la vida, lo que proporcionará la base para una mejor comprensión del impacto de los microplásticos en los animales acuáticos.
Introduction
Desde que se sintetizó por primera vez en la década de 1900, los plásticos son ampliamente utilizados en varios campos, lo que resulta en un rápido crecimiento de la producción mundial1. En 2018, se produjeron aproximadamente 360 millones de toneladas de plásticos en todo el mundo2. Los plásticos en el medio natural se degradarán a partículas finas debido a procesos químicos, físicos o biológicos3. En general, las partículas plásticas finas de tamaño <5 mm se definen como microplásticos4. Los microplásticos también están diseñados para aplicaciones específicas, como las microperlas de productos cosméticos5. Como contaminantes casi permanentes, los microplásticos se acumulan en el medio ambiente, y han atraído cada vez más la atención de los científicos, los responsables de la formulación de políticas y el público1,6. Estudios previos documentaron que los microplásticos podían causar efectos adversos en los peces, como daño gastrointestinal7,neurotoxicidad8,alteración endocrina9,estrés oxidativo10 y daño en el ADN11. Sin embargo, la toxicidad de los microplásticos no se ha revelado completamente hasta ahora12,13.
Los embriones de pez cebra ofrecen muchas ventajas experimentales, incluyendo tamaño pequeño, fertilización externa, transparencia óptica y embragues grandes, y es considerado como un organismo modelo ideal para estudiar in vivo los efectos de los contaminantes en los peces en las primeras etapas de la vida. Además, sólo se necesitan cantidades limitadas de sustancias de ensayo para la evaluación de las respuestas biológicas. Aquí, los embriones de pez cebra se exponen a diferentes concentraciones de microplásticos (0,1, 1, 10 mg / L) durante 5 días, y se evalúa la bioacumulación y distribución de microplásticos en embriones / larvas de pez cebra. Este resultado avanzará nuestra comprensión sobre la toxicidad de los microplásticos para los peces, y el método descrito aquí puede potencialmente generalizarse para determinar la acumulación y distribución de otros tipos de materiales fluorescentes en las primeras etapas de la vida del pez cebra.
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Protocol
Los peces cebra adultos se originan en el Centro de Recursos de Pez Cebra de China (Wuhan, China). Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la guía nacional "Guía de animales de laboratorio para la revisión ética del bienestar animal (GB/T35892-2018).
1. Recolección de embriones
- Mantener los peces en tanques de vidrio de 20 L con sistema de agua del grifo filtrada por carbón recirculante (pH 7.0 ± 0.2) a una temperatura constante (28 ± 0.5 °C) en un fotoperiodo de 14:10 h luz: oscuro.
- Alimente a los peces dos veces al día con Artemia nauplii. Se recomienda que la comida se dé a un máximo del 3% de peso de pescado por día y debe comerse dentro de los 5 min cada vezque 14.
- Transferir peces cebra adultos bien desarrollados (con una longitud corporal de 3-4 cm) en el tanque de desove en una proporción de un macho a dos hembras la noche antes de la cría.
NOTA: A la mañana siguiente, los peces comienzan a desovar después del inicio del ciclo de luz. - Recoger los huevos con una pipeta Pasteur. Enjuague con la solución de Hank al 10% varias veces y luego verifique la fertilización con un microscopio. Los óvulos fertilizados experimentan el período de escisión después de aproximadamente 2 h después de la fertilización (hpf) y pueden ser claramente identificados15.
- Incubar los embriones fertilizados en un casto de 500 mL que contenga 200 mL de solución de Hank al 10% con 1% de azul de metileno para su desinfección a 28 °C. No exceda una velocidad de carga de 1 embrión/2 mL de solución.
NOTA: La solución de Hank al 10% se compone de 137 mM De NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4,0.44 mM KH2PO4,1.3 mM CaCl2,1.0 mM MgSO4 y 4.2 mM NaHCO3.
2. Preparación de suspensiones microplásticas
- Sonicar la solución común de perlas de poliestireno verdes marcados fluorescentemente (10 mg / mL) con diámetro nominal de 500 nm (excitación / emisión: 460 / 500 nm) durante 10 minutos.
- Diluya la solución común con la solución de Hank al 10% para producir las soluciones de exposición deseadas (0,1, 1 y 10 mg/L).
- Prepare siempre las soluciones de exposición de los microplásticos antes de la exposición.
NOTA: Se debe tener precaución al evaluar los efectos tóxicos de los microplásticos, ya que la presencia de conservantes, como la azida de sodio, en las formulaciones de partículas comerciales, puede ser tóxica para diferentes organismos 16. Por lo tanto, estos aditivos deben eliminarse o tenerse en cuenta en los controles antes de realizar un experimento de toxicidad.
3. Exposición a microplásticos
- Seleccione aleatoriamente 6 embriones recién fertilizados (4 hpf), y luego transfiera a cada pozo de una placa de 6 pozos que contenga 5 mL de soluciones microplásticas con diferentes concentraciones. Incluya los grupos de control que contienen el 10% de la solución de Hank.
- Utilice pozos triplicados (con un total de 18 embriones) para cada tratamiento.
- Incubar los embriones bajo la misma luz: ciclo oscuro y temperatura que los adultos (ver 1.2) y observar cada 12 horas. Retire los muertos inmediatamente.
- Renovar las soluciones microplásticas 90% cada 24 h. Durante el período de exposición, los peces no son alimentados.
NOTA: Generalmente, la eclosión del embrión comienza en 48 hpf y se completa a unos 72 hpf.
4. Evaluación de la distribución de microplásticos
- A las 24, 48, 72, 96 y 120 h después de la fertilización, seleccione aleatoriamente los embriones /larvas (uno de cada una de las tres réplicas) y enjuague con la solución de Hank al 10%.
- Transferir las larvas en una placa de Petri y exponer a 0.016% tricaine para la anestesia.
- Preparar la solución común de tricaína: 4 mg de polvo de tricaina se disuelve en 100 mL de agua destilada doble, y ajustar el pH a 7.0 con Tris-HCl (pH 9.0). Guarde la solución de stock en el congelador.
- Prepare la solución de trabajo. Diluir la solución común a la concentración deseada (0.016%) con 10% de solución de Hank a temperatura ambiente14.
- Organice los embriones/larvas y prepárese para la observación.
- Observe a los peces con un microscopio de fluorescencia e imagen con software de imágenes.
- Cuantificar la intensidad de fluorescencia en peces con ImageJ.
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Representative Results
La distribución y acumulación de microplásticos fluorescentes se muestran en la Figura 1 y tabla 1. No se observa fluorescencia visible en el grupo no expuesto (control). Sin embargo, se encuentra una acumulación de fluorescencia que rodea el corion después de la exposición a diferentes concentraciones de microplásticos (24 hpf). La fluorescencia verde también se detecta en larvas, y los niveles de fluorescencia parecen aumentar de una manera dependiente de la concentración y el tiempo. El saco vitelino, el pericardio y el tracto gastrointestinal son los principales sitios acumulados de microplásticos (Figura 2).
Figura 1: Distribución de microplásticos fluorescentes de poliestireno en embriones/larvas de pez cebra (40×). Los peces son muestreado del grupo de control, o los grupos expuestos a microplásticos de 500 nm a 0,1, 1 y 10 mg/L. Barra de escala 100 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los sitios de acumulación de microplásticos en larvas de pez cebra (40×). Esta larva se muestrea del grupo expuesto a microplásticos de 500 nm a 10 mg/L durante 120 horas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| concentración | embrión | larva | ||||
| (mg/L) | 24 hpf | 48 hpf a | 48 hpf b | 72 hpf | 96 hpf | 120 hpf |
| Cont. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7,5±0,5 | 8,7±0,5 | 10,0±1,9 |
| 0.1 | 7,0±0,9 | 26,1±2,9 | 8.9 | 18,4±0,7 | 16.3±2.8 | 25,7±2,7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82,3±5,3 | 30.4 | 32,7±3,2 | 41,6±0,4 | 44,1±0,9 |
| a: sólo se evaluaron dos embriones; b: sólo se evaluó una larva. | ||||||
Tabla 1: El cambio del nivel de fluorescencia en el pez cebra tras la exposición a microplásticos fluorescentes (n=3). Debido a la influencia del corion en la absorción de microplásticos fluorescentes, los datos se dividen en dos partes, la de los embriones (antes de la eclosión) y la de las larvas (después de la eclosión).
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Discussion
De acuerdo con la directriz sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos, como la Directiva 2010/63/UE de la UE, el permiso de ética animal no es obligatorio para un experimento con etapas tempranas de la vida del pez cebra hasta la etapa de ser capaz de alimentarse de forma independiente (5 días después de la fertilización)17. Sin embargo, las mejores prácticas de bienestar son importantes para optimizar el uso del pez cebra y, por ejemplo, los métodos humanos de anestesia y eutanasia deben ser motivo de preocupación. El metanosulfato de etilo 3-aminobenzoato (MS-222, o tricaína), el agente de uso rutinario en la mayoría de los laboratorios, se emplea aquí para la anestesia y la eutanasia.
Antes de la observación bajo el microscopio, los embriones y las larvas deben enjuagarse ya que los microplásticos adsorbidos en la superficie externa podrían interferir con los resultados. Además, la autofluorescencia en los embriones/larvas, especialmente alrededor del saco vitelino, que se ha reportado ocasionalmente, podría ser problemática. La presencia de muchos biomacromolecules, tales como flavinas, dinucleótido de la nicotinamida-adenina (NAD), aminoácidos aromáticos, lipofuscins, productos finales avanzados del glycation, y collage, emitirá la luz cuando está excitado en la longitud de onda apropiada.
Es importante señalar que, como contaminante de partículas, el tamaño de los microplásticos es considerado como uno de los factores determinantes de la biodisponibilidad y toxicidad18. El diámetro nominal de los microplásticos utilizados aquí es de 500 nm, que es comparativo con el tamaño del poro del corión embrionario (dentro del rango de 300 nm a 1 μm)19. Por lo tanto, no se espera que estos microplásticos pasen fácilmente a través del corion del pez cebra. Consistentemente, hay poca fluorescencia visible en los embriones antes de la eclosión (Figura 1). Dado que el corion actuará como una barrera efectiva contra las partículas de gran tamaño, el proceso de decorionación antes de la exposición puede ser necesario. El corion se puede quitar fácilmente usando el pórceps, pero la decorionación enzimática con la pronasa se prefiere cuando los embriones se manejan a granel. Sin embargo, aunque la decorionación aumentará la biodisponibilidad y facilitará el cribado de alto rendimiento para la toxicidad de las sustancias, el embrión con el corion intacto es más recomendable para evaluar la ecotoxicidad de los contaminantes al considerar la condición de exposición en el mundo "real".
Aunque se han dedicado esfuerzos considerables a investigar los efectos adversos de los microplásticos en los peces, los conocimientos actuales, incluido el de la bioacumulación, siguen siendo limitados o incluso contradictorios. Estas inconsistencias en todos los estudios se atribuyen principalmente a las diferencias de propiedades de las partículas, incluyendo el tamaño, la densidad y las características de la superficie (por ejemplo, la carga superficial). El comportamiento de los microplásticos en la solución también es crítico para la biodisponibilidad. Las características fisicoquímicas de los microplásticos deben rastrearse a lo largo de la duración de la exposición, y debe registrarse el fenómeno de agregación que puede ocurrir. De hecho, para las exposiciones que requieren que los microplásticos se suspendan durante un período prolongado, se recomienda sonicación o agitación con una barra magnética.
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Disclosures
El autor declara que no hay intereses contrapuestos o financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21777145, 22076170), y el Programa para Académicos Changjiang y equipo de investigación innovadora en la Universidad (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
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