Summary
Описано применение свиной роговицы для проверки противовирусной эффективности экспериментальных препаратов.
Abstract
Вирусы и бактерии могут вызывать различные дефекты поверхности глаз и дегенерацию, такие как раны и язвы, через инфекцию роговицы. С серораспространенностью, которая колеблется от 60-90% во всем мире, вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) обычно вызывает слизисто-кожные поражения орофациальной области, которые также проявляются как поражения и связанная с инфекцией слепота. Хотя современные противовирусные препараты эффективны, появление резистентности и сохранение токсичных побочных эффектов требует разработки новых противовирусных препаратов против этого вездесущего патогена. Хотя оценка in vitro предоставляет некоторые функциональные данные относительно появляющегося противовирусного препарата, они не демонстрируют сложность глазной ткани in vivo. Однако исследования in vivo стоят дорого и требуют обученного персонала, особенно при работе с вирусными агентами. Следовательно, модели ex vivo являются эффективными, но недорогими шагами для противовирусного тестирования. Здесь мы обсуждаем протокол изучения инфекции ВПГ-1 с использованием роговиц свиней ex vivo и метод их местного лечения с использованием существующих и новых противовирусных препаратов. Мы также демонстрируем метод проведения анализа бляшек с использованием ВПГ-1. Подробные методы могут быть использованы для проведения аналогичных экспериментов по изучению инфекций, которые напоминают возбудителя ВПГ-1.
Introduction
Люди, страдающие глазными инфекциями, часто страдают от потеризрения 1. С высокой серораспространенностью во всем мире инфицированные ВПГ лица страдают от повторяющихся глазных инфекций, которые приводят к рубцеванию роговицы, стромальному кератиту и неоваскуляризации2,3,4,5. Инфекции ВПГ также показали, что вызывают реже ряд серьезных состояний среди пациентов с ослабленным иммунитетом, нелеченных пациентов, таких как энцефалит и системная заболеваемость6,7,8. Такие препараты, как Ацикловир (ЯЦВ) и его аналоги нуклеозидов, показали последовательный успех в сдерживании инфекции ВПГ-1 и даже контроле реактивации, однако длительное использование этих препаратов связано с почечной недостаточностью, аномалиями плода и неспособностью ограничить появление лекарственной устойчивости к развивающимся вирусным штаммам9,10,11,12,13. Сложности, связанные с глазными инфекциями ВПГ-1, ранее изучались in vitro с использованием монослоев и 3D-культур клеток роговицы человека и in vivo с использованием мышиных или кроличьих глазных инфекций. Хотя эти модели in vitro предоставляют значительные данные о клеточных биологических компонентах инфекций ВПГ-1, они, однако, не могут имитировать сложную сложность ткани роговицы и мало что делают для освещения дендритного распространения вируса14. Напротив, хотя системы in vivo более проницательны в демонстрации распространения инфекции в роговице и реакций иммунной активации во время инфекции ВПГ-1, они приходят с оговоркой, что им требуются обученные исследователи и большие учреждения по уходу за животными, чтобы игнорировать эксперименты.
Здесь мы используем роговицу свиней в качестве модели ex vivo для изучения раневой системы, вызванной инфекцией ВПГ-1. Как потенциальная фармакология некоторых лекарств, так и клеточная и молекулярная биология раневой системы, вызванной инфекцией, могут быть изучены с помощью тканевых эксплантных культур. Эта модель также может быть изменена для использования при других вирусных и бактериальных инфекциях. В этом исследовании роговицы свиней использовались для проверки противовирусной эффективности доклинической малой молекулы BX795. Использование роговиц свиней было предпочтительным из-за простоты доступа и экономической эффективности. Кроме того, модели роговицы свиней являются хорошими моделями человеческих глаз, причем роговицы легко изолируются, имеют адекватный размер для инфекции и визуализации и надежны для обработки15. Роговицы свиней также сопоставимы со сложностью моделей роговицы человека как по транспроницаемости роговицы, так и по системной абсорбции15. Используя эту модель для исследования, мы смогли выяснить, как BX795 заслуживает дальнейшего изучения в качестве компетентного ингибитора вирусной инфекции ВПГ-1 и добавить к литературе классификацию его как потенциального маломолекулярного противовирусного соединения16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Вся свиная ткань, используемая в этом исследовании, была предоставлена сторонней частной организацией, и ни одна из обработк животных не была выполнена персоналом Университета Иллинойса в Чикаго.
1. Материалы
-
Реагентов
- Используйте следующие реагенты для анализа бляшек: порошковая метилцеллюлоза, модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM), фетальная бытовая сыворотка (FBS), пенициллин и стрептомицин (P / S) для анализа бляшек.
- Используйте кристаллические фиолетовые таблетки и этанол (молекулярно-биологический сорт) для приготовления кристаллического фиолетового раствора для анализа бляшек.
-
Среда роста клеток Vero - ЦЕЛЬНАЯ среда DMEM
- Откройте флакон со средой DMEM внутри вытяжки для культивации тканей. Извлеките 55 мл среды из бутылки с помощью серологической пипетки и выбросьте ее. Добавить 50 мл FBS P/S к DMEM. Хранить в холодильнике при 4 °C.
-
Среда для анализа бляшек - Запас 5% метилцеллюлозных сред
- Отмерьте 2,5 г порошка метилцеллюлозы с помощью перемешивающего магнита внутри стеклянной бутылки объемом 500 мл и автоклавните ее. После того, как бутылка остынет до комнатной температуры, возьмите 500 мл цельной среды DMEM, содержащей 50 мл FBS и 5 мл P/S, и добавьте ее в стеклянную бутылку, содержащую метилцеллюлозу.
- Перемешайте при 4 °C в течение 2 дней с помощью магнитной мешалки. Хранить в холодильнике при 4 °C.
-
Подготовка среды для иссеченной роговицы свиней
- Откройте бутылку с минимально необходимыми средами (MEM) внутри вытяжки для культивирование тканей. Выбросьте 10 мл MEM из бутылки с помощью серологической пипетки.
- Добавьте 5 мл инсулина-трансферрина-селена (ИТС) и 5 мл антимикотик-антибиотика (АА) в жиму и охладить при 4°C.
-
Мастер и рабочий фонд хрустальной фиалки:
- Чтобы сделать кристаллический фиолетовый бульоновый раствор, добавьте 1 г кристаллического фиолетового порошка к 100 мл 20% этанола в воде. Этот запас (1% мас./v кристаллической фиалки) можно хранить и использовать до года при хранении в темном месте.
- Чтобы сделать из этого рабочий запас, добавьте 50 мл оригинального стоковой раствора на 350 мл воды. Добавьте 100 мл этанола в этот раствор, чтобы получить 500 мл рабочего кристаллического фиолетового раствора (0,1% мас./v кристаллического фиолетового).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба этих раствора необходимо хранить в темноте.
2. Процедура
- Выделение роговицы свиней из цельных глаз17
- Получив глаза свиней от подходящего продавца, храните на льду, если есть задержка с обработкой тканей, как показано на рисунке 1.
- Убедитесь, что во время этой процедуры используются и носят средства индивидуальной защиты, чтобы избежать загрязнения, а также несчастных случаев от разлива стекловидного подела.
- Опрыскивайте рабочую зону 70% этанолом для очистки и дезинфекции. Чтобы обеспечить стабильность рабочего пространства, надежно распределите крышку скамейки и лентой по бокам, как показано на рисунке 2.
- Поместите глаза свиней на марлю(рисунок 3). Используя марлю 50 мм, держите заднее сечение(рисунок 4A)глаз свиней, как показано на рисунке 4B, одной рукой.
- С помощью иглы 30 Г осторожно сделайте один удар примерно по центру эпителиальной поверхности глаза и убедитесь, что строма не повреждена(рисунок 5). Поке должен быть ограничен эпителием (~ 100-200 мкм), чтобы избежать стромального поражения.
- Используя острое стерилизованное лезвие, сделайте небольшой разрез на склере на расстоянии 1 мм от роговицы. Обрежьте край роговицы, чтобы стекловидное тело не протекала, используя быстрое и плавное вращательное действие руки(рисунок 6А). Удерживая роговицу у края роговицы-склеры плоским пинцем, с помощью лезвия отрежьте оставшиеся привязные мембраны глаза(рисунок 6В).
- Возьмите роговицу и поместите ее в 12-колодезируемую пластину, наложенную 2 мл роговицы. Роговицу следует располагать лицом вверх, что показано в серии шагов на рисунках 7A-D, рисунок 8).
- Добавьте 5 мкл раствора вируса, содержащего 5 х 105 бляшек, образующих единицы (ПФЕ) 17 GFP, к санированной площадке на поверхности роговицы. Поместите 12-колодезную пластину, содержащую зараженные роговицы свиней, в инкубатор с 5% CO2 в течение 72 ч.
- Распылите любые дополнительные глаза, не используемые в эксперименте, с 10% отбеливателем и надежно утилизируйте в биологические мешки.
- Визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус следует визуализировать каждый день перед добавлением лекарств.- Включите стереомикроскоп и светодиодный источник света и позвольте лампе машины прогреться перед визуализацией роговицы. Аккуратно пронесем пластинку роговицы к инструменту, не нарушая раствор. Измените фильтр таким образом, чтобы для просмотра образцов использовался GFP (380-460 нм). Установите время экспозиции на 500 мс для захвата изображений.
- Во-первых, поместите пластину роговицы под стереоскоп и захватите изображения с наименьшим увеличением 7,5x. Затем следует серия изображений с увеличением увеличения (например, 15x, 25x, 35x), так что все вирусное распространение и образование дендритов визуализируются.
- Обязательно верните зараженные роговицы обратно в инкубатор культуры тканей и сохраните все снимки, которые были сделаны.
- Количественная оценка вирусной инфекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Титры вируса из роговицы свиней следует оценивать каждый день для анализа эффекта от медикаментозного лечения.- Для количественной оценки вируса засейте клетки Vero плотностью 5 х 105 клеток на скважину, если использовать 6-колодезную пластину, как это было сделано в этом эксперименте. Делайте это за день до заражения. Инкубировать позолоченные клетки в течение ночи, чтобы убедиться, что они сливаются для количественной оценки вируса.
- Aliquot 500 мкл свободных сред сыворотки в несколько микроцентрифужных пробирок. Вставить стерильный ватный тампон с наконечником, смоченный в сыворотке свободной среды, заполненной пробирками. Ватные тампоны необходимо окунуть и смачивать не менее чем за 5 минут до использования.
- Не нарушая подлежащие среды, транспортировать инфицированную пластину роговицы свиней в шкаф биобезопасности. Используя влажные ватные тампоны, сделайте 3 оборота по часовой стрелке и 3 оборота против часовой стрелки на диаметре 5 мм от центра зараженной роговицы свиньи, не применяя чрезмерного давления.
- Вставьте обратно ватный тампон в сыворотку свободной среды, заполненную микроцентрифужной трубкой, и поверните ее по часовой стрелке и против часовой стрелки 5 раз. Металлический наконечник ватного тампона должен быть обрезан так, чтобы он полностью помещался в микроцентрифужную трубку, а крышку можно было закрыть.
- Поместите трубку микроцентрифуги, содержащую мазанный хлопковый наконечник, на вихревую машину и вихрь на высокой скорости в течение 1 мин.
- Выполните количественную оценку вируса с помощью анализа бляшек на этих образцах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап количественной оценки должен быть выполнен на 2, 4 день и, по желанию, на 6 днях после заражения.
- Количественная оценка вируса с помощью анализа бляшек
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выполнить анализ бляшек, вырастите и размяжите клетки Vero в 6-колодезную пластину и обеспечьте 90% слияние клеток до начала анализа. Используйте смеяную колбу этих клеток75 см2. Все описанные ниже шаги должны быть выполнены внутри шкафа биобезопасности.- Смыть слеющийся монослой клеток Vero в колбе 10 мл свежего фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) после аспирации питательной среды. Повторите этап стирки еще раз с PBS после аспирации первого набора раствора для стирки.
- Добавьте 1 мл 0,05% трипсина в клеточный монослой. Инкубировать колбу при 37 °C в течение 5 мин. Невооруженным глазом убедитесь, что клетки отделены от внутренней поверхности колбы. Если нет, подождите еще 5 минут, прежде чем снова озучить колбу. Когда клетки кажутся отсоединенными, добавьте 9 мл целой среды в монослой, чтобы гарантировать, что клетки полностью вытесняются с поверхности колбы.
- Соберите все клетки из колбы вместе со всей средой и поместите их в трубку центрифуги 15 мл.
- Для каждого колодца из 6 пластин скважины, которые используются для анализа бляшек, используйте 300 мкл из центрифужной трубки. Пополняйте каждую скважину из 6 плит скважин 2 мл целой среды. Оставьте пластины в инкубаторе на ночь, чтобы они росли и образовывать в каждом колодце сливаемый монослой.
- Для того, чтобы выполнить анализ бляшек, необходимо провести серийное разведение образцов перед количественной оценкой вируса.
- Выполняютлогарифмное 10-кратноеразведение вируса в микроцентрифужных пробирках с использованием сывороточных свободных сред до достижения разведения 10-8. Когда при разведении10 -3 переложить 1 мл разведения на монослой позолоченных клеток после аспирации ростовой среды на клетках из 6-й пластины, это будет этап заражения. Инкубируют инфицированную пластину при 37 °C инкубатора в течение 2 ч.
- Аспирировать существующие инфекционные среды, дважды осторожно промыть PBS для покрытия клеток и добавить 2 мл метилцеллюлозной среды на скважину во все 6 скважин. Насиживают в течение 72 ч или до образования бляшек можно будет увидеть. Бляшки можно выявить по образованию небольших промежутков между клетками в клеточном монослое.
- Медленно добавляйте 1 мл метанола в угол каждой скважины, используя стенку в качестве направляющего наконечника. Инкубировать плиту из 6 скважин при комнатной температуре в течение 15 мин. Медленно аспирировать содержимое каждой скважины с пластины, не нарушая и не перемешивая монослой клетки.
- Добавьте 1 мл кристаллического фиолетового рабочего раствора в каждую скважину из 6 пластин, обеспечив покрытие всех ячеек. Инкубировать 6-ю пластину в темноте в течение 30 мин. Выбросьте кристаллический фиолетовый раствор, аспирируя его, и высушите колодцы на листе абсорбирующей бумаги.
- Подсчитайте количество бляшек в наибольшем разведении, чтобы количественно оценить общее содержание вируса в исходном растворе. Повторите процесс дважды, чтобы подтвердить вирусный титр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы понять эффективность экспериментальных противовирусных препаратов, их необходимо тщательно протестировать, прежде чем они будут отправлены на клинические испытания in vivo на людях. В связи с этим необходимо выявить группы положительного контроля, отрицательного контроля и тестов. Трифтортимидин (ТФТ) уже давно используется в качестве предпочтительного лечения герпетического кератита местно16. Используемые в качестве положительного контроля, группы роговицы, обработанные TFT, показывают более низкое распространение инфекции. В качестве отрицательного контроля мы использовали DMSO или управление транспортным средством, растворенным в PBS. BX795, экспериментальный доклинический препарат, был тестовой группой. В общей сложности 4 роговицы были назначены каждой группе, и препараты добавлялись 3 раза каждый день в роговицу свиней. Наши результаты с использованием стереоскопической флуоресцентной визуализации показывают, что противовирусная эффективность BX795 аналогична TFT в контроле распространения вируса. Распространение вируса в наших исследованиях можно визуализировать, визуализируя зеленый флуоресцентный канал в стереоскопе. Мы наблюдали, что только обработанные роговицы отрицательной контрольной группы показали распространение вируса из центральной инфекционной зоны на ее периферию через 6 дней после первоначальной вирусной инокуляции, в то время как оба препарата (BX795 и TFT) очищают инфекцию на 4-6 день изображений(рисунок 9A). Аналогичным образом, глазные мазки, взятые на 2 и 4 день после заражения, показывают полное ингибирование вируса в положительном контроле и обработанных BX795 образцах, в то время как резкое увеличение титра инфекционного вируса наблюдается в отрицательной контрольной группе(рисунок 9B).
Рисунок 1:Глаза свиней держат на льду до тех пор, пока ткань не будет обработана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Настройка рабочего стенда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Глаза свиней, помещенные на марлю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Свиной глаз с иглой 30G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Используется игла 30 г; отверстие сделано в центре эпителиальной поверхности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Вращающееся действие, используемое для разрезания вокруг края роговицы с использованием острого стерилизованного лезвия (A, B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Изображения роговицы. (А,Б) Роговица окончательно разрезается острыми ножницами(C)Изолированная роговица удерживается пинцем(D)Полностью изолированная роговица, готовая к использованию Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8:Роговицы помещены в 12-скважинную пластину и инкубированы в течение 72 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9:Прогрессирование вирусного распространения, назначаемое во время течения инфекции. Свежеиссеченные роговицы свиней были инфицированы ВПГ-1 17-GFP и(A),изображенные с помощью микроскопа на 2, 4 и 6 день после заражения. Местное лечение DMSO, TFT или BX795 было начато на 2-й день после заражения. (B) Анализы бляшек проводились с использованием мазков, взятых из роговиц свиней на клетках Веро. Двусторонний тест ANOVA был выполнен для понимания существенных различий между группами лечения. n=4, ****p=0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущие исследования показали, что BX795 играет многообещающую роль в качестве противовирусного средства против инфекции ВПГ-1; путем ингибирования TANK-связывающей киназы 1 (TBK1)16. Как TBK1, так и аутофагия сыграли определенную роль в ингибировании инфекции ВПГ-1, как показано на эпителиальных клетках роговицы человека. Было показано, что BX795 максимально эффективен с противовирусной активностью в концентрации 10 мкМ, и, используя как анализ вестерн-блот, так и анализ вирусных бляшек ключевых вирусных белков, BX795 ингибирует инфекцию ВПГ-1, сопоставимую с активностью TFT16. Исследование роговицы свиней проводилось после того же анализа и было получено сходных результатов, как показано выше; Показано, что BX795 так же эффективен, как и TFT, в ингибировании инфекции - изображения, сделанные роговицами свиней на 4 и 6-м дне инфекции, показывают сопоставимые результаты как по TFT, так и по BX795. Анализы бляшек, выполненные для количественной оценки секретируемых вирионов, также подтверждают эти результаты16. BX795 также показал, что обладает противовирусным эффектом in vitro, и его местное использование в мышиных моделях in vivo также показало подавление инфекции ВПГ-1 роговицы16.
Исследование способствует установлению BX795 в качестве эффективного и ведущего соединения для противовирусного применения широкого спектра действия против инфекции ВПГ-1. Демонстрируя свою эффективность в моделях свиней как сопоставимую с TFT, BX795 является успешным в моделях с несколькими инфекциями16. Кроме того, BX795 важен, поскольку было показано, что он эффективен при нескольких штаммах вируса, даже в HSV-1 (KOS)tk12, который устойчив к другому широко используемому препарату Acyclovir (ACV)16. Клетки, обработанные BX975, показывают очень слабую экспрессию вирусного белка ВПГ-1 gB, что подтверждает его эффективность ингибирования вируса ВПГ-1. BX795 также демонстрирует лучшую противовирусную эффективность при более низких дозах по сравнению с другими методами лечения и антигерапесвирусной терапией. Кроме того, терапевтические концентрации BX795 (даже предполагаемая концентрация 10 мкМ) не показывают неблагоприятной цитотоксичности по отношению к клеткам - нет индуцирования апоптоза и гибели клеток, что опять же сопоставимо с контролем TFT16.
Критические шаги в рамках раздела протокола включают выделение роговицы свиней из всего глаза. Это включает в себя саниду роговицы в центре глаза с помощью иглы и требует очень небольшой силы, чтобы обеспечить отсутствие стромального участия с последующим аккуратным высечением роговицы с глазной поверхности, не нарушая радужную оболочку. Другой набор критических шагов включает в себя детали, включающие предварительное смачивание хлопчатобумажных наконечников и смачивание поверхности роговицы. Движение должно быть мягким, чтобы эпителий роговицы не смещался с глазной поверхности.
Модификация может быть сделана на этапе санирация эпителия. Вместо того, чтобы использовать иглу 30 Г для одного тычка в центре роговицы, экспериментатор может использовать стерильное лезвие или иглу 30 г, чтобы аккуратно сделать сетчатые царапины на эпителии роговицы. Это обеспечивает устойчивую инфекцию эпителия.
Роговицы свиней следует использовать в тот же день заготовки и не следует удерживать дольше 24 ч. Роговицы свиней, удерживаемые во льду более 4 ч, приведут к тому, что радужная оболочка прилипнет к роговице. Это затрудняет отделение роговицы от остальной части глаза во время иссечения. Не все роговицы свиней будут инфицированы одинаково. Экспериментатор должен заразить не менее 5 глаз в группе, а затем выбрать одинаково инфицированные роговицы на 2-й день после заражения, чтобы продолжить эксперимент.
Значение нынешнего метода связано с экономической эффективностью использования свинины над роговицей человека. Метод также важен из-за относительной свежести используемых роговиц по сравнению с роговицей человека.
Будущие применения нынешнего метода включают, но не ограничиваются его использованием в испытаниях исследований проницаемости лекарственных средств, фармакокинетических и фармакодинамических исследованиях ex vivo. Роговицы свиней также могут быть использованы для тестирования антибактериальных и противогрибковых препаратов в дополнение к противовирусным препаратам. Роговицы также могут быть использованы для анализа заживления ран ex vivo для изучения диабетических ран.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов и конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 и RO1 EY029426) для D.S. A.A. было поддержано грантом F30EY025981 от Национального института глаз, NIH. Исследование проводилось с использованием роговицы свиней, полученной от компании Park Packing, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers --80 °C. - | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | - | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium - ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium - MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | Special order by request | |
| Procedure bench covers - as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
References
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
