Summary
我们描述了使用猪角膜来测试实验药物的抗病毒功效。
Abstract
病毒和细菌可通过角膜感染导致各种眼部表面缺陷和退化，如伤口和溃疡。由于血清超常范围为全球 60-90%，单纯疱疹病毒类型-1 （HSV-1） 通常会导致或非酸性区域的粘皮病变，这也表现为病变和感染相关失明。虽然目前的抗病毒药物是有效的，但耐药性和持久性毒副作用的出现需要开发针对这种无处不在的病原体的新型抗病毒药物。虽然体外评估提供了一些有关新兴抗病毒药物的功能数据，但它们并不显示体内眼组织具有复杂性。然而，在体内研究是昂贵的，需要训练有素的人员，尤其是当与病毒剂工作。因此，前体内模型是高效但廉价的抗病毒测试步骤。在这里，我们讨论一个协议，研究感染HSV-1使用猪角膜前体内和方法，以治疗他们使用现有的和新的抗病毒药物。我们还演示了使用 HSV-1 进行斑块检测的方法。详细的方法可用于进行类似的实验，以研究类似于HSV-1病原体的感染。
Introduction
患有眼部感染的人经常会出现视力丧失1。由于全球血清高超常，HSV感染者患有复发性眼部感染，导致角膜疤痕、频闪角膜炎和新血管化2、3、4、5。HSV感染也显示导致较少的频率，免疫功能低下，未经治疗的患者，如脑炎和系统性发病率6，7，8的一系列严重情况。像Acyclovir（ACV）及其核苷类比这样的药物在抑制HSV-1感染甚至控制重新激活方面已经取得了一致的成功，然而这些药物的长期使用与肾衰竭、胎儿畸形和未能限制抗药性对进化的病毒株9、10、11、12、13的产生有关。与HSV-1眼部感染相关的复杂性，以前曾使用人类角膜细胞的单层和3D培养物进行体外研究，并使用穆林或兔眼感染进行体内研究。虽然这些体外模型提供了关于HSV-1感染的细胞生物成分的重要数据，但是，它们不能模仿角膜组织的复杂复杂性，也无助于照亮病毒的树突传播。相比之下，虽然体内系统在显示 HSV-1 感染期间角膜感染传播和免疫激活反应方面更有见地，但它们确实附带了警告，即它们需要训练有素的研究人员和大型动物护理设施来忽略实验。
在这里，我们使用猪角膜作为前体内模型来检查HSV-1感染诱发的伤口系统。通过组织外植培养，可以研究某些药物的潜在药理学以及感染引起的伤口系统的细胞和分子生物学。该模型也可以修改为用于其他病毒和细菌感染。在这项研究中，猪角膜被用来测试临床前小分子BX795的抗病毒功效。由于容易获得和成本效益，更倾向于使用猪角膜。此外，猪角膜模型是人眼的良好模型，角膜易于分离，适合感染和可视化，坚固耐用，可处理15。猪角膜也可与人类角膜模型在跨角膜渗透性和全身吸收15的复杂性相媲美。通过使用这个模型进行研究，我们能够阐明BX795作为HSV-1病毒感染的称职抑制剂如何值得进一步研究，并增加了将其分类为潜在的小分子抗病毒化合物16的文献。
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Protocol
这项研究中使用的所有猪组织都由第三方私人组织提供，伊利诺伊大学芝加哥分校的人员没有对动物进行处理。
1. 材料
-
试剂
- 使用以下试剂进行普拉克检测：粉末甲基纤维素、杜尔贝科改良鹰的介质（DMEM）、胎儿牛血清（FBS）、青霉素和链霉素（P/S）用于普拉克检测。
- 使用水晶紫罗兰片剂和乙醇（分子生物学等级）为斑块检测准备水晶紫罗兰溶液。
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维罗细胞生长介质 - DMEM 全媒体
- 打开组织培养罩内的 DMEM 介质瓶。使用血清移液器从瓶子中取出 55 mL 的介质并丢弃它。将 50 mL 的 P/S FBS 添加到 DMEM 中。在 4 °C 下冷藏。
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斑块检测介质 - 库存 5% 甲基纤维素介质
- 测量2.5克甲基纤维素粉末，在500毫升玻璃瓶内用搅拌磁铁将其高压灭菌。瓶子冷却到室温后，取500毫升含有50毫升FBS和5毫升P/S的DMEM全媒体，并将其添加到含有甲基纤维素的玻璃瓶中。
- 使用磁搅拌器在 4 °C 下搅拌 2 天。在 4 °C 下冷藏。
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切除猪角膜的媒体准备
- 在组织培养罩内打开最小必需介质 （MEM） 瓶。使用血清移液器从瓶子中丢弃 10 mL 的 MEM。
- 在介质中加入 5 mL 胰岛素转移素 -钚 （ITS） 和 5 mL 抗菌抗生素 （AA），并在 4°C 下冷藏。
-
水晶紫罗兰的主和工作库存：
- 要制作水晶紫罗兰库存溶液，在水中加入 1 克 1 克水晶紫罗兰粉，加入 100 mL 的 20% 乙醇。此库存（1% w/v 水晶紫罗兰）可存储和使用长达一年，当存储在黑暗的地方。
- 要从中制作工作库存，在 350 mL 水中添加 50 mL 的原始库存溶液。在此溶液中加入 100mL 乙醇，使 500 mL 工作晶体紫罗兰溶液（0.1% w/v 水晶紫罗兰）。
注：这两种解决方案都需要存储在黑暗中。
2. 程序
- 从全眼分离的猪角膜17
- 收到合适的供应商的猪眼后，如果组织处理出现延迟，如 图1所示，储存在冰上。
- 确保在此过程中使用和佩戴个人防护设备，以避免污染和因体外幽默溢出而发生事故。
- 用 70% 乙醇喷洒工作区域以进行清洁和消毒。为了确保工作空间稳定，将长凳盖和胶带安全地铺在两侧，如图 2所示。
- 将猪眼放在纱布上（图3）。使用50毫米纱布，用一只手握住图4B中所示的猪眼后部（图4A）。
- 用30G针，轻轻地在眼睛上皮表面的大约中心仔细戳一下，确保频闪没有损伤（图5）。戳应限制在上皮 （+100-200 μm）， 以避免频闪参与。
- 使用锋利的绝育刀片，在离角膜 1 毫米远的硬囊上做一个小切口。切开角膜的边缘，确保边缘幽默不会泄漏使用快速和流畅的手旋转动作（图6A）。通过用扁平的钳子将角膜固定在角膜边缘，使用刀片切断眼睛的剩余系绳膜（图6B）。
- 取角膜，放在一个12井板覆盖2mL角膜介质。角膜应朝上放置，在图 7A-D、 图 8中的一系列步骤中演示。
- 将含有 5 x 105 斑块形成单元 （PFU） 的 5 μL 病毒溶液添加到角膜表面的脱脂部位。将含有受感染猪角膜的 12 井板放入孵化器中，5% CO2 为 72 小时。
- 喷洒任何额外的眼睛不用于实验10%漂白剂，并安全地处置在生物危害袋。
- 可视化
注：在添加药物之前，应每天对病毒进行可视化。- 打开立体显微镜和 LED 光源，让机器灯在成像角膜之前预热。小心地将角膜板带到仪器上，而不会干扰溶液。更改过滤器，以便 GFP（380-460 nm）用于查看标本。将曝光时间设置为 500 ms 以捕获图像。
- 首先，将角膜板放在立体镜下，以 7.5 倍的最低放大倍率捕捉图像。跟进一系列增加的放大图像（例如，15 倍、25 倍、35 倍），以便清晰地可视化所有病毒传播和树突形成
- 确保将受感染的角膜返回组织培养孵化器，并保存拍摄的所有图像。
- 病毒感染量化
注：应每天评估猪角膜的病毒滴答声，以分析药物治疗的效果。- 为了量化病毒，如果使用6井板，则以每口井5×105 个细胞的密度播种Vero细胞，就像在实验中所做的那样。在感染前一天这样做。在一夜之间孵育镀细胞，以确保它们为病毒定量而汇流。
- 阿里奎特 500 μL 的无血清介质成多个微中心管。插入无菌棉尖拭子浸入血清自由介质填充管。棉签需要浸湿至少5分钟才能使用。
- 在不干扰底层媒体的情况下，将受感染的猪角膜板运送到生物安全柜中。使用湿棉签，顺时针旋转3圈，逆时针旋转3圈，直径为5毫米，从受感染的猪角膜中心，不施加过大的压力。
- 将棉签插入无血清介质填充微中心管中，顺时针和逆时针旋转5次。棉签的金属尖端应剪短，使其完全适合微中心管，盖子可以关闭。
- 将含有棉尖的微中心管高速放置在涡流机和漩涡上1分钟。
- 通过对这些样本的斑块检测进行病毒量化。
注：此量化步骤需要在感染后的第 2 天、第 4 天和 6 天内可选执行。
- 病毒定量由普拉克检测
注意：进行斑块检测，将 Vero 细胞培养并板入 6 井板，并确保在开始检测之前细胞的 90% 汇合。使用这些细胞的汇流75厘米2 烧瓶。下面的所有步骤都需要在生物安全柜内执行。- 吸气培养基后，用 10 mL 的新鲜磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗烧瓶中 Vero 细胞的汇流单层。吸气第一组洗涤液后，再次用 PBS 重复洗涤步骤。
- 在细胞单层添加 1 mL 0.05% 的 Trypsin。在 37 °C 下孵化烧瓶 5 分钟。用肉眼，确保细胞与烧瓶内部表面分离。如果没有，请再等 5 分钟，然后再检查烧瓶。当细胞看起来分离时，将整个介质的 9 mL 添加到单层，以确保细胞完全从烧瓶表面脱落。
- 收集所有细胞从烧瓶与整个媒体，并把它们放在一个15mL离心机管。
- 对于用于斑块检测的 6 井板中的每一口井，请使用离心机管中的 300 μL。用 2 mL 的整层媒体充值 6 井板的每口井。将板材留在孵化器中过夜，使其在每个井中生长并形成一个汇合层。
- 为了进行斑块检测，在病毒量化之前需要对样本进行连续稀释。
- 使用无血清介质在微型离心机管中对病毒进行101 倍的日志稀释，直到达到10-8 的稀释。当在10-3 稀释时，将1 mL的稀释转移到镀金细胞的单层后，从6井板吸气细胞的生长介质，这将是感染步骤。在 37 °C 孵化器下将受感染的板孵化 2 小时。
- 吸气现有的感染介质，用PBS轻轻清洗两次，涂覆细胞，并在所有6口井中每口井加入2兆L甲基纤维素。孵育72小时或直到斑块形成可见。细胞单层细胞之间的小缝隙形成可以识别斑块。
- 将1mL甲醇慢慢添加到每口井的一角，用墙壁作为引导尖。在室温下将6井板孵育15分钟。慢慢地从盘子里吸出每口井中的内容，而不会干扰或搅动细胞单层。
- 在 6 井板的每口井中加入 1 mL 的水晶紫罗兰工作解决方案，确保所有细胞都覆盖。在黑暗中孵育6井板30分钟。通过吸气和干燥吸水纸上的油井来丢弃水晶紫罗兰溶液。
- 计算最高稀释井下的斑块数量，以量化启动溶液中的病毒总含量。重复两次过程以确认病毒滴答声。
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Representative Results
为了了解实验抗病毒药物的功效，在进行人体人体临床试验之前，需要对它们进行广泛的测试。在这方面，必须确定正控、阴性控制和测试组。三氟二甲胺（TFT）长期以来一直被用作治疗疱疹角膜炎的首选治疗方法。作为阳性控制，TFT治疗的角膜组显示感染传播较低。作为负控制，我们使用 DMSO 或溶解在 PBS 中的车辆控制。BX795，实验性临床前药物是测试组。每组共分配了4个角膜，每天在猪角膜上添加3次药物。我们使用立体荧光成像的结果表明，BX795的抗病毒功效与TFT在控制病毒传播方面相似。病毒在我们的研究中传播可以通过成像立体镜中的绿色荧光通道来可视化。我们观察到，车辆只治疗阴性对照组角膜显示病毒在初始病毒接种后6天内从中央感染区传播到其周围，而两种药物（BX795和TFT）在第4-6张图像（图9A）中清除了感染。同样，在感染后的第2天和第4天拍摄的眼拭子显示，在阳性控制和BX795治疗样本中完全抑制病毒，而在阴性对照组观察到感染病毒滴答声急剧增加（图9B）。
图1：猪眼一直放在冰上，直到组织被处理。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2：工作台设置。请点击这里查看此图的较大版本。
图3：猪眼放在纱布上。请点击这里查看此图的较大版本。
图4：猪眼配30G针图。请点击这里查看此图的较大版本。
图5：30 G针头使用：上皮表面中心打的洞。请点击这里查看此图的较大版本。
图6：使用锋利的消毒刀片（A，B）在角膜边缘周围切割的旋转动作。请点击这里查看此图的较大版本。
图7： 角膜图像。（A、B） 角膜最后用锋利的剪刀切开（C） 孤立的角膜是由钳子（D）完全隔离的角膜， 准备使用 请点击这里查看此图的较大版本。
图8：将角膜放置在12井板中，孵育72小时。请点击这里查看此图的较大版本。
图9：感染过程中病毒传播的进展。 新鲜排出的猪角膜感染HSV-1 17-GFP和（A）图像使用显微镜在感染后第2天，第4天和第6天。感染后的第 2 天开始使用 DMSO、TFT 或 BX795 进行局部治疗。（B） 使用从维罗细胞上的猪角膜中取出的拭子进行斑块检测。进行了双向 ANOVA 测试，以了解治疗组之间的显著差异。n=4，***p=0.0001。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
先前的研究表明，BX795作为抗HSV-1感染的抗病毒药物具有很有前途的作用：通过抑制坦克绑定激酶1（TBK1）16。TBK1和自噬在帮助抑制HSV-1感染方面都起到了一定的作用，这表现在人类角膜上皮细胞上。BX795在浓度为10μM的抗病毒活性方面被证明是最大的有效，并且使用西方斑点分析和关键病毒蛋白的病毒斑块分析，BX795被证明可以抑制HSV-1感染，与TFT16的活动相当。对猪角膜的研究遵循了同样的分析，并取得了与上述类似的结果：BX795 在抑制感染方面与 TFT 一样有效 - 感染第 4 天和第 6 天拍摄的猪角膜图像显示 TFT 和 BX795 的可比结果。进行对分泌病毒物进行量化的斑块分析也强化了这些发现。BX795在体外也显示出抗病毒作用，它在体内的小鼠模型中也显示出抑制角膜HSV-1感染的特异性。
这项研究有助于建立BX795作为一个有效和领先的化合物，用于广谱抗病毒应用对HSV-1感染。通过展示其在猪模型的功效，可与TFT相媲美，BX795将在多个感染模型16中取得成功。此外，BX795是重要的，因为它已被证明对多种病毒株有效，甚至HSV-1 （KOS）tk12，这是耐另一种广泛使用的药物环丙酮 （ACV）16.BX975治疗细胞很少表现出HSV-1病毒蛋白gB的表达，这证明其HSV-1病毒的抑制作用。与其他治疗和抗疱疹病毒疗法相比，BX795 在低剂量下也表现出更好的抗病毒功效。此外，BX795的治疗浓度（甚至建议浓度为10μM）对细胞没有不良细胞毒性 - 无凋亡诱因和细胞死亡，这再次可与TFT控制16相提并论。
协议部分的关键步骤包括将猪角膜与整个眼睛隔离。这涉及到用针头在眼睛中心角膜的脱皮，并且几乎不需要任何力来确保没有频闪介入，然后轻轻地从眼部表面切除角膜，而不会干扰虹膜。另一组关键步骤包括涉及预润湿棉尖和擦拭角膜表面的部分。运动应温和，以确保角膜上皮不会从眼部表面脱落。
可以对上皮脱毛步骤进行修改。实验者不用30G针头在角膜中心做一次戳，而是可以用无菌刀片或30G针轻轻地使角膜上皮有网格形状的划痕。这确保了对上皮的强力感染。
猪角膜应在采购当天使用，不应停留超过24小时。猪角膜在冰中保存超过4小时将导致虹膜粘在角膜上。这使得在切除过程中很难将角膜与眼睛的其他部位分离。不是所有的猪角膜都会被感染。实验者应感染每组至少5只眼睛，然后在感染后的第2天采摘同样受感染的角膜，以继续实验。
目前技术的意义涉及在人类角膜上使用猪的成本效益。该技术也很重要，因为与人类角膜相比，角膜的相对新鲜度。
当前技术的未来应用包括但不限于其用于测试药物渗透性研究、前活体药理动力学和药理动力学研究。除了抗病毒药物外，猪角膜还可用于检测抗菌和抗真菌药物。角膜也可用于前体内伤口愈合检测，以研究糖尿病伤口。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突，也没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究得到了国家卫生研究院向D.S.A.提供的F30EY024710、RO1 AI139768和RO1 EY029426的资助，并得到了国家眼科研究所F30EY025981赠款的支持。研究使用从公园包装公司获得的猪角膜进行，4107阿什兰大道，新城，芝加哥，IL-60609
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers --80 °C. - | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | - | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium - ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium - MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | Special order by request | |
| Procedure bench covers - as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
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