Summary

In vivo Imaging af fuldt aktivt hjernevæv i vågen zebrafisk larver og unge fugle ved kraniet og fjernelse af huden

Published: February 10, 2021
doi:

Summary

Her præsenterer vi en metode til at forestille zebrafisk embryonale hjerne in vivo op til larve og unge stadier. Denne mikroinvasive procedure, der er tilpasset fra elektrofysiologiske tilgange, giver adgang til cellulære og subcellulære detaljer om moden neuron og kan kombineres med optogenetik og neurofarmakologiske undersøgelser til karakterisering af hjernefunktion og lægemiddelintervention.

Abstract

Forståelse af de kortvarige ændringer, der opstår under hjernens udvikling og modning kræver detaljeret høj opløsning billeddannelse i tid og rum på cellulære og subcellulære opløsning. Fremskridt inden for molekylære og billeddannelsesteknologier har gjort det muligt for os at få mange detaljerede indsigter i cellulære og molekylære mekanismer i hjernens udvikling i det gennemsigtige zebrafiskembryo. For nylig er processer til raffinement af neuronal forbindelse, der forekommer på senere larvestadier flere uger efter befrugtning, som for eksempel er kontrol over social adfærd, beslutningstagning eller motivationsdrevet adfærd, flyttet i fokus for forskning. På disse stadier forstyrrer pigmentering af zebrafiskhuden lysindtrængning i hjernevævet, og løsninger til embryonale stadier, f.eks. farmakologisk hæmning af pigmentering, er ikke længere mulige.

Derfor gives en minimalt invasiv kirurgisk løsning til mikroskopiadgang til hjernen af vågen zebrafisk, der stammer fra elektrofysiologiske tilgange. I teleosts, hud og bløde kraniet brusk kan forsigtigt fjernes ved mikro-peeling disse lag, udsætter underliggende neuroner og axonale skrifter uden skader. Dette giver mulighed for registrering af neuronal morfologi, herunder synaptiske strukturer og deres molekylære indhold, og observation af fysiologiske ændringer såsom Ca2 + transienter eller intracellulære transporthændelser. Desuden er det muligt at forhøre disse processer ved hjælp af farmakologisk hæmning eller optogenetisk manipulation. Denne hjerneeksponeringsmetode giver information om strukturelle og fysiologiske ændringer i neuroner samt sammenhængen og den indbyrdes afhængighed mellem disse hændelser i levende hjernevæv inden for få minutter eller timer. Teknikken er velegnet til in vivo hjernescanning af zebrafisk larver op til 30 dage efter befrugtning, den seneste udviklingsstadie testet hidtil. Det giver således adgang til så vigtige spørgsmål som synaptisk raffinement og skalering, axonal og dendritisk transport, synaptisk målretning af cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsafhængigt udtryk. Derfor kan der forventes en bred anvendelse af denne monterings- og billedbehandlingsmetode.

Introduction

I løbet af de seneste årtier har zebrafisken (Danio rerio) udviklet sig som en af de mest populære hvirveldyrmodelorganismer til embryonale og larveudviklingsundersøgelser. Zebrafiskhunnernes store fecundity kombineret med embryoets hurtige udvikling og dets gennemsigtighed i de tidlige embryonale udviklingsstadier er blot nogle få nøglefaktorer, der gør zebrafisk til en stærk modelorganisme til at løse udviklingsmæssige spørgsmål1. Fremskridt inden for molekylære genteknologier kombineret med undersøgelser med høj opløsning in vivo-billeddannelse gjorde det muligt at behandle cellebiologiske mekanismer, der ligger til grund for udviklingsprocesser2. Især inden for neuronal differentiering, fysiologi, forbindelse og funktion har zebrafisk kastet lys over samspillet mellem molekylær dynamik, hjernefunktioner og organismeadfærd i hidtil usete detaljer.

Men de fleste af disse undersøgelser er begrænset til embryonale og tidlige larvestadier i løbet af den første uge af udviklingen, da gennemsigtigheden af nervesystemvævet gradvist går tabt. På disse stadier forhindres hjernevæv fra adgang ved højopløsningsmikroskopimetoder, der bliver afskærmet af kraniedifferentiering og pigmentering3.

Derfor er centrale spørgsmål om neuronal differentiering, modning og plasticitet såsom forfinelse af neuronal forbindelse eller synaptisk skalering vanskelige at studere. Disse cellulære processer er vigtige for at definere cellulære mekanismer, der kører, for eksempel social adfærd, beslutningstagning eller motivationsbaseret adfærd, områder, som zebrafisk forsker i flere ugers gamle larver for nylig har bidraget med nøgleresultater baseret på adfærdsundersøgelser4.

Farmakologiske metoder til at hæmme pigmentering i zebrafisklarver i flere uger er næppe gennemførlige eller kan endda forårsage skadelige virkninger5,6,7,8. Dobbelt eller tredobbelt mutant stammer med specifikke pigmenteringsdefekter, såsom casper9 eller krystal10, er blevet enormt værdifulde værktøjer, men er besværlige i avl, giver få afkom og udgør faren for at akkumulere genetiske misdannelser på grund af overdreven indavl.

Her gives en minimal invasiv procedure som et alternativ, der gælder for enhver zebrafiskstamme. Denne procedure blev tilpasset fra elektrofysiologiske undersøgelser for at registrere neuronal aktivitet i levende og vågne zebrafisklarver. I teleosts, hud og bløde kraniet brusk kan forsigtigt fjernes ved mikro-peeling disse lag, fordi de ikke er tæt sammenvævet med hjernen vaskulatur. Dette giver mulighed for at udsætte hjernevæv, der indeholder neuroner og axonale skrifter uden skader og til registrering af neuronal morfologi, herunder synaptiske strukturer og deres molekylære indhold, som igen omfatter observation af fysiologiske ændringer som Ca2 + transienter eller intracellulære transporthændelser i op til flere timer. Ud over beskrivende karakteristik muliggør den direkte adgang til hjernevæv desuden forhør af modne neuronale funktioner ved hjælp af neurofarmakologisk stofbrug og optogenetiske tilgange. Derfor kan ægte strukturfunktionsforhold afsløres i den unge zebrafiskhjerne ved hjælp af denne hjerneeksponeringsstrategi.

Protocol

Alt dyrearbejde, der beskrives her, er i overensstemmelse med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63). Vedligeholdelse og håndtering af fisk er blevet godkendt af de lokale myndigheder og af dyrevelfærdsrepræsentanten for Technische Universität Braunschweig. 1. Fremstilling af kunstig cerebro spinalvæske (ACSF), lavt smeltende agarose og skarpe glasnåle Forbered ACSF ved at opløse de anførte kemikalier ved følgende koncentrationer i destilleret vand. 134 mM NaCl (58,44 g/mol),…

Representative Results

Figur 3AC viser en 14 dpf larve af den transgene linje Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] med kraniet stadig intakt. Pigmentcellerne i den overlejrende hud fordeles over hele hovedet og forstyrrer fluorescenssignalet i interesseområdet (her lillehjernen). Med larven i denne tilstand er det ikke muligt at opnå billeder i høj opløsning af hjernen. Figur 3B viser en larve af sa…

Discussion

Den præsenterede metode giver en alternativ tilgang til hjerneisolation eller behandling af zebrafisklarver med lægemidler, der hæmmer pigmentering til optagelse af billeder i høj opløsning af neuroner i deres in vivo-miljø. Kvaliteten af billeder optaget med denne metode kan sammenlignes med billeder fra udplantede hjerner, men under naturlige forhold.

Desuden undgås et tab i intensiteten af fluorescens, fordi der ikke er behov for behandling med fikseringsmidler<sup class="xr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker især Timo Fritsch for fremragende dyrepleje og Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti og Barbara Winter for deres hjælpsomme støtte. Vi er også taknemmelige for alle de andre medlemmer af Köster lab for deres feedback. Projektet blev delvist finansieret af det tyske forskningsfond (DFG, KO1949/7-2) projekt 241961032 (til RWK) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projekt 01EW1520 til JCM) er anerkendt.

Materials

Calcium chloride Roth A119.1
Confocal Laser scanning microscope Leica TCS SP8
d-Glucose Sigma G8270-1KG
d-Tubocurare Sigma-Aldrich T2379-100MG
Glass Capillary type 1 WPI 1B150F-4
Glass Capillary type 2 Harvard Apparatus GC100F-10
Glass Coverslip deltalab D102424
HEPES Roth 9105.4
Hoechst 33342 Invitrogen (Thermo Fischer) H3570
Imaging chamber Ibidi 81156
Potassium chloride Normapur 26764298
LM-Agarose Condalab 8050.55
Magnesium chloride (Hexahydrate) Roth A537.4
Microscope Camera Leica DFC9000 GTC
Needle-Puller type 1 NARISHIGE Model PC-10
Needle-Puller type 2 Sutter Instruments Model P-2000
Pasteur-Pipettes 3ml A.Hartenstein 20170718
Sodium chloride Roth P029.2
Sodium hydroxide Normapur 28244262
Tricain Sigma-Aldrich E10521-50G
Waterbath Phoenix Instrument WB-12
35 mm petri dish Sarstedt 833900
90 mm petri dish Sarstedt 821473001

References

  1. Embryology. Zebrafish Development Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020)
  2. Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
  3. Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
  4. Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish ‘affective’ behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
  5. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
  6. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
  7. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
  8. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  9. White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  10. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  11. Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
  12. Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
  13. Furman, B. . Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
  14. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
  15. Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
  16. Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  19. Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
  20. Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
  21. Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
  22. Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
  23. Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
  24. Dhabhar, F. S. The short-term stress response – mother nature’s mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).

Play Video

Cite This Article
Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Köster, R. W. In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal. J. Vis. Exp. (168), e62166, doi:10.3791/62166 (2021).

View Video