Her præsenterer vi en metode til at forestille zebrafisk embryonale hjerne in vivo op til larve og unge stadier. Denne mikroinvasive procedure, der er tilpasset fra elektrofysiologiske tilgange, giver adgang til cellulære og subcellulære detaljer om moden neuron og kan kombineres med optogenetik og neurofarmakologiske undersøgelser til karakterisering af hjernefunktion og lægemiddelintervention.
Forståelse af de kortvarige ændringer, der opstår under hjernens udvikling og modning kræver detaljeret høj opløsning billeddannelse i tid og rum på cellulære og subcellulære opløsning. Fremskridt inden for molekylære og billeddannelsesteknologier har gjort det muligt for os at få mange detaljerede indsigter i cellulære og molekylære mekanismer i hjernens udvikling i det gennemsigtige zebrafiskembryo. For nylig er processer til raffinement af neuronal forbindelse, der forekommer på senere larvestadier flere uger efter befrugtning, som for eksempel er kontrol over social adfærd, beslutningstagning eller motivationsdrevet adfærd, flyttet i fokus for forskning. På disse stadier forstyrrer pigmentering af zebrafiskhuden lysindtrængning i hjernevævet, og løsninger til embryonale stadier, f.eks. farmakologisk hæmning af pigmentering, er ikke længere mulige.
Derfor gives en minimalt invasiv kirurgisk løsning til mikroskopiadgang til hjernen af vågen zebrafisk, der stammer fra elektrofysiologiske tilgange. I teleosts, hud og bløde kraniet brusk kan forsigtigt fjernes ved mikro-peeling disse lag, udsætter underliggende neuroner og axonale skrifter uden skader. Dette giver mulighed for registrering af neuronal morfologi, herunder synaptiske strukturer og deres molekylære indhold, og observation af fysiologiske ændringer såsom Ca2 + transienter eller intracellulære transporthændelser. Desuden er det muligt at forhøre disse processer ved hjælp af farmakologisk hæmning eller optogenetisk manipulation. Denne hjerneeksponeringsmetode giver information om strukturelle og fysiologiske ændringer i neuroner samt sammenhængen og den indbyrdes afhængighed mellem disse hændelser i levende hjernevæv inden for få minutter eller timer. Teknikken er velegnet til in vivo hjernescanning af zebrafisk larver op til 30 dage efter befrugtning, den seneste udviklingsstadie testet hidtil. Det giver således adgang til så vigtige spørgsmål som synaptisk raffinement og skalering, axonal og dendritisk transport, synaptisk målretning af cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsafhængigt udtryk. Derfor kan der forventes en bred anvendelse af denne monterings- og billedbehandlingsmetode.
I løbet af de seneste årtier har zebrafisken (Danio rerio) udviklet sig som en af de mest populære hvirveldyrmodelorganismer til embryonale og larveudviklingsundersøgelser. Zebrafiskhunnernes store fecundity kombineret med embryoets hurtige udvikling og dets gennemsigtighed i de tidlige embryonale udviklingsstadier er blot nogle få nøglefaktorer, der gør zebrafisk til en stærk modelorganisme til at løse udviklingsmæssige spørgsmål1. Fremskridt inden for molekylære genteknologier kombineret med undersøgelser med høj opløsning in vivo-billeddannelse gjorde det muligt at behandle cellebiologiske mekanismer, der ligger til grund for udviklingsprocesser2. Især inden for neuronal differentiering, fysiologi, forbindelse og funktion har zebrafisk kastet lys over samspillet mellem molekylær dynamik, hjernefunktioner og organismeadfærd i hidtil usete detaljer.
Men de fleste af disse undersøgelser er begrænset til embryonale og tidlige larvestadier i løbet af den første uge af udviklingen, da gennemsigtigheden af nervesystemvævet gradvist går tabt. På disse stadier forhindres hjernevæv fra adgang ved højopløsningsmikroskopimetoder, der bliver afskærmet af kraniedifferentiering og pigmentering3.
Derfor er centrale spørgsmål om neuronal differentiering, modning og plasticitet såsom forfinelse af neuronal forbindelse eller synaptisk skalering vanskelige at studere. Disse cellulære processer er vigtige for at definere cellulære mekanismer, der kører, for eksempel social adfærd, beslutningstagning eller motivationsbaseret adfærd, områder, som zebrafisk forsker i flere ugers gamle larver for nylig har bidraget med nøgleresultater baseret på adfærdsundersøgelser4.
Farmakologiske metoder til at hæmme pigmentering i zebrafisklarver i flere uger er næppe gennemførlige eller kan endda forårsage skadelige virkninger5,6,7,8. Dobbelt eller tredobbelt mutant stammer med specifikke pigmenteringsdefekter, såsom casper9 eller krystal10, er blevet enormt værdifulde værktøjer, men er besværlige i avl, giver få afkom og udgør faren for at akkumulere genetiske misdannelser på grund af overdreven indavl.
Her gives en minimal invasiv procedure som et alternativ, der gælder for enhver zebrafiskstamme. Denne procedure blev tilpasset fra elektrofysiologiske undersøgelser for at registrere neuronal aktivitet i levende og vågne zebrafisklarver. I teleosts, hud og bløde kraniet brusk kan forsigtigt fjernes ved mikro-peeling disse lag, fordi de ikke er tæt sammenvævet med hjernen vaskulatur. Dette giver mulighed for at udsætte hjernevæv, der indeholder neuroner og axonale skrifter uden skader og til registrering af neuronal morfologi, herunder synaptiske strukturer og deres molekylære indhold, som igen omfatter observation af fysiologiske ændringer som Ca2 + transienter eller intracellulære transporthændelser i op til flere timer. Ud over beskrivende karakteristik muliggør den direkte adgang til hjernevæv desuden forhør af modne neuronale funktioner ved hjælp af neurofarmakologisk stofbrug og optogenetiske tilgange. Derfor kan ægte strukturfunktionsforhold afsløres i den unge zebrafiskhjerne ved hjælp af denne hjerneeksponeringsstrategi.
Den præsenterede metode giver en alternativ tilgang til hjerneisolation eller behandling af zebrafisklarver med lægemidler, der hæmmer pigmentering til optagelse af billeder i høj opløsning af neuroner i deres in vivo-miljø. Kvaliteten af billeder optaget med denne metode kan sammenlignes med billeder fra udplantede hjerner, men under naturlige forhold.
Desuden undgås et tab i intensiteten af fluorescens, fordi der ikke er behov for behandling med fikseringsmidler<sup class="xr…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker især Timo Fritsch for fremragende dyrepleje og Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti og Barbara Winter for deres hjælpsomme støtte. Vi er også taknemmelige for alle de andre medlemmer af Köster lab for deres feedback. Projektet blev delvist finansieret af det tyske forskningsfond (DFG, KO1949/7-2) projekt 241961032 (til RWK) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projekt 01EW1520 til JCM) er anerkendt.
Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
HEPES | Roth | 9105.4 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |