Summary
We beschrijven het gebruik van een varkenshoornvlies om de antivirale werkzaamheid van experimentele geneesmiddelen te testen.
Abstract
Virussen en bacteriën kunnen een verscheidenheid aan oculaire oppervlaktedefecten en degeneratie veroorzaken, zoals wonden en zweren door hoornvliesinfectie. Met een seroprevalentie die wereldwijd varieert van 60-90%, veroorzaakt het Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) vaak mucocutane laesies van het orofaciale gebied die zich ook manifesteren als laesies en infectiegerelateerde blindheid. Hoewel de huidige antivirale geneesmiddelen effectief zijn, vereist het ontstaan van resistentie en persistentie van toxische bijwerkingen de ontwikkeling van nieuwe antivirale middelen tegen deze alomtegenwoordige ziekteverwekker. Hoewel in vitro beoordeling enkele functionele gegevens oplevert met betrekking tot een opkomend antiviraal middel, tonen ze de complexiteit van oculair weefsel in vivo niet aan. In vivo studies zijn echter duur en vereisen getraind personeel, vooral bij het werken met virale agentia. Vandaar dat ex vivo modellen efficiënte maar goedkope stappen zijn voor antivirale testen. Hier bespreken we een protocol om infectie door HSV-1 te bestuderen met behulp van varkenshoornvliezen ex vivo en een methode om ze topisch te behandelen met behulp van bestaande en nieuwe antivirale geneesmiddelen. We demonstreren ook de methode om een plaque-assay uit te voeren met behulp van HSV-1. De gedetailleerde methoden kunnen worden gebruikt om vergelijkbare experimenten uit te voeren om infecties te bestuderen die lijken op de HSV-1-ziekteverwekker.
Introduction
Mensen die lijden aan ooginfecties lopen vaak verlies van hetgezichtsvermogen op 1. Met een hoge seroprevalentie wereldwijd lijden HSV-geïnfecteerde personen aan terugkerende ooginfecties die leiden tot cornealittekens, stromale keratitis en neovascularisatie2,3,4,5. HSV-infecties hebben ook aangetoond dat ze minder vaak een reeks ernstige aandoeningen veroorzaken bij immuungecompromitteerde, onbehandelde patiënten zoals encefalitis en systemische morbiditeit6,7,8. Geneesmiddelen zoals Acyclovir (ACV) en zijn nucleoside-analogen hebben consistent succes getoond bij het beteugelen van HSV-1-infectie en zelfs controlereactivering, maar het langdurige gebruik van deze geneesmiddelen is geassocieerd met nierfalen, foetale afwijkingen en het niet beperken van de opkomst van geneesmiddelresistentie tegen evoluerende virale stammen9,10,11,12,13. Complexiteiten geassocieerd met HSV-1 oculaire infecties, zijn eerder in vitro bestudeerd met behulp van monolagen en 3D-culturen van menselijke hoornvliescellen en in vivo met behulp van muizen- of konijnenoculaire infecties. Hoewel deze in vitro modellen significante gegevens opleveren over de cellulaire biologische componenten van HSV-1-infecties, slagen ze er echter niet in om de ingewikkelde complexiteit van hoornvliesweefsel na te bootsen en doen ze weinig om de dendritische verspreiding van het virus te verlichten14. Hoewel in vivo systemen daarentegen inzichtelijker zijn in het aantonen van infectieverspreiding in hoornvliezen en immuunactivatieresponsen tijdens HSV-1-infectie, komen ze met het voorbehoud dat ze getrainde onderzoekers en grote faciliteiten voor dierenverzorging nodig hebben om de experimenten over het hoofd te zien.
Hier gebruiken we varkenshoornvliezen als een ex vivo model om het door HSV-1-infectie geïnduceerde wondsysteem te onderzoeken. Zowel de potentiële farmacologie van bepaalde geneesmiddelen als de cel- en moleculaire biologie van het wondsysteem veroorzaakt door de infectie kunnen worden bestudeerd door middel van weefselexplantatieculturen. Dit model kan ook worden aangepast voor het gebruik voor andere virale en bacteriële infecties. In deze studie werden varkenshoornvliezen gebruikt om de antivirale werkzaamheid van een preklinisch klein molecuul, BX795, te testen. Het gebruik van varkenshoornvliezen had de voorkeur vanwege de gemakkelijke toegang en de kosteneffectiviteit. Bovendien zijn varkens corneamodellen goede modellen van menselijke ogen, waarbij de hoornvliezen gemakkelijk te isoleren zijn, voldoende groot zijn voor infectie en visualisatie en robuust zijn om15te verwerken . Varkenshoornvliezen zijn ook vergelijkbaar met de complexiteit van menselijke hoornvliesmodellen in zowel trans corneapermeabiliteit als systemische absorptie15. Door dit model voor de studie te gebruiken, konden we ophelderen hoe BX795 het waard is om verder te worden onderzocht als een competente remmer van HSV-1-virusinfectie en voegt het toe aan de literatuur van het classificeren als een potentiële antivirale verbinding met klein molecuul16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het varkensweefsel dat in deze studie werd gebruikt, werd geleverd door een externe particuliere organisatie en geen van de dierbehandeling werd uitgevoerd door personeel van de Universiteit van Illinois in Chicago.
1. Materialen
-
Reagentia
- Gebruik de volgende reagentia voor plaquetest: poedermethylcellulose, Dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), penicilline en streptomycine (P / S) voor plaquetest.
- Gebruik kristalviolettabletten en ethanol (moleculair biologische kwaliteit) voor het bereiden van kristalviolette oplossing voor plaque-assay.
-
Vero cell groeimedia - DMEM hele media
- Open de DMEM-mediafles in de tissuekweekkap. Verwijder 55 ml media uit de fles met een serologische pipet en gooi deze weg. Voeg 50 ml FBS P/S toe aan DMEM. Koel bij 4 °C.
-
Plaque assay media - Voorraad van 5% methylcellulose media
- Meet 2,5 g methylcellulosepoeder met een roermagneet in een glazen fles van 500 ml en autoclaaf het. Nadat de fles is afgekoeld tot kamertemperatuur, neemt u 500 ml DMEM hele media met 50 ml FBS en 5 ml P / S en voegt u deze toe aan een glazen fles met methylcellulose.
- Roer dit bij 4 °C gedurende 2 dagen met behulp van een magneetroerder. Koel bij 4 °C.
-
Mediavoorbereiding voor weggesneden varkenshoornvlies
- Open een mem-fles (minimum essential media) in de weefselkweekkap. Gooi 10 ml MEM uit de fles met behulp van een serologische pipet.
- Voeg 5 ml insuline-transferrine-selenium (ITS) en 5 ml antimycotisch-antibioticum (AA) toe aan de media en koel bij 4 °C.
-
Meester- en werkvoorraad kristalviolet:
- Om de kristalviolette stamoplossing te maken, voegt u 1 g kristalvioletpoeder toe aan 100 ml 20% ethanol in water. Deze voorraad (1% w/v kristalviolet) kan tot een jaar worden bewaard en gebruikt wanneer deze op een donkere plaats wordt bewaard.
- Om hier een werkvoorraad van te maken, voegt u 50 ml originele voorraadoplossing toe aan 350 ml water. Voeg 100 ml ethanol toe aan deze oplossing om een 500 ml werkende kristalvioletoplossing (0,1% m/v kristalviolet) te maken.
OPMERKING: Beide oplossingen moeten in het donker worden opgeslagen.
2. Werkwijze
- Isolatie van varkenshoornvliezen van hele ogen17
- Na ontvangst van de varkensogen van een geschikte verkoper, bewaar op ijs als er een vertraging is met weefselverwerking zoals afgebeeld in figuur 1.
- Zorg ervoor dat persoonlijke beschermingsmiddelen worden gebruikt en gedragen tijdens deze procedure om besmetting en ongevallen door morsen van glasachtig humor te voorkomen.
- Spuit het werkgebied met 70% ethanol om te reinigen en te desinfecteren. Om ervoor te zorgen dat de werkruimte stabiel is, spreidt u een bankafdekking uit en plakt u de zijkanten stevig af zoals afgebeeld in figuur 2.
- Plaats varkensogen op gaas (figuur 3). Houd met behulp van 50 mm gaas het achterste gedeelte (figuur 4A) van de varkensogen vast, zoals weergegeven in figuur 4B, met één hand.
- Maak met een naald van 30 G voorzichtig een enkele prik in ongeveer het midden van het epitheeloppervlak van het oog en zorg ervoor dat er geen schade aan stroma is(figuur 5). De prik moet worden beperkt tot het epitheel (~ 100-200 μm) om stromale betrokkenheid te voorkomen.
- Maak met behulp van een scherp gesteriliseerd mes een kleine incisie op de sclera op 1 mm afstand van het hoornvlies. Snijd de rand van het hoornvlies af om ervoor te zorgen dat de glasvochthumor niet lekt met behulp van een snelle en soepele roterende actie van de hand(figuur 6A). Door het hoornvlies aan de rand van het hoornvlies-sclera met een plat pincet vast te houden, snijdt u de resterende tethering membranen van het oog af met behulp van het mes (Figuur 6B).
- Neem het hoornvlies en plaats het in een 12-well plaat bedekt met 2 ml hoornvlies medium. Het hoornvlies moet naar boven worden geplaatst, aangetoond in een reeks stappen in figuren 7A-D, figuur 8).
- Voeg 5 μL van de virusoplossing met 5 x 105 plaquevormende eenheden (PFU) van 17 GFP toe aan de gedebrideerde plaats op het hoornvliesoppervlak. Plaats de 12-well plaat met geïnfecteerde varkenshoornvliezen gedurende72 uur in een incubator met 5% CO 2.
- Spray eventuele extra ogen die niet in het experiment zijn gebruikt met 10% bleekmiddel en veilig weggegooid in biohazard-zakken.
- Visualisatie
OPMERKING: Het virus moet elke dag worden gevisualiseerd voorafgaand aan de toevoeging van geneesmiddelen.- Schakel de stereomicroscoop en LED-lichtbron in en laat de lamp van de machine opwarmen voordat u de hoornvliezen in beeld brengen. Draag de plaat met hoornvliezen voorzichtig naar het instrument zonder de oplossing te verstoren. Vervang het filter zodat GFP (380-460 nm) wordt gebruikt om naar monsters te kijken. Stel de belichtingstijd in op 500 ms om beelden vast te leggen.
- Plaats eerst de hoornvliesplaat onder de stereoscoop en leg de beelden vast met de laagste vergroting van 7,5x. Volg dit op met een reeks toenemende vergrotingsbeelden (bijv. 15x, 25x, 35x) zodat alle virale verspreiding en dendrietvorming duidelijk wordt gevisualiseerd
- Zorg ervoor dat u de geïnfecteerde hoornvliezen terugbrengt naar de weefselkweekincubator en sla alle foto's op die zijn gemaakt.
- Kwantificering van virusinfecties
OPMERKING: Virustiters van varkenshoornvliezen moeten elke dag worden geëvalueerd om het effect van medicamenteuze behandeling te analyseren.- Om het virus te kwantificeren, zaad Vero-cellen met een dichtheid van 5 x10 5 cellen per put als een 6-well plaat wordt gebruikt, zoals in dit experiment is gedaan. Doe dit een dag voor de infectie. Incubeer de vergulde cellen 's nachts om ervoor te zorgen dat ze samenvloeien voor viruskwantificering.
- Aliquot 500 μL serumvrije media in meerdere microcentrifugebuizen. Plaats steriel wattenstaafje gedompeld in de met serumvrije media gevulde buisjes. De wattenstaafjes moeten minstens 5 minuten voor gebruik worden gedoopt en bevochtigd.
- Zonder de onderliggende media te verstoren, transporteert u de geïnfecteerde hoornvliesplaat van varkens naar een bioveiligheidskast. Maak met behulp van de natte wattenstaafjes 3 omwentelingen met de klok mee en 3 omwentelingen tegen de klok in bij een diameter van 5 mm vanaf het midden van het geïnfecteerde varkenshoornvlies zonder overmatige druk uit te oefenen.
- Steek het wattenstaafje terug in de met serumvrije media gevulde microcentrifugebuis en draai het 5 keer met de klok mee en tegen de klok in. De metalen punt van het wattenstaafje moet worden ingekort zodat het volledig in de microcentrifugebuis past en het deksel kan worden gesloten.
- Plaats de microcentrifugebuis met het afgeveegde watje op een vortexmachine en vortex op hoge snelheid gedurende 1 min.
- Voer viruskwantificering uit via een plaquetest op deze monsters.
OPMERKING: Deze kwantificeringsstap moet worden uitgevoerd op dag 2, 4 en optioneel op 6 dagen na infectie.
- Viruskwantificering door Plaque-assay
OPMERKING: Om een plaque-assay uit te voeren, groeien en platen Vero-cellen in een 6-putplaat en zorgen voor 90% confluentie van cellen vóór het begin van de test. Gebruik een kolf van 75 cm2 van deze cellen. Alle onderstaande stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast.- Was de samenvloeiende monolaag van Vero-cellen in de kolf met 10 ml verse fosfaatbufferzilte (PBS) na het aanzuigen van het kweekmedium. Herhaal de wasstap nogmaals met PBS na het aanzuigen van de eerste set wasoplossing.
- Voeg 1 ml 0,05% trypsine toe aan de celmonolaag. Incubeer de kolf bij 37 °C gedurende 5 min. Zorg er met het blote oog voor dat de cellen loskomen van het binnenoppervlak van de kolf. Zo niet, wacht dan nog eens 5 minuten voordat u de kolf opnieuw onderzoekt. Wanneer cellen lijken te zijn losgemaakt, voegt u 9 ml hele media toe aan de monolaag om ervoor te zorgen dat de cellen zich volledig losmaken van het kolfoppervlak.
- Verzamel alle cellen uit de kolf samen met het hele medium en plaats ze in een centrifugebuis van 15 ml.
- Gebruik voor elke put van de 6 putplaten die worden gebruikt voor plaque-assay 300 μL uit de centrifugebuis. Top elke put van de 6 putplaat bij met 2 ml hele media. Laat de platen een nacht in de incubator om ze te laten groeien en een confluente monolaag te vormen in elke put.
- Om een plaquetest uit te voeren, moet een seriële verdunning van monsters worden uitgevoerd voordat het virus wordt gekwantificeerd.
- Voer een log101-voudige verdunning van het virus uit in microcentrifugebuizen met behulp van serumvrije media totdat een verdunning van 10-8 is bereikt. Wanneer bij een verdunning van 10-3 1 ml van de verdunning wordt overgedragen aan de monolaag van vergulde cellen na het opzuigen van de groeimedia op de cellen van de 6-putplaat, zal dit de infectiestap zijn. Incubeer de geïnfecteerde plaat bij 37 °C incubator gedurende 2 uur.
- Aspirateer de bestaande infectiemedia, was tweemaal voorzichtig met PBS om cellen te coaten en voeg 2 ml met methylcellulose beladen media per put toe aan alle 6 putten. Incubeer gedurende 72 uur of totdat de vorming van plaques kan worden gezien. Plaques kunnen worden geïdentificeerd door de vorming van kleine openingen tussen cellen in de celmonolaag.
- Voeg langzaam 1 ml methanol toe aan de hoek van elke put en gebruik de muur als geleidingspunt. Incubeer de 6 well plaat op kamertemperatuur gedurende 15 min. Adem langzaam de inhoud van elke put uit de plaat zonder de celmonolaag te verstoren of te roeren.
- Voeg 1 ml kristalviolet werkoplossing toe aan elke put van 6 putplaat, zodat alle cellen bedekt zijn. Incubeer de 6 well plaat in het donker gedurende 30 min. Gooi de kristalviolette oplossing weg door deze op te zuigen en droog de putjes op een vel absorberend papier.
- Tel het aantal plaques bij de hoogste verdunning goed om het totale virusgehalte in de startoplossing te kwantificeren. Herhaal het proces twee keer om de virale titer te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de werkzaamheid van de experimentele antivirale middelen te begrijpen, moeten ze uitgebreid worden getest voordat ze worden verzonden voor in vivo klinische onderzoeken bij mensen. In dit verband moeten positieve controle-, negatieve controle- en testgroepen worden geïdentificeerd. Trifluorothymidine (TFT) wordt al lang gebruikt als de voorkeursbehandeling om herpes keratitis topisch te behandelen16. Gebruikt als een positieve controle, vertonen de tft behandelde hoornvliesgroepen een lagere infectieverspreiding. Als negatieve controle gebruikten we DMSO of voertuigbesturing opgelost in PBS. BX795, het experimentele preklinische medicijn was de testgroep. In totaal werden 4 hoornvliezen toegewezen aan elke groep en de geneesmiddelen werden 3 keer per dag toegevoegd aan de varkenshoornvliezen. Onze resultaten met behulp van stereoscopische fluorescentie beeldvorming tonen aan dat de antivirale werkzaamheid van BX795 vergelijkbaar is met TFT bij het beheersen van virale verspreiding. Virale verspreiding in onze studies kan worden gevisualiseerd door het groene fluorescentiekanaal in de stereoscoop in beeld te brengen. We zagen dat het voertuig alleen negatieve controlegroep cornea's vertoonde verspreiding van het virus van de centrale infectiezone naar de periferie binnen 6 dagen na de eerste virale inenting, terwijl beide geneesmiddelen (BX795 en TFT) de infectie op dag 4 - 6 beelden verwijderen (Figuur 9A). Evenzo vertonen de ooguitstrijkjes die op dag 2 en 4 na infectie worden genomen een volledige remming van het virus in de positieve controle en met BX795 behandelde monsters, terwijl een sterke toename van infectieuze virustiter wordt waargenomen in de negatieve controlegroep (figuur 9B).
Figuur 1: Varkensogen worden op ijs gehouden totdat weefsel is verwerkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Werkbankopstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Varkensogen geplaatst op gaas. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 4: Varkensoog met 30G naald afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: 30 G naald gebruikt; gat gemaakt in het midden van het epitheeloppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Roterende actie die wordt gebruikt om rond de rand van het hoornvlies te snijden met behulp van een scherp gesteriliseerd mes (A, B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Hoornvliesafbeeldingen. (A,B) Het hoornvlies dat uiteindelijk met een scherpe schaar (C) geïsoleerd hoornvlies wordt gesneden, wordt vastgehouden door een pincet (D) Volledig geïsoleerd hoornvlies, klaar voor gebruik Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Hoornvliezen geplaatst in 12-putplaat en geïncubeerd gedurende 72 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Progressie van virale verspreiding genomen tijdens het verloop van de infectie. Vers weggesneden varkenshoornvliezen werden geïnfecteerd met HSV-1 17-GFP en (A) afgebeeld met behulp van een microscoop op dag 2, 4 en 6 na infectie. Topische behandeling met DMSO, TFT of BX795 werd gestart op dag 2 na infectie. (B)Plaque-assays werden uitgevoerd met behulp van swabs uit de varkenshoornvliezen op Vero Cells. Tweeweg ANOVA-test werd uitgevoerd om significante verschillen tussen de behandelingsgroepen te begrijpen. n=4, ****p=0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerder onderzoek heeft aangetoond dat BX795 een veelbelovende rol speelt als antiviraal middel tegen HSV-1-infectie; door het TANK-bindende kinase 1 (TBK1)16te remmen . Zowel TBK1 als autofagie hebben een rol gespeeld bij het helpen remmen van HSV-1-infectie, zoals aangetoond op menselijke cornea-epitheelcellen. BX795 bleek maximaal effectief te zijn met antivirale activiteit bij een concentratie van 10μM en met behulp van zowel western blot-analyse als virale plaque-analyse van belangrijke virale eiwitten, werd aangetoond dat BX795 HSV-1-infectie remt die vergelijkbaar is met de activiteit van TFT16. Het onderzoek naar hoornvliezen van varkens volgde dezelfde analyse en behaalde vergelijkbare resultaten als hierboven aangetoond; BX795 blijkt net zo effectief te zijn als TFT bij het remmen van infecties - beelden gemaakt van varkenshoornvliezen op dag 4 en 6 van infectie tonen vergelijkbare resultaten in zowel TFT als BX795. Plaque-assays die worden uitgevoerd om uitgescheiden virionen te kwantificeren, versterken deze bevindingen ook16. BX795 heeft ook aangetoond antivirale effecten te hebben in vitro en het gebruik ervan topisch in muismodellen in vivo heeft ook onderdrukking van cornea HSV-1-infectie aangetoond16.
De studie draagt bij aan het vaststellen van BX795 als een effectieve en toonaangevende verbinding voor breedspectrum antivirale toepassing tegen HSV-1-infectie. Door zijn werkzaamheid in varkensmodellen aan te tonen als vergelijkbaar met TFT, is BX795 succesvol in meerdere infectiemodellen16. Bovendien is BX795 belangrijk omdat is aangetoond dat het effectief is in meerdere virusstammen, zelfs HSV-1 (KOS) tk12 dat resistent is tegen een ander veel gebruikt medicijn Acyclovir (ACV)16. Met BX975 behandelde cellen vertonen zeer weinig expressie van HSV-1 viraal eiwit gB, wat de remmende werkzaamheid van het HSV-1-virus certificeert. BX795 is ook toont een betere anti-virale werkzaamheid bij lagere doses in vergelijking met andere behandelingen en anti-herpesvirus therapieën. Bovendien vertonen therapeutische concentraties van BX795 (zelfs voorgestelde concentratie van 10 μM) geen nadelige cytotoxiciteit ten opzichte van cellen - geen apoptose-inducering en celdood, wat weer vergelijkbaar is met de TFT-controle16.
Kritieke stappen binnen de protocolsectie omvatten isolatie van het hoornvlies van varkens van het hele oog. Dit omvat het debridement van het hoornvlies in het midden van het oog met behulp van een naald en vereist zeer weinig kracht om ervoor te zorgen dat er geen stromale betrokkenheid is, gevolgd door het voorzichtig uit het oogoppervlak te halen zonder de iris te verstoren. Een andere reeks kritieke stappen omvat onderdelen waarbij wattenpunten voorbevochtigd worden en het hoornvliesoppervlak wordt afgeveegd. De beweging moet zacht zijn om ervoor te zorgen dat het hoornvliesepitheel niet van het oculaire oppervlak wordt losgemaakt.
Modificatie kan worden gedaan aan de epitheliale debridementstap. In plaats van een naald van 30 G te gebruiken om een enkele prik in het midden van het hoornvlies te maken, kan de experimentator een steriel mes of 30 G naald gebruiken om voorzichtig rastervormige krassen op het hoornvliesepitheel te maken. Dit zorgt voor een robuuste infectie aan het epitheel.
Varkenshoornvliezen moeten op dezelfde dag van verkrijging worden gebruikt en mogen niet langer dan 24 uur worden bewaard. Varkenshoornvliezen die langer dan 4 uur in ijs worden gehouden, zullen ertoe leiden dat de iris aan het hoornvlies blijft plakken. Dit maakt het moeilijker om het hoornvlies te scheiden van de rest van het oog tijdens de excisie. Niet alle hoornvliezen van varkens zullen op hetzelfde lijken geïnfecteerd raken. De experimentator moet minimaal 5 ogen per groep infecteren en vervolgens op dag 2 na infectie gelijk geïnfecteerde hoornvliezen plukken om door te gaan met het experiment.
Het belang van de huidige techniek betreft de kosteneffectiviteit van het gebruik van varkens boven menselijke hoornvliezen. De techniek is ook belangrijk vanwege de relatieve versheid van de hoornvliezen die worden gebruikt in vergelijking met menselijke hoornvliezen.
Toekomstige toepassingen van de huidige techniek omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het gebruik ervan bij het testen van geneesmiddelenpermeabiliteitsstudies, ex vivo farmacokinetische en farmacodynamische studies. Varkenshoornvliezen kunnen naast antivirale geneesmiddelen ook worden gebruikt om antibacteriële en antischimmelmiddelen te testen. De hoornvliezen kunnen ook worden gebruikt voor ex vivo wondgenezingstests om diabetische wonden te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling en geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door NIH-subsidies (R01 EY024710, RO1 AI139768 en RO1 EY029426) aan D.S. A.A. werd ondersteund door een F30EY025981-beurs van het National Eye Institute, NIH. Studie werd uitgevoerd met behulp van de varkens hoornvliezen verkregen van Park Packing bedrijf, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper - 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium - DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers --80 °C. - | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | - | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium - ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium - MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | Special order by request | |
| Procedure bench covers - as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
References
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
