Summary
Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.
Abstract
Het begrijpen van de kortstondige veranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling en rijping van de hersenen vereist gedetailleerde beeldvorming met hoge resolutie in ruimte en tijd bij cellulaire en subcellulaire resolutie. Vooruitgang in moleculaire en beeldvormingstechnologieën heeft ons in staat gesteld om tal van gedetailleerde inzichten te krijgen in cellulaire en moleculaire mechanismen van hersenontwikkeling in het transparante zebravisembryo. Onlangs zijn processen van verfijning van neuronale connectiviteit die enkele weken na bevruchting in latere larvale stadia optreden, die bijvoorbeeld controle van sociaal gedrag, besluitvorming of motivatiegestuurd gedrag zijn, in focus van onderzoek gegaan. In deze stadia interfereert pigmentatie van de zebravishuid met lichte penetratie in hersenweefsel, en oplossingen voor embryonale stadia, bijvoorbeeld farmacologische remming van pigmentatie, zijn niet meer haalbaar.
Daarom wordt een minimaal invasieve chirurgische oplossing voor microscopietoegang tot de hersenen van wakkere zebravissen geboden die is afgeleid van elektrofysiologische benaderingen. Bij teleosten kunnen huid en zacht schedelkraakbeen zorgvuldig worden verwijderd door deze lagen te micropelen, waardoor onderliggende neuronen en axonale tractus zonder schade worden blootgelegd. Dit maakt het mogelijk om neuronale morfologie, inclusief synaptische structuren en hun moleculaire inhoud, en de observatie van fysiologische veranderingen zoals Ca2 + transiënten of intracellulaire transportgebeurtenissen vast te houden. Bovendien is ondervraging van deze processen door middel van farmacologische remming of optogenetische manipulatie mogelijk. Deze benadering van blootstelling aan de hersenen biedt informatie over structurele en fysiologische veranderingen in neuronen, evenals de correlatie en onderlinge afhankelijkheid van deze gebeurtenissen in levend hersenweefsel in het bereik van minuten of uren. De techniek is geschikt voor in vivo hersenbeeldvorming van zebravislarven tot 30 dagen na bevruchting, de nieuwste ontwikkelingsfase die tot nu toe is getest. Het biedt dus toegang tot belangrijke vragen zoals synaptische verfijning en schaalvergroting, axonale en dendritische transport, synaptische targeting van cytoskeletlading of lokale activiteitsafhankelijke expressie. Daarom kan een breed gebruik voor deze montage- en beeldvormingsbenadering worden verwacht.
Introduction
In de afgelopen decennia is de zebravis (Danio rerio) geëvolueerd als een van de meest populaire gewervelde modelorganismen voor embryonale en larvale ontwikkelingsstudies. De grote vruchtbaarheid van zebravis vrouwtjes in combinatie met de snelle ex utero ontwikkeling van het embryo en de transparantie ervan tijdens vroege embryonale ontwikkelingsfasen zijn slechts een paar belangrijke factoren die zebravissen tot een krachtig modelorganisme maken om ontwikkelingsvragen aan te gaan1. Vooruitgang in moleculair genetische technologieën in combinatie met hoge resolutie in vivo beeldvormingsstudies maakten het mogelijk celbiologische mechanismen aan te pakken die ten grondslag liggen aan ontwikkelingsprocessen2. Met name op het gebied van neuronale differentiatie, fysiologie, connectiviteit en functie heeft zebravis in ongekende details licht geworpen op het samenspel van moleculaire dynamica, hersenfuncties en organismegedrag.
Toch zijn de meeste van deze studies beperkt tot embryonale en vroege larvale stadia tijdens de eerste week van ontwikkeling, omdat transparantie van het zenuwstelselweefsel geleidelijk verloren gaat. In deze stadia wordt hersenweefsel verhinderd door microscopiebenaderingen met hoge resolutie die worden afgeschermd door schedeldifferentiatie en pigmentatie3.
Daarom zijn belangrijke vragen over neuronale differentiatie, rijping en plasticiteit, zoals de verfijning van neuronale connectiviteit of synaptische schaling, moeilijk te bestuderen. Deze cellulaire processen zijn belangrijk om cellulaire mechanismen te definiëren die bijvoorbeeld sociaal gedrag, besluitvorming of op motivatie gebaseerd gedrag stimuleren, gebieden waaraan zebravisonderzoek op enkele weken oude larven onlangs belangrijke bevindingen heeft bijgedragen op basis van gedragsstudies4.
Farmacologische benaderingen om pigmentatie bij zebravislarven gedurende enkele weken te remmen zijn nauwelijks haalbaar of kunnen zelfs schadelijke effecten veroorzaken5,6,7,8. Dubbele of drievoudige mutante stammen met specifieke pigmentatiedefecten, zoals casper9 of kristal10,zijn enorm waardevolle hulpmiddelen geworden, maar zijn moeizaam in de fokkerij, bieden weinig nakomelingen en vormen het gevaar van het accumuleren van genetische misvormingen als gevolg van overmatige inteelt.
Hier wordt een minimale invasieve procedure als alternatief geboden die van toepassing is op elke zebravisstam. Deze procedure werd aangepast van elektrofysiologische studies om neuronale activiteit in levende en wakkere zebravislarven vast te leggen. Bij teleosten kunnen huid en zacht schedelkraakbeen zorgvuldig worden verwijderd door deze lagen te micropelen, omdat ze niet nauw verweven zijn met de vasculatuur van de hersenen. Dit maakt het mogelijk om hersenweefsel met neuronen en axonale tractus zonder schade bloot te stellen en voor het registreren van neuronale morfologie, inclusief synaptische structuren en hun moleculaire inhoud, die op hun beurt de observatie van fysiologische veranderingen zoals Ca2 + transiënten of intracellulaire transportgebeurtenissen gedurende maximaal enkele uren omvatten. Bovendien, naast beschrijvende karakteriseringen, maakt de directe toegang tot hersenweefsel ondervraging van volwassen neuronale functies mogelijk door middel van neurofarmacologische toediening van stoffen en optogenetische benaderingen. Daarom kunnen echte structuurfunctierelaties worden onthuld in de juveniele zebravishersenen met behulp van deze hersenblootstellingsstrategie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven dierwerkzaamheden zijn in overeenstemming met wettelijke voorschriften (EU-richtlijn 2010/63). Het onderhoud en de behandeling van vis zijn goedgekeurd door de lokale autoriteiten en door de vertegenwoordiger voor dierenwelzijn van de Technische Universität Braunschweig.
1. Bereiding van kunstmatige cerebro spinale vloeistof (ACSF), laag smeltende agarose en scherpe glazen naalden
- Bereid de ACSF voor door de vermelde chemicaliën op te lossen bij de volgende concentraties in gedestilleerd water. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/mol),2,1 mM CaCl 2 (110,99 g/mol), 1,2 mM MgCl 2 6x H 2 O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,3 g/mol), 1,2 mM MgCl 2 6x H 2 O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,3 g/mol), 1,2 mM MgCl 2 6x H 2 O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,3 g/mol), 1,2 mM MgCl 2 6x H 2 O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,3 g/mol), 1,2 mM MgCl26x H 2 O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (
OPMERKING: Voor MgCl2,CaCl2en KCl worden 1 M voorraadoplossingen bereid in ontzout steriel water en bewaard bij 4 °C voor het vervolgens bereiden van verse ACSF. Glucose, HEPES en NaCl worden opgelost als vaste verbindingen in de verse ACSF-oplossing. Volg voor het oplossen van chemicaliën de instructies van de fabrikant. - Stel de pH van de ACSF in op 7,8 met 10 M NaOH. Voorbereiding van ACSF vereist nauwkeurige meting van chemicaliën en fijne aanpassing van de pH als het vervangt de cerebro spinale vloeistof en handhaaft de fysiologische omstandigheden die nodig zijn voor neuronen volledig functioneel anders kan het leiden tot hersenmisfunctie en neuronale dood.
- Bewaar de vers bereide ACSF maximaal 4 weken bij 4 °C. Voor werkomstandigheden, aliquot het vereiste volume ACSF voor de dag/experiment en prewarm bij 25-28 °C (en optioneel oxygeneren, stap 2.5)
OPMERKING: Vers bereide ASCF is prima voor 1 dag. Als u van plan bent het gedurende meerdere dagen te gebruiken, moet ACSF steriel worden gefilterd. - Voor latere anesthesie van de larven, bereid een 50 mM stamoplossing van d-Tubocurarine in gedestilleerd water en bewaar de oplossing bij -20 °C als 100 μL aliquots in de vriezer tot het nodig is.
- Om de vis in te bedden, bereidt u 2,5% laagsmeltende (LM) agarose door 1,25 g LM-agarose(Tafel van materialen)op te lossen in 50 ml ACSF en kookt u totdat de agarose volledig is opgelost.
OPMERKING: Als alternatief kunnen hogere of lagere concentraties LM-agarose worden gebruikt, afhankelijk van de experimentele opstelling. Als de agarose echter te zacht is, kan hij de vis niet op zijn plaats houden bij het openen van de schedel. - Bewaar de agarose bij 37 °C waterbad, om stolling te voorkomen en omdat deze temperatuur ook de larven niet schaadt bij het insluiten. Nadat de gekookte agarose is afgekoeld tot 37 °C in het waterbad, voegt u de benodigde hoeveelheid d-Tubocurarine toe aan de aliquoted agarose die nodig is voor de dag om een werkconcentratie van 10 μM te bereiken. Bewaar voor toekomstig gebruik de overgebleven agarose bij 4 °C om besmetting te voorkomen.
- Bereid scherpe en dunne glazen naalden uit glazen haarvaten (Aanvullende figuur 1) met behulp van een micropipettrekker met de volgende instellingen.
- Trekker I, Capillair type 1: Serie 1: 65.8; Serie 2: 55.1; 2-staps trekken
Trekker II, Capillair type 2: Warmte = 700; Fil = 4; Vel = 55; Del = 130; Pul = 55; 1-staps trekken.
OPMERKING: De eenheden zijn specifiek voor elke trekker en glazen capillair die hier worden gebruikt (zie tabel met materialen). Andere haarvaten en trekkers kunnen ook worden gebruikt om de glazen naalden te bereiden. Maar de glazen naalden mogen niet te dun zijn, omdat ze kunnen breken wanneer ze in contact komen met de schedel. Capillair: lengte: 100 mm (4 inch); OD: 1,5 mm; ID: 0,84 mm; filament: Ja
- Trekker I, Capillair type 1: Serie 1: 65.8; Serie 2: 55.1; 2-staps trekken
2. Anesthesie van larven en voorbereidingen voor inbedding
- Wanneer u het experiment voor de dag start, breng dan de dieren die nodig zijn met een plastic Pasteur pipet over naar een Petrischaal met een diameter van 90 mm, die is gevuld met Danieau (voor larven die nog steeds in een Petrischaal met Danieau worden gehouden) of water uit de visfaciliteit (voor larven die ouder zijn dan 7 dpf en in de visfaciliteit worden gehouden).
- Wanneer u vissen pipet die ouder zijn dan 2 weken, zorg er dan voor dat de opening van de pipet groot genoeg is om te voorkomen dat de vis gewond raakt bij het overbrengen ervan. Gebruik geen net omdat het vooral de jongere larven fysiek zal beschadigen.
- Voeg rotifera of artemia nauplii toe die geschikt zijn voor de grootte van de larven die in de petrischaal worden bewaard, om vrije toegang tot voedsel en maximale gezondheidsstatus van de larven te garanderen en stress te verminderen.
- Breng voor inbedding de geselecteerde larven over naar een Petrischaal met een diameter van 35 mm gevuld met ACSF. Voeg het benodigde volume d-Tubocurarine toe om een werkconcentratie/effectieve dosis van 10 μM te bereiken en wacht een paar minuten tot de larven volledig geïmmobiliseerd zijn11.
OPMERKING: Wanneer de vis ouder wordt of als een snellere volledige anesthesie nodig is (minder dan 5 minuten), is het mogelijk om de concentratie d-Tubocurarine te verhogen (LD50 voor muizen is 0,13 mg/kg intraveneus12). Het is ook mogelijk om een ander verdovingsmiddel te gebruiken, zoals α-bungarotoxine (werkconcentratie: 1 mg/ml), dat hetzelfde effect heeft als curare en ook de hersenen volledig actief houdt13. Als een volledig actief brein niet nodig is voor het onderwerp van belang, Tricaine in een niet-dodelijke dosis (0,02%) is ook een optie om de larven volledig te verdoven. Tricaine blokkeert echter natriumkanalen, waardoor de hersenactiviteit wordt aangetast14. - Bereid de montagekamer voor door het deksel van de Petrischaal met een diameter van 35 mm te nemen, het deksel ondersteboven te draaien en een vierkante glazen deksellip (24 x 24 mm) op de onderkant van het deksel te plaatsen. Zie figuur 1 (bovenste deel) voor een schematische beschrijving van deze stappen. Het gladdere oppervlak van het glas voorkomt uitglijden van het agaroseblok, dat de larven bevat tijdens de schedelopeningsprocedure.
- Aliquot de hoeveelheid ACSF die nodig is voor de dag in een geschikte flacon (bijv. 50 ml buis, beker, Schott-fles, enz.) en oxygeneer het met carbogen (5% CO2,95% O2). Als beeldvorming alleen morfologie (bijv. fluorescentiepatronen) ACSF nog steeds nodig is om de integriteit van de hersenen te waarborgen en dat cellen niet negatief worden beïnvloed door osmolariteitseffecten, maar oxygenatie van de ACSF niet nodig is. Deze stap hoeft alleen te worden uitgevoerd wanneer volledige hersenactiviteit nodig is voor beeldvorming.
OPMERKING: Voeg voor een optimale zuurstofverzadiging van het medium een luchtsteen toe aan het uiteinde van de carbogenbuis. Om een voldoende hoog zuurstofgehalte te garanderen, is het noodzakelijk om de ACSF in de beeldvormingskamers om de 20-60 minuten te vervangen door vers zuurstofrijke ACSF, afhankelijk van het aantal en de leeftijd van larven die in dezelfde beeldkamer zijn ingebed (bijvoorbeeld voor een enkele ingebedde larve ACSF-uitwisseling per uur is voldoende. Voor zes larven ouder dan 14 dpf parallel ingebed, is het nodig om ACSF elke 20 minuten uit te wisselen) dus plan de benodigde hoeveelheid zuurstof verzadigde ACSF volgens het geplande experiment.
3. Inbedding van de larven
- Breng de volledig verdoofde larven met een plastic Pasteur pipet over naar de (in stap 2.4) voorbereide montagekamer. Verwijder vervolgens voorzichtig het overtollige medium om verdunning van de LM-agarose te voorkomen. Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder een stereomicroscoop met voldoende vergroting.
OPMERKING: Het kantelen van de montagekamer kan helpen om het medium volledig te verwijderen. - Ga onmiddellijk verder met de volgende stap, door een voldoende grote LM-agarose-druppel bovenop de larven toe te voegen (ongeveer 1 ml, afhankelijk van de grootte van de larven) om de dieren te beschermen tegen uitdroging en om onnodige stress te verminderen.
- Oriënteer de larven in positie voordat de agarose stolt. Zorg ervoor dat het dorsale deel van de larven naar boven is gericht. Zorg er ook voor dat u de larven zo dicht mogelijk bij het oppervlak van de agarose insluit.
OPMERKING: Afhankelijk van de grootte en het aantal larven dat tegelijkertijd moet worden ingesloten, is het mogelijk om de agaroseconcentratie aan te passen. Bijvoorbeeld, voor 1-3 larven die 30 dpf oud zijn, wordt een concentratie van 1,8%-2% LM-agarose aanbevolen. Voor 1-4 larven die 7 dpf oud zijn, is het het meest praktisch om 2,5% LM-agarose te gebruiken, terwijl voor 5-8 larven 2% meer geschikt is. Als een volledig actief brein nodig is, wordt aanbevolen om slechts drie vissen tegelijkertijd in te sluiten om de tijd te verkorten die nodig is om de larven te bedienen. Over het algemeen wordt aanbevolen om lagere concentraties te gebruiken (1,8%-2%) hoe ouder de larven worden of hoe meer larven tegelijkertijd worden ingebed. - Als beelden worden opgenomen met een omgekeerde microscoop, knipt u het agaroseblok met de larven in een kleine kubusvorm. Dit is belangrijk voor het later overbrengen van de larven naar de beeldvormingskamer. Bij gebruik van een rechtopstaande microscoop is een dergelijke trimming niet nodig, omdat de montagekamer ook als beeldkamer kan worden gebruikt. In figuur 1 (bovenste deel) vindt u een schematische beschrijving van deze stappen.
4. De hersenen blootstellen
OPMERKING: Alle volgende stappen moeten met de grootste zorg worden uitgevoerd om de larven niet onnodig te verwonden. Als een volledig actief brein nodig is voor het experiment, houd er dan rekening mee dat met elke seconde die voorbijgaat, terwijl de vis nog steeds volledig in agarose is gemonteerd en een open schedel heeft zonder zuurstofrijke ACSF, de hersenen last hebben van een gebrek aan zuurstof en ook uitdrogen. De effecten van zuurstoftekort zullen nog dramatischer worden, hoe ouder de ingebedde larven zijn. Daarom is het belangrijk om de operatie niet alleen binnen de kortst mogelijke tijd uit te voeren, maar ook met maximale precisie om geen mechanische hersenbeschadiging met de naald op te roepen. Wanneer getraind, mogen de stappen 4.2-4.4 niet meer dan 30 s per vis innemen.
- Begin met de operatie zodra de agarose is gestold. Knip eerst alle overtollige agarose boven het hersengebied van belang weg om vrije toegang tot het hoofd en een duidelijke werkruimte te verkrijgen. Als het dorsale deel van het hoofd al uit de agarose steekt, sla deze stap dan over.
- Afhankelijk van de regio van belang, kies een plek om te beginnen met de operatie. Neem de glazen naald en maak een kleine incisie door de huid, maar zonder te diep in het weefsel te penetreren. Dit zal het startpunt zijn voor het afpellen van de bedekkende huid.
OPMERKING: Voor een optimaal resultaat moet u nooit direct boven de interesseregio beginnen om het risico op beschadiging van belangrijke structuren te verminderen. Indien nodig is het mogelijk om zelfs posterieure naar de hindbrain te beginnen en van daaruit vooruit te werken totdat het ongewenste gebied van de huid is weggepeld. - Ga verder met zeer kleine sneetjes langs het deel van de huid dat gericht is op verwijderen door de naald nauwelijks net onder het oppervlak te bewegen. Meestal is het niet nodig om volledig rond de hersenen te bewegen en een cirkelachtig stuk huid en schedel uit te snijden, maar maak gewoon twee incisies langs het hoofd en duw de huid vervolgens weg naar de ene of de andere kant. Figuur 2 toont een schematische weergave van de optimale snijstrategie om vrije toegang tot het cerebellum te verkrijgen.
OPMERKING: Deze micro-operatie is een delicate procedure en het zal hoogstwaarschijnlijk enige training nodig hebben om de huid perfect te verwijderen zonder de onderliggende hersenen te beschadigen. Het wordt ook aanbevolen om de optimale snijstrategie voor het hersengebied van belang te achterhalen en eraan vast te houden voor de periode van het experiment. - Onmiddellijk na het verwijderen van de huid van alle ingebedde larven, ga verder door (zuurstofrijke) ACSF over de agarose te gieten om ongewenste huiddeeltjes en bloed weg te spoelen en de hersenen volledig actief te houden en te beschermen tegen uitdroging.
OPMERKING: Als een gezond brein nodig is voor het experiment, wordt aanbevolen om voor maximaal drie vissen tegelijk te gaan. - Als u een rechtopstaande microscoop gebruikt, begin dan direct met beeldvorming.
- Wanneer u een omgekeerde microscoop gebruikt, schuift u een kleine spatel onder het cuboïde agaroseblok (stap 3.4).
- Voeg een klein druppeltje LM-agarose toe aan de onderkant van de beeldvormingskamer (bijv. glazen bodemschaal) en draai onmiddellijk het agaroseblok met de larven met de spatel gedurende 180° om en duw het voorzichtig naar de bodem van de beeldvormingskamer, terwijl de vloeibare agarosedruppel als lijm werkt.
- Wanneer de agarose is gestold, vult u de beeldvormingskamer met (zuurstofrijke) ACSF en begint u met beeldvorming. Zie figuur 1 (onderste deel) voor een schematische beschrijving.
- Wanneer volledige hersenactiviteit nodig is voor het experiment, zorg er dan altijd voor dat ACSF in de beeldvormingskamer een voldoende hoog zuurstofgehalte heeft. Om dit te garanderen, wisselt u het medium indien mogelijk elke 20-60 minuten zorgvuldig uit met vers zuurstofrijke ACSF (afhankelijk van het aantal en de grootte van de vis, de grootte en het oppervlak van de beeldvormingskamer en de beeldvormingsduur).
Figuur 1: Schematische procedure voor de voorbereiding van open schedelzebravissen voor in vivo beeldvorming op een stapsgewijze manier. De werkinstructies voor de verschillende stappen zijn te vinden in de afbeelding zelf. Grafisch ontworpen door Florian Hetsch en bewerkt door Paul Schramm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Gedetailleerde schematische weergave van de micro-operatie uitgevoerd om stukjes huid en schedel boven het hersengebied van belang te verwijderen. De rode cirkel markeert de plek waar de eerste snede moet worden gemaakt. De roodgestippelde lijn omlijnt het optimale pad om samen met de naald te snijden om vrije toegang tot het cerebellum te verkrijgen zonder het te beschadigen. De groene pijl markeert de richting waarin de overmatige huid- en schedelstukken gemakkelijk kunnen worden weggeduwd. Zorg ervoor dat u tijdens de hele procedure nooit in het hersenweefsel doordringt. Na het succesvol afpellen van de huid, zal het hersengebied van belang (hier, cerebellum) vrij toegankelijk zijn voor elke vorm van hoge resolutie in vivo beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3A,C toon een 14 dpf larve van de transgene lijn Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] Met de schedel nog intact. De pigmentcellen in de bedekkende huid zijn verspreid over het hoofd en interfereren met het fluorescentiesignaal in het interessegebied (hier, cerebellum). Met de larve in deze toestand is het niet mogelijk om afbeeldingen met hoge resolutie van de hersenen te verkrijgen. Figuur 3B toont een larve van dezelfde transgene lijn na het uitvoeren van de open schedeloperatie. Het interessegebied is nu vrij toegankelijk voor de excitatielaser en straalt fluorescentielicht uit om het weefsel te penetreren zonder te worden verspreid en gereflecteerd. Foto's opgenomen van deze larve zullen resulteren in gedetailleerde hoge resolutie beelden (Figuur 3D), vergelijkbaar met beelden van een geïsoleerd brein, maar met als voordeel dat de hersenen nog steeds volledig actief zijn. Bovendien verliezen de hersenen geen fluorescentie-intensiteit die normaal gesproken zou worden veroorzaakt door fixatie met paraformaldehyde, zoals het geval zou zijn voor een vast en uitgeplant brein. In een larve met een open schedel en dus een vrij toegankelijk brein met volledig actieve neuronen, die nog steeds alle fysiologische verbindingen mogelijk maakt en normale input van het sensorische systeem ontvangt, zal het ook mogelijk zijn om kortdurende gebeurtenissen te observeren, bijvoorbeeld synaptogenese, wervelkolomgroei, dendritische / axonale migratie of lokale mRNA-expressie16 onder fysiologische omstandigheden. Een ander voordeel van deze methode is dat het geschikt is voor de toepassing van verschillende farmacologische stoffen om de effecten op de levende larve te onderzoeken zonder de diffusieproblemen veroorzaakt door de huid en schedel of de bloed-hersenbarrière, die normaal gesproken stoffen zouden belemmeren om de hersenen binnen te dringen (Figuur 3E). Om aan te tonen dat een larve van 14 dpf met een open schedel gedurende 10 minuten werd geïncubeerd met Hoechst-33342 (5 μg/ml in ACSF) en vervolgens in beeld werd gebracht (Figuur 3F-Ik). Figuur 4A,B toon 30 dpf oude larven voor en na het openen van de schedel. Het is het meest geavanceerde tijdspunt dat tot nu toe voor deze methode is getest. Zelfs in dit ontwikkelingsstadium van de larve is het mogelijk om beelden met hoge resolutie van enkele neuronen en ook subcellulaire compartimenten te verkrijgen met behulp van de hier beschreven methode (Figuur 4C,D). Deze 30 dpf oude larven vertoonden geen activiteitstekorten na 1 uur beeldvorming. Deze methode wordt ook gebruikt voor elektrofysiologische patchklemanalyse van 30 dpf oude larven en er is geen teken voor het verlies van neuronale activiteit in Purkinje-cellen (maar cellen dicht bij het oppervlak zijn delicaat en kwetsbaar) tijdens de eerste 60 minuten dat ze zijn ingebed met een open schedel. Door regelmatig de hoeveelheid bloedstroom te inspecteren, is het mogelijk om te valideren dat de larve nog steeds in een gezonde status verkeert. Deze status kan worden gehandhaafd door ACSF regelmatig uit te wisselen of zuurstof te geven tijdens langdurige beeldopnamen. Het is daarom vrij eenvoudig om te valideren of een larve nog steeds geschikt is voor functionele hersenstudies. Om te bewijzen, dat geen belangrijke bloedvaten worden beschadigd tijdens de micro-chirurgie en ook om aan te tonen dat deze methode maakt veel diepere penetratie van de excitatie laser licht in hersenweefsel en de reflectie-verminderde emissie van fotonen, een 10 dpf oude larve van de transgene stam Tg (flk1:mCherry)y206Tg17 werd geanalyseerd door deze methode. Deze vissen bevatten een fluorescerende vasculatuur in de hersenen als gevolg van de expressie van de rode fluorescerende eiwit mCherry in endotheelcellen. Een projectie met maximale intensiteit van een beeldstapel van 245 μm diep onthult het ingewikkelde netwerk van de bloedvaten die door het midden- en achterwervelen slingeren (Figuur 5A). Bovendien toont kleurcodering van dieptewaarden van de beeldstapel aan dat zelfs bloedvaten die met bijna 250 μm diep in de hersenen zijn begraven, duidelijk zichtbaar en traceerbaar zijn (Figuur 5B). Aanvullende video 1A toont een gezond brein met voldoende bloedtoevoer, terwijl Aanvullende video 1B toont een hersenen met gecompromitteerde bloedstroom als gevolg van het gebrek aan uitwisseling van ACSF en gebrek aan medium oxygenatie.
Figuur 3: Huidschilfering bij zebravislarven biedt optimale toegang voor in vivo hersenbeeldvorming. Confocale microscopie analyse van 14 dpf oude transgene Tg(-7.5ca8:GFP]bz12 larven. Overzicht van midden- en hindbrain van niet-geschilde (A,C) en huid geschilde (B,D) specimens bij respectievelijk 20x en 40x vergroting. In het laatste geval verbetert het gebrek aan pigment duidelijk de beeldkwaliteit en maakt het gedetailleerde beeldopname van fluorescerende Purkinje-cellen in het cerebellum mogelijk. Subcellulaire beeldvorming en het gemak van samengestelde toediening aan de hersenen wordt aangetoond door een incubatietijd van 10 minuten met de nucleïnezuur fluorescerende kleuring met behulp van Hoechst-33342 (5 μg/ml in ACSF). Terwijl alleen huidcellen deze kleurstof opnemen in niet-geschilde larven (E), vertonen exemplaren met opgeheven huid intense etikettering van hun kernen in de hersenen (F) waardoor individuele kernen (G) van GFP-fluorescerende Purkinje-neuronen (H, samengevoegde afbeelding weergegeven in I, 63x optische en 4x digitale vergroting ) kunnen worden gevisualiseerd. Schaalbalken: A-F: 100 μm, G-I: 5 μm. Larven waren ingebed met hun hoofd naar links, dorsaal is omhoog. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Huidschilfering breidt de toegang voor in vivo hersenbeeldvorming uit tot jonge zebravissen. Confocale microscopie analyse van 30 dpf oude transgene Tg(-7.5ca8:GFP]bz12Tg juvenielen. Overzicht over midden- en achterhersenen van niet-geschilde (A) en huid geschilde exemplaren bij respectievelijk 10x (B) en 40x (C) en 63x optische vergroting met 4x digitale zoom (D). De verwijdering van gepigmenteerde huid maakt visualisatie van de cellulaire organisatie van de continue cerebellaire Purkinje cellaag mogelijk en om projecties van individuele neuronen(D,witte pijlen) weer te geven. Schaalbalken: A-C: 100 μm, D: 5 μm. Larven waren ingebed met hun hoofd naar links, dorsaal is omhoog. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Huidverwijdering maakt hersen vasculatuur reconstructie op uitgebreide diepte in een 10 dpf oude Tg (flk1:mCherry)y206Tg zebravis larve. (A) Maximale intensiteitsprojectie van een stapel beelden (245 beelden met een dikte van 1 μm op een totale afstand van 245 μm, 20x optische vergroting) toont een continu netwerk van bloedvaten in deze hersengebieden. (B) Dieptekleurcodering laat zien dat dit netwerk van bloedvaten kan worden gecontroleerd op een diepte van 200 μm en verder. Om autofluorescentie en reflectie te verwijderen, werden de ogen gemaskeerd door zwarte kleur. Schaalbalk: 100 μm. Larven waren ingebed met hun hoofd naar links, dorsaal is omhoog. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Naalden van glazen haarvaten. (A) Twee naaldtypes verkregen uit twee verschillende naaldtrekkers worden getoond. Het is belangrijk dat de tip niet te lang is om hem voldoende stabiliteit te bieden en om te voorkomen dat hij breekt wanneer hij in contact komt met de huid / schedel. Toch is er voldoende scherpte nodig om sneden met schone randen mogelijk te maken. (B) Er wordt een afbeelding getoond van het capillair dat in de naaldtrekkers is geladen. Schaalbalk is 250 μm. Capillaire lengte: 100 mm; OD: 1,5 mm: ID: 0,84 mm; filament: Ja. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende Video 1: Imaging 7dpf oude larve. (A) Real-time Filmopname (30 fps) van een 7 dpf oude larve 10 min nadat de huid boven de hersenen is verwijderd. De levendige doorbloeding duidt op een gezonde toestand met voldoende bloedtoevoer. (B) Real-time filmopname (30 fps) van dezelfde 7 dpf oude larve getoond in aanvullende video 1A, 2 uur na de microchirurgie zonder uitwisseling van ACSF en gebrek aan medium oxygenatie. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde methode biedt een alternatieve benadering van hersenisolatie of de behandeling van zebravislarven met geneesmiddelen die pigmentatie remmen voor het opnemen van hoge resolutie beelden van neuronen in hun in vivo omgeving. De kwaliteit van beelden die met deze methode zijn opgenomen, is vergelijkbaar met beelden van uitgeplante hersenen, maar onder natuurlijke omstandigheden.
Bovendien wordt een verlies in intensiteit van fluorescentie vermeden, omdat er geen behandeling met fixatieven nodig is18. Ook is deze methode niet zo invasief als het isoleren van een brein en bestaat het slechts uit één cruciale stap die tot falen kan leiden, dus de kans op een succesvolle voorbereiding is hoger in vergelijking met hersenverplanting. Het belangrijkste voordeel is dat deze methode geschikt is voor in vivo beeldopname. Op voorwaarde dat de schedelopening nauwkeurig, snel en succesvol wordt uitgevoerd en de zuurstofverzadiging van ACSF regelmatig wordt gecontroleerd, moeten de hersenen urenlang volledig functioneel en levensvatbaar zijn. Op basis van elektrofysiologische opnames, bloedcirculatie, ademhaling en overleving van vissen gedurende extra dagen, achten we het waarschijnlijk dat huid- en schedelverwijdering niet ernstig schadelijk is voor de algehele gezondheid. Deze methode kan dus worden gebruikt voor real-time beeldvorming van cellulaire en subcellulaire processen in een gezond en functioneel brein zonder beeldbe storende pigmentatie. Deze methode is een standaardprocedure die wordt gebruikt voor elektrofysiologische opnames van neuronale activiteit in vivo in ons laboratorium en is ook goed ingeburgerd in andere elektrofysiologische laboratoria over de hele wereld19,20,21,22, waaruit blijkt dat de functie van de hersenen niet wordt aangetast door de microchirurgie. Een nadeel dat moet worden vermeld, is dat deze aanpak alleen geschikt is voor beeldvorming van dorsale en laterale hersengebieden en niet herhaaldelijk met hetzelfde exemplaar kan worden uitgevoerd.
Als echter een volledig functioneel brein nodig is voor het experiment, moet de zuurstofverzadiging permanent worden gecontroleerd en, indien nodig, moet de ACSF in de beeldvormingskamer worden uitgewisseld met vers zuurstofrijke ACSF. Dit betekent dat er voor langetermijnopnamen een optie moet zijn om de gebruikte ACSF te vervangen door met zuurstof verzadigde ACSF zonder de beeldvormingsprocedure te verstoren die met een miniatuurpomp kan worden aangepakt.
Let op, als de micro-operatie niet correct of onnauwkeurig wordt uitgevoerd, zal dit leiden tot hersenletsel of hersenbloeding, wat resulteert in gecompromitteerde hersenfysiologie. Ook kan een lage zuurstofverzadiging in de ACSF (zie aanvullende video 1) of te veel stress voor de larven tijdens deze hele procedure een negatieve invloed hebben op de hersenen23,24. Daarom is deze methode niet geschikt voor analyse met hoge doorvoer, maar eerder voor longitudinale of zeer gedetailleerde beeldopname van slechts een paar larven per tijdspunt. Daarom moet deze methode niet gericht zijn op geneesmiddelenscreening bij hoge doorvoer, maar kan deze worden gebruikt om veelbelovende farmacologische verbindingen in detail te karakteriseren of te valideren, waar beeldvorming met hoge resolutie informatief en noodzakelijk is. Om een goede gezondheidsstatus van de hersenen te garanderen, wordt aanbevolen om het aantal van drie larven per proef niet te overschrijden.
Via de open schedel is het zelfs mogelijk om stoffen direct op het hersenweefsel aan te brengen zonder dat ze door de bloed- en hersenbarrière hoeven te gaan. Over het algemeen is de hier beschreven methode - momenteel toegepast voor in vivo elektrofysiologie - een techniek met een hoog potentieel op een zeer breed gebied van in vivo hersenbeeldvorming en optogenetica bij zebravislarven en juvenielen en kan worden gekoppeld aan neurofarmacologische benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We danken vooral Timo Fritsch voor de uitstekende verzorging van dieren en Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti en Barbara Winter voor hun behulpzame steun. We zijn ook alle andere leden van het Köster lab dankbaar voor hun feedback. Het project werd gedeeltelijk gefinancierd door de Duitse Stichting voor Onderzoek (DFG, KO1949/7-2) project 241961032 (aan RWK) en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS project 01EW1520 naar JCM) wordt erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
