Summary
Descrevemos o uso de uma córnea suína para testar a eficácia antiviral de drogas experimentais.
Abstract
Vírus e bactérias podem causar uma variedade de defeitos da superfície ocular e degeneração, como feridas e úlceras através de infecção corneal. Com uma soroprevalência que varia de 60 a 90% em todo o mundo, o Vírus Herpes Simplex tipo-1 (HSV-1) geralmente causa lesões mucocutâneas da região orofacial que também se manifestam como lesões e cegueira associada à infecção. Embora as drogas antivirais atuais sejam eficazes, o surgimento de resistência e persistência de efeitos colaterais tóxicos requer o desenvolvimento de novos antivirais contra este patógeno onipresente. Embora a avaliação in vitro forneça alguns dados funcionais sobre um antiviral emergente, eles não demonstram a complexidade do tecido ocular in vivo. No entanto, os estudos in vivo são caros e exigem pessoal treinado, especialmente quando se trabalha com agentes virais. Portanto, os modelos ex vivo são passos eficientes, mas baratos para testes antivirais. Aqui discutimos um protocolo para estudar a infecção pelo HSV-1 usando córneas suínas ex vivo e um método para tratá-los topicamente usando drogas antivirais existentes e novas. Também demonstramos o método para realizar um ensaio de placa usando o HSV-1. Os métodos detalhados podem ser usados para realizar experimentos semelhantes para estudar infecções que se assemelham ao patógeno HSV-1.
Introduction
Pessoas que sofrem de infecções oculares muitas vezes incorrem em perda de visão1. Com alta soroprevalência em todo o mundo, indivíduos infectados pelo HSV sofrem de infecções oculares recorrentes que levam a cicatrizes na córnea, ceratite estromica e neovascularização2,3,4,5. As infecções por HSV também têm se mostrado com menos frequência, uma série de condições graves entre pacientes imunocomprometidos e não tratados como encefalite e morbidade sistêmica6,7,8. Drogas como o Acyclovir (ACV) e seus análogos nucleosídeos têm mostrado sucesso consistente na contenção da infecção do HSV-1 e até mesmo na reativação decontrole,mas o uso prolongado dessas drogas está associado à insuficiência renal, anormalidades fetais e falha em restringir o surgimento da resistência a drogas às cepas virais em evolução9,10,11,12,13. Complexidades associadas às infecções oculares do HSV-1 foram previamente estudadas in vitro usando monocamadas e culturas 3D de células córneas humanas e in vivo usando infecções oculares de murina ou coelho. Embora esses modelos in vitro forneçam dados significativos sobre os componentes biológicos celulares das infecções pelo HSV-1, eles, no entanto, não conseguem imitar a complexidade intrincada do tecido córnea e pouco fazem para iluminar a propagação dendrítica do vírus14. Em contraste, embora os sistemas in vivo sejam mais perspicazes em mostrar infecção espalhada em córneas e respostas de ativação imunológica durante a infecção pelo HSV-1, eles vêm com a ressalva de que eles exigem pesquisadores treinados e grandes instalações para cuidados com animais para ignorar os experimentos.
Aqui usamos córneas suínas como modelo ex vivo para examinar o sistema de feridas induzidas pela infecção por HSV-1. Tanto a farmacologia potencial de certas drogas quanto a biologia celular e molecular do sistema de feridas causada pela infecção podem ser estudadas através de culturas de explanta tecidual. Este modelo também pode ser alterado para uso de outras infecções virais e bacterianas. Neste estudo, foram utilizadas córneas suínas para testar a eficácia antiviral de uma pequena molécula pré-clínica, BX795. O uso de córneas suínas foi preferido devido à facilidade de acesso e custo-benefício. Além disso, os modelos suínos de córneas são bons modelos de olhos humanos, sendo as córneas fáceis de isolar, adequadamente dimensionadas para infecção e visualização e robustas para manusear15. As córneas suínas também são comparáveis à complexidade dos modelos de córnea humanas tanto na permeabilidade da córnea trans quanto na absorção sistêmica15. Usando este modelo para o estudo, pudemos elucidar como o BX795 é digno de uma investigação mais aprofundada como um inibidor competente da infecção pelo vírus HSV-1 e adiciona à literatura de classificá-lo como um potencial composto antiviral de pequenas moléculas16.
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Protocol
Todo o tecido suíno usado neste estudo foi fornecido por uma organização privada terceirizada e nenhum dos manuseamentos de animais foi realizado pela Universidade de Illinois em Chicago.
1. Materiais
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Reagentes
- Use os seguintes reagentes para ensaio de placa: metilcelulose em pó, meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal (FBS), penicilina e estreptomicina (P/S) para ensaio de placa.
- Use comprimidos de cristal violeta e etanol (grau de biologia molecular) para preparar solução violeta cristalina para ensaio de placa.
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Vero cell growth media - DMEM whole media
- Abra a garrafa de mídia DMEM dentro da capa de cultura de tecido. Remova 55 mL de mídia da garrafa usando uma pipeta sorológica e descarte-a. Adicione 50 mL de FBS de P/S ao DMEM. Leve à geladeira a 4 °C.
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Mídia de ensaio de placa - Estoque de 5% de mídia de metilcelulose
- Meça 2,5 g de pó de metilcelulose com um ímã de agitação dentro de uma garrafa de vidro de 500 mL e autoclave-a. Depois que a garrafa esfriar até a temperatura ambiente, pegue 500 mL de mídia inteira DMEM contendo 50 mL de FBS e 5 mL de P/S e adicione-a à garrafa de vidro contendo metilcelulose.
- Mexa a 4 °C por 2 dias usando um agitador magnético. Leve à geladeira a 4 °C.
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Preparação da mídia para córnea suína excizada
- Abra uma garrafa de mídia essencial mínima (MEM) dentro da capa de cultura de tecido. Descarte 10 mL de MEM da garrafa usando uma pipeta sorológica.
- Adicione 5 mL de insulina-transferrina-selênio (ITS) e 5 mL de antibiótico antimíctico (AA) à mídia e leve à geladeira a 4°C.
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Mestre e estoque de cristal violeta:
- Para fazer a solução de estoque cristalino, adicione 1 g de pó violeta cristalina a 100 mL de 20% de etanol na água. Este estoque (1% c/v de cristal violeta) pode ser armazenado e usado por até um ano quando armazenado em um lugar escuro.
- Para fazer um estoque de trabalho a partir disso, adicione 50 mL de solução de estoque original a 350 mL de água. Adicione 100mL de etanol a esta solução para fazer uma solução de cristal violeta de 500 mL (0,1% w/v de violeta cristalina).
NOTA: Ambas as soluções precisam ser armazenadas no escuro.
2. Procedimento
- Isolamento das córneas suínas de olhos inteiros17
- Ao receber os olhos suínos de um fornecedor adequado, armazene no gelo se houver um atraso com o processamento de tecidos como retratado na Figura 1.
- Certifique-se de que os equipamentos de proteção individual são usados e usados durante este procedimento para evitar contaminação, bem como acidentes de derramamento de humor vítreo.
- Pulverizar a área de trabalho com 70% de etanol para limpar e desinfetar. Para garantir que o espaço de trabalho esteja estável, espalhe uma tampa de banco e tape pelos lados com segurança, conforme retratado na Figura 2.
- Coloque os olhos suínos na gaze (Figura 3). Utilizando gaze de 50 mm, segure a seção posterior(Figura 4A) dos olhos suínos, conforme mostrado na Figura 4B com uma mão.
- Com uma agulha de 30 G, faça delicadamente um único poke no centro da superfície epitelial do olho cuidadosamente e certifique-se de que não há danos ao estroma(Figura 5). A cutucada deve ser limitada ao epitélio (~100-200 μm) para evitar o envolvimento estromalítico.
- Usando uma lâmina esterilizada afiada, faça uma pequena incisão na esclera a 1 mm de distância da córnea. Corte a borda da córnea garantindo que o humor vítreo não vaze usando uma ação rotativa rápida e suave da mão(Figura 6A). Segurando a córnea na borda córnea-esclera com uma pinça plana, corte as membranas de amarração restantes do olho usando a lâmina(Figura 6B).
- Pegue a córnea e coloque-a em uma placa de 12 poços sobreposta com 2 mL de meio de córnea. A córnea deve ser colocada de frente para cima, demonstrada em uma série de passos nas Figuras 7A-D, Figura 8).
- Adicione 5 μL da solução de vírus contendo unidades de formação de placas (PFU) de 5 x10 5 placas (PFU) de 17 GFP ao local desbridado na superfície da córnea. Coloque a placa de 12 poços contendo córneas suínas infectadas em uma incubadora com 5% de CO2 por 72 h.
- Pulverize quaisquer olhos adicionais não utilizados em experimentos com alvejante 10% e descartados com segurança em sacos de risco biológico.
- Visualização
NOTA: O vírus deve ser visualizado todos os dias antes da adição de medicamentos.- Ligue o microscópio estéreo e a fonte de luz LED e deixe a lâmpada da máquina aquecer antes de imaginar as córneas. Leve cuidadosamente a placa de córneas para instrumento sem perturbar a solução. Altere o filtro para que o GFP (380-460 nm) seja usado para olhar amostras. Defina o tempo de exposição para 500 ms para capturar imagens.
- Primeiro, coloque a placa de córnea sob o estereoscópio e capture as imagens na menor ampliação de 7,5x. Acompanhe isso com uma série de imagens de ampliação crescentes (por exemplo, 15x, 25x, 35x) de tal formação viral de spread e dendrito é visualizada claramente
- Certifique-se de devolver as córneas infectadas de volta à incubadora de cultura tecidual e salvar todas as imagens que foram tiradas.
- Quantificação da infecção por vírus
NOTA: Os de vírus das córneas suínas devem ser avaliados todos os dias para analisar o efeito do tratamento medicamentoso.- Para quantificar o vírus, as células vero sementes a uma densidade de 5 x 105 de células por poço se usar uma placa de 6 poços como feito neste experimento. Faça isso um dia antes da infecção. Incubar as células banhadas durante a noite para garantir que elas sejam confluentes para quantificação do vírus.
- Alíquota de 500 μL de mídia livre de soro em múltiplos tubos de microcentrifuuge. Insira o cotonete estéril de algodão mergulhado nos tubos cheios de mídia livre de soro. Os cotonetes de algodão precisam ser mergulhados e molhados por pelo menos 5 minutos antes do uso.
- Sem perturbar a mídia subjacente, transporte a placa de córnea suína infectada para um armário de biossegurança. Usando os cotonetes de algodão molhado, faça 3 revoluções no sentido horário e 3 revoluções no sentido anti-horário a um diâmetro de 5 mm do centro da córnea suína infectada sem aplicar pressão excessiva.
- Insira o cotonete de algodão no tubo de microcentrifusagem preenchido com soro e gire-o no sentido horário e anti-horário 5 vezes. A ponta metálica do cotonete deve ser cortada para que se encaixe inteiramente no tubo de microcentrifuuge e a tampa possa ser fechada.
- Coloque o tubo de microcentrifuge contendo a ponta de algodão esfregado em uma máquina de vórtice e vórtice em alta velocidade por 1 min.
- Realize a quantificação do vírus através de um ensaio de placa nestas amostras.
NOTA: Esta etapa de quantificação precisa ser realizada nos dias 2, 4 e opcionalmente em 6 dias após a infecção.
- Quantificação de vírus por ensaio de placa
NOTA: Para realizar um ensaio de placa, cresça e emplaque células Vero em uma placa de 6 poços e garanta 90% de confluência de células antes do início do ensaio. Use um frasco confluente de 75 cm2 dessas células. Todas as etapas abaixo precisam ser realizadas dentro de um armário de biossegurança.- Lave a monocamada confluente das células Vero no frasco com 10 mL de soro fisco tampão de fosfato fresco (PBS) após aspirar o meio de cultura. Repita o passo de lavagem mais uma vez com PBS depois de aspirar o primeiro conjunto de solução de lavagem.
- Adicione 1 mL de 0,05% trypsin à monocamada celular. Incubar o frasco a 37 °C por 5 min. A olho nu, certifique-se de que as células se desvincularão da superfície interna do frasco. Se não, espere mais 5 minutos antes de examinar o frasco novamente. Quando as células parecerem separadas, adicione 9 mL de toda a mídia à monocamada para garantir que as células se desalojam completamente da superfície do frasco.
- Colete todas as células do frasco junto com toda a mídia e coloque-as em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Para cada poço das 6 placas que são usadas para ensaio de placa, use 300 μL do tubo centrífuga. Cubra cada poço da placa de 6 poços com 2 mL de mídia inteira. Deixe as placas na incubadora durante a noite para permitir que elas cresçam e formem uma monocamada confluente em cada poço.
- Para realizar um ensaio de placa, realizar uma diluição serial das amostras precisa ser realizada antes da quantificação do vírus.
- Realize uma diluição de101 vezes do vírus em tubos de microcrífugas usando mídia livre de soro até que uma diluição de 10-8 seja alcançada. Quando em uma diluição de 10-3, transfira 1 mL da diluição para a monocamada de células banhadas depois de aspirar a mídia de crescimento nas células da placa de 6 poços, este será o passo da infecção. Incubar a placa infectada a 37 °C incubadora por 2 h.
- Aspire a mídia de infecção existente, lave com PBS duas vezes suavemente para revestir células e adicione 2 mL de mídia carregada de metilcelulose por poço a todos os 6 poços. Incubar por 72 h ou até que a formação de placas possa ser vista. As placas podem ser identificadas pela formação de pequenas lacunas entre as células da monocamada celular.
- Adicione 1 mL de metanol lentamente ao canto de cada poço, usando a parede como ponta guia. Incubar a placa de 6 poços à temperatura ambiente por 15 minutos. Aspire lentamente o conteúdo de cada poço da placa sem perturbar ou agitar a monocamada celular.
- Adicione 1 mL de solução de trabalho cristal violeta a cada poço de 6 placas de poço, garantindo que todas as células estejam cobertas. Incubar a placa de 6 poços no escuro por 30 minutos. Descarte a solução violeta cristalina aspirando-a e seque os poços em uma folha de papel absorvente.
- Conte o número de placas no poço de diluição mais alta para quantificar o conteúdo total do vírus na solução inicial. Repita o processo duas vezes para confirmar o título viral.
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Representative Results
Para entender a eficácia dos antivirais experimentais, eles precisam ser testados extensivamente antes de serem enviados para testes clínicos in vivo em humanos. Nesse sentido, devem ser identificados controles positivos, controle negativo e grupos de testes. Trifluorothymidina (TFT) tem sido usada há muito tempo como o tratamento preferido para tratar a ceratite de herpes topicamente16. Usados como controle positivo, os grupos córneas tratados com TFT mostram menor propagação de infecções. Como controle negativo, usamos DMSO ou controle de veículo dissolvido em PBS. BX795, a droga pré-clínica experimental foi o grupo de teste. Um total de 4 córneas foram atribuídas a cada grupo e as drogas foram adicionadas 3 vezes por dia às córneas suínas. Nossos resultados usando imagens de fluorescência estereoscópica mostram que a eficácia antiviral do BX795 é semelhante ao TFT no controle da propagação viral. A disseminação viral em nossos estudos pode ser visualizada por meio da imagem do canal de fluorescência verde no estereoscópio. Observou-se que o veículo só tratava córneas negativas do grupo controle mostrou disseminação do vírus da zona central de infecção para sua periferia em 6 dias após a inoculação viral inicial, enquanto ambas as drogas (BX795 e TFT) limpam a infecção no dia 4 - 6 imagens(Figura 9A). Da mesma forma, os cotonetes oculares retirados nos dias 2 e 4 pós-infecção mostram uma inibição completa do vírus no controle positivo e amostras tratadas com BX795, enquanto um aumento acentuado no titulador do vírus infeccioso é observado no grupo de controle negativo(Figura 9B).
Figura 1: Olhos suínos mantidos no gelo até que o tecido seja processado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração do banco de trabalho. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Olhos suínos colocados na gaze. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Olho suíno com agulha 30G retratado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: agulha de 30 G usada; orifício feito no centro da superfície epitelial. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Ação rotativa usada para cortar em torno da borda da córnea usando lâmina esterilizada afiada (A,B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Imagens de córnea. (A,B) A córnea finalmente cortada usando uma tesoura afiada(C) C É mantida por pinças (D) Córnea completamente isolada, pronta para uso Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Córneas colocadas em placa de 12 poços e incubadas por 72 h. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Progressão da propagação viral tomada durante o curso da infecção. Córneas suínas recém-extirpadas foram infectadas com HSV-1 17-GFP e(A)imagens usando microscópio nos dias 2, 4 e 6 pós infecção. O tratamento tópico com DMSO, TFT ou BX795 foi iniciado no dia 2 após a infecção. (B) Os ensaios de placa foram realizados utilizando cotonetes retirados das córneas suínas em Células Vero. O teste ANOVA bidirecional foi realizado para compreender diferenças significativas entre os grupos de tratamento. n=4, ****p=0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Pesquisas anteriores mostraram que o BX795 tem um papel promissor como agente antiviral contra a infecção pelo HSV-1; inibindo a quinase de ligação tank 1 (TBK1)16. Tanto o TBK1 quanto a autofagia desempenharam um papel em ajudar a inibir a infecção pelo HSV-1, como demonstrado nas células epiteliais da córnea humana. O BX795 mostrou-se extremamente eficaz com a atividade antiviral em uma concentração de 10μM e usando tanto a análise de manchas ocidentais quanto a análise de placas virais das principais proteínas virais, o BX795 mostrou-se inibir a infecção por HSV-1 comparável à atividade do TFT16. O estudo sobre córneas suínas seguiu a mesma análise e obteve resultados semelhantes como demonstrado acima; O BX795 mostra-se tão eficaz quanto o TFT na inibição da infecção - imagens tiradas de córneas suínas nos dias 4 e 6 de infecção mostram resultados comparáveis tanto no TFT quanto no BX795. Ensaios de placas realizados para quantificar virions secretados também reforçam esses achados16. O BX795 também mostrou ter efeitos antivirais in vitro e seu uso topicamente em modelos de camundongos in vivo também mostrou supressão da infecção hsv-1córnea 16.
O estudo contribui para estabelecer o BX795 como um composto eficaz e líder para aplicação antiviral de amplo espectro contra a infecção pelo HSV-1. Ao mostrar sua eficácia em modelos suínos como comparável ao TFT, o BX795 tem sucesso em múltiplos modelos de infecção16. Além disso, o BX795 é importante, pois tem se mostrado eficaz em múltiplas cepas de vírus, até mesmo o HSV-1 (KOS)tk12 que é resistente a outra droga amplamente utilizada Acyclovir (ACV)16. As células tratadas com BX975 mostram muito pouca expressão da proteína viral HSV-1 gB que certificam sua eficácia de inibição do vírus HSV-1. BX795 também demonstra melhor eficácia antiviral em doses mais baixas em comparação com outros tratamentos e terapias anti-herpesvírus. Além disso, as concentrações terapêuticas de BX795 (mesmo concentração proposta de 10 μM) não mostram citotoxicidade adversa em relação às células - sem incentivo à apoptose e morte celular, que é novamente comparável ao controle TFT16.
Passos críticos na seção de protocolo incluem isolamento da córnea suína de todo o olho. Isso envolve o debridamento da córnea no centro do olho usando uma agulha e requer muito pouca força para garantir nenhum envolvimento estroma, seguido de excisão da córnea da superfície ocular suavemente sem perturbar a íris. Outro conjunto de etapas críticas incluem peças que envolvem pontas de algodão pré-molhadas e esfregar a superfície da córnea. O movimento deve ser suave para garantir que o epitélio córnea não esteja sendo desalojado da superfície ocular.
A modificação pode ser feita à etapa de debridamento epitelial. Em vez de usar uma agulha de 30 G para fazer uma única cutucada no centro da córnea, o experimentador pode usar uma lâmina estéril ou agulha de 30 G para fazer suavemente arranhões em forma de grade para o epitélio da córnea. Isso garante uma infecção robusta ao epitélio.
As córneas suínas devem ser utilizadas no mesmo dia da aquisição e não devem ser mantidas por mais de 24h. Córneas suínas mantidas no gelo por mais de 4h resultarão na aderência da íris à córnea. Isso torna mais difícil separar a córnea do resto do olho durante a excisão. Nem todas as córneas suínas serão infectadas. O experimentador deve infectar um mínimo de 5 olhos por grupo e, em seguida, escolher córneas igualmente infectadas no dia 2 após a infecção para prosseguir com o experimento.
A importância da técnica atual envolve o custo efetivo do uso de suínos sobre córneas humanas. A técnica também é significativa devido ao frescor relativo das córneas que estão sendo utilizadas quando comparadas às córneas humanas.
As aplicações futuras da técnica atual incluem, mas não se limitando ao seu uso em estudos de permeabilidade de medicamentos, estudos pharmacocinéticos e farmacodinâmicos ex vivo. Córneas suínas também podem ser usadas para testar drogas antibacterianas e antifúngicas, além de drogas antivirais. As córneas também podem ser usadas para ensaios de cicatrização de feridas ex vivo para estudar feridas diabéticas.
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Disclosures
Os autores declaram que não há conflito de interesses e nenhum interesse financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por subvenções do NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 e RO1 EY029426) ao D.S. A.A. foi apoiado por uma bolsa F30EY025981 do National Eye Institute, NIH. O estudo foi realizado utilizando as córneas suínas obtidas da empresa Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers --80 °C. - | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | - | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium - ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium - MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | Special order by request | |
| Procedure bench covers - as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
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