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Immunology and Infection

दाद सिंप्लेक्स वायरस-1 एंटीवायरल की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए पोर्सिन कॉर्नियल ऊतक एक्सप्लांट

Published: September 20, 2021 doi: 10.3791/62195
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Illinois at Chicago, 2Department of Microbiology and Immunology, University of Illinois at Chicago

Summary

हम प्रायोगिक दवाओं की एंटीवायरल प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक पोर्सिन कॉर्निया के उपयोग का वर्णन करते हैं।

Abstract

वायरस और बैक्टीरिया कॉर्नियल संक्रमण के माध्यम से कई प्रकार के नेत्र सतह दोष और पतन जैसे घावों और अल्सर का कारण बन सकते हैं। दुनिया भर में 60-90% से लेकर एक सेरोप्रेवलेंस के साथ, हर्पीस सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 (एचएसवी-1) आमतौर पर ओरोफेशियल क्षेत्र के म्यूकोक्यूटेनियस घावों का कारण बनता है जो घावों और संक्रमण से जुड़े अंधापन के रूप में भी प्रकट होता है। जबकि वर्तमान एंटीवायरल दवाएं प्रभावी हैं, प्रतिरोध और विषाक्त दुष्प्रभावों के हठ के उद्भव से इस सर्वव्यापी रोगजनक के खिलाफ उपन्यास एंटीवायरल के विकास की आवश्यकता होती है। हालांकि इन विट्रो मूल्यांकन एक उभरते एंटीवायरल के बारे में कुछ कार्यात्मक डेटा प्रदान करता है, वे वीवो में नेत्र ऊतक की जटिलता का प्रदर्शन नहीं करते हैं। हालांकि, वीवो अध्ययन में महंगे होते हैं और प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है, खासकर वायरल एजेंटों के साथ काम करते समय। इसलिए पूर्व वीवो मॉडल एंटीवायरल परीक्षण के लिए कुशल अभी तक सस्ती कदम हैं। यहां हम पोर्सिन कॉर्निया पूर्व वीवो का उपयोग करके एचएसवी-1 द्वारा संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं और मौजूदा और उपन्यास एंटीवायरल दवाओं का उपयोग करके उन्हें सामयिक रूप से इलाज करने की विधि है। हम एचएसवी-1 का उपयोग करके पट्टिका परख करने की विधि भी प्रदर्शित करते हैं। विस्तृत तरीकों का उपयोग एचएसवी-1 रोगजनक के समान संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए समान प्रयोगों का संचालन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

नेत्र संक्रमण से पीड़ित लोगों को अक्सर दृष्टि हानि उठानी पड़ती है1. दुनिया भर में एक उच्च सेरोप्रेवलेंस के साथ, एचएसवी संक्रमित व्यक्ति आवर्ती आंखों के संक्रमण से पीड़ित होते हैं जो कॉर्नियल स्कारिंग, स्ट्रोमल केराटिटिस और नियोवैस्कुलराइजेशन2,3,4, 5का कारणबनतेहैं। एचएसवी संक्रमण भी कम बार कारण दिखाया गया है, इम्यूनोसमझौता के बीच गंभीर स्थितियों की एक श्रृंखला, इंसेफेलाइटिस और प्रणालीगत रुग्णता6,7,8जैसे अनुपचारित रोगियों । एसीक्लिवोविर (एसीवी) और इसके न्यूक्लियोसाइड एनालॉग जैसी दवाओं ने एचएसवी-1 संक्रमण को रोकने और यहां तक कि पुनर्सक्रियण को नियंत्रित करने में लगातार सफलता दिखाई है फिर भी इन दवाओं का लंबे समय तक उपयोग गुर्दे की विफलता, भ्रूण असामान्यताओं और विकसित वायरल उपभेदों के लिए दवा प्रतिरोध के उद्भव को प्रतिबंधित करने में विफलता के साथ जुड़ा हुआ है9,10,11, 12,13। एचएसवी-1 नेत्र संक्रमण से जुड़ी जटिलताओं का पहले मोनोलेयर और मानव कॉर्नियल कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों और वीवो में मुरीन या खरगोश नेत्र संक्रमणों का उपयोग करके विट्रो में अध्ययन किया गया है। हालांकि ये इन इन विट्रो मॉडल एचएसवी-1 संक्रमणों के सेलुलर जैविक घटकों पर महत्वपूर्ण डेटा प्रदान करते हैं, हालांकि, वे कॉर्नियल ऊतक की जटिल जटिलता की नकल करने में विफल रहते हैं और वायरस14के डेंड्रिटिक प्रसार को रोशन करने के लिए कुछ नहीं करते हैं। इसके विपरीत, हालांकि वीवो सिस्टम में एचएसवी-1 संक्रमण के दौरान कॉर्निया और प्रतिरक्षा सक्रियण प्रतिक्रियाओं में फैले संक्रमण को दिखाने में अधिक व्यावहारिक होते हैं, वे चेतावनी के साथ आते हैं कि उन्हें प्रयोगों को नजरअंदाज करने के लिए प्रशिक्षित जांचकर्ताओं और पशु देखभाल के लिए बड़ी सुविधाओं की आवश्यकता होती है।

यहां हम एचएसवी-1 संक्रमण प्रेरित घाव प्रणाली की जांच करने के लिए एक पूर्व वीवो मॉडल के रूप में पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग करते हैं। संक्रमण के कारण घाव प्रणाली के सेल और आणविक जीव विज्ञान के संभावित औषध विज्ञान दोनों का अध्ययन ऊतक एक्सप्लांट संस्कृतियों के माध्यम से किया जा सकता है। इस मॉडल को अन्य वायरल और बैक्टीरियल संक्रमणों के लिए भी उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग एक प्रीक्लीनिकल छोटे अणु, BX795 की एंटीवायरल प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया गया था। पहुंच में आसानी और लागत प्रभावशीलता के कारण पोर्सिन कॉर्निया के उपयोग को प्राथमिकता दी गई थी। इसके अतिरिक्त, पोर्सिन कॉर्नियल मॉडल मानव आंखों के अच्छे मॉडल हैं, कॉर्निया को अलग करना आसान है, संक्रमण और दृश्य के लिए पर्याप्त आकार और15को संभालने के लिए मजबूत। पोर्सिन कॉर्निया ट्रांस कॉर्नियल पारमेबिलिटी और प्रणालीगत अवशोषणदोनोंमें मानव कॉर्नियल मॉडल की जटिलता के बराबर भी हैं। अध्ययन के लिए इस मॉडल का उपयोग करके, हम यह स्पष्ट करने में सक्षम थे कि BX795 एचएसवी-1 वायरस संक्रमण के एक सक्षम अवरोधक के रूप में आगे की जांच के योग्य कैसे है और इसे एक संभावित छोटे अणु एंटीवायरल यौगिक16के रूप में वर्गीकृत करने के साहित्य में जोड़ता है।

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Protocol

इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी पोर्सिन ऊतक एक तीसरे पक्ष के निजी संगठन द्वारा प्रदान किया गया था और पशु हैंडलिंग में से कोई भी शिकागो कर्मियों में इलिनोइस विश्वविद्यालय द्वारा किया गया था ।

1. सामग्री

  1. अभिकर्मकों
    1. पट्टिका परख के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों का उपयोग करें: पाउडर मिथाइलसेलुलोस, डल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम), भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) पट्टिका परख के लिए।
    2. पट्टिका परख के लिए क्रिस्टल वायलेट समाधान तैयार करने के लिए क्रिस्टल वायलेट गोलियों और इथेनॉल (आणविक जीव विज्ञान ग्रेड) का उपयोग करें।
  2. वेरो सेल ग्रोथ मीडिया - डीएमईएम पूरे मीडिया
    1. ऊतक संस्कृति हुड के अंदर DMEM मीडिया की बोतल खोलें। एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके बोतल से मीडिया के 55 एमएल निकालें और इसे त्यागें। डीएमईएम में पी/एस के एफबीएस की 50 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें।
  3. पट्टिका परख मीडिया - 5% मिथाइलसेलुलोस मीडिया का स्टॉक
    1. 500 एमएल ग्लास की बोतल के अंदर एक सरगर्मी चुंबक के साथ मिथाइलसेल्यूलोस पाउडर के 2.5 ग्राम को मापें और इसे ऑटोक्लेव करें। बोतल कमरे के तापमान को ठंडा करने के बाद, DMEM पूरे मीडिया के ५०० एमएल एफबीएस के ५० एमएल और पी/एस के 5 एमएल युक्त ले और यह मिथाइलसेलुलोस युक्त कांच की बोतल में जोड़ें ।
    2. एक चुंबकीय उभारने वाला का उपयोग करके 2 दिनों के लिए इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें।
  4. उत्पादित पोर्सिन कॉर्निया के लिए मीडिया की तैयारी
    1. ऊतक संस्कृति हुड के अंदर एक न्यूनतम आवश्यक मीडिया (एमईएम) बोतल खोलें। सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके बोतल से एमईएम के 10 एमएल को त्यागें।
    2. इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम (आईटीएस) के 5 एमएल और एंटीमाइकोटिक-एंटीबायोटिक (एए) के 5 एमएल को मीडिया में जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखें ।
  5. क्रिस्टल वायलेट के मास्टर और काम स्टॉक:
    1. क्रिस्टल वायलेट स्टॉक समाधान बनाने के लिए, पानी में 20% इथेनॉल के 100 मिलील में 1 ग्राम क्रिस्टल वायलेट पाउडर जोड़ें। इस स्टॉक (1% w/v क्रिस्टल वायलेट) संग्रहीत किया जा सकता है और साल के लिए इस्तेमाल किया जब एक जगह है कि अंधेरा है में संग्रहीत ।
    2. इससे वर्किंग स्टॉक बनाने के लिए 350 एमएल पानी में ओरिजनल स्टॉक सॉल्यूशन का 50 एमएल डालें। 500 एमएल काम क्रिस्टल वायलेट समाधान (0.1% w/v क्रिस्टल वायलेट) बनाने के लिए इस समाधान में इथेनॉल का 100mL जोड़ें।
      नोट: इन दोनों समाधानों को अंधेरे में संग्रहीत करने की आवश्यकता है।

2. प्रक्रिया

  1. पूरी आंखों से पोर्सिन कॉर्निया का अलगाव17
    1. एक उपयुक्त विक्रेता से पोर्सिन आंखें प्राप्त करने पर, बर्फ पर स्टोर करें यदि चित्र 1में चित्र के रूप में ऊतक प्रसंस्करण में देरी हो रही है।
    2. सुनिश्चित करें कि व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग किया जाता है और इस प्रक्रिया के दौरान पहना जाता है ताकि संदूषण के साथ-साथ विट्रियस हास्य के बिखराव से दुर्घटनाओं से बचा जा सके।
    3. साफ और कीटाणुरहित करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र स्प्रे करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि काम करने की जगह स्थिर है, एक बेंच कवर फैलाएं और चित्र 2में चित्र के रूप में सुरक्षित रूप से पक्षों को टेप करें।
    4. धुंध(चित्रा 3)पर पोर्सिन आंखें रखें । 50 मिमी धुंध का उपयोग करके, एक हाथसे चित्रा 4Bमें दिखाए गए पोर्सिन आंखों के पीछे के खंड (चित्रा 4A) को पकड़ें।
    5. एक 30 जी सुई के साथ, धीरे से आंख की epithelial सतह के केंद्र में एक भी प्रहार ध्यान से बनाने के लिए और सुनिश्चित करें कि वहां स्ट्रोमा(चित्रा 5)को कोई नुकसान नहीं है । प्रहार स्ट्रोमल की भागीदारी से बचने के लिए एपिथेलियम (~ 100-200 माइक्रोन) तक सीमित होना चाहिए।
    6. एक तेज निष्फल ब्लेड का उपयोग करके, कॉर्निया से 1 मिमी दूरी पर स्क्लेरा पर एक छोटा सा चीरा बनाएं। कॉर्निया के किनारे को काट दें यह सुनिश्चित करना कि विट्रियस हास्य हाथ की एक तेज और चिकनी घूर्णन कार्रवाई(चित्रा 6A)का उपयोग करके रिसाव नहीं करता है। एक फ्लैट चिमटी के साथ कॉर्निया-स्क्लेरा किनारे पर कॉर्निया पकड़कर, ब्लेड(चित्रा 6B)का उपयोग करके आंख की शेष टेदरिंग झिल्ली को काट दें।
    7. कॉर्निया लें और इसे कॉर्निया मीडियम के 2 एमएल के साथ मढ़ा 12-वेल प्लेट में रखें। कॉर्निया का सामना करना पड़ रखा जाना चाहिए, आंकड़े 7A-D, चित्रा 8में कदम की एक श्रृंखला में प्रदर्शन किया) ।
    8. कॉर्नियल सतह पर डिब्राइड साइट में 17 जीएफपी की 5 x10 5 पट्टिका बनाने वाली 5 μL जोड़ें। 72 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ एक इनक्यूबेटर में संक्रमित पोर्सिन कॉर्निया युक्त 12-अच्छी तरह से प्लेट रखें।
    9. 10% ब्लीच के साथ प्रयोग में उपयोग नहीं की गई किसी भी अतिरिक्त आंखों को स्प्रे करें और बायोहैजार्ड बैग में सुरक्षित रूप से निपटाए गए।
  2. दृश्य
    नोट: वायरस दवाओं के अलावा करने से पहले हर दिन कल्पना की जानी चाहिए ।
    1. स्टीरियो माइक्रोस्कोप और एलईडी प्रकाश स्रोत चालू करें और कॉर्निया इमेजिंग से पहले मशीन के दीपक को गर्म करने की अनुमति दें। ध्यान से समाधान को परेशान किए बिना कॉर्निया की प्लेट को साधन तक ले जाएं। फिल्टर बदलें ताकि नमूनों को देखने के लिए जीएफपी (380-460 एनएम) का उपयोग किया जाए। छवियों को कैप्चर करने के लिए एक्सपोजर समय 500 एमएस सेट करें।
    2. सबसे पहले, कॉर्निया प्लेट को स्टीरियोस्कोप के नीचे रखें और छवियों को 7.5x के सबसे कम आवर्धन पर कैप्चर करें। बढ़ती आवर्धन छवियों (जैसे, 15x, 25x, 35x) की एक श्रृंखला के साथ इसका पालन करें, जैसे कि सभी वायरल स्प्रेड और डेंड्राइट गठन स्पष्ट रूप से कल्पना की जाती है
    3. संक्रमित कॉर्निया को ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में वापस लौटाना सुनिश्चित करें और ली गई सभी छवियों को बचाएं।
  3. वायरस संक्रमण मात्राकरण
    नोट: दवा उपचार के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए हर दिन पोर्सिन कॉर्निया से वायरस टाइटर्स का मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
    1. वायरस की मात्रा निर्धारित करने के लिए, इस प्रयोग में किए गए 6-अच्छी प्लेट का उपयोग करके कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से 5 x 105 के घनत्व पर बीज वेरो कोशिकाएं। संक्रमण से एक दिन पहले ऐसा करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे वायरस क्वांटिफिकेशन के लिए कॉन्फ्ल्यूटी हैं, रात भर प्लेटेड कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    2. अलीकोट 500 सीरम मुक्त मीडिया के माइक्रोसेन्ट्राइज ट्यूबों में। बाँझ कपास इत्तला दे दी झाड़ू सीरम मुक्त मीडिया भरा ट्यूबों में डूबा डालें । कपास झाड़ू को उपयोग से पहले कम से कम 5 मिनट के लिए डूबा और गीला करने की आवश्यकता होती है।
    3. अंतर्निहित मीडिया को परेशान किए बिना, संक्रमित पोर्सिन कॉर्निया प्लेट को जैवसेफ्टी कैबिनेट में परिवहन करें। गीले सूती झाड़ू का उपयोग करके, अत्यधिक दबाव लागू किए बिना संक्रमित पोर्सिन कॉर्निया के केंद्र से 5 मिमी के व्यास पर 3 क्रांतियों को दक्षिणावर्त और 3 क्रांतियां विरोधी दक्षिणावर्त बनाएं।
    4. कपास झाड़ू को सीरम फ्री मीडिया से भरे माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में वापस डालें और इसे दक्षिणावर्त और एंटी-क्लॉकवाइज 5 बार घुमाएं। कपास झाड़ू की धातु की नोक को कम काटा जाना चाहिए ताकि यह पूरी तरह से माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में फिट हो और ढक्कन बंद किया जा सके।
    5. एक भंवर मशीन और भंवर पर 1 मिनट के लिए उच्च गति पर स्वैब्ड सूती टिप युक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें।
    6. इन नमूनों पर एक पट्टिका परख के माध्यम से वायरस मात्राकरण प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: इस मात्राकरण चरण को संक्रमण के बाद 2, 4 और वैकल्पिक रूप से 6 दिनों के बाद 2, 4 और वैकल्पिक रूप से किया जाना चाहिए।
  4. पट्टिका परख द्वारा वायरस मात्राकरण
    नोट: एक पट्टिका परख प्रदर्शन करने के लिए, बढ़ने और एक 6 अच्छी तरह से थाली में वेरो कोशिकाओं की थाली और परख की शुरुआत से पहले कोशिकाओं की ९०% संकुचन सुनिश्चित करते हैं । इन कोशिकाओं के एक कॉन्फ्ल्यूंट 75 सेमी2 फ्लास्क का उपयोग करें। नीचे दिए गए सभी चरणों को जैवसेफ्टी कैबिनेट के अंदर किए जाने की आवश्यकता है।
    1. संस्कृति माध्यम को एस्पिर करने के बाद ताजा फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ फ्लास्क में वेरो कोशिकाओं के शांत मोनोलेयर को धोएं। वॉश सॉल्यूशन के पहले सेट को एस्पिर करने के बाद पीबीएस के साथ एक बार फिर वॉश स्टेप दोहराएं।
    2. सेल मोनोलेयर में 0.05% ट्राइप्सिन का 1 मिलियन एमएलए जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें। नग्न आंखों के साथ, यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को फ्लास्क की अंदर की सतह से अलग किया जाता है। यदि नहीं, तो फिर से फ्लास्क की जांच करने से पहले एक और 5 मिनट की प्रतीक्षा करें। जब कोशिकाएं अलग दिखाई देती हैं, तो मोनोलेयर में पूरे मीडिया के 9 एमएल जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं फ्लास्क सतह से पूरी तरह से उखाड़ फेंकती हैं।
    3. पूरे मीडिया के साथ फ्लास्क से सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें।
    4. पट्टिका परख के लिए उपयोग की जाने वाली 6 अच्छी प्लेटों में से हर कुएं के लिए, अपकेंद्रित्र ट्यूब से 300 माइक्रोन का उपयोग करें। पूरे मीडिया के 2 एमएल के साथ 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं को ऊपर करें। प्लेटों को इनक्यूबेटर में रात भर छोड़ दें ताकि वे बड़े हो सके और प्रत्येक कुएं में एक कॉन्फ्ल्यूंट मोनोलेयर बनाएं।
    5. एक पट्टिका परख करने के लिए, वायरस की मात्रा से पहले नमूनों का एक धारावाहिक कमजोर पड़ने की आवश्यकता है।
    6. 10 -8के कमजोर पड़ने तक सीरम मुक्त मीडिया का उपयोग करके माइक्रो-अपकेंद्रित्र ट्यूबों में वायरस का लॉग10 1 गुना कमजोर करना करें। जब 10-3 कमजोर पड़ने पर, 6 अच्छी प्लेट से कोशिकाओं पर विकास मीडिया को एस्पिर करने के बाद चढ़ाया कोशिकाओं के मोनोलेयर को कमजोर पड़ने की 1 मिलीएल स्थानांतरित करें, यह संक्रमण कदम होगा। संक्रमित प्लेट को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर इनक्यूबेट करें।
    7. मौजूदा संक्रमण मीडिया को एस्पिरेट करें, पीबीएस के साथ दो बार धीरे से कोट कोशिकाओं को धोएं और सभी 6 कुओं में मेथिलसेल्यूलोस लादेन मीडिया के 2 एमएल को अच्छी तरह से जोड़ें। 72 घंटे के लिए या सजीले टुकड़े के गठन तक इनक्यूबेट देखा जा सकता है। कोशिका मोनोलेयर में कोशिकाओं के बीच छोटे अंतराल के गठन से सजीले टुकड़े की पहचान की जा सकती है।
    8. प्रत्येक कुएं के कोने में मेथनॉल का 1 एमसीएल जोड़ें, दीवार को मार्गदर्शक टिप के रूप में उपयोग करें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 6 अच्छी तरह से थाली इनक्यूबेट । धीरे-धीरे कोशिका मोनोलेयर को परेशान या उत्तेजित किए बिना प्लेट से प्रत्येक कुएं की सामग्री को एस्पिरेट करें।
    9. 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में क्रिस्टल वायलेट काम समाधान के 1 एमएल जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी कोशिकाएं कवर की गई हैं। 30 मिनट के लिए अंधेरे में 6 अच्छी तरह से थाली इनक्यूबेट। क्रिस्टल वायलेट समाधान को त्यागकर इसे और शोषक कागज की शीट पर कुओं को सुखा दें।
    10. शुरुआती समाधान में कुल वायरस सामग्री की मात्रा निर्धारित करने के लिए उच्चतम कमजोर पड़ने पर सजीले टुकड़े की संख्या को गिनें। वायरल टाइटर की पुष्टि करने के लिए इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।

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Representative Results

प्रायोगिक एंटीवायरल की प्रभावकारिता को समझने के लिए, वीवो मानव नैदानिक परीक्षणों में भेजे जाने से पहले उन्हें बड़े पैमाने पर परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। इस संबंध में सकारात्मक नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण और परीक्षण समूहों की पहचान करनी होगी। ट्राइफ्लोरोथिमिडीन (टीएफटी) का उपयोग लंबे समय से दाद केराटिटिस सामयिक16के इलाज के लिए पसंदीदा उपचार के रूप में किया जाता रहा है। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया, टीएफटी इलाज कॉर्नियल समूहों कम संक्रमण फैल दिखाते हैं । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हमने पीबीएस में भंग डीएमएसओ या वाहन नियंत्रण का उपयोग किया। BX795, प्रायोगिक प्रीक्लिनिकल दवा परीक्षण समूह था। प्रत्येक समूह को कुल 4 कॉर्निया सौंपे गए और दवाओं को हर दिन 3 बार पोर्सिन कॉर्निया में जोड़ा गया । स्टीरियोस्कोपिक फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके हमारे परिणाम बताते हैं कि BX795 की एंटीवायरल प्रभावकारिता वायरल प्रसार को नियंत्रित करने में टीएफटी के समान है। हमारे अध्ययनों में वायरल प्रसार को स्टीरियोस्कोप में हरे फ्लोरेसेंस चैनल इमेजिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है। हमने देखा कि वाहन केवल नकारात्मक नियंत्रण समूह कॉर्निया का इलाज केंद्रीय संक्रमण क्षेत्र से अपनी परिधि के लिए वायरस के प्रसार से पता चला 6 दिन के बाद प्रारंभिक वायरल टीका, जबकि दोनों दवाओं (BX795 और TFT) दिन में संक्रमण साफ-6-6 छवियों(चित्रा 9A)। इसी तरह, 2 और 4 पोस्ट संक्रमण के दिनों में लिए गए नेत्र झाड़ू सकारात्मक नियंत्रण और BX795 उपचारित नमूनों में वायरस का पूर्ण अवरोध दिखाते हैं जबकि संक्रामक वायरस टाइटर में तेजी से वृद्धि नकारात्मक नियंत्रण समूह(चित्रा 9 बी)में देखी जाती है ।

Figure 1
चित्र 1:टिश्यू प्रोसेस होने तक बर्फ पर रखी पोर्सिन आंखें। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2:वर्क बेंच सेटअप. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:पोर्सिन आंखें धुंध पर रखी गई हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:30G सुई के साथ पोर्सिन आंख चित्र । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:30 जी सुई का इस्तेमाल किया; एपिथेलियल सतह के केंद्र में बनाया गया छेद । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:तेज निष्फल ब्लेड (ए, बी) का उपयोग करके कॉर्नियल किनारे को काटने के लिए उपयोग की जाने वाली घूर्णन कार्रवाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7:कॉर्निया छवियां। (A,B) कॉर्निया अंत में तेज कैंची(सी)अलग कॉर्निया चिमटी(डी)पूरी तरह से अलग कॉर्निया, उपयोग के लिए तैयार द्वारा आयोजित किया जाता है कटौती कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8:कॉर्निया 12-अच्छी तरह से प्लेट में रखा गया है और ७२ घंटे के लिए इनक्यूबेटेड है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9:संक्रमण के दौरान किए गए वायरल प्रसार की प्रगति। हौसले से उत्पादित पोर्सिन कॉर्निया एचएसवी-1 17-जीएफपी और(ए)से संक्रमित थे, जो 2, 4 और 6 पोस्ट संक्रमण के दिनों में माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेज्ड थे। DMSO, TFT या BX795 के साथ सामयिक उपचार 2 पोस्ट संक्रमण के दिन शुरू किया गया था । (ख)पट्टिका परख वेरो कोशिकाओं पर पोर्सिन कॉर्निया से लिए गए झाड़ू का उपयोग करके किया गया था । उपचार समूहों के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों को समझने के लिए दो तरह का ANOVA परीक्षण किया गया था । n=4, ****p=0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

पूर्व अनुसंधान एचएसवी-1 संक्रमण के खिलाफ एक एंटीवायरल एजेंट के रूप में एक आशाजनक भूमिका के लिए BX795 दिखाया गया है; टैंक-बाइंडिंग किनेज़ 1 (TBK1)16को रोककर । टीबीके 1 और ऑटोफैगी दोनों ने एचएसवी-1 संक्रमण को बाधित करने में मदद करने में भूमिका निभाई है जैसा कि मानव कॉर्नियल एपिथेलियल कोशिकाओं पर प्रदर्शित किया गया है। BX795 को 10μM की एकाग्रता पर एंटीवायरल गतिविधि के साथ अधिकतम प्रभावी दिखाया गया था और प्रमुख वायरल प्रोटीन के पश्चिमी दाग विश्लेषण और वायरल पट्टिका विश्लेषण दोनों का उपयोग करके, BX795 को टीएफटी16की गतिविधि के बराबर एचएसवी-1 संक्रमण को बाधित करने के लिए दिखाया गया था। पोर्सिन कॉर्निया पर अध्ययन ने एक ही विश्लेषण का पालन किया और ऊपर प्रदर्शित समान परिणाम प्राप्त किए; BX795 को संक्रमण को बाधित करने में टीएफटी के रूप में उतना ही प्रभावी दिखाया गया है - संक्रमण के दिन 4 और 6 पर पोर्सिन कॉर्निया की ली गई छवियां टीएफटी और बीएक्स795 दोनों में तुलनीय परिणाम दिखाती हैं। स्रावित वीरों को निर्धारित करने के लिए की गई पट्टिका का उपयोग भी इन निष्कर्षों को सुदृढ़ करता है16. BX795 ने विट्रो में एंटीवायरल प्रभाव भी दिखाया है और वीवो में माउस मॉडल में सामयिक रूप से इसके उपयोग ने कॉर्नियल एचएसवी-1 संक्रमण16का दमन भी दिखाया है ।

यह अध्ययन एचएसवी-1 संक्रमण के खिलाफ व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीवायरल आवेदन के लिए एक प्रभावी और अग्रणी यौगिक के रूप में BX795 स्थापित करने में योगदान देता है । टीएफटी के बराबर के रूप में पोर्सिन मॉडल में अपनी प्रभावकारिता दिखाकर, BX795 कई संक्रमण मॉडल16में सफल होने के लिए खड़ा है । इसके अतिरिक्त, BX795 महत्वपूर्ण है क्योंकि यह कई वायरस उपभेदों में प्रभावी दिखाया गया है, यहां तक कि एचएसवी-1 (KOS) tk12 जो एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दवा Acyclovir (ACV)16के लिए प्रतिरोधी है । BX975 इलाज कोशिकाओं एचएसवी-1 वायरल प्रोटीन जीबी जो एचएसवी-1 वायरस की अपनी निषेध प्रभावकारिता प्रमाणित की बहुत कम अभिव्यक्ति दिखाते हैं । BX795 भी अन्य उपचार और एंटी-दाद वायरस उपचारों की तुलना में कम खुराक पर बेहतर एंटी-वायरल प्रभावकारिता को दर्शाता है। इसके अलावा, BX795 (यहां तक कि 10 माइक्रोन की प्रस्तावित एकाग्रता) की चिकित्सीय सांद्रता कोशिकाओं के प्रति कोई प्रतिकूल साइटोटॉक्सिकिटी नहीं दिखाती है - कोई एपोप्टोसिस प्रलोभन और सेल डेथ, जो फिर से टीएफटी नियंत्रण16के बराबर है।

प्रोटोकॉल अनुभाग के भीतर महत्वपूर्ण कदम पूरी आंख से पोर्सिन कॉर्निया के अलगाव शामिल हैं। इसमें सुई का उपयोग करके आंख के केंद्र में कॉर्निया का डिब्राइडमेंट शामिल है और आईरिस को परेशान किए बिना धीरे-धीरे नेत्र सतह से कॉर्निया को उत्तेजित करने के बाद कोई स्ट्रोमल भागीदारी सुनिश्चित करने के लिए बहुत कम बल की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण चरणों के एक अन्य सेट में पूर्व-गीला कपास युक्तियां शामिल हैं और कॉर्नियल सतह को स्वैबिंग करते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रस्ताव कोमल होना चाहिए कि कॉर्नियल एपिथेलियम को नेत्र सतह से उखाड़ नहीं दिया जा रहा है ।

संशोधन एपिथेलियल डिब्राइडमेंट चरण में किया जा सकता है। कॉर्निया के केंद्र में एक प्रहार करने के लिए 30 जी सुई का उपयोग करने के बजाय, प्रयोगकर्ता कॉर्नियल एपिथेलियम के लिए ग्रिड के आकार की खरोंच बनाने के लिए एक बाँझ ब्लेड या 30 जी सुई का उपयोग कर सकता है। यह एपिथेलियम में मजबूत संक्रमण सुनिश्चित करता है।

पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग खरीद के उसी दिन किया जाना चाहिए और इसे 24 घंटे से अधिक समय तक आयोजित नहीं किया जाना चाहिए। 4 घंटे से अधिक समय तक बर्फ में रखा गया पोर्सिन कॉर्निया के परिणामस्वरूप कॉर्निया से चिपके आईरिस में परिणाम होगा। इससे उत्तेजना के दौरान कॉर्निया को बाकी आंखों से अलग करना कठिन हो जाता है। सभी पोर्सिन कॉर्निया समान रूप से संक्रमित नहीं होंगे। प्रयोगकर्ता को प्रति समूह न्यूनतम 5 आंखों को संक्रमित करना चाहिए और फिर प्रयोग के साथ आगे बढ़ने के लिए 2 पोस्ट संक्रमण पर समान रूप से संक्रमित कॉर्निया चुनना चाहिए।

वर्तमान तकनीक के महत्व में मानव कॉर्निया पर पोर्सिन का उपयोग करने की लागत प्रभावशीलता शामिल है। मानव कॉर्निया की तुलना में कॉर्निया की सापेक्ष ताजगी के कारण यह तकनीक भी महत्वपूर्ण है।

वर्तमान तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों में दवा पारमेबिलिटी अध्ययन, पूर्व वीवो फार्माकोकिनेटिक और फार्माकोडायनामिक अध्ययनों के परीक्षण में इसके उपयोग तक सीमित नहीं है। पोर्सिन कॉर्निया का इस्तेमाल एंटीवायरल दवाओं के अलावा एंटीबैक्टीरियल और एंटीफंगल दवाओं का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है। कॉर्निया भी पूर्व वीवो घाव भरने परख मधुमेह के घावों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों के हितों का कोई टकराव और कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

इस अध्ययन NIH अनुदान (R01 EY024710, RO1 AI139768, और RO1 EY029426) द्वारा डीएस एए को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान, NIH से एक F30EY025981 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । पार्क पैकिंग कंपनी, 4107 एशलैंड एवेन्यू, न्यू सिटी, शिकागो, आईएल-60609 से प्राप्त पोर्सिन कॉर्निया का उपयोग करके अध्ययन किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 G hypodermic needles. BD 305128
500 mL glass bottle. Thomas Scientific 844027
Antimycotic and Antibiotic (AA) GIBCO 15240096 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Benchtop vortexer. BioDot BDVM-3200
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. Thermofisher Scientific Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. Puritan 22029501
Cell scraper - 25 cm Biologix BE 70-1180 70-1250
Crystal violet Sigma Aldrich C6158 Store the powder in a dark place
Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM GIBCO 41966029 Store at 4 °C until use
Ethanol Sigma Aldrich E7023
Fetal bovine serum -FBS Sigma Aldrich F2442 Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use
Flat edged tweezers – 2. Harward Instruments 72-8595
Freezers --80 °C. - Thermofisher Scientific 13 100 790
Fresh box of blades. Thomas Scientific TE05091
Guaze Johnson & Johnson 108 square inch folder 12 ply
HSV-1 17GFP grown in house - Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17
Insulin, Transferrin, Selenium - ITS GIBCO 41400045 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Magnetic stirrer. Thomas Scientific H3710-HS
Metallic Scissors. Harward Instruments 72-8400
Micropipettes 1 to 1000 µL. Thomas Scientific 1159M37
Minimum Essential Medium - MEM GIBCO 11095080 Store at 4 °C until use
OptiMEM  GIBCO 31985047 Store at 4 °C until use
Penicillin/streptomycin. GIBCO 15140148 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Phosphate Buffer Saline -PBS GIBCO 10010072 Store at room temperature
Porcine Corneas Park Packaging Co., Chicago, IL Special order by request
Procedure bench covers - as needed. Thermofisher Scientific S42400
Serological Pipettes Thomas Scientific P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serological Pipetting equipment. Thomas Scientific Ezpette Pro
Stereoscope Carl Zeiss SteREO Discovery V20
Stirring magnet. Thomas Scientific F37120
Tissue culture flasks, T175 cm2. Thomas Scientific T1275
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. Thermofisher Scientific Forma 50145523
Tissue culture treated plates (6-well). Thomas Scientific T1006
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red GIBCO 25-300-062 Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use
Vero cells American Type Culture Collection ATCC CRL-1586

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 175 पूर्व वीवो कॉर्निया दाद सिंप्लेक्स वायरस टाइप-1 एंटीवायरल बीएक्स795 नेत्र संक्रमण
दाद सिंप्लेक्स वायरस-1 एंटीवायरल की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए पोर्सिन कॉर्नियल ऊतक एक्सप्लांट
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Yadavalli, T., Volety, I., Shukla, D. Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals. J. Vis. Exp. (175), e62195, doi:10.3791/62195 (2021).

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