Summary
実験薬の抗ウイルス効果を試験するためのブタ角膜の使用について述べる。
Abstract
ウイルスや細菌は、角膜感染を通じて様々な眼表面欠陥や創傷や潰瘍などの変性を引き起こす可能性があります。世界の60〜90%の範囲の血清過率で、単純ヘルペスウイルスタイプ1(HSV-1)は、一般的に病変および感染関連失明としても現れる口顔面領域の粘膜皮病変を引き起こす。現在の抗ウイルス薬は有効ですが、毒性副作用の耐性と持続性の出現は、このユビキタス病原体に対する新しい抗ウイルス薬の開発を必要とします。in vitro評価は、新たな抗ウイルスに関する機能的なデータを提供するが、生体内の眼組織の複雑さを示すものではありません。しかし、in vivo研究は高価であり、特にウイルス剤を扱う場合には訓練を受けた人員を必要とする。したがって、ex vivoモデルは、抗ウイルス検査のための効率的でありながら安価なステップです。ここでは、ブタコルネエクスビボを用いてHSV-1による感染を研究するプロトコルと、既存および新規の抗ウイルス薬を用いてそれらを局所的に治療する方法について議論する。また、HSV-1を用いてプラークアッセイを行う方法も実証する。詳細な方法は、HSV-1病原体に似た感染症を研究するために同様の実験を行うために使用することができる。
Introduction
眼感染症に罹患している人は、しばしば視力低下1を起こします。世界的に高い血清威容性を持つHSV感染者は、角膜瘢痕化、間質角膜炎および新血管新生症に至る眼感染症の再発に苦しむ2、3、4、5。HSV感染はまた、より少ない頻度を引き起こすことが示されている、免疫不全の間で重篤な状態の範囲、脳炎および全身性罹患率6、7、8のような未治療の患者。アシクロビル(ACV)およびそのヌクレオシド類似体のような薬物は、HSV-1感染を抑制し、再活性化を制御することに一貫した成功を示していますが、これらの薬物の長期使用は腎不全、胎児の異常および進化するウイルス株9、10、11、12、13に対する薬剤耐性の出現を制限する失敗に関連している。HSV-1眼感染症に関連する複合体は、マウスまたはウサギの眼感染症を用いてヒト角膜細胞の単層および3D培養物および生体内でのインビトロで以前に研究されてきた。これらのin vitroモデルはHSV-1感染の細胞生物学的構成要素に関する重要なデータを提供するが、しかし、角膜組織の複雑な複雑さを模倣できず、ウイルス14の樹状拡散を照らすことはほとんどしない。対照的に、in vivoシステムは、HSV-1感染中に角膜および免疫活性化応答で感染が広がっていることを示す上でより洞察力があるが、実験を見落とすために訓練を受けた研究者と動物ケアのための大規模な施設が必要であるという警告が付属している。
ここでは、HSV-1感染誘発創傷系を調べるために、ブタ角膜をex vivoモデルとして使用します。特定の薬物の潜在的な薬理学だけでなく、感染によって引き起こされる創傷系の細胞および分子生物学の両方を組織外植物培養を通じて研究することができる。このモデルは、他のウイルスおよび細菌感染の使用についても修正される可能性があります。本研究では、ブタコーンネを用い、前臨床小分子BX795の抗ウイルス効果を試験した。ブタの角膜の使用は、アクセスの容易さと費用対効果のために好まれました。さらに、ブタ角膜モデルは、角膜が単離しやすく、感染および可視化のために十分な大きさで、15を処理するための堅牢な人間の目の良いモデルです。ブタ角膜はまた、トランス角膜透過性および全身吸収15の両方におけるヒト角膜モデルの複雑さに匹敵する。このモデルを用いて研究を行うことで、HsV-1ウイルス感染の有能な阻害剤としてBX795がさらなる調査に値する方法を解明し、それを潜在的な低分子抗ウイルス化合物16として分類する文献に加えた。
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Protocol
この研究で使用されるすべてのブタ組織は、第三者の民間組織によって提供され、動物の取り扱いのいずれもイリノイ大学シカゴ校の職員によって行われませんでした。
1. 材料
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試薬
- プラークアッセイの試薬として、パウダーメチルセルロース、ダルベッコの改変ワシ培地(DMEM)、ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン、ストレプトマイシン(P/S)を使用してプラークアッセイを行います。
- プラークアッセイ用の結晶紫色溶液を調製するために、クリスタルバイオレット錠剤とエタノール(分子生物学グレード)を使用してください。
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ベロ細胞増殖培地 - DMEM全メディア
- DMEMメディアボトルを組織培養フードの内側に開きます。血清ピペットを使用してボトルから55mLの培地を取り出し、捨てます。50 mLのP/SのFBSをDMEMに加えます。4°Cで冷蔵する。
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プラークアッセイ媒体 - メチルセルロース培地の在庫5%
- メチルセルロース粉末の2.5gを、500 mLガラス瓶内の攪拌磁石で測定し、オートクレーブします。ボトルが室温まで冷却した後、50 mLのFBSと5mLのP/Sを含むDMEM全体の培地を500mLとし、メチルセルロースを含むガラス瓶に加えます。
- 磁気攪拌機を使用して、これを4°Cで2日間撹拌します。4°Cで冷蔵する。
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切除されたブタ角膜の培地調製
- ティッシュ培養フードの中に最低限必要なメディア(MEM)ボトルを開きます。血清学的ピペットを使用してボトルからMEMの10 mLを捨てます。
- 培地に5mLのインスリントランスフェリンセレン(ITS)と抗ミキサンク抗菌剤(AA)5 mLを加え、4°Cで冷蔵します。
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クリスタルバイオレットのマスターと作業ストック:
- 水晶紫色のストック液を作るために、水に20%エタノールの100 mLに1gの水晶紫色粉末を加えます。このストック(1%w/vクリスタルバイオレット)は、暗い場所に保管すると最長1年間保存して使用できます。
- この中から作業ストックを作るために、350 mLの水に50mLのオリジナルストック液を加えます。この溶液に100mLのエタノールを加えた場合、500 mLの働く結晶バイオレット溶液(0.1%w/v水晶紫色)を作ります。
注: これらのソリューションはどちらも暗闇の中に保存する必要があります。
2. 手順
- 目全体からの豚の角膜の分離17
- 適切なベンダーからブタの目を受け取った後、 図1に示すようにティッシュ処理に遅れがある場合は氷の上に保管する。
- この手順では、個人の保護機器を使用して、汚染や、膜炎のユーモアのこぼれによる事故を避けてください。
- 作業領域に70%エタノールをスプレーして、洗浄し、消毒します。作業スペースが安定していることを確認するには、ベンチカバーを広げ、テープを側面にしっかりと広げて 、図2に示すようにします。
- ガーゼにブタの目を置く(図3)。50mmガーゼを使用して、図4Bに示すようにブタの目の後部(図4A)を片手で保持します。
- 30G針で、目の上皮表面の中心を丁寧に1本軽く突き刺し、間質に損傷がないことを確認する(図5)。間質の関与を避けるために、ポークは上皮(〜100〜200 μm)に限定する必要があります。
- 鋭い滅菌ブレードを使用して、角膜から1mmの距離でスクレラに小さな切開を行います。角膜の縁を切り、手の素早く滑らかな回転作用を使用して、膜炎のユーモアが漏らないようにします(図6A)。角膜スクレーラエッジを平坦なトゥイザーで保持することにより、ブレードを使用して残りのテザリング膜を切断する(図6B)。
- 角膜を取り、角膜培地の2 mLを重ねた12ウェルプレートに入れ.角膜は、図7A-D、 図8の一連のステップで示され、上を向けて配置する必要があります。
- 角膜表面のデブリ部位に、17 GFPの5 x 105 プラーク形成ユニット(PFU)を含むウイルス溶液5μLを加えます。感染したブタの角膜を含む12ウェルプレートを、5%のCO2 を72時間インキュベーターに入れる。
- 10%漂白剤で実験に使用されていない追加の目をスプレーし、バイオハザードバッグにしっかりと配置します。
- 視覚化
注:ウイルスは、薬物の添加前に毎日視覚化する必要があります。- ステレオ顕微鏡とLED光源をオンにし、角膜をイメージングする前に機械のランプをウォームアップさせます。慎重に溶液を乱すことなく、インストルメントに角膜のプレートを運びます。GFP(380-460 nm)を使用して検体を見るようにフィルターを変更します。画像をキャプチャするには、露出時間を 500 ミリ秒に設定します。
- まず、角膜板をステレオスコープの下に置き、7.5倍の最も低い倍率で画像をキャプチャします。すべてのウイルスの広がりと樹状突起の形成が明確に視覚化されるような一連の拡大画像(例えば、15x、25x、35x)でこれをフォローアップ
- 感染した角膜を組織培養器に戻し、撮影したすべての画像を保存してください。
- ウイルス感染定量
注:ブタの角膜からのウイルス力価は、薬物治療の効果を分析するために毎日評価されるべきである。- ウイルスを定量化するために、この実験で行われた6ウェルプレートを使用する場合、ウェルあたり5 x 105 の細胞の密度でVero細胞をシードします。感染の前日にこれを行います.メッキされた細胞を一晩インキュベートして、ウイルス定量に合流していることを確認します。
- アリコート500 μLの血清フリー培地を複数のマイクロ遠心チューブに入れ.無菌綿の先端綿棒を無血清培地充填チューブに挿入します。綿棒は、使用前に少なくとも5分間浸漬し、湿潤する必要があります。
- 基礎となる媒体を妨げることなく、感染したブタの角膜板をバイオセーフティキャビネットに輸送する。湿った綿棒を使用して、過剰な圧力をかけることなく、感染したブタの角膜の中心から直径5mmで3回転を時計回りに、3回転を反時計回りにします。
- 綿棒を無血清培地に挿入し、マイクロ遠心チューブを充填し、時計回りと反時計回りに5回回転させます。綿棒の金属先端はマイクロ遠心チューブに完全に収まり、蓋を閉じることができるように短く切る必要があります。
- 綿棒の先端を含むマイクロ遠心チューブを渦マシンに、渦を高速で1分間に置きます。
- これらのサンプルにプラークアッセイを介してウイルス定量を行う。
注: この定量化ステップは、2日目、4日目、および必要に応じて感染後6日間に実行する必要があります。
- プラークアッセイによるウイルス定量
注:プラークアッセイを実行するには、ベロ細胞を6ウェルプレートに成長させ、プレートし、アッセイ開始前に細胞の90%の合流性を確保します。これらの細胞のコンフルエント75 cm2 フラスコを使用してください。以下のすべてのステップは、バイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。- 培養液を吸引した後、新鮮なリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)の10 mLでフラスコ中のベロ細胞のコンフルエント単層を洗浄する。洗浄液の最初のセットを吸引した後、PBSで再度洗浄ステップを繰り返します。
- セル単層に0.05%トリプシンの1 mLを加えます。フラスコを37°Cで5分間インキュベートします。肉眼で、フラスコの内側表面から細胞が切り離されていることを確認します。ない場合は、フラスコを再び調べる前に、さらに5分待ちます。細胞が剥離しているように見える場合は、1層に9mLのメディアを加え、フラスコ表面から細胞が完全に外れ出るようにします。
- フラスコから全ての細胞をメディア全体と一緒に集め、15 mL遠心分離管に入れる。
- プラークアッセイに使用される6つのウェルプレートのウェルごとに、遠心チューブから300 μLを使用してください。6ウェルプレートの各ウェルを2mLのメディアで上に上げなさい。プレートをインキュベーターに一晩放置して、成長し、各井戸にコンフルエント単層を形成できるようにします。
- プラークアッセイを行うためには、ウイルスの定量化前にサンプルを連続希釈する必要があります。
- 10-8の希釈に達するまで血清遊離培地を用いてマイクロ遠心管内でウイルスの丸11倍希釈を行う。10-3希釈時に、希釈液の1mLを、6ウェルプレートから細胞上の増殖培地を吸引した後のめっき細胞の単層に移し、これが感染工程となる。感染したプレートを37°Cインキュベーターで2時間インキュベートする。
- 既存の感染媒体を吸引し、PBSで2回静かに洗浄して細胞をコーティングし、メチルセルロースを含む培地を6つのウェルすべてに2mL添加する。72時間またはプラークの形成が見られるまでインキュベート。プラークは、細胞単層内の細胞間の小さな隙間の形成によって同定することができる。
- 各ウェルの隅に1mLのメタノールをゆっくりと加え、壁を導く先端として使用します。室温で6ウェルプレートを15分間インキュベートします。細胞単層を乱したり攪拌したりすることなく、プレートから各ウェルの内容物をゆっくりと吸引する。
- 6ウェルプレートのウェルに1mLの結晶バイオレット加工液を加え、すべての細胞が覆われていることを確認します。暗闇の中で6ウェルプレートを30分間インキュベートします。水晶の紫色溶液を吸引して捨て、吸収性紙の上でウェルを乾燥させます。
- 開始溶液中のウイルス総量を定量化するために、最も高い希釈ウェルでプラークの数を数えます。このプロセスを2回繰り返して、ウイルスの引き機を確認します。
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Representative Results
実験的な抗ウイルス薬の有効性を理解するには、生体内ヒト臨床試験のために送られる前に、広範囲にテストする必要があります。この点に関して、正の対照、陰性対照および試験群を同定しなければならない。トリフルオロチミジン(TFT)は、長い間、角膜炎を局所的に治療するための好ましい治療法として使用されてきた。陽性対照として使用され、TFT処置された角膜基は、より低い感染広がりを示す。陰性対照として、PBSに溶解したDMSOまたは車両制御を用いた。BX795は、実験前臨床薬を試験群であった。各グループに合計4つの角膜が割り当てられ、薬物は豚の角膜に毎日3回添加された。立体蛍光イメージングを用いた我々の結果は、BX795の抗ウイルス効果が、ウイルス拡散を制御するTFTと類似していることを示している。我々の研究におけるウイルスの広がりは、ステレオスコープ内の緑色蛍光チャネルを画像化することによって可視化することができる。我々は、負の対照群角膜のみを治療した車両が最初のウイルス接種後6日までに中央感染領域からその周辺にウイルスが広がっていることを観察したが、両方の薬物(BX795およびTFT)は4日目から6日目の画像(図9A)で感染をクリアした。同様に、感染後2日目と4日目に採取した眼綿棒は、陽性対照およびBX795処理サンプルにおけるウイルスの完全な阻害を示し、一方で感染性ウイルス力素の急激な増加が陰性対照群で観察される(図9B)。
図1: 豚の目は、組織が処理されるまで氷の上に留めてお きます。
図2:ワークベンチのセットアップ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ガーゼにポータシの目を置く。この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
図4:30G針の豚目を撮影した。 この図の大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
図5:30 G針を使用し、上皮表面の中心に穴を開けます 。
図6:鋭い滅菌ブレード(A,B)を使用して角膜縁の周りを切り取るために使用される回転アクションは、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: コルネア画像(A,B) 角膜は最終的に鋭いはさみを使用してカット(C)単離角膜はピンセット(D)完全に単離した角膜によって保持され、使用の準備は、 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:コルネアスを12ウェルプレートに入れ、72時間インキュベートした。
図9:感染過程でのウイルスの広がりの進行 切除したばかりのブタの角膜は、2日目、4日目、6日目の感染後に顕微鏡を用いてHSV-1 17-GFPおよび(A)画像化に感染した。DMSO、TFTまたはBX795による局所治療は、2日目の感染後に開始された。(B)プラークアッセイは、ベロ細胞上のブタ角膜から採取した綿棒を用いて行った。治療群間の有意な違いを理解するために、双方向ANOVA試験を実施した。n=4、 ****p=0.0001。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
以前の研究は、HSV-1感染に対する抗ウイルス剤として有望な役割を有することを示しているBX795;タンク結合キナーゼ1(TBK1)16を阻害することによって。TBK1とオートファジーの両方がヒト角膜上皮細胞で実証されるようにHSV-1感染を阻害する役割を果たしてきました。BX795は、10μMの濃度で抗ウイルス活性と最大に有効であることが示され、主要ウイルスタンパク質のウェスタンブロット分析およびウイルスプラーク分析の両方を用いて、BX795はTFT16の活性に匹敵するHSV-1感染を阻害することが示された。ブタの角膜に関する研究は、同じ分析に従い、上記のように同様の結果を得た;BX795は、感染を阻害するTFTと同じくらい効果的であることが示されている - 感染の4日目と6日目にブタ角膜を撮影した画像は、TFTとBX795の両方で同等の結果を示す。分泌されたビリオンを定量化するために実施されたプラークアッセイもまた、これらの知見を補強する16。BX795はまた、インビトロで抗ウイルス作用を有することを示しており、その使用は生体内のマウスモデルにおける局所的に、また角膜HSV-1感染16の抑制を示している。
この研究は、HSV-1感染に対する広域スペクトル抗ウイルスアプリケーションに効果的かつ主要な化合物としてBX795を確立することに貢献している。TFTに匹敵するブタモデルにおけるその有効性を示すことによって、BX795は複数の感染モデル16で成功する立場にある。さらに、BX795は、複数のウイルス株に有効であることが示されているので重要であり、別の広く使用されている薬物アシクロビル(ACV)16に耐性があるHSV-1(KOS)tk12でさえも重要である。BX975処理細胞は、HSV-1ウイルスの阻害効果を証明するHSV-1ウイルスタンパク質gBの発現をほとんど示さない。BX795はまた、他の治療法および抗ヘルペスウイルス療法と比較して、低用量でより良い抗ウイルス効果を示す。さらに、BX795の治療濃度(提案された濃度10μM)は、細胞に対する有害な細胞毒性を示さない−アポトーシス誘導および細胞死はなく、これは再びTFT制御16に匹敵する。
プロトコルセクション内の重要なステップは、全体の目からのブタ角膜の分離を含む。これは、針を使用して眼の中心にある角膜のデブリディアンを含み、虹彩を邪魔することなく優しく眼表面から角膜を切除することによって、間質の関与を確実にするために非常に少ない力を必要とします。重要なステップの別のセットは、事前に濡れた綿の先端と角膜表面を振り回す部品が含まれます。角膜上皮が眼表面から外れていないことを確実にするために、動きは穏やかであるべきです。
修飾は上皮脱花剤ステップに行うことができる。30G針を使用して角膜の中心に1本の突きをする代わりに、実験者は無菌ブレードまたは30G針を使用して、角膜上皮にグリッド状の傷を優しく作ることができます。これは上皮への強い伝染を保障する。
豚の角膜は、調達の同じ日に使用されるべきであり、24時間以上保持されるべきではありません。4時間以上氷に保たれたブタの角膜は、角膜に虹彩が付着する結果となる。これは、切除中に目の残りの部分から角膜を分離することが困難になります.すべてのブタの角膜が同様に感染するわけではありません。実験者は、グループあたり最低5つの目に感染し、2日目の感染後の感染時に同様に感染した角膜を選んで実験を進めるべきである。
現在の技術の重要性は、人間の角膜の上にブタを使用することの費用対効果を含みます.この技術は、ヒト角膜と比較して使用される角膜の相対的な鮮度のためにも重要である。
現在の技術の将来の用途は、薬物透過性研究、エクスビボ薬物動態および薬物力学研究におけるその使用に限定されない。ブタ角膜はまた抗ウイルス薬に加えて抗菌および抗真菌薬をテストするために使用することができる。角膜はまた、糖尿病性創傷を研究するために元生体創傷治癒アッセイに使用することができます。
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Disclosures
著者らは、利益相反や競合する財政的利益を宣言していない。
Acknowledgments
この研究は、D.S.A.A.A.A.A.に対するNIH助成金(R01 EY024710、RO1 AI139768、RO1 EY029426)によって支えられ、NIH国立眼科研究所からのF30EY025981助成金によって支えられた。研究は、パークパッキング会社、4107アシュランドアベニュー、ニューシティ、シカゴ、IL-60609から得たブタの角膜を使用して行われました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers --80 °C. - | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | - | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium - ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium - MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | Special order by request | |
| Procedure bench covers - as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
References
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