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Medicine

अंतर्जात रूप से व्यक्त मानव RYR1 वेरिएंट के कार्यात्मक लक्षण वर्णन

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62196
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Department of Biomedicine, Basel University Hospital, 2Department of Life Sciences, University of Ferrara, 3Department of Anesthesia, Basel University Hospital

Summary

यहां एपस्टीन बार वायरस में अंतर्जात रूप से व्यक्त किए गए आरवाईआर 1 उत्परिवर्तन के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों ने मानव बी-लिम्फोसाइट्स को अमर कर दिया और मांसपेशियों की बायोप्सी व्युत्पन्न उपग्रह कोशिकाओं को मायोट्यूब में विभेदित किया गया।

Abstract

RYR1 जीन में 700 से अधिक वेरिएंट की पहचान विभिन्न न्यूरोमस्कुलर विकारों वाले रोगियों में की गई है, जिनमें घातक हाइपरथर्मिया संवेदनशीलता, कोर मायोपैथी और सेंट्रोन्यूक्लियर मायोपैथी शामिल हैं। आरवाईआर 1 उत्परिवर्तन से जुड़े विभिन्न फेनोटाइप्स के कारण भविष्य के चिकित्सीय हस्तक्षेपों के लिए रोगियों द्वारा किए गए वेरिएंट को वर्गीकृत करने और गैर-रोगजनक वेरिएंट की पहचान करने के लिए उनके कार्यात्मक प्रभावों को चिह्नित करना मौलिक है। कई प्रयोगशालाएं रोगियों की कोशिकाओं में व्यक्त RYR1 उत्परिवर्तन को कार्यात्मक रूप से चिह्नित करने के तरीकों को विकसित करने में रुचि रखती हैं। इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं, जिनमें शामिल हैं: उत्परिवर्तन अंतर्जात रूप से व्यक्त किए जाते हैं, RyR1 को अधिक व्यक्त नहीं किया जाता है, हेटरोलॉगस RyR1 व्यक्त कोशिकाओं के उपयोग से बचा जाता है। हालांकि, चूंकि रोगी आरवाईआर 1 के अलावा विभिन्न जीनों में उत्परिवर्तन प्रस्तुत कर सकते हैं, इसलिए विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ एक ही उत्परिवर्तन को आश्रय देने वाले व्यक्तियों से जैविक सामग्री के परिणामों की तुलना करना महत्वपूर्ण है। वर्तमान पांडुलिपि अंतर्जात रूप से व्यक्त RYR1 वेरिएंट के कार्यात्मक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए विकसित तरीकों का वर्णन करती है: (ए) एपस्टीन बार वायरस ने मानव बी-लिम्फोसाइट्स को अमर कर दिया और (बी) मांसपेशियों की बायोप्सी से व्युत्पन्न उपग्रह कोशिकाओं और मायोट्यूब में विभेदित किया। इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन एक औषधीय RyR1 activators के अलावा द्वारा ट्रिगर तो निगरानी कर रहे हैं. चयनित सेल प्रकार एक ratiometric फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक और intracellular [Ca2+]परिवर्तन के साथ भरी हुई है या तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल सेल स्तर पर या एक स्पेक्ट्र फ्लोरोमीटर का उपयोग कर सेल आबादी में निगरानी की जाती है। आराम [सीए2 +],एगोनिस्ट खुराक प्रतिक्रिया घटता तब स्वस्थ नियंत्रण से कोशिकाओं और RYR1 वेरिएंट harboring रोगियों के बीच तुलना कर रहे हैं एक दिए गए संस्करण के कार्यात्मक प्रभाव में अंतर्दृष्टि के लिए अग्रणी.

Introduction

आज तक मानव आबादी में 700 से अधिक RYR1 वेरिएंट की पहचान की गई है और घातक हाइपरथर्मिया संवेदनशीलता (MHS), व्यायाम प्रेरित rhabdomyolysis, केंद्रीय कोर रोग (सीसीडी), मल्टी-मिनीकोर रोग (MmD), सेंट्रोन्यूक्लियर मायोपैथी (CNM)1,2,3 सहित विभिन्न न्यूरोमस्कुलर विकारों से जुड़ा हुआ है ; फिर भी, उनके कार्यात्मक प्रभावों को चिह्नित करने के लिए अध्ययन पिछड़ रहे हैं और केवल लगभग 10% उत्परिवर्तनों का कार्यात्मक रूप से परीक्षण किया गया है। किसी दिए गए RyR1 संस्करण के प्रभाव का आकलन करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें हेटरोलॉगस कोशिकाओं जैसे HEK293 और COS-7 कोशिकाओं का अभिकर्मक WT और उत्परिवर्ती RYR1 cDNA4,5केलिए प्लास्मिड एन्कोडिंग के साथ प्लास्मिड और वैक्टर एन्कोडिंग के साथ डिस्पेडिक माउस फाइब्रोब्लास्ट्स का ट्रांसडक्शन शामिल है, इसके बाद मायो-डी के साथ ट्रांसडक्शन और मायोट्यूब में भेदभाव6 , उत्परिवर्ती RyR1s 7 ,8,9को ले जाने वाले ट्रांसजेनिक पशुमॉडलोंका उत्पादन , RYR1 संस्करण अंतर्जात रूप से10 , 11,12को व्यक्त करने वाले रोगियों से कोशिकाओं का लक्षण वर्णन . इस तरह के तरीकों ने यह स्थापित करने में मदद की है कि विभिन्न उत्परिवर्तन कार्यात्मक रूप से RyR1 Ca2 + चैनल को कैसे प्रभावित करते हैं।

यहां, RYR1 उत्परिवर्तन के कार्यात्मक प्रभावों का आकलन करने के लिए विकसित तरीकों का वर्णन किया गया है। इंट्रासेल्युलर कैल्शियम होमोस्टैसिस के विभिन्न मापदंडों की जांच मानव कोशिकाओं में अंतर्जात रूप से RyR1 कैल्शियम चैनल को व्यक्त करते हुए की जाती है, जिसमें मायोट्यूब और एपस्टीन बार वायरस (ईबीवी) अमर बी-लिम्फोसाइट्स शामिल हैं। कोशिकाओं को रोगियों से प्राप्त किया जाता है, संस्कृति में विस्तारित किया जाता है और रेशियोमेट्रिक फ्लोरोसेंट कैल्शियम इंडिक्टर जैसे कि फुरा -2 या इंडो -1 के साथ लोड किया जाता है। जिन मापदंडों को रोगजनक RYR1 उत्परिवर्तन के कारण परिवर्तित होने की सूचना दी गई है, जिसमें आराम करना [Ca2+]शामिल है, विभिन्न औषधीय एगोनिस्टों के प्रति संवेदनशीलता और इंट्रासेल्युलर Ca2 + स्टोर के आकार को या तो एकल सेल स्तर पर मापा जाता है, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, या एक फ्लोरिमीटर का उपयोग करके सेल आबादी में। उत्परिवर्तन वाहक से कोशिकाओं में प्राप्त परिणामों की तुलना तब स्वस्थ नियंत्रण परिवार के सदस्यों से प्राप्त लोगों से की जाती है। इस दृष्टिकोण ने प्रदर्शित किया है कि: (i) एमएचएस से जुड़े कई उत्परिवर्तन आराम में वृद्धि का कारण बनते हैं [सीए2+]और खुराक प्रतिक्रिया वक्र में बाईं ओर एक बदलाव या तो KCl-प्रेरित विध्रुवीकरण या औषधीय RyR1 सक्रियण के साथ 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल10,11,12,13; (ii) सीसीडी से जुड़े उत्परिवर्तन ों से RyR1 के औषधीय सक्रियण द्वारा जारी शिखर [Ca2+]में कमी आती है और यदि इंट्रासेल्युलरCa2+ 12, 13, 14,15संग्रहीत करता है तो आकार में कमी आती है; (iii) कुछ प्रकार Ca2+ होमोस्टैसिस13को प्रभावित नहीं करते हैं। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के फायदे हैं: RyR1 प्रोटीन अधिक व्यक्त नहीं किया गया है और शारीरिक स्तर मौजूद हैं, कोशिकाओं को अमर किया जा सकता है (मांसपेशियों की कोशिकाओं और बी-लिम्फोसाइट्स दोनों) उत्परिवर्तन युक्त सेल लाइनों को प्रदान करते हैं। कुछ नुकसान इस तथ्य से संबंधित हैं कि रोगी कैल्शियम होमोस्टैसिस और / या उत्तेजना संकुचन युग्मन (ईसीसी) में शामिल एक से अधिक जीन एन्कोडिंग प्रोटीन में उत्परिवर्तन ले जा सकते हैं और यह प्रयोगात्मक निष्कर्षों को जटिल बना सकता है। उदाहरण के लिए, एमएचएस और नियंत्रण जनसंख्या में दो जेपी -45 वेरिएंट की पहचान की गई थी और उनकी उपस्थिति को सक्रियण16के लिए डाइहाइड्रोपायरिडीन रिसेप्टर (डीएचपीआर) की संवेदनशीलता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था। रोगियों को उपलब्ध होने की आवश्यकता है, जैविक सामग्री को ताजा एकत्र करने की आवश्यकता है और स्थानीय नैतिक बोर्डों से नैतिक परमिट प्राप्त करने की आवश्यकता है।

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Protocol

नीचे वर्णित प्रोटोकॉल Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ के नैतिकता दिशानिर्देशों का पालन करते हैं।

1. एपस्टीन बार अमर बी लिम्फोसाइट सेल लाइनों की तैयारी11

  1. सूचित सहमति के बाद, RYR1 उत्परिवर्तन ले जाने वाले प्रोबैंड से और बिना किसी उत्परिवर्तन के स्वस्थ परिवार के सदस्यों से ईडीटीए-उपचारित बाँझ ट्यूबों में 30 मिलीलीटर पूरे रक्त एकत्र करें।
    नोट: सभी समाधान बाँझ रखें और एक ऊतक संस्कृति हुड में काम करते हैं।
  2. घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन मीडिया द्वारा पूरे रक्त से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करें (उदाहरण के लिए, फिकोल-हाइपाक, .077 ग्राम / एल)।
    1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार बाँझ ट्यूब में बाँझ रक्त के 30 मिलीलीटर जगह.
    2. ट्यूब के तल पर घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन मीडिया वाले एक पाश्चर पिपेट की नोक रखें और रक्त के नीचे धीरे-धीरे घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन मीडिया समाधान की परत 20 मिलीलीटर बाँझ हो।
    3. 18 डिग्री -20 डिग्री सेल्सियस पर 900 x जी पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, बिना किसी ब्रेक के।
      नोट: मोनोन्यूक्लियर सेल परत घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन मीडिया परत और प्लेटलेट समृद्ध प्लाज्मा युक्त शीर्ष परत के बीच इंटरफ़ेज़ पर एक बादल की अंगूठी के रूप में प्रकट होता है।
  3. एक बाँझ पिपेट के साथ धीरे-धीरे मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (लगभग 3-5 मिलीलीटर) वाले इंटरफेज परत को हटा दें और समाधान को एक साफ 50 एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. कोशिकाओं को कुल्ला करने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 20 मिलीलीटर जोड़ें, कमरे के तापमान पर 600 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और पीबीएस में गोली resuspend। कुल तीन बार के लिए दोहराएं; यह सुनिश्चित करता है कि सभी मीडिया को हटा दिया गया है।
  5. अंतिम धोने के बाद, ऊतक संस्कृति माध्यम के 1-2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया गया (आरपीएमआई माध्यम 10% भ्रूण बछड़े के सीरम, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन की 100 इकाइयों के साथ पूरक)। एक T125 ऊतक संस्कृति फ्लास्क में मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (लगभग 1 x10 6 कोशिकाओं) को रखें जिसमें ऊतक संस्कृति माध्यम के 20 मिलीलीटर होते हैं।
  6. एपस्टीन-बार वायरस के साथ मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को संक्रमित करें।
    1. EBV के स्रोत के रूप में B95.8 सेल लाइन संस्कृतियों (जिसमें 102-10 3 ट्रांसफॉर्मिंग यूनिट / एमएल -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक किया गया है) से supernatants का उपयोग करें।
    2. ऊतक संस्कृति माध्यम के 20 मिलीलीटर में चरण 1.5 से 1 x 106 मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और उन्हें संक्रमण के लिए साइक्लोस्पोरिन ए (0.2 μg / mL अंतिम एकाग्रता) की उपस्थिति में B95.8 सेल लाइन से supernatant के 2 मिलीलीटर के लिए उजागर करें।
  7. फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें और कोशिकाओं को बढ़ने की अनुमति दें। एक सप्ताह के बाद संस्कृति माध्यम बदलें।
    नोट: एक बार जब बी-कोशिकाएं फैलना शुरू कर देती हैं, तो वे पहचानने योग्य clumps बनाते हैं और तेजी से बढ़ते हैं ताकि संस्कृतियों का विस्तार और जमे हुए हो सके।
  8. दिए गए उत्परिवर्तन की उपस्थिति या अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए ईबीवी अमर बी-लिम्फोसाइट सेल लाइनों11 से जीनोमिक डीएनए निकालें।

2. इंट्रासेल्युलर सीए2 + माप

नोट: ईबीवी-रूपांतरित बी-लिम्फोसाइट सेल लाइनों की इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन को सेल आबादी में मॉनिटर किया जा सकता है, जिसमें चुंबकीय हलचल और क्यूवेट धारक से सुसज्जित स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट होता है। वैकल्पिक रूप से Ca2+ परिवर्तनों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल कोशिकाओं में मॉनिटर किया जा सकता है। दोनों मामलों में कोशिकाओं को ऊतक संस्कृति फ्लास्क से हटा दिया जाता है, क्रेब्स रिंगर के समाधान (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 20mM HEPES, 1 mM NaHPO4,5.5 mM ग्लूकोज, pH 7.4 जिसमें 1 mM CaCl2होता है) के साथ दो बार धोया जाता है और गिना जाता है।

  1. एक स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर11, 13, 14का उपयोग करके सेल आबादी में प्रयोगोंके लिए
    1. क्रेब्स रिंगर के समाधान में 1 x 107 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 5 μM Fura-2 / AM की अंतिम एकाग्रता के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. 10 मिनट के लिए 900 x g पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाएं और उन्हें 2 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर क्रेब्स रिंगर के समाधान में फिर से निलंबित कर देती हैं।
    3. एक स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति परिवर्तन (अनुपात 340/380 एनएम) को मापें जो अधिकतम वेग पर चुंबकीय हलचल सेट से सुसज्जित है और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट है।
    4. प्रयोग से ठीक पहले एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज में 5 मिनट के लिए 900 x g पर कोशिकाओं को स्पिन करें और जल्दी से 0.5 mM EGTA के साथ क्रेब्स रिंगर के समाधान के 1.5 mL में गोली को फिर से निलंबित कर दें, लेकिन कोई जोड़ा Ca2 +नहीं।
    5. कोशिकाओं को 3 एमएल ग्लास स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर क्यूवेट में रखें और प्रतिदीप्ति अनुपात (340 एनएम / 380 एनएम उत्तेजना, 510 एनएम उत्सर्जन) रिकॉर्ड करें।
    6. एक स्थिर आधार रेखा (लगभग 30 सेकंड) प्राप्त करें, RyR1 एगोनिस्ट (4-क्लोरो-एम-क्रेसोल, या 4-cmc) की चयनित एकाग्रता जोड़ें और कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्ड करें।
      नोट: DMSO में किए गए 4-cmc के 300 mM स्टॉक समाधान का उपयोग प्रारंभिक अभिकर्मक के रूप में किया जाता है। इस समाधान को पहले से बनाया जा सकता है, कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एलीकोट और संग्रहीत किया जा सकता है।
    7. विभिन्न 4-cmc सांद्रता के लिए प्रयोगों का प्रदर्शन करें।
      नोट: 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM से 1 mM शामिल करें एगोनिस्ट बनाम परिवर्तन की एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करने के लिए [Ca2+]। विभिन्न 4-cmc सांद्रता स्टॉक समाधान से 4-cmc की उचित मात्रा को जोड़कर प्राप्त की जाती है, सीधे फुरा -2 लोड कोशिकाओं वाले क्यूवेट में। उदाहरण के लिए, 300 μM 4-cmc की अंतिम एकाग्रता के लिए, स्टॉक समाधान के 1.5 μL को क्रेब्स रिंगर के समाधान में 1.5 मिलीलीटर कोशिकाओं वाले क्यूवेट में जोड़ा जाता है। कम एगोनिस्ट सांद्रता के लिए, 300 mM स्टॉक समाधान को DMSO के साथ 75 mM तक पतला किया जाना चाहिए और क्रेब्स रिंगर के समाधान में 1.5 mL कोशिकाओं वाले क्यूवेट में उचित मात्रा जोड़ी जानी चाहिए।
    8. इंट्रासेल्युलर स्टोर में मौजूद Ca2+ की कुल मात्रा की गणना करने के लिए कोशिकाओं में 400 nM thapsigargin जोड़ें। चोटी Ca2+रिकॉर्ड करें।
    9. एक दिए गए 4-cmc एकाग्रता बनाम चोटी कैल्शियम द्वारा प्रेरित शिखर कैल्शियम द्वारा प्रेरित शिखर कैल्शियम को प्लॉट करें, जिसे 100% माना जाता है और प्रोबैंड और स्वस्थ रिश्तेदार से कोशिकाओं की तुलना में 4-cmc खुराक प्रतिक्रिया वक्र का निर्माण करें
  2. एकल कोशिकाओं पर प्रयोगों के लिए13
    1. बाँझ एच2ओ में पॉली-एल-लाइसिन 1: 10 को पतला करें और 30 मिनट के लिए ग्लास कवरलिप्स का पूर्व-इलाज करें। एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के तहत हवा सूखने की अनुमति दें।
    2. ईबीवी-रूपांतरित बी-लिम्फोसाइट्स को क्रेब्स रिंगर के समाधान में 1 x10 6 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित करें जिसमें 1 एमएम CaCl 2 होता है और5 μM Fura-2 / AM की अंतिम एकाग्रता जोड़ता है।
    3. पॉली-एल-लाइसिन उपचारित कवरलिप्स पर कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर रखें और 30 मिनट के लिए एक ह्यूमिडिफाइड सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ताकि ईबीवी कोशिकाओं को लोडिंग के दौरान ग्लास कवरस्लिप से चिपकने की अनुमति मिल सके।
    4. कवरस्लिप को परफ्यूजन चैंबर में रखें और क्रेब्स रिंगर के समाधान के साथ परफ्यूजन (2 एमएल / मिनट की दर से) शुरू करें जिसमें 1 एमएम सीए2 +शामिल है।
    5. एक उलटा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (40x तेल-विसर्जन उद्देश्य (0.17 संख्यात्मक एपर्चर) से सुसज्जित), फिल्टर (बीपी 340/380, एफटी 425, बीपी 500/530) का उपयोग करें, एक सॉफ्टवेयर-नियंत्रित चार्ज युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा अनुलग्नक के साथ ऑनलाइन माप रिकॉर्ड करने के लिए।
    6. एक निश्चित एक्सपोज़र समय पर 1 s अंतराल पर छवियों को प्राप्त करें (340- और 380-nm उत्तेजना तरंग दैर्ध्य दोनों के लिए 100 ms)। प्रतिदीप्ति में परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें. 340 और 380 nm13की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर प्रत्येक सेल के लिए औसत पिक्सेल मान को मापें।
    7. सेल उत्तेजना प्राप्त करने के लिए, 12 वाल्वों के साथ एक सेल परफ्यूजन उत्तेजक का उपयोग करें और 4-cmc की विभिन्न सांद्रता जोड़ें। फ्लश वाल्व में क्रेब्स रिंगर का समाधान होता है जिसमें केवल इंट्रासेल्युलर स्टोर से कैल्शियम रिलीज की निगरानी करने के लिए कोई जोड़ा Ca2 + प्लस 100 μM La3 + नहीं होता है।
    8. [Ca2+]में परिवर्तन बनाम 4-cmc की एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र का निर्माण करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है।

3. मांसपेशी बायोप्सी10, 12, 15 से मानव myotubes की तैयारी

नोट: उपग्रह सेल-व्युत्पन्न मायोब्लास्ट्स और मायोट्यूब प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा विभिन्न तरीकों का उपयोग किया गया है। नीचे बेसल में उपयोग की जाने वाली विधि का विवरण दिया गया है।

  1. अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ मांसपेशियों की बायोप्सी कुल्ला और लगभग 0.5-1 मिमी के छोटे टुकड़ों में कटौती।
  2. डालने के साथ 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति व्यंजन तैयार करें। प्रत्येक अच्छी तरह से मानव मांसपेशी विकास माध्यम के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें और प्रत्येक सम्मिलित करने के लिए मानव मांसपेशी विकास माध्यम के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: विकास माध्यम निम्नानुसार बना है: उच्च ग्लूकोज, या डीएमईएम (4.5 मिलीग्राम / एमएल) के साथ ड्यूलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम का 500 एमएल, जिसमें 10% हॉर्स सीरम, 5 एनजी / एमएल इंसुलिन, 3 एमएम ग्लूटामाइन, 600 एनजी / एमएल पेनिसिलिन जी और स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 7 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.4 शामिल हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कंकाल की मांसपेशियों के विकास माध्यम का भी उपयोग किया जा सकता है।
  3. प्रत्येक सम्मिलित करें(चित्रा 1A)में 2-3 छोटे मांसपेशियों के टुकड़े रखें और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस) में संस्कृति व्यंजनों को रखें। लगभग 8-10 दिनों के बाद उपग्रह कोशिकाओं को मांसपेशियों की बायोप्सी से बाहर और उसके आसपास बढ़ते हुए देखा जा सकता है, जो सम्मिलित करने से जुड़ा होता है(चित्रा 1,बी और सी, तीर)।
  4. बायोप्सी से पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को छोड़ें (लगभग 10-14 दिनों के बाद), ट्रिप्सिनाइज़ निम्नानुसार:
    1. सभी संस्कृति माध्यम को हटा दें, पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार कोशिकाओं को कुल्ला करें, ट्रिप्सिन / ईडीटीए समाधान (0.025% ट्रिप्सिन और 0.01% ईडीटीए) के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. ट्रिप्सिन के प्रभाव को बेअसर करने और उपग्रह कोशिकाओं को एक नए टी 25 सेल संस्कृति फ्लास्क में स्थानांतरित करने के लिए कोशिकाओं में 1 एमएल विकास माध्यम जोड़ें; विकास माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 37डिग्री सेल्सियस) में रखें।
    3. ईडीटीए को हटाने के लिए अगले दिन विकास माध्यम को बदलें और बाद में प्रति सप्ताह एक बार माध्यम बदलें।
  5. जब मायोब्लास्ट लगभग 75% confluent होते हैं, तो ट्रिप्सिनाइज़ करें और उन्हें लैमिनिन-उपचारित ग्लास कवरस्लिप पर स्थानांतरित करें।
    नोट: एक अनुपात के रूप में, एक T25 फ्लास्क में बढ़ने वाली कोशिकाओं को एक 43 मिमी व्यास लैमिनिन-उपचारित ग्लास कवरस्लिप पर स्थानांतरित किया जाना चाहिए। ग्लास कवरस्लिप को 60 मिमी व्यास के ऊतक संस्कृति प्लेट के भीतर रखा जाना चाहिए जिसमें 3 मिलीलीटर विकास माध्यम होता है।
  6. एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस) में विकास माध्यम में ग्लास कवरस्लिप पर कोशिकाओं को बढ़ाएं, जो प्रति सप्ताह एक बार माध्यम को बदलते हैं। 90% confluency पर, निम्नानुसार बने भेदभाव माध्यम पर स्विच करें: उच्च ग्लूकोज DMEM (4.5 mg / mL), 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, 10 ng / mL एपिडर्मल विकास कारक, 0.15 mg / mL क्रिएटिन, 5 ng / mL इंसुलिन, 200 mM ग्लूटामाइन, 600 ng / mL पेनिसिलिन जी और स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 7 mM HEPES, pH 7.4)। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भेदभाव माध्यम का भी उपयोग किया जा सकता है। प्रति सप्ताह एक बार विभेदन माध्यम बदलें।
  7. भेदभाव माध्यम में 7-10 दिनों के बाद, मल्टीन्यूक्लिएटेड मायोट्यूब दिखाई देते हैं। एक सप्ताह के भीतर [Ca2+]में परिवर्तन के लिए मूल्यांकन करें, जैसा कि नीचे वर्णित है।

4. [Ca2+]i अनुपात Fura-2 के साथ निर्धारित माप

  1. लोड ग्लास coverslip Fura-2 / AM (5 μM की अंतिम एकाग्रता) के साथ विकसित मायोट्यूब विकसित किया गया है, जो 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए DMEM में पतला है। संक्षेप में, ग्लास कवरस्लिप उगाई गई कोशिकाओं से भेदभाव माध्यम को हटा दें और 2 एमएल ताजा भेदभाव माध्यम जोड़ें। 1 mM के स्टॉक समाधान से Fura-2 AM के 10 μL जोड़ें और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (5% CO2,37 °C) में 30 मिनट इनक्यूबेट करें।
  2. परफ्यूजन कक्ष में ग्लास कवरस्लिप स्थानांतरित करें और क्रेब्स रिंगर के समाधान के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें जिसमें 2 mM CaCl2शामिल है।
  3. 20x जल विसर्जन FLUAR उद्देश्य(0.17संख्यात्मक एपर्चर) के उपयोग के साथ EBV एकल सेल अनुभाग में ऊपर वर्णित के रूप में ऑन-लाइन [Ca 2+] माप करें।

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Representative Results

[Ca2+]मैं EBV-अमर बी लिम्फोसाइटों की आबादी में माप
प्राथमिक बी-लिम्फोसाइट्स RyR1 आइसोफोर्म को व्यक्त करते हैं जो बी सेल एंटीजन रिसेप्टर के दौरान सीए2 + रिलीज चैनल के रूप में कार्य करता है, जो सिग्नलिंग प्रक्रियाओं को उत्तेजित करताहै। ईबीवी के साथ बी-कोशिकाओं का अमरीकरण, एक प्रक्रिया जो आनुवंशिकीविदों द्वारा नियमित रूप से रोगियों की जीनोमिक जानकारी युक्त सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाती है, सेल लाइनों को उत्पन्न करने का लाभ प्रदान करती है जो आरवाईआर 1 उत्परिवर्तन 11,13को आश्रय देने वाले रोगियों में उत्परिवर्ती RyR1 Ca2+ चैनलों को व्यक्त करती हैं। [Ca2+] मैं इस तरह के 4-क्लोरो-एम-cresol18 और कैफीन के रूप में विशिष्ट RyR1 एगोनिस्ट के अलावा के बारे में लाया परिवर्तन आसानी से निगरानी की जा सकती है ताकि यह स्थापित करने के लिए कि क्या एक दिया गया RYR1 उत्परिवर्तन एक एगोनिस्ट के प्रति संवेदनशीलता को बदल देता है, कैल्शियम की मात्रा जारी की, आराम [Ca2+],या अन्य पैरामीटर जो उत्परिवर्तन से प्रभावित होने के लिए दिखाया गया है। [Ca2+] मैं परिवर्तन या तो एक स्पेक्ट्रोमीटर के साथ निलंबन में Fura-2 भरी हुई कोशिकाओं की आबादी में या कांच coverslips से जुड़े कोशिकाओं के समूहों पर निगरानी की जा सकती है और epifluorescence द्वारा जांच की. चित्रा 2 सेल निलंबन पर किए गए एक प्रतिनिधि प्रयोग को दर्शाता है। क्यूवेट में रखे जाने से तुरंत पहले, कोशिकाओं को फुरा -2 को हटाने के लिए काता गया था जो लीक हो सकता है; कोशिकाओं को तब गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) क्रेब्स रिंगर के समाधान में 1 x10 6 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित कर दिया गया था, जिसमें कोई अतिरिक्त सीए2 + प्लस 0.5 एमएम ईजीटीए नहीं था और स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर में रखा गया था। चुंबकीय हलचल को निलंबन में कोशिकाओं को रखने के लिए स्थिति 4 (उच्चतम स्थिति) पर स्विच किया गया था और प्रतिदीप्ति दर्ज की गई थी। एक स्थिर ट्रेस प्राप्त करने के बाद, चयनित एगोनिस्ट को जोड़ा गया था (चित्रा 2 ए में यह 300 μM 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल था) जिससे तेजी से Ca2 + वृद्धि हुई जो तब धीरे-धीरे आराम के स्तर पर वापस आ गई। प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की क्षणिक प्रकृति महत्वपूर्ण है क्योंकि यह इंगित करता है (i) कि यह एक फ्लोरोसेंट या शमन यौगिक के अलावा के कारण एक कलाकृति नहीं है, (ii) कि यह कैल्शियम को बाह्य कोशिकीय फुरा -2 और (iii) के लिए बाध्यकारी के कारण नहीं है कि कोशिकाएं स्वस्थ हैं और सक्रिय रूप से अपने साइटोप्लाज्म से कैल्शियम को हटा सकती हैं।

एक ही प्रयोग को सांख्यिकीय रूप से विश्लेषण करने के लिए कई बार दोहराया जाना चाहिए। प्रत्येक सेल लाइन और प्रत्येक दिन के लिए, प्रयोग किए जाते हैं और दुकानों में तेजी से releasable कैल्शियम की कुल मात्रा SERCA अवरोधक thapsigargin11, 13, 14जोड़कर निर्धारित किया जाना चाहिए। जैसा कि चित्रा 2 बीमें दिखाया गया है, 400 एनएम थाप्सिगार्जिन के अलावा एक बड़े कैल्शियम क्षणिक का कारण बनता है जो 2.4 मनमाने ढंग से इकाइयों (ए.यू.) के चरम प्रतिदीप्ति मूल्य तक पहुंचता है; इस प्रकार कैल्शियम की कुल मात्रा जो चित्र 2B में दिखाए गए EBV-अमर B-कोशिकाओं के इंट्रासेल्युलर स्टोर से जारी की जा सकती है, 2.4 a.u. (thapsigargin चोटी) - 1.45 a.u. (आराम अनुपात) या 0.95 के बराबर होती है, चित्र 2Cमें दिखाए गए खुराक प्रतिक्रिया वक्र का निर्माण करते समय इस प्रतिदीप्ति मान को 100% माना जाताथा।

एकल सेल [Ca2+]i EBV-अमर बी लिम्फोसाइटों में माप
यह दूसरा दृष्टिकोण एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और माइक्रोपरफ्यूजन की उपलब्धता पर निर्भर करता है जो एगोनिस्ट की दी गई एकाग्रता के साथ एक एकल सेल या कोशिकाओं के छोटे समूहों की उत्तेजना और प्रतिदीप्ति परिवर्तनों की एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। माइक्रोपरफ्यूजन सिस्टम के सिरिंज चयनित RyR1 एगोनिस्ट (या तो कैफीन या 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल) की विभिन्न सांद्रता से भरे हुए हैं, जिनका उपयोग खुराक प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करने के लिए किया जाएगा। चित्रा 3में दिखाए गए उदाहरण में, कोशिकाओं को क्रेब्स रिंगर के समाधान में भंग किए गए 0.5-10 एमएम कैफीन के साथ उत्तेजित किया गया था, जिसमें इंट्रासेल्युलर स्टोर से सीए 2 + रिलीज की निगरानी करने के लिए कोई जोड़ा कैल्शियम प्लस 100 μM La3 + शामिल नहीं था। ग्लास कवरलिप्स जिस पर फुरा -2 लोड ईबीवी-अमर बी लिम्फोसाइट्स को संलग्न करने की अनुमति दी गई थी, को परफ्यूजन चैंबर में रखा गया था और क्रेब्स रिंगर के समाधान के साथ 1 एमएम सीए2 +युक्त किया गया था। अधिकांश कोशिकाओं ने पॉली-एल-लाइसिन उपचारित कवरस्लिप का पालन किया होगा और कोशिकाओं के छोटे समूहों की पहचान की जानी चाहिए और फुरा -2 लोडिंग के लिए जांच की जानी चाहिए। परफ्यूजन सिस्टम की नोक को कैफीन के साथ उन्हें नहलाने के लिए कोशिकाओं के करीब रखा जाता है (और कवरस्लिप पर सभी कोशिकाएं नहीं)। आमतौर पर कोशिकाओं को कैफीन के सबसे कम से उच्चतम एकाग्रता तक शुरू करने के लिए प्रेरित किया जाता है; प्रत्येक एकाग्रता के लिए, एक नया कक्ष या कक्षों का समूह चुना जाता है. रेशियोमेट्रिक प्रतिदीप्ति माप (340 एनएम और 380 एनएम पर उत्तेजना, 510 एनएम पर उत्सर्जन) 2 मिनट तक हर सेकंड दर्ज किए जाते हैं। एक स्थिर आधार रेखा प्राप्त करने के लिए परफ्यूजन से पहले कुछ छवियां प्राप्त की जाती हैं, बाद में सेल परफ्यूजन शुरू किया जाता है, पहले क्रेब्स रिंगर के समाधान के साथ कोशिकाओं को फ्लश करके जिसमें 5 सेकंड के लिए 100 μM La3 + होता है। इसके परिणामस्वरूप फ्लोरेसेंस में बदलाव नहीं होना चाहिए और यह सुनिश्चित करने के लिए एक नियंत्रण है कि सेल (ओं) पूरे प्रयोग में कवरस्लिप से चिपके रहते हैं; बाद में चयनित एगोनिस्ट एकाग्रता वाले एक समाधान को सेल (ओं) पर फ्लश किया जाता है। चित्रा 3एमें दिखाए गए उदाहरण में, कोशिकाओं को 20 सेकंड के लिए 5 एमएम कैफीन के साथ उत्तेजित किया गया था। दिखाया गया तीर इंगित करता है कि कैफीन वाल्व कब खोला गया था और इसके परिणामस्वरूप 340/380 एनएम फ्लोरोसेंट अनुपात में तत्काल वृद्धि होती है। 20 सेकंड के बाद, कैफीन वाल्व बंद हो जाता है, और कोशिकाओं को क्रेब्स रिंगर के समाधान के साथ फ्लश किया जाता है जिसमें 100 μM La3 +होता है; प्रतिदीप्ति तब तक दर्ज की जाती है जब तक कि आधार रेखा तक नहीं पहुंच जाता है। प्रत्येक कैफीन सांद्रता के लिए, जो कि कैफीन प्रेरित शिखर 340/380 एनएम प्रतिदीप्ति है - प्रारंभिक विश्राम 340/380 एनएम प्रतिदीप्ति की गणना की जाती है और एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र के निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है जैसा कि चित्र 3 बीमें दिखाया गया है। प्रत्येक कैफीन एकाग्रता के लिए 5-10 कोशिकाओं से माध्य ΠF का औसत निकाला जाता है। इंट्रासेल्युलर स्टोर में कैल्शियम की मात्रा की भी निगरानी की जा सकती है। इस मामले में, कोशिकाओं को क्रेब्स रिंगर के समाधान के साथ कुल्ला जाता है जिसमें 0.5 एमएम ईजीटीए होता है और 1 μM thapsigargin, 1 μM ionomycin और 0.5 mM EGTA का एक समाधान कोशिकाओं को हाथ से जोड़ा जाता है (माइक्रोपरफ्यूजन सिस्टम के माध्यम से नहीं क्योंकि आयनोमाइसिन टयूबिंग से चिपक जाता है और धोया नहीं जा सकता है) और प्रतिदीप्ति लगभग 4-5 मिनट के लिए दर्ज की जाती है। ΠF की गणना करने के लिए, एक सेल को रेखांकित करने वाले ब्याज का एक क्षेत्र (ROI) प्राप्त किया जाता है और ROI के भीतर प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की गणना एक इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके की जाती है।

संक्षेप में, एक विशिष्ट एगोनिस्ट के लिए RyR1 की संवेदनशीलता को मापने के लिए ईबीवी अमर बी-कोशिकाओं का उपयोग करते समय, विभिन्न दिनों में एक व्यक्ति से कोशिकाओं पर दोहराए गए प्रयोग किए जाने चाहिए। सेल आबादी पर माप के लिए, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम स्टोर की स्थिति का आकलन करने की आवश्यकता होती है और एगोनिस्ट प्रेरित कैल्शियम रिलीज के लिएईसी 50 को कैल्शियम की कुल मात्रा के सापेक्ष प्लॉट किया जाता है जिसे स्टोर से जारी किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि लाखों कोशिकाओं की [Ca2+]प्रतिक्रिया औसत है; इसके अतिरिक्त, कोई microperfusion प्रणाली और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप आवश्यक हैं. एकल सेल विधि कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के उपयोग और चयनित कक्षों के [Ca2+]में परिवर्तनों के ऑन-लाइन विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है।

एकल सेल [Ca2+]मैं मानव उपग्रह सेल व्युत्पन्न मायोट्यूब में माप
ग्लास कवरलिप उगाए गए और विभेदित मायोट्यूब को फुरा -2 के साथ लोड किया जाता है, जो परफ्यूजन चैंबर में स्थानांतरित हो जाता है और क्रेब्स रिंगर के समाधान में स्नान किया जाता है जिसमें ईबीवी कोशिकाओं के लिए ऊपरवर्णित 2 एमएम सीए 2 + होता है। परफ्यूजन प्रणाली के सिरिंज चयनित एगोनिस्ट से भरे होते हैं और मायोट्यूब को ऊपर वर्णित के रूप में उत्तेजित किया जाता है। चूंकि कवरस्लिप पर सभी कोशिकाएं मल्टीन्यूक्लिएटेड मायोट्यूब नहीं हैं, इसलिए उचित सेल (ओं) का चयन करना महत्वपूर्ण है जिसे मापा जाएगा। मायोट्यूब के छोटे समूहों को एक साथ उत्तेजित किया जा सकता है। चित्रा 4में दिखाए गए उदाहरण में, एक एकल मायोट्यूब को KCl युक्त समाधान के साथ फ्लश किया गया था, 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल और अंत में कैफीन की विभिन्न सांद्रता, हालांकि, आमतौर पर एगोनिस्ट के लिए खुराक प्रतिक्रिया वक्र का निर्माण किया जाता है, जैसा कि पिछले खंड में इंगित किया गया है, विभिन्न व्यक्तियों से कोशिकाओं की एगोनिस्ट संवेदनशीलता की तुलना करने के लिए12,15,16 . केसीएल का उपयोग प्लाज्मा झिल्ली को विध्रुवित करने के तरीके के रूप में किया जाता है। कंकाल में, मांसपेशी प्लाज्मा झिल्ली विध्रुवीकरण वोल्टेज संवेदन DHPR द्वारा महसूस किया जाता है जो इस प्रकार सक्रियण और RyR1 के उद्घाटन के लिए अग्रणी एक संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरता है। दूसरी ओर, 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल और कैफीन RyR1 के प्रत्यक्ष औषधीय उत्प्रेरक हैं।

Figure 1
चित्र1:प्राथमिक मानव मांसपेशी बायोप्सी-व्युत्पन्न मायोब्लास्ट संस्कृतियों का उत्पादन। (ए)मांसपेशियों (तीर) के छोटे टुकड़ों को 0.5 मिलीलीटर विकास माध्यम वाले आवेषण में रखा जाता है। 7-14 दिनों के बाद उपग्रह कोशिकाओं को मांसपेशियों के ऊतकों से सटे (छोटे तीर) देखा जा सकता है और सम्मिलित करने के निचले हिस्से पर बढ़ रहा है। एक 10x उद्देश्य(बी)और 20x उद्देश्य(सी)के माध्यम से ली गई छवि। पैनल ए में ग्रे बक्से का उपयोग रोगी की पहचान को कवर करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2:ईबीवी अमर बी लिम्फोसाइट्स में कैल्शियम रिलीज प्रयोगों। Ratiometric [Ca2+]i निलंबन में Fura-2 लोड कोशिकाओं की आबादी में माप। ए) 300 μM 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल (तीर) के अलावा साइटोप्लाज्मिक [Ca2+] में तत्काल वृद्धि का कारण बनता है, जो बाद में 500 सेकंड के भीतर आराम के स्तर पर वापस क्षय हो जाता है। इस उदाहरण में, 300 μM 4-क्लोरो-m-cresol के अतिरिक्त द्वारा प्रेरित ΠF 1.7 प्रतिदीप्ति इकाइयाँ- 1.4 प्रतिदीप्ति इकाइयाँ = 0.3 प्रतिदीप्ति इकाइयाँ हैं। बी) SERCA अवरोधक thapsigargin (400 nM, तीर) के अलावा Fura-2 प्रतिदीप्ति अनुपात में एक बड़ी वृद्धि का कारण बनता है जो 2.4 प्रतिदीप्ति इकाइयों पर चोटियों, और बाद में 1.45 प्रतिदीप्ति इकाइयों पर आराम के स्तर के लिए क्षय का कारण बनता है। Thapsigargin प्रेरित [Ca2+]क्षणिक सेल आबादी में मौजूद इंट्रासेल्युलर स्टोर में तेजी से releasable कैल्शियम की कुल मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है। प्राप्त शिखर क्षणिक (2.4-1.45 = 0.95 इकाइयाँ) का उपयोग 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल की दी गई सांद्रता द्वारा जारी कैल्शियम के प्रतिशत की गणना करने के लिए किया जाता है। C) प्रतिनिधि खुराक प्रतिक्रिया घटता इंट्रासेल्युलर स्टोर में तेजी से releasable कैल्शियम की कुल राशि के प्रतिशत के रूप में ΠF correlating. 300 μM 4-क्लोरो-m-cresol के लिए यह मान 0.3/0.95x100 = 31.6% है। प्रत्येक प्रतीक एक नियंत्रण (बंद हलकों, बिंदीदार रेखा) और एक MHS व्यक्ति (बंद वर्गों, निरंतर रेखा) से EBV अमर कोशिकाओं से 5-10 मानों के SEM% का माध्य± SEM% का प्रतिनिधित्व करता है जो एक RYR1 उत्परिवर्तन ले जाता है। वक्र एक अवग्रह खुराक-प्रतिक्रिया वक्र समारोह का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। पैनल A और B को Girard et al.11से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3:कैफीन-प्रेरित सीए2 + एक नियंत्रण व्यक्ति से व्यक्तिगत ईबीवी-अमर बी लिम्फोसाइट्स में रिलीज। ए) शीर्ष पैनलों, समय चूक छवियों(ए)चरण-विपरीत; (बी-ई),एकल-सेल [सीए2 +]मैं फूरा-2-लोडेड ईबीवी-अमर लिम्फोसाइट्स के माप: (बी) टी = 0, (सी) टी = 36 एस, (डी) टी = 50 एस और (ई) टी = 77 एस 5 एमएम कैफीन के आवेदन के बाद। कोशिकाओं को व्यक्तिगत रूप से क्रेब्स-रिंगर समाधान में पतला कैफीन के अलावा द्वारा उत्तेजित किया गया था। स्केल बार = 10 μm. नीचे पैनल, प्रतिनिधि ट्रेस 5 mM कैफीन (तीर) के साथ एक एकल सेल की उत्तेजना के बाद प्राप्त किया। बी) खुराक प्रतिक्रिया वक्र [Ca2+]iमें कैफीन-निर्भर परिवर्तन को दिखाते हुए, प्रतिदीप्ति अनुपात में परिवर्तन के रूप में व्यक्त किया जाता है (शिखर अनुपात 340/380 nm−resting ratio 340/380 nm)। प्रत्येक बिंदु 4-15 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के औसत ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है। वक्र एक अवग्रह खुराक-प्रतिक्रिया वक्र समारोह का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। बंद वर्गों, बिंदीदार रेखा, नियंत्रण कोशिकाओं; बंद त्रिकोण, निरंतर लाइन, MHS एक RYR1 उत्परिवर्तन ले जाने व्यक्ति. यह आंकड़ा Ducreux et al.13से एक अनुकूलन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4:कैल्शियम एक नियंत्रण व्यक्ति से मानव मायोट्यूब में KCl, 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल और कैफीन द्वारा प्रेरित रिलीज। बाएं पैनल: ए) चरण कंट्रास्ट (बी-एच), एकल सेल इंट्रासेल्युलर सीए2 + फ्यूरा -2-लोडेड मानव मायोट्यूब के माप। B) आराम [Ca2+]i; C) t = 2 s 150 mM KCl के आवेदन के बाद D) t = 2 s 150 μM 4-chloro-m-cresol के आवेदन के बाद; ई) 300 μM 4-क्लोरो-m-cresol के आवेदन के बाद t = 2 s; एफ) 600 μM 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल के आवेदन के बाद टी = 2 एस; जी) 10 mM कैफीन के आवेदन के बाद टी = 2 एस; एच) टी = 20 एस कैफीन के आवेदन के बाद। दायाँ पैनल:उत्तेजित सेल में समय (एस) बनाम प्रतिदीप्ति अनुपात (340/380 एनएम) का प्लॉट। मायोट्यूब्स को व्यक्तिगत रूप से क्रेब्स-रिंगर बफर में एगोनिस्ट के अलावा 100 μM La3 +युक्त करके उत्तेजित किया गया था, इस प्रकार [Ca2+]में वृद्धि मैं इंट्रासेल्युलर स्टोर से केवल कैल्शियम की रिहाई का प्रतिनिधित्व करताहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कई प्रयोगशालाओं द्वारा कैल्शियम होमियोस्टैसिस पर RYR1 उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इस पेपर में उल्लिखित दृष्टिकोणों के महत्वपूर्ण चरण बाँझपन, सेल कल्चरिंग कौशल और तकनीकों और जैविक सामग्री की उपलब्धता से निपटते हैं। सिद्धांत रूप में, ईबीवी-अमर बी लिम्फोसाइट्स का उपयोग सरल है और एक को उत्परिवर्ती RyR1 चैनलों वाली सेल लाइनों को उत्पन्न करने की अनुमति देता है। कोशिकाओं को जमे हुए और कई वर्षों तक तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है और संस्कृतियों को किसी भी समय फिर से शुरू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, कोई भी यह चुन सकता है कि सेल आबादी में या एकल सेल स्तर पर कैल्शियम होमोस्टैसिस की निगरानी करना है या नहीं। पूर्व विधि सरल है, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की आवश्यकता नहीं है और जांचकर्ता को थोड़े समय के भीतर विभिन्न व्यक्तियों से उत्पन्न सेल लाइनों का परीक्षण करने की अनुमति देता है। सीमा सेल विकास का वेग और एक पूरी तरह से सुसज्जित (गर्म और चुंबकीय हलचल के साथ) स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर की उपलब्धता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतकों के साथ संयोजन में प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग ईबीवी-अमर बी लिम्फोसाइट्स में कैल्शियम फ्लक्स को मापने के लिए किया जा सकता है; इस तरह से इंट्रासेल्युलर कैल्शियम सांद्रता में परिवर्तन निर्धारित किया जा सकता है19. यदि एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, परफ्यूजन चैंबर और माइक्रोपरफ्यूजन सिस्टम उपलब्ध हैं, तो एकल सेल इमेजिंग को अधिक संवेदनशील होने और सेल परिवर्तनशीलता, गतिज विश्लेषण और कैल्शियम रिलीज में शामिल उपकोशिकीय डोमेन की पहचान सहित सेल सहित अधिक विस्तृत जानकारी देने का लाभ होता है। उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए अधिक उपकरणों की आवश्यकता होती है।

ईबीवी-अमर बी लिम्फोसाइट्स का उपयोग करने के कई फायदे हैं, जिसमें अन्य पैरामीटर एक तरफ [सीए2 +]आई होमियोस्टैसिस को मापा जा सकता है। उदाहरण के लिए, बी कोशिकाओं के 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल प्रेरित अम्लीकरण का उपयोग एमएचएस रोगियों20, 21से नियंत्रण व्यक्तियों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया है। फिर भी किसी को ध्यान में रखना चाहिए (i) कि बी कोशिकाएं कंकाल की मांसपेशियों की उत्तेजना संकुचन युग्मन में शामिल कई प्रोटीनों को व्यक्त नहीं करती हैं जो अप्रत्यक्ष रूप से कैल्शियम रिलीज को प्रभावित कर सकती हैं, (ii) वे गैर-उत्तेजक कोशिकाएं हैं इस प्रकार प्लाज्मा झिल्ली विध्रुवीकरण द्वारा शारीरिक रूप से सक्रिय नहीं की जा सकती हैं, और अंत में मोनियर एट अल द्वारा एक रिपोर्ट में पाया गया कि एक रोगी में पहचाने गए उत्परिवर्तन को ईबीवी-अमर बी कोशिकाओं में व्यक्त नहीं किया गया था क्योंकि एक गुप्त स्प्लिस साइट22के कारण।

कैल्शियम होमोस्टैसिस10,23,24में शामिल प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले विभिन्न जीनों में उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने में रुचि रखने वाले कई समूहों द्वारा रोगी व्युत्पन्न प्राथमिक मांसपेशी कोशिका संस्कृतियों का उपयोग किया गया है। इन कोशिकाओं को मल्टीन्यूक्लिएटेड मायोट्यूब में विभेदित किया जा सकता है, प्लाज्मा झिल्ली विध्रुवीकरण का जवाब दिया जा सकता है और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल साधनों द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके अलावा, उन्हें आरवाईआर 1 उत्परिवर्तन25ले जाने वाली सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए अमर किया जा सकता है, हालांकि प्रक्रिया बी-लिम्फोसाइट्स की तुलना में कहीं अधिक जटिल है। हालांकि यह भी सच है कि मांसपेशियों की कोशिकाएं धीमी गति से बढ़ रही हैं और बायोप्सी लेने से लेकर पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं के लिए आवश्यक समय एक महीने से अधिक हो सकता है, लेकिन वर्षों बाद मायोब्लास्ट प्राप्त करने के लिए तरल नाइट्रोजन में ठंड के माध्यम में मांसपेशियों की बायोप्सी के छोटे टुकड़ों को स्टोर करना भी संभव है। लंबे समय तक खेती के समय में बैक्टीरिया, खमीर या मोल्ड्स द्वारा संदूषण का अतिरिक्त जोखिम होता है और जैसे ही मायोब्लास्ट्स की पर्याप्त संख्या में प्राप्त किया जाता है, उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज और स्टोर करना महत्वपूर्ण है। हमारी प्रयोगशाला ने मायोट्यूब के लिए ऊपर उल्लिखित एक ही तकनीक को सफलतापूर्वक लागू किया है, ताकि मानव त्वचा-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट्स में कैल्शियम परिवर्तनों का अध्ययन किया जा सके, जो मायोडी के साथ ट्रांसड्यूस किए गए थे और मायोट्यूब26में विभेदित थे। यह RYR1 उत्परिवर्तन के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गया था जब मांसपेशियों की बायोप्सी-व्युत्पन्न मायोब्लास्ट उपलब्ध नहीं थे। बी-लिम्फोसाइट्स के लिए, एमएचएस से जुड़े RYR1 उत्परिवर्तन वाले रोगियों से मायोट्यूब्स के 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल प्रेरित अम्लीकरण कासफलतापूर्वकपरीक्षण किया गया है।

निष्कर्ष में, जीनोटाइप-फेनोटाइप सहसंबंध का अध्ययन करने के लिए रोगियों से जैविक सामग्री के उपयोग के कई फायदे हैं और आरवाईआर 1 में उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अन्य जीनों में मौजूद उत्परिवर्तन कैल्शियम होमोस्टैसिस को प्रभावित कर सकते हैं; इसलिए, विभिन्न परिवारों से कोशिकाओं का उपयोग एक ही उत्परिवर्तन के साथ-साथ परिवार के सदस्यों से नियंत्रण के रूप में RYR1 उत्परिवर्तन को आश्रय नहीं देने से किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि में वर्णित कार्य स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (एसएनएफ) और स्विस मसल फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-m-cresol Fluka 24940
Blood collection tubes Sarstedt 172202
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906
caffeine Merk 102584
Cascade 125+ CCD camera Photometrics
Cascade 128+ CCD Photometrics
Creatine Sigma-Aldrich C-3630
DMEM ThermoFisher Scientific 11965092
DMSO Sigma 41639
EGTA Fluka 3778
Epidermal Growth Factor (EGF) Sigma-Aldrich E9644
Ficoll Paque Cytiva 17144002
Foetal calf serum ThermoFisher Scientific 26140079
Fura-2/AM Invitrogen Life Sciences F1201
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050061
HEPES ThermoFisher Scientific 15630049
Horse serum Thermo Fisher Scientific 16050122
Insulin ThermoFisher Scientific A11382II
Ionomycin Sigma I0634
KCl Sigma-Aldrich P9333
Laminin ThermoFisher Scientific 23017015
Lanthanum Fluka 61490
Microperfusion system ALA-Scientific DAD VM 12 valve manifold
Origin Software OriginLab Corp Software
Pennicillin/Streptomycin Gibco Life Sciences 15140-122
Perfusion chamber POC-R Pecon 000000-1116-079
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
RPMI ThermoFisher Scientific 21875091
Spectrofluorimeter Perkin Elmer LS50
Thapsigargin Calbiochem 586005
Tissue culture dishes Falcon 353046
Tissue culture flask Falcon 353107
Tissue culture inserts Falcon 353090
Trypsin/EDTA solution ThermoFisher Scientific 25300054
Visiview Visitron Systems GmbH Software
Zeiss Axiovert S100 TV microscope Carl Zeiss AG
Zeiss glass coverslips Carl Zeiss AG 0727-016

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References

  1. Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
  2. Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
  3. Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
  4. Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
  5. Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
  6. Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
  7. Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
  8. Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
  9. Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
  10. Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
  11. Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
  12. Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
  13. Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
  14. Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
  15. Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
  16. Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
  17. Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
  18. Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
  19. Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
  20. Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
  21. Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
  22. Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
  23. Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
  24. Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
  25. Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
  26. Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
  27. Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).

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अंतर्जात रूप से व्यक्त मानव RYR1 वेरिएंट के कार्यात्मक लक्षण वर्णन
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Treves, S., Girard, T., Zorzato, F.… More

Treves, S., Girard, T., Zorzato, F. Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants. J. Vis. Exp. (172), e62196, doi:10.3791/62196 (2021).

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