Summary
여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.
Abstract
뇌 발달 과 성숙 중에 발생하는 일시적인 변화를 이해하려면 세포 및 세포 외 해상도의 공간과 시간에 대한 상세한 고해상도 이미징이 필요합니다. 분자 및 이미징 기술의 발전으로 투명한 제브라피시 배아에서 뇌 발달의 세포 및 분자 메커니즘에 대한 수많은 상세한 통찰력을 얻을 수 있었습니다. 최근, 사회 행동의 제어, 의사 결정 또는 동기 부여 중심 행동의 예를 들어 제어되는 수정 후 몇 주 후 후 애벌레 단계에서 발생하는 신경 연결의 정제 과정은 연구의 초점으로 이동했다. 이러한 단계에서, 제브라피쉬 피부의 색소 침착은 뇌 조직에 대한 가벼운 침투를 방해하고, 배아 단계에 대한 해결책, 예를 들어, 색소 침착의 약리학적 억제는 더 이상 가능하지 않다.
따라서, 깨어 있는 제브라피시의 뇌에 대한 현미경 접근을 위한 최소침습수술용용액은 전기생리학적 접근법에서 유래되는 것을 제공한다. 텔레오스트에서 피부와 부드러운 두개골 연골은 이러한 층을 미세 하게 벗겨내어 손상없이 기본 뉴런과 축산 관을 노출시킴으로써 조심스럽게 제거 할 수 있습니다. 이를 통해 시냅스 구조와 분자 내용을 포함한 신경 형태학을 기록하고 Ca2+ 과도 또는 세포내 운송 이벤트와 같은 생리적 변화의 관찰을 할 수 있습니다. 또한 약리학적 억제 또는 광유전학 적 조작을 통해 이러한 프로세스의 심문이 가능합니다. 이 두뇌 노출 접근은 분 또는 시간의 범위에 있는 살아있는 두뇌 조직에 있는 이 사건의 상호 관계 그리고 상호 의존뿐만 아니라 뉴런에 있는 구조적이고 생리적인 변경에 관하여 정보를 제공합니다. 이 기술은 지금까지 테스트 된 최신 발달 단계인 수정 후 30 일까지 제브라피시 애벌레의 생체 내 뇌 이미징에 적합합니다. 따라서 시냅스 미세 조정 및 스케일링, 축산 및 수지상 운송, 시토스켈레탈 화물의 시냅스 타겟팅 또는 현지 활동에 의존하는 표현과 같은 중요한 질문에 대한 액세스를 제공합니다. 따라서 이러한 마운팅 및 이미징 접근 방식에 대한 광범위한 사용이 예상될 수 있습니다.
Introduction
최근 수십 년 동안,제브라피쉬(Danio rerio)는배아 및 애벌레 발달 연구를 위한 가장 인기 있는 척추동물 모델 유기체 중 하나로 발전해 왔습니다. 제브라피쉬 암컷의 큰 대변은 배아의 급속한 자궁 발달과 초기 배아 발달 단계 동안의 투명성과 결합된 몇 가지 주요 요인에 불과하며, 제브라피쉬는 발달 문제1을유발하는 강력한 모델 유기체로 만드는 몇 가지 주요 요인일 뿐이다. 생체 내 고해상도와 결합된 분자 유전 기술의 어드밴스는 발달 과정의 기본 세포 생물학적 메커니즘을 해결하는 데허용하였다 2. 특히, 신경 분화, 생리학, 연결 성 및 기능 분야에서, 제브라피쉬는 전례없는 세부 사항에서 분자 역학, 뇌 기능 및 유기체 행동의 상호 작용에 빛을 비추고있다.
그러나, 이 연구 결과의 대부분은 신경계 조직의 투명성이 점진적으로 분실되기 때문에 발달의 첫번째 주 도중 배아 및 초기 애벌레 단계에 제한됩니다. 이러한 단계에서 뇌 조직은 두개골 분화 및 색소 침착3에의해 차폐되는 고해상도 현미경 검사법에 의해 접근이 방지됩니다.
따라서, 신경 분화의 주요 질문, 성숙, 및 뉴런 연결또는 시냅스 스케일링의 정제와 같은 가소성은 공부하기 어렵다. 이러한 세포 과정은 예를 들어 사회적 행동, 의사 결정 또는 동기 부여 기반 행동을 구동하는 세포 메커니즘을 정의하기 위해 중요하며, 몇 주 간의 오래된 애벌레에 대한 제브라피시 연구가 최근 행동 연구4에기초한 주요 연구 결과를 기여했습니다.
몇 주 동안 제브라피시 애벌레에서 색소 침착을 억제하는 약리학적 접근법은 거의 실현 가능하지 않거나5,6,7,8에해로운 효과를 일으킬 수도 있다. 캐스퍼9 또는 크리스탈10과같은 특정 색소 침착 결함을 가진 이중 또는 삼중 돌연변이 균주는 엄청난 귀중한 도구가되었지만 번식에서 힘들고 몇 자손을 제공하며 과도한 근친 교배로 인한 유전 적 기형을 축적 할 위험이 있습니다.
여기서, 대안으로 최소 침습 절차는 어떤 제브라피시 균주에 적용 할 수 있습니다. 이 절차는 생활과 깨어 얼룩말 물고기 애벌레에 있는 신경 활동을 기록하기 위하여 전기 생리학 연구 결과에서 적응되었습니다. 텔레오스트에서, 피부와 부드러운 두개골 연골은 두뇌 혈관과 단단히 섞이지 않기 때문에, 이 층을 마이크로 박리해서 주의 깊게 제거할 수 있습니다. 이것은 손상 없이 신경과 축 관을 포함 하는 뇌 조직을 노출 하 고 신경 형태를 기록에 대 한 허용, 시 냅 스 구조 와 그들의 분자 내용을 포함 하 여, 차례로 Ca 와 같은 생리적 변화의 관찰을 포함2+ 과도 또는 세포 내 전송 이벤트 최대 몇 시간 동안. 더욱이, 설명적 특성을 넘어, 뇌 조직에 직접 접근은 신경 약리학 물질 관리 및 광유전학 적 접근을 통해 성숙한 신경 기능의 심문을 가능하게 합니다. 따라서, 진정한 구조 기능 관계는 이 두뇌 노출 전략을 사용하여 청소년 제브라피시 뇌에서 드러나게 될 수 있다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 동물 작업은 법적 규정에 따라 다됩니다(EU-지침 2010/63). 생선의 유지 보수 및 취급은 지방 당국과 테크니슈 유니버시타트 브라운슈바이크의 동물 복지 대표에 의해 승인되었습니다.
1. 인공 세레브로 척수액 (ACSF), 낮은 녹는 아가로즈 및 날카로운 유리 바늘의 준비
- 증류수의 농도에 따라 나열된 화학 물질을 용해하여 ACSF를 준비합니다. 134 mM NaCl (58.44 g/mol), 2.9 mM KCl (74.55 g/mol), 2.1 mM CaCl2 (110.99 g/mol), 1.2 m M MgCl2 6x H2O (203.3 g/mol), 10m HEPES (238.31 g/mol), 10 mM d-포도당 (180.16 g/mol).
참고: MgCl2,CaCl2및 KCl의 경우 1M 스톡 용액을 무염 멸균수로 제조하고 4°C에 저장하여 신선한 ACSF를 준비합니다. 포도당, HEPES 및 NaCl은 신선한 ACSF 용액에서 고체 화합물로 용해됩니다. 화학 물질을 용해하기 위해 제조업체의 지침을 따르십시오. - ACSF의 pH를 10M NaOH로 7.8로 조정합니다. ACSF의 준비는 세레브로 척수를 대체하고 신경이 완전히 기능하기 위해 필요한 생리적 조건을 유지하므로 뇌 기능 장애 및 신경 사망을 일으킬 수 있으므로 화학 물질의 정확한 측정 및 pH의 미세 조정이 필요합니다.
- 갓 준비된 ACSF를 4°C에서 최대 4주 동안 보관합니다. 작업 조건에 대 한, 하루/실험및 25-28°C에서 prewarm에 대 한 ACSF의 필요한 볼륨을 알리 쿼트 (그리고 선택적으로 그것을 산소, 단계 2.5)
참고 : 갓 준비 된 ASCF는 1 일 동안 괜찮습니다. 며칠 동안 사용할 계획이라면 ACSF를 필터링해야 합니다. - 유충의 후이 마취를 위해, 증류수에 d-Tubocurarine의 50 mM 스톡 용액을 준비하고 필요할 때까지 냉동실에 100 μL 알리쿼트로 -20 °C에 용액을 저장합니다.
- 물고기를 포함하려면 1.25g LM-아가로즈(재료표)를 50mL ACSF로 용해하여2.5% 낮은 용융(LM)을 준비하고 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 끓입니다.
참고: 대안적으로, LM-아가로즈의 더 높거나 낮은 농도는 실험적인 셋업에 따라 사용될 수 있다. 그러나 아가로즈가 너무 부드러워지면 두개골을 열 때 물고기를 제자리에 고정시킬 수 없습니다. - 아가로즈를 37°C의 수조에 저장하여 고화를 피하고 이 온도가 포함될 때 애벌레에 해를 끼치지 않기 때문이다. 삶은 아가로즈가 수조에서 37°C로 냉각된 후, 10 μM의 작동 농도에 도달하기 위해 하루에 필요한 알로인용 아가로즈에 필요한 양의 d-Tubocurarine을 첨가한다. 향후 사용을 위해 오염을 피하기 위해 남은 아가로즈를 4°C에 저장하십시오.
- 다음 설정과 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세 혈관(보충 도 1)에서날카롭고 얇은 유리 바늘을 준비합니다.
- 풀러 I, 모세관 유형 1: 열 1: 65.8; 열 2: 55.1; 2단계 당기기
풀러 II, 모세관 형 2 : 열 = 700; 필 = 4; 벨 = 55; 델 = 130; 펄 = 55; 1 단계 당기.
참고: 단위는 각각 여기에 사용되는 각 풀러 및 유리 모세관에 대해 특정합니다(재료 표참조). 다른 모세 혈관및 풀러는 유리 바늘을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 유리 바늘은 두개골과 접촉 할 때 부러질 수 있기 때문에 너무 얇아서는 안됩니다. 모세관: 길이: 100mm(4인치); OD: 1.5 mm; ID: 0.84 mm; 필라멘트: 예
- 풀러 I, 모세관 유형 1: 열 1: 65.8; 열 2: 55.1; 2단계 당기기
2. 애벌레의 마취 및 포함 준비
- 하루 동안 실험을 시작할 때, 90mm 직경 페트리 접시에 플라스틱 파스퇴르 파이펫에 필요한 동물을 전송, 이는 다니오 (여전히 다니오와 페트리 접시에 보관되는 애벌레) 또는 물고기 시설에서 물 (7 dpf 보다 오래되고 물고기 시설에 보관됩니다)로 채워집니다.
- 2주 이상 된 물고기를 피킹할 때, 피펫의 개구부가 물고기를 옮길 때 물고기를 다치게 하지 않도록 충분히 큰지 확인하십시오. 그것은 물리적으로 특히 젊은 애벌레를 손상하기 때문에 그물을 사용하지 마십시오.
- 페트리 접시에 보관된 애벌레의 크기에 적합한 로티페라 또는 아르테미아 아우플리이를 추가하여 음식에 무료로 접근할 수 있도록 하고 스트레스를 줄입니다.
- 포함의 경우 선택한 유충을 ACSF로 채워진 35mm 직경의 페트리 접시로 옮킨다. D-Tubocurarine의 필요한 부피를 추가하여 10 μM의 작동 농도/유효 용량에 도달하고 애벌레가 완전히 고정될 때까지 몇 분 동안 기다린다11.
참고: 물고기가 나이가 들거나 더 빠른 전체 마취가 필요한 경우(5분 미만), d-Tubocurarine의 농도를 증가시킬 수 있습니다(마우스의 경우 LD50은 0.13 mg/kg 정맥내 12). 또한 α-분가로톡신(작동 농도: 1 mg/mL)과 같은 다른 마취제를 사용할 수 있으며, 이는 큐레어와 동일한 효과를 가지며 뇌를 완전히 활성 상태로 유지하는13. 완전히 활동적인 뇌가 관심대상에 필요하지 않은 경우, 비치명적인 용량(0.02%)의 트리카인은 애벌레를 완전히 마취시키는 옵션이기도 하다. 그러나 트리카인은 나트륨 채널을 차단하여 뇌 활동을손상시(14)한다. - 35mm 직경의 페트리 접시의 뚜껑을 가져 와서 장착 챔버를 준비하고 뚜껑을 거꾸로 뒤집고 뚜껑 바닥에 사각형 유리 커버 슬립 (24 x 24mm)을 놓습니다. 이러한 단계에 대한 회로도 설명을 보려면 그림 1(위쪽 부분)을 참조하십시오. 유리의 매끄러운 표면은 두개골 개구부 시유를 포함하는 아가로즈 블록에서 미끄러지는 것을 방지합니다.
- Aliquot적절한 바이알(예: 50mL 튜브, 비커, 쇼트 병 등)에서 하루에 필요한 ACSF의 양을 인용하고 카보겐(5% CO2,95% O2)으로산소를 공급한다. 이미징만 형태 (예를 들어, 형광 패턴) ACSF는 여전히 뇌의 무결성을 보장하고 세포가 삼투성 효과에 의해 부정적인 영향을받지 않지만 ACSF의 산소가 필요하지 않다는 것을 보장하기 위해 여전히 필요하다. 이 단계는 전체 뇌 활동이 이미징에 필요한 경우에만 수행될 필요가 있습니다.
참고: 매체의 최적의 산소 포화도를 위해 카보겐 튜브 끝에 공기석을 추가합니다. 충분히 높은 산소 수준을 보장하기 위해, 동일한 이미징 챔버에 내장 된 애벌레의 수와 나이에 따라 20-60 분마다 갓 산소 ACSF와 이미징 챔버에서 ACSF를 교환 할 필요가있다 (예를 들어, 단일 임베디드 애벌레 ACSF 교환에 대한 매 시간마다 충분하다. 14dpf 이상의 6개의 애벌레의 경우, ACSF를 20분마다 교환하는 것이 필요하므로 계획된 실험에 따라 필요한 양의 산소 포화 ACSF를 계획한다.
3. 애벌레의 포함
- 완전히 마취된 애벌레를 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로 (2.4 단계) 준비된 장착 챔버로 옮킨다. 그런 다음, LM-아가로즈의 희석을 피하기 위해 초과 매체를 신중하게 제거한다. 다음의 모든 단계는 충분한 배율을 가진 스테레오 현미경으로 수행되어야 합니다.
참고: 마운팅 챔버를 기울이면 매체를 완전히 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. - 동물을 건조시키지 않도록 보호하고 불필요한 스트레스를 줄이기 위해 애벌레 위에 충분히 큰 LM-아가로즈 드롭을 추가하여 즉시 다음 단계로 진행하십시오( 애벌레의 크기에 따라 1mL 경).
- 아가로즈가 굳어지기 전에 애벌레를 위치에 고정시한다. 애벌레의 등쪽 부분이 위쪽으로 향하도록 합니다. 또한, 가능한 한 아가로즈의 표면에 가까운 애벌레를 포함해야합니다.
참고: 동시에 포함될 예정인 애벌레의 크기와 개수에 따라 아가로즈 농도를 조절할 수 있다. 예를 들어, 30dpf 의 1-3 애벌레의 경우, 1.8%-2%의 LM-아가로즈 농도가 권장됩니다. 7dpf 의 1-4 애벌레의 경우 2.5 % LM-아가로즈를 사용하는 것이 가장 실용적입니다. 완전 활성 뇌가 필요한 경우 애벌레를 작동하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 세 마리의 물고기만 동시에 포함시키는 것이 좋습니다. 일반적으로, 더 낮은 농도(1.8%-2%)를 사용하는 것이 좋습니다. - 반전된 현미경을 사용하여 이미지가 기록될 경우 애벌레를 포함하는 아가로즈 블록을 작은 큐비드 모양으로 다듬습니다. 이것은 나중에 화상 진찰실로 애벌레를 전송하기 위해 중요합니다. 직립 현미경을 사용하는 경우, 이러한 트리밍은 필요하지 않습니다, 마운팅 챔버는 또한 이미징 챔버로 사용할 수 있기 때문에. 그림 1(상부)에서 이러한 단계에 대한 회로도 설명을 찾을 수 있습니다.
4. 뇌 노출
참고: 다음의 모든 단계는 애벌레를 불필요하게 손상시키지 않도록 주의를 기울여 수행해야 합니다. 실험에 완전히 활동적인 뇌가 필요한 경우, 물고기가 여전히 완전히 아가로즈에 장착되어 산소 ACSF없이 열린 두개골을 가지고있는 동안, 통과 매 초마다, 뇌는 산소의 부족으로 고생하고 또한 건조. 산소 결핍의 효과는 더욱 극적으로 될 것입니다, 오래된 내장 된 애벌레는. 따라서, 가능한 최단 시간 내에뿐만 아니라, 바늘로 기계적 뇌 손상을 불러 일으키지 않도록 최대 정밀도로 수술을 수행하는 것이 중요합니다. 훈련을 받으면 4.2-4.4단계는 물고기 당 30개 이상을 섭취해서는 안 됩니다.
- 아가로즈가 굳어지자마자 수술을 시작한다. 첫째, 머리와 명확한 작업 공간에 무료로 액세스 할 수 있도록 관심의 뇌 영역 위에 초과 아가로즈의 모든 트림. 머리의 등쪽 부분이 이미 아가로즈에서 튀어 나와 있는 경우 이 단계를 건너뜁니다.
- 관심 지역에 따라 수술로 시작하는 장소를 선택하십시오. 유리 바늘을 가지고 피부를 통해 작은 절개를하지만 조직에 너무 깊이 침투하지 않고. 이것은 오버레이 피부를 벗겨내는 출발점이 될 것입니다.
참고: 최적의 결과를 얻으려면 관심 지역 바로 앞에서 시작하여 중요한 구조물을 손상시킬 위험을 줄이지 마십시오. 필요한 경우, 심지어 뒤늦게 뇌에 후방을 시작하고 거기에서 피부의 원치 않는 영역이 벗겨질 때까지 앞으로 작동 할 수 있습니다. - 표면 바로 아래에 바늘을 거의 움직여 제거하는 것을 목표로 하는 피부 부분을 따라 아주 작은 상처를 계속하십시오. 대부분의 경우 뇌를 완전히 움직이고 원모양의 피부와 두개골 조각을 잘라낼 필요는 없지만, 오히려 머리를 따라 두 개의 절개를 한 다음 피부를 한쪽 또는 다른 쪽으로 밀어 낼 필요가 없습니다. 도 2는 소뇌에 대한 자유로운 접근을 얻기 위한 최적의 절단 전략의 회로도 표현을 나타낸다.
참고 : 이 미세 수술은 섬세한 절차이며 기본 뇌를 손상시키지 않고 피부를 완벽하게 제거하기 위해 약간의 훈련이 필요할 것입니다. 그것은 또한 관심의 두뇌 영역에 대 한 최적의 절단 전략을 찾아 실험의 기간 동안 그것에 충실 하는 것이 좋습니다. - 모든 내장 된 애벌레에서 피부를 제거 한 직후, 원치 않는 피부 입자와 혈액을 홍수와 완전히 활성 뇌를 유지하고 건조에서 보호하기 위해 아가로즈 위에 (산소) ACSF를 부어 진행합니다.
참고: 실험에 건강한 뇌가 필요한 경우 한 번에 최대 3마리의 물고기를 찾는 것이 좋습니다. - 직립 현미경을 사용하는 경우 이미징으로 직접 시작합니다.
- 반전 된 현미경을 사용하는 경우, 입체 아가로즈 블록 (단계 3.4)의 밑에 작은 주걱을 밀어.
- 이미징 챔버의 바닥에 LM-아가로즈의 작은 방울을 추가하고 (예를 들어, 유리 바닥 접시) 즉시 180 ° 주걱으로 애벌레를 포함하는 아가로즈 블록을 뒤집어 부드럽게 이미징 챔버의 바닥에 밀어, 액체 아가로즈 드롭접착제 역할을하는 동안.
- 아가로즈가 고화되면 이미징 챔버를 (산소화) ACSF로 채운 다음 이미징을 시작합니다. 회로도 설명은 그림 1(하부)을 참조하십시오.
- 실험에 대한 완전한 뇌 활동이 필요한 경우 이미징 챔버의 ACSF가 산소 수준이 충분히 높은지 항상 확인하십시오. 이를 보장하기 위해, 가능한 경우 신선 산소 ACSF와 신중하게 배지를 교환 20-60 분 (물고기의 수와 크기에 따라, 이미징 챔버의 크기와 표면, 및 이미징 기간).
그림 1: 단계적 방식으로 생체 내 이미징을위한 열린 두개골 얼룩말 피시의 준비를위한 회로도 절차. 다른 단계에 대한 작업 지침은 그래픽 자체에서 찾을 수 있습니다. 플로리안 헤치가 디자인하고 폴 슈람이 디자인한 그래픽. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 관심의 뇌 영역 위의 피부와 두개골조각을 제거하기 위해 수행 된 미세 수술의 상세한 회로도 표현. 빨간색 원은 첫 번째 컷을 만들어야 하는 지점을 표시합니다. 적색 점선은 바늘과 함께 절단하는 최적의 경로를 묘사하여 소뇌에 대한 무료 접근을 손상시키지 않고 얻습니다. 녹색 화살표는 과도한 피부와 두개골 조각을 쉽게 밀어 넣을 수있는 방향을 표시합니다. 전체 절차 동안 뇌 조직에 침투하지 않도록하십시오. 성공적으로 피부를 벗겨 후, 관심의 뇌 영역 (여기, 소뇌) 생체 내 이미징에서 고해상도의 모든 종류에 자유롭게 액세스 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
그림 3A,C 형질 전환선 Tg의 14dpf 애벌레 표시[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] 두개골은 여전히 그대로. 과부하 피부의 안료 세포는 머리 전체에 분포되어 관심 영역에서 형광 신호를 방해하고 있습니다 (여기, 소뇌). 이 조건에서 애벌레와 함께, 뇌의 고해상도 이미지를 얻을 수 없습니다. 그림 3B 열린 두개골 수술을 수행 한 후 동일한 형질 전환선의 애벌레를 보여줍니다. 관심 영역은 이제 발산 레이저와 방출 형광 광에 대한 자유롭게 액세스 할 수 있습니다 흩어지고 반사되지 않고 조직을 관통. 이 유충의 사진으로 인해 상세한 고해상도 이미지가 생성됩니다(그림 3D) 고립 된 뇌의 이미지와 비교하지만, 뇌가 여전히 완전히 활성화되어 있다는 장점이 있습니다. 추가적으로, 두뇌는 일반적으로 파라 포름알데히드로 고정에 기인할 어떤 형광 강렬든지 분실하지 않습니다, 고정되고 심어진 두뇌를 위한 케이스일 것입니다. 두개골이 열린 유충에서, 따라서, 여전히 모든 생리적 연결을 포즈와 감각 시스템에서 정상적인 입력을수신 완전히 활성 뉴런과 자유롭게 접근 할 수있는 뇌, 그것은 또한 단기 이벤트를 관찰 할 수있을 것입니다, 예를 들어, 시냅토 발생, 척추 성장, 수지상 / 축삭 이동 또는 로컬 mRNA 발현16 생리학적 조건하에서. 이 방법의 또 다른 장점은, 피부와 두개골 또는 혈액 뇌 장벽으로 인한 확산 문제없이 살아있는 애벌레에 미치는 영향을 조사하기 위해 다른 약리학적 물질의 적용에 적합하다는 것입니다, 이는 일반적으로 뇌를 관통하는 물질을 방해할 것이다 (그림 3E). 이를 입증하기 위해, 열린 두개골을 가진 14 dpf 애벌레는 Hoechst-33342 (ACSF에서 5 μg /mL)로 10 분 동안 배양된 다음 이미지화되었습니다 (그림 3F-나는). 그림 4A,B 두개골을 열기 전과 후에 30 dpf 오래된 애벌레를 보여줍니다. 이 메서드에 대 한 지금까지 테스트 하는 가장 진보 된 타임 포인트입니다. 유충의 이러한 발달 단계에서도, 여기에 기재된 방법을 사용하여 단일 뉴런및 세포전 구획의 고해상도 이미지를 얻을 수 있다(그림 4C,D). 이 30 dpf 오래된 애벌레는 화상 진찰의 1 시간 후에 활동 적자를 보여주지 않았습니다. 이 방법은 또한 30dpf 오래된 애벌레의 전기 생리학적 패치 클램프 분석에 사용되며 Purkinje 세포에서 뉴런 활성의 손실에 대한 징후가 없다 (아직 표면에 가까운 세포는 섬세하고 취약) 오픈 두개골에 내장되는 처음 60 분 동안. 혈류량을 정기적으로 검사함으로써 애벌레가 여전히 건강한 상태임을 확인할 수 있습니다. 이 상태는 장기 이미지 녹화 중에 ACSF를 정기적으로 교환하거나 산소화하여 유지할 수 있습니다. 따라서 유충이 여전히 기능성 뇌 연구에 적합한지 여부를 확인하는 것은 매우 간단합니다. 증명하기 위해, 마이크로 수술 중에 어떤 중요한 혈관이 손상되지 않으며 또한이 방법은 뇌 조직에 흥분 레이저 빛의 훨씬 더 깊은 침투와 광자의 반사 감소 방출, 형질 균주 Tg의 10 dpf 오래된 애벌레 (flk1:mCherry)y206Tg17 이 방법으로 분석하였다. 이 물고기는 내피 세포에 있는 적색 형광 단백질 mCherry의 발현 때문에 두뇌에 있는 형광 혈관을 포함합니다. 깊이 245 μm을 덮는 이미지 스택의 최대 강도 투영은 중간 및 힌드뇌를 통해 구불 구불 구불 혈관의 복잡한 네트워크를 드러낸다(그림 5A). 더욱이, 이미지 스택의 깊이 값의 컬러 코딩은 거의 250 μm에서 뇌에 깊이 부리된 혈관조차도 명확하게 보이고 추적할 수 있음을 보여줍니다(그림 5B). 보충 비디오 1A 충분한 혈액 공급과 건강한 두뇌를 보여줍니다, 동안 보충 비디오 1B ACSF의 교환의 부족과 중간 산소의 부족으로 인해 손상 된 혈류와 뇌를 보여줍니다.
그림 3: 제브라피시 애벌레의 피부 박리는 생체 내 뇌 이미징에 최적의 액세스를 제공합니다. 공초점 현미경 분석 14 dpf 오래된 형질 전환 Tg (-7.5ca8:GFP]bz12 애벌레. 비껍질(A,C)과피부껍질(B,D)표본의 중간 및 뒤뇌에 대한 개요는 각각 20배 및 40배율로 나타났다. 후자의 경우, 안료의 부족은 명확하게 이미지 품질을 향상시키고 소뇌에서 형광 Purkinje 세포의 상세한 이미지 기록을 할 수 있습니다. 세포전 영상과 뇌에 대한 화합물 투여의 용이성은 Hoechst-33342(ACSF에서 5 μg/mL)를 사용하여 핵산 형광 염색으로 10분 배양 기간에 의해 입증된다. 피부 세포만이 이 염료를 비껍질을 벗긴 애벌레(E)에 통합하는 반면, 피부가 들어 올린 시편은 뇌 전체에 핵의강렬한 라벨링을표시(F)GFP-형광 퍼킨제 뉴런(H, 합병된 이미지) GFP-형광 퍼킨제 뉴런(H, 63x 광학 및 4배 디지털 배율)에 통합한다. 스케일 바: A-F: 100 μm, G-I: 5 μm. 유충은 머리를 왼쪽으로 박혀 있었고, 등은 위로 올라갔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 피부 박리 청소년 제브라피시에 생체 내 뇌 이미징에 대한 액세스를 확장합니다. 30dpf 오래된 형질전환 Tg (-7.5ca8:GFP]bz12Tg 청소년의 공초점 현미경 분석. 비껍질을 벗긴(A)및 피부 껍질을 벗긴 시편의 중간 및 뒷뇌에 대한 개요는 각각 4배 디지털줌(D)으로10x(B) 및 40x(C) 및 63배 광학 배율로 피부 껍질을 벗긴 시편을 볼 수 있다. 안료 피부의 제거는 연속 소뇌 Purkinje 세포 층의 세포 조직의 시각화를 가능하게하고 개별 뉴런(D,백색 화살표)의 투영을 묘사할 수 있습니다. 스케일 바: A-C: 100 μm, D: 5 μm. 유충은 머리를 왼쪽으로 박혀 있었고, 등은 위로 올라갔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 피부 제거는 10 dpf 오래된 Tg (flk1:mCherry)y206Tg 제브라피시 애벌레에서 연장 된 깊이에서 뇌 혈관 재구성을 허용합니다. (A)이미지 스택의 최대 강도 투영(총 거리 245 μm, 20배 광학 배율의 두께 245개 영상)은 이러한 뇌 영역 전체에 혈관의 연속 네트워크를 표시한다. (B)깊이 색상 코딩은 혈관의이 네트워크가 200 μm 이상의 깊이에서 모니터링 할 수 있음을 보여줍니다. 자동 불발성과 반사를 제거하기 위해 눈은 검은 색으로 가려졌습니다. 스케일 바: 100 μm. 유충은 머리를 왼쪽으로 박혀 있었고, 등은 위로 올라갔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 유리 모세 혈관으로 만든 바늘. (A)두 개의 서로 다른 바늘 풀러로부터 얻어진 두 개의 바늘 유형이 표시됩니다. 팁이 충분한 안정성을 제공하고 피부 / 두개골과 접촉 할 때 파손을 피하기 위해 너무 길지 않는 것이 중요합니다. 그러나 깨끗한 가장자리로 컷을 만들 수 있도록 충분한 선명도가 필요합니다. (B)바늘 풀러에 적재되는 모세관의 이미지가 표시됩니다. 스케일 바는 250 μm입니다. 모세관 길이: 100mm; OD: 1.5 mm: ID: 0.84 mm; 필라멘트: 네. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1: 이미징 7dpf 오래 된 애벌레. (A)뇌 위의 피부가 제거된 후 10분 후 7dpf 의 오래된 애벌레로부터 실시간 영화 녹화(30fps)가 제거되었다. 생생한 혈류는 충분한 혈액 공급을 가진 건강한 상태를 나타냅니다. (B)ACSF의 교환 없이 미세 수술 후 2시간 동안 보조 비디오 1A에 도시된 동일한 7dpf 오래된 애벌레로부터 의 실시간 영화 기록(30fps)이 ACSF및 중간 산소의 부족. 스케일 바: 100 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 방법은 생체 내 환경에서 뉴런의 고해상도 이미지를 기록하기 위한 색소 침착을 억제하는 약제와 함께 뇌 격리 또는 제브라피시 애벌레의 치료에 대한 대체 접근법을 제공한다. 이 방법으로 기록 된 이미지의 품질은 이식 된 뇌의 이미지와 유사하지만 자연 조건에서도 마찬가지입니다.
더욱이, 형광의 강도의 손실은 고정제(18)로치료에 대한 필요가 없기 때문에 피한다. 또한,이 방법은 뇌를 고립시키는 것만큼 침략적이지 않으며 실패로 이어질 수있는 하나의 중요한 단계로 만 구성되므로 성공적인 준비의 기회는 뇌 농장에 비해 높습니다. 가장 중요한 장점은 이 방법이 생체 내 이미지 레코딩에 적합하다는 것입니다. 두개골 개구부가 정밀하고 빠르며 성공적이며 ACSF의 산소 포화도가 정기적으로 모니터링되는 경우 뇌는 몇 시간 동안 완벽하게 기능적이고 실행 가능해야 합니다. 전기 생리학적 기록, 혈액 순환, 호흡 및 물고기의 생존을 며칠 동안 기준으로, 우리는 피부와 두개골 제거가 전반적인 건강에 크게 해롭지 않다고 생각합니다. 따라서, 이 방법은 이미지 방해 착색없이 건강하고 기능적인 두뇌에 있는 세포 및 세포 외 과정의 실시간 화상 진찰에 이용될 수 있습니다. 이 방법은 우리의 실험실에서 생체 내의 신경 활성의 전기 생리학적 기록에 사용되는 표준 절차이며 또한 전 세계 다른 전기 생리학 실험실에서 잘 확립되어있으며,20,21,22,뇌의 기능이 미세 수술에 의해 손상되지 않음을 증명한다. 언급해야 할 한 가지 단점은이 접근법이 등쪽 및 측면 뇌 영역의 이미징에만 적합하며 동일한 표본으로 반복적으로 수행 할 수 없다는 것입니다.
그러나, 실험에 완전 기능뇌가 필요한 경우 산소 포화도를 영구적으로 모니터링해야 하며, 필요한 경우 이미징 챔버의 ACSF를 갓 산소로 처리한 ACSF로 교환해야 한다. 즉, 장기 레코딩의 경우 소형 펌프를 사용하여 해결할 수 있는 이미징 절차를 방해하지 않으면서 사용된 ACSF를 산소 포화 ACSF와 교환할 수 있는 옵션이 필요합니다.
참고, 마이크로 수술이 정확하거나 부정확하게 수행되지 않으면 뇌 손상이나 뇌 출혈로 인해 뇌 생리학이 손상됩니다. 또한, ACSF에서 낮은 산소 포화도(보충 비디오 1참조) 또는 이 전체 절차 동안 애벌레에 대한 너무 많은 스트레스는 뇌에 부정적인 영향을 미칠 수있습니다(23,24). 따라서 이 방법은 고처리량 분석에 적합하지 않고 시간당 몇 개의 애벌레만의 세로 또는 매우 상세한 이미지 레코딩에 적합합니다. 따라서, 이 방법은 높은 처리량에 약물 검열을 겨냥해서는 안됩니다, 그러나 고해상도 화상 진찰이 유익하고 필요한 세부적으로 유망한 약리학 화합물을 특성화하거나 검증하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 적절한 뇌 건강 상태를 보장하기 위해, 시험 당 세 애벌레의 수를 초과하지 않는 것이 좋습니다.
열린 두개골을 통해 혈액-뇌 장벽을 통과하지 않고도 뇌 조직에 물질을 직접 적용할 수도 있습니다. 전반적으로, 여기에서 기술된 방법은 - 현재 생체 내 전기 생리학에 적용되고 - 제브라피시 애벌레와 청소년에 있는 생체 내 두뇌 화상 진찰 및 광유전학의 아주 넓은 필드에 있는 높은 잠재력을 가진 기술이고 신경 약리학 접근과 결합될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 특히 훌륭한 동물 보호와 헤르만 도링, 모하메드 엘세이, 솔 포즈- 멘데스, 야콥 폰 트로타, 코말리 발리셰티, 바바라 윈터에게 도움을 준 티모 프리치에게 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 의견에 대한 Köster 연구소의 다른 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 독일 연구 재단 (DFG, KO1949/7-2) 프로젝트 241961032 (RWK) 및 분데스 장관 퓌르 빌둥 und Forsung (BMBF)에 의해 부분적으로 투자되었다; 에라넷 뉴런 II CIPRESS 프로젝트 01EW1520 ~ JCM)이 인정된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
