Summary
Aqui são descritos métodos usados para estudar o efeito funcional das mutações RYR1 expressas endógenamente no Vírus Epstein Barr, linfócitos B humanos e células de satélite derivadas da biópsia muscular diferenciadas em miótubos.
Abstract
Mais de 700 variantes do gene RYR1 foram identificadas em pacientes com diferentes distúrbios neuromusculares, incluindo suscetibilidade de hipertermia maligna, miopatias centrais e miopatia centronuclear. Devido aos diversos fenótipos ligados às mutações RYR1, é fundamental caracterizar seus efeitos funcionais para classificar variantes transportadas pelos pacientes para futuras intervenções terapêuticas e identificar variantes não patogênicas. Muitos laboratórios têm se interessado em desenvolver métodos para caracterizar funcionalmente mutações RYR1 expressas nas células dos pacientes. Essa abordagem tem inúmeras vantagens, incluindo: mutações são expressas endógenamente, RyR1 não é super-expressa, o uso de células expressas heterólogas RyR1 é evitado. No entanto, uma vez que os pacientes podem apresentar mutações em diferentes genes além do RYR1, é importante comparar os resultados de material biológico de indivíduos que abrigam a mesma mutação, com diferentes origens genéticas. O presente manuscrito descreve métodos desenvolvidos para estudar os efeitos funcionais das variantes ryr1 expressas endógenamente em: (a) O vírus Epstein Barr imortalizou linfócitos B humanos e (b) células satélites derivadas de biópsias musculares e diferenciadas em miotubes. Alterações na concentração intracelular de cálcio desencadeadas pela adição de ativadores RyR1 farmacológicos são então monitoradas. O tipo de célula selecionada é carregado com um indicador de cálcio fluorescente ratiométrico e alterações intracelulares [Ca2+] são monitoradas tanto no nível de célula única por microscopia de fluorescência ou em populações celulares usando um espectrômetro. As curvasde resposta à dose agonista são então comparadas entre células de controles saudáveis e pacientes que abrigam variantes RYR1 levando a uma visão sobre o efeito funcional de uma determinada variante.
Introduction
Até o momento, mais de 700 variantes RYR1 foram identificadas na população humana e ligadas a vários distúrbios neuromusculares, incluindo suscetibilidade de hipertermia maligna (SM), rabdomiólise induzida pelo exercício, doença central do núcleo (CCD), doença multi-minicore (TM), miopatia centronuclear (CNM)1,2,3 ; no entanto, estudos para caracterizar seus efeitos funcionais estão defasados e apenas aproximadamente 10% das mutações foram testadas funcionalmente. Diferentes abordagens experimentais podem ser usadas para avaliar o impacto de uma determinada variante RyR1, incluindo transfecção de células heterólogas como HEK293 e CÉLULAS CO-7 com codificação plasmida para o WT e mutante RYR1 cDNA4,5, transdução de fibroblastos de camundongos dispédicos com plasmídeos e vetores codificando para o WT e mutante RYR1 cDNA, seguido de transdução com mio-D e diferenciação em miotubes6 , geração de modelos animais transgênicos portadores de mutantes RyR1s7,8,9, caracterização de células de pacientes que expressam a variante RYR1 endndogenously10,11,12. Tais métodos ajudaram a estabelecer como diferentes mutações afetam funcionalmente o canal RyR1 Ca2+.
Aqui, são descritos métodos desenvolvidos para avaliar os efeitos funcionais das mutações RYR1. Vários parâmetros de homeostase intracelular de cálcio são investigados em células humanas expressando endógenamente o canal de cálcio RyR1, incluindo myotubes e Epstein Barr Virus (EBV) linfócitos Imortais. As células são obtidas de pacientes, expandidas na cultura e carregadas com indicadores de cálcio fluorescentes ratiométricos, como Fura-2 ou indo-1. Parâmetros que foram relatados para serem alterados por causa de mutações patogênicas RYR1, incluindo o repouso [Ca2+],a sensibilidade a diferentes agonistas farmacológicos e o tamanho das lojas intracelulares Ca2+ são medidos tanto no nível de célula única, usando microscopia de fluorescência, ou em populações de células usando um fluorímetro. Os resultados obtidos em células de portadores de mutação são então comparados aos obtidos de membros da família de controle saudável. Esta abordagem demonstrou que: (i) muitas mutações ligadas ao MHS levam a um aumento no repouso [Ca2+] e uma mudança para a esquerda na curva de resposta de dose para despolarização induzida por KCl ou ativação farmacológica RyR1 com 4-cloro-m-cresol10,11,12,13; (ii) mutações ligadas ao CCD levam a uma diminuição no pico [Ca2+] liberado pela ativação farmacológica do RyR1 e diminuição do tamanho se o Ca2+ intracelular armazena12,13,14,15; (iii) algumas variantes não impactam a homeostase Ca2+13. As vantagens dessa abordagem experimental são: a proteína RyR1 não é superfostinada e os níveis fisiológicos estão presentes, as células podem ser imortalizadas (tanto células musculares quanto linfócitos B) fornecendo linhas celulares contendo mutações. Algumas desvantagens dizem respeito ao fato de que os pacientes podem carregar mutações em mais de um gene codificando proteínas envolvidas na homeostase de cálcio e/ou acoplamento de contração de excitação (ECC) e isso pode complicar conclusões experimentais. Por exemplo, duas variantes JP-45 foram identificadas na população de CONTROLE e sua presença e sua presença foi demonstrada para impactar a sensibilidade do receptor de dihidropyridina (DHPR) à ativação16. Os pacientes precisam estar disponíveis, o material biológico precisa ser coletado recentemente e as licenças éticas precisam ser obtidas nos conselhos éticos locais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os protocolos descritos abaixo estão em conformidade com as diretrizes éticas da Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. Preparação de Epstein Barr imortalizada linhas celulares B-linfócitos11
- Após o consentimento informado, colete 30 mL de sangue inteiro em tubos estéreis tratados com EDTA a partir da banda proband portadora de uma mutação RYR1 e de familiares saudáveis sem mutação.
NOTA: Mantenha todas as soluções estéreis e trabalhe em uma capa de cultura de tecidos. - Isole as células mononucleares do sangue inteiro por meio de centrifugação gradiente de densidade (por exemplo, Ficoll-Hypaque, 0,077 g/L).
- Coloque 30 mL de sangue estéril em um tubo estéril cônico de 50 mL.
- Coloque a ponta de uma pipeta Pasteur contendo a mídia de centrifugação de gradiente de densidade na parte inferior do tubo e a camada 20 mL estéril de solução de mídia de centrifugação de gradiente de densidade lentamente sob o sangue.
- Centrifugar por 30 min a 900 x g a 18°-20°C, sem quebra.
NOTA: A camada de célula mononuclear aparece como um anel nublado na interfase entre a camada de mídia de centrifugação de gradiente de densidade e a camada superior contendo plasma enriquecido por plaquetas.
- Com uma pipeta estéril, remova suavemente a camada interfárica contendo células mononucleares (aproximadamente 3-5 mL) e transfira a solução para um tubo cônico estéril limpo de 50 mL.
- Adicione 20 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) para enxaguar células, centrífuga por 10 min a 600 x g à temperatura ambiente e resuspensar a pelota em PBS. Repita por um total de três vezes; isso garante que todos os meios de comunicação sejam removidos.
- Após a última lavagem, resuspend as células em 1-2 mL de meio de cultura tecidual (meio RPMI suplementado com soro de bezerro fetal de 10%, 2 mM L-glutamina e 100 unidades de penicilina e estreptomicina). Coloque as células mononucleares (aproximadamente 1 x 106 células) em um frasco de cultura tecidual T125 contendo 20 mL de meio de cultura tecidual.
- Infectar células mononucleares com o vírus Epstein-Barr.
- Use supernacantes de culturas de linha celular B95.8 (contendo 102-103 unidades transformadoras/mL estocadas a -80 °C) como fonte de EBV.
- Resuspend 1 x 106 células mononucleares da etapa 1,5 em 20 mL de meio de cultura tecidual e expô-los a 2 mL de supernasce da linha celular B95.8 na presença de ciclosporina A (concentração final de 0,2 μg/mL) para infecção.
- Coloque o frasco em uma incubadora de cultura celular de 37 °C e permita que as células cresçam. Depois de uma semana mude o meio de cultura.
NOTA: Uma vez que as células B começam a proliferar, elas formam aglomerados reconhecíveis e crescem rapidamente para que as culturas possam ser expandidas e congeladas. - Extrair o DNA genômico das linhas celulares B-linfócitos B imortalizadas do EBVpara confirmar a presença ou ausência da mutação dada.
2. Medidas intracelulares ca2+
NOTA: Alterações na concentração intracelular de cálcio das linhas celulares B-linfócitos B transformadas em EBV podem ser monitoradas em populações celulares, com um espectrofluorômetro equipado com um agitador magnético e suporte de cuvette definido para 37 °C. Alternativamente, as alterações de Ca2+ podem ser monitoradas em células únicas por microscopia de fluorescência. Em ambos os casos as células são removidas do frasco de cultura tecidual, lavadas duas vezes com a solução de Krebs Ringer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4, 5,5 mM de glicose, pH 7.4 contendo 1 mM CaCl2) e contados .
- Para experimentos em populações celulares usando um espectrofluorômetro11,13,14
- Células resuspend em uma concentração final de 1 x 107 células/ mL na solução de Krebs Ringer e incubar a 37°C por 30 min com uma concentração final de 5 μM Fura-2/AM.
- Centrífugas células a 900 x g por 10 min e resuspensá-las na solução de Krebs Ringer em uma concentração de 2 x 106 células/mL.
- Meça as alterações de fluorescência (razão 340/380 nm) usando um espectrômetro equipado com um agitador magnético definido em velocidade máxima e definido para 37 °C.
- Pouco antes do experimento girar células a 900 x g por 5 min em um microcentrifuuge e rapidamente resuspensar a pelota em 1,5 mL da solução de Krebs Ringer com 0,5 mM EGTA, mas sem adição de Ca2+.
- Coloque as células em um 3 mL de espectrofluorômetro de vidro cuvette e registe a razão da fluorescência (excitação de 340 nm/380 nm, emissão de 510 nm).
- Obtenha uma linha de base estável (aproximadamente 30 segundos), adicione a concentração selecionada de agonista RyR1 (4-cloro-m-cresol, ou 4 cmc) e registe o transitório de cálcio.
NOTA: Uma solução de estoque de 300 mM de 4 cmc feita em DMSO é usada como reagente inicial. Esta solução pode ser feita com antecedência, aliquoted e armazenada a -20 °C por vários meses. - Realizar experimentos para diferentes concentrações de 4 cmc.
NOTA: Inclua 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM a 1 mM para gerar uma curva de resposta de dose de agonista versus mudança em [Ca2+]. As diferentes concentrações de 4 cmc são obtidas adicionando o volume apropriado de 4 cmc da solução de estoque, diretamente no cuvette contendo as células carregadas Fura-2. Por exemplo, para uma concentração final de 300 μM 4 cmc, 1,5 μL da solução de estoque são adicionados ao cuvette contendo 1,5 mL de células na solução de Krebs Ringer. Para concentrações agonistas mais baixas, a solução de estoque de 300 mM deve ser diluída para 75 mM com DMSO e o volume apropriado adicionado ao cuvette contendo 1,5 mL de células na solução de Krebs Ringer. - Adicione 400 nM thapsigargin às células para calcular a quantidade total de Ca2+ presente em lojas intracelulares. Regisso pico Ca2+.
- Plote o pico de cálcio induzido por uma dada concentração de 4 cmc versus o pico de cálcio induzido pela thapsigargin, que é considerado 100% e construa uma curva de resposta de dose de 4 cmc comparando células de um proband e parente saudável
- Para experimentos em células únicas13
- Diluir a poli-L-lisina 1:10 no Estéril H2O e pré-tratar as tampas de vidro por 30 minutos. Deixe secar sob uma capa de cultura de tecido estéril.
- Suspenda os linfócitos B transformados em EBV para uma concentração final de 1 x 106 células/mL na solução de Krebs Ringer contendo 1 mM CaCl2 e adicione uma concentração final de 5 μM Fura-2/AM.
- Coloque 1 mL de células nas tampas tratadas de poli-L-lisina e incubar a 37 °C em uma incubadora de cultura celular umidificada por 30 minutos para permitir que as células EBV grudem na tampa de vidro durante o carregamento.
- Coloque o deslizamento de cobertura na câmara de perfusão e inicie a perfusão (a uma taxa de 2 mL/min) com a solução de Krebs Ringer contendo 1 mM Ca2+.
- Use um microscópio fluorescente invertido (equipado com um objetivo de imersão em óleo de 40x (0,17 abertura numérica), filtros (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) para registrar medições on-line, com um acessório de câmera de carga controlada por software (CCD).
- Adquira imagens em intervalos de 1 s a um tempo fixo de exposição (100 ms para comprimentos de onda de excitação de 340 e 380 nm. Use software de imagem para analisar mudanças na fluorescência. Meça o valor médio do pixel para cada célula em comprimentos de onda de excitação de 340 e 380 nm13.
- Para obter estimulação celular, use um estimulador de perfusão celular com 12 válvulas e adicione diferentes concentrações de 4 cmc. A válvula de descarga contém a solução de Krebs Ringer sem adição de Ca2+ mais 100 μM La3+ para monitorar a liberação de cálcio apenas de lojas intracelulares.
- Construa uma curva de resposta de dose de 4 cmc versus mudança em [Ca2+], conforme descrito acima.
3. Preparação de miotubes humanos a partir de biópsias musculares10,12,15
NOTA: Diferentes métodos têm sido usados por diferentes laboratórios para obter myoblasts e miotubes derivados de células satélites. Abaixo está a descrição do método utilizado na Basileia.
- Enxágüe a biópsia muscular com PBS estéril para remover o excesso de sangue e corte em pequenos fragmentos de cerca de 0,5-1 mm.
- Prepare 6 pratos de cultura de tecido com inserção. Adicione 1,5 mL de médio de crescimento muscular humano a cada poço e 0,5 mL de meio de crescimento muscular humano a cada inserção.
NOTA: O meio de crescimento é feito da seguinte forma: 500 mL do meio modificado da Águia de Dulbecco com alta glicose, ou DMEM (4,5 mg/mL), contendo 10% de soro de cavalo, 5 insulina ng/mL, glutamina de 3 mM, penicilina G de 600 ng/mL e estreptomicina, e 7 mM HEPES, pH 7.4. O meio de crescimento muscular esquelético disponível comercialmente também pode ser usado. - Coloque 2-3 pequenos fragmentos musculares em cada inserção(Figura 1A) e coloque pratos de cultura na incubadora de cultura celular (5% CO2, 37 °C). Após aproximadamente 8-10 dias, as células satélites podem ser vistas crescendo fora e ao redor da biópsia muscular, anexada à inserção(Figuras 1,B e C, flechas).
- Liberar um número suficiente de células da biópsia (após aproximadamente 10-14 dias), trypsinize da seguinte forma:
- Retire todo o meio de cultura, enxágue as células uma vez com 1 mL de PBS, adicione 0,5 mL de solução de trippsina/EDTA (0,025% trypsin e 0,01% EDTA) e incubar a 37 °C por 5 min.
- Adicione 1 mL de meio de crescimento às células para neutralizar o efeito da trippsina e transferir as células satélites para um novo frasco de cultura celular T25; adicionar 3 mL de meio de crescimento e colocar as células em uma incubadora de cultura celular (5% CO2, 37 °C).
- Altere o meio de crescimento no dia seguinte para remover o EDTA e, posteriormente, mude o meio uma vez por semana.
- Quando os myoblasts forem aproximadamente 75% confluentes, tente e transfira-os para a tampa de vidro tratada com laminina.
NOTA: Como proporção, as células que crescem em um frasco T25 devem ser transferidas para uma tampa de vidro tratada com laminina de 43 mm de diâmetro. A mancha de tampa de vidro deve ser colocada dentro de uma placa de cultura de tecido de 60 mm de diâmetro contendo 3 mL de meio de crescimento. - Cultivar células no deslizamento de vidro em meio de crescimento em uma incubadora de cultura celular (5% CO2, 37 °C) mudando o meio uma vez por semana. Com 90% de confluência, mudar para meio de diferenciação composta da seguinte forma: DMEM de alta glicose (4,5 mg/mL), 0,5% de albumina de soro bovino, 10 ng/mL fator de crescimento epidérmico, 0,15 mg/mL creatina, 5 ng/mL insulina, 200 mM glutamina, 600 ng/mL penicilina G e estreptomicina, e 7 mM HEPES, pH 7.4). O meio de diferenciação comercialmente disponível também pode ser utilizado. Mude o meio de diferenciação uma vez por semana.
- Após 7-10 dias em meio de diferenciação, miótubos multinucleados são visíveis. Avalie as alterações em [Ca2+] dentro de uma semana, conforme descrito abaixo.
4. [Ca2+]i medidas de razão determinadas com Fura-2
- Tampas de vidro de cargalip miotubes cultivados com Fura-2/AM (concentração final de 5 μM) diluídos em DMEM por 30 min a 37 °C. Brevemente, remova o meio de diferenciação das células cultivadas do deslizamento de vidro e adicione um meio de diferenciação fresco de 2 mL. Adicione 10 μL de Fura-2 AM de uma solução de estoque de 1 mM e incubar 30 min em uma incubadora de cultura celular (5% CO2, 37 °C).
- Transfira a tampa de vidro para a câmara de perfusão e enxágue células com a solução de Krebs Ringer contendo 2 mM CaCl2.
- Realize medições on-line [Ca2+] conforme descrito acima na seção de célula única EBV com o uso de um objetivo FLUAR de imersão de água de 20x (abertura numérica de 0,17).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[Ca2+]i medições em populações de linfócitos B imortalizados pelo EBV
Linfócitos B primários expressam o isoform RyR1 que funciona como um canal de liberação ca2+ durante os processos de sinalização estimulados pelo receptor de antígeno celular B17. A imortalização de células B com EBV, procedimento rotineiramente utilizado por geneticistas para obter linhas celulares contendo informações genômicas dos pacientes, proporciona a vantagem de gerar linhas celulares que expressam canais mutantes RyR1 Ca2+ em pacientes que abrigam mutações RYR111,13. [Ca2+] i mudanças provocadas pela adição de agonistas ryr1 específicos como 4-cloro-m-cresol18 e cafeína podem ser facilmente monitoradas a fim de estabelecer se uma dada mutação RYR1 altera a sensibilidade a um agonista, a quantidade de cálcio liberado, o repouso [Ca2+], ou outros parâmetros que se mostraram impactados por mutações. [Ca2+] i as alterações podem ser monitoradas em populações de células carregadas Fura-2 em suspensão com um espectrômetro ou em grupos de células presas a tampas de vidro e examinadas por epifluorescência. A Figura 2 mostra um experimento representativo realizado em suspensões celulares. Imediatamente antes de serem colocadas na cuvette, as células foram giradas para remover o Fura-2 que pode ter vazado; as células foram então resuspendidas para uma concentração final de 1 x 106 células/mL em quente (37°C) A solução de Krebs Ringer não contém ca2+ adicional mais 0,5 mM EGTA e colocada no espectrômetro. O agitador magnético foi ligado à posição 4 (a posição mais alta) para manter as células em suspensão e a fluorescência foi registrada. Depois que um traço estável foi obtido, o agonista selecionado foi adicionado (na Figura 2A este foi 300 μM 4-cloro-m-cresol) levando a um rápido aumento de Ca2+ que, em seguida, lentamente recuou para níveis de descanso. A natureza transitória da mudança na fluorescência é importante, pois indica (i) que não é um artefato causado pela adição de um composto fluorescente ou quenching, (ii) que não é devido à ligação de cálcio à Fura-2 extracelular e (iii) que as células são saudáveis e podem remover ativamente o cálcio de seu citoplasma.
O mesmo experimento precisa ser repetido várias vezes para ser analisado estatisticamente. Para cada linha celular e cada dia, os experimentos são realizados e a quantidade total de cálcio rapidamente liberado nos estoques precisa ser determinada adicionando o inibidor serca thapsigargin11,13,14. Como mostrado na Figura 2B, a adição de 400 nM thapsigargin faz com que um grande transitório de cálcio atinja um valor de fluorescência de pico de 2,4 unidades arbitrárias (a.u.); assim, a quantidade total de cálcio que pode ser liberada das lojas intracelulares das células B imortalizadas pelo EBV mostradas na Figura 2B é igual a 2,4 a.u. (pico thapsigargin) - 1,45 a.u. (razão de repouso) ou 0,95 Este valor de fluorescência foi considerado 100% ao construir a curva de resposta da dose mostrada na Figura 2C.
Célula única [Ca2+]i medições em linfócitos B imortalizados pelo EBV
Esta segunda abordagem conta com a disponibilidade de um microscópio de fluorescência e uma configuração de microperfusão permitindo a estimulação de uma única célula ou pequenos grupos de células com uma dada concentração de agonista e o registro simultâneo das alterações de fluorescência. As seringas do sistema de microperfusão são carregadas com diferentes concentrações do agonista RyR1 selecionado (cafeína ou 4-cloro-m-cresol) que serão usadas para gerar curvas de resposta de dose. No exemplo mostrado na Figura 3,as células foram estimuladas com cafeína de 0,5-10 mM dissolvida na solução de Krebs Ringer que não contém cálcio adicionado mais 100 μM La3+ para monitorar a liberação de Ca2+ de lojas intracelulares. As tampas de vidro nas quais os linfócitos B imortais da Fura-2 carregados foram autorizados a anexar são colocados na câmara de perfusão e perfundidos com a solução de Krebs Ringer contendo 1 mM Ca2+. A maioria das células terá aderido ao deslizamento tratado de poli-L-lisina e pequenos grupos de células devem ser identificados e verificados para o carregamento de Fura-2. A ponta do sistema de perfusão é colocada perto das células para banhá-las (e não todas as células da tampa) com cafeína. Normalmente as células são estimuladas a partir da menor para a maior concentração de cafeína; para cada concentração, uma nova célula ou grupo de células são selecionadas. As medidas de fluorescência racionada (excitação a 340 nm e 380 nm, emissão a 510 nm) são registradas a cada segundo por até 2 min. Algumas imagens são obtidas antes da perfusão, a fim de obter uma linha de base estável, posteriormente a perfusão celular é iniciada, primeiro por células de descarga com uma solução da solução de Krebs Ringer contendo 100 μM La3+ por 5 segundos. Isso não deve resultar em uma mudança na florescência e é um controle para garantir que as células grudem no deslizamento de cobertura durante todo o experimento; posteriormente, uma solução contendo a concentração agonista selecionada é lavada sobre as células.s. No exemplo mostrado na Figura 3A,as células foram estimuladas com cafeína de 5 mM durante 20 segundos. A seta mostrada indica quando a válvula de cafeína foi aberta e isso resulta em um aumento imediato na razão fluorescente de 340/380 nm. Após 20 segundos, a válvula de cafeína fecha, e as células são lavadas com a solução de Krebs Ringer contendo 100 μM La3+; fluorescência é registrada até que a linha de base seja atingida. Para cada concentração de cafeína o ΔF, que é o pico induzido pela cafeína 340/380 nm fluorescência - a fluorescência inicial de 340/380 nm é calculada e usada para construir uma curva de resposta de dose, como mostrado na Figura 3B. ΔF médio de 5-10 células é mediana para cada concentração de cafeína. A quantidade de cálcio em lojas intracelulares também pode ser monitorada. Neste caso, as células são enxaguadas com a solução de Krebs Ringer contendo 0,5 mM EGTA e uma solução de 1 μM thapsigargin, 1 μM ionomicina e 0,5 mM EGTA é adicionada manualmente às células (não através do sistema de microperfusão como bastões de ionomicina na tubulação e não pode ser lavada) e a fluorescência é registrada por aproximadamente 4-5 min. Para calcular o ΔF, uma região de interesse (ROI) delineando uma célula é obtida e as alterações na fluorescência dentro do ROI são calculadas usando um software de imagem.
Em resumo, ao usar células B imortalizadas do EBV para medir a sensibilidade do RyR1 a um agonista específico, experimentos repetidos devem ser realizados em células de um indivíduo, em dias diferentes. Para medições em populações de células, o status dos estoques de cálcio intracelular precisa ser avaliado e a liberação de cálcio induzido eC50 agonista é traçada em relação à quantidade total de cálcio que pode ser liberada dos estoques. Uma vantagem de usar essa abordagem é que a resposta [Ca2+] de milhões de células é mediana; além disso, não são necessários sistema de microperfusão e microscópios fluorescentes. O método de célula única permite o uso de um número menor de células e a visualização on-line de alterações em [Ca2+] de células selecionadas.
Mamótuisderivados de células únicas [Ca2+] em miótubos derivados de células satélites humanas
Os miotubos cultivados e diferenciados são carregados com Fura-2, transferidos para a câmara de perfusão e banhados na solução de Krebs Ringer contendo 2 mM Ca2+ como descrito acima para células EBV. As seringas do sistema de perfusão estão preenchidas com o agonista selecionado e os miotubes são estimulados como descrito acima. Uma vez que nem todas as células no deslizamento são miótubos multinucleados, é importante selecionar as células apropriadas que serão medidas. Pequenos grupos de miotubes podem ser estimulados simultaneamente. No exemplo mostrado na Figura 4, um único miotube foi lavado com uma solução contendo KCl, diferentes concentrações de 4-cloro-m-cresol e finalmente cafeína, no entanto, normalmente são construídas curvas de resposta de dose aos agonistas, como indicado na seção anterior, a fim de comparar a sensibilidade agonista das células de diferentes indivíduos12,15,16 . KCl é usado como uma maneira de despolarizar a membrana plasmática. No esquelético, a despolarização da membrana plasmática muscular é sentida pela tensão sensoriamento DHPR que, assim, sofre uma mudança conformacional que leva à ativação e abertura do RyR1. Por outro lado, 4-cloro-m-cresol e cafeína são ativadores farmacológicos diretos do RyR1.
Figura 1: Geração de culturas mióclatas derivadas da biópsia muscular humana primária. (A) Pequenos fragmentos de músculo (setas) são colocados em pastilhas contendo meio de crescimento de 0,5 mL. Após 7-14 dias, as células satélites podem ser vistas (pequenas flechas) adjacentes ao tecido muscular e crescendo na parte inferior da inserção. Imagem tirada através de um objetivo de 10x (B) e 20x objetivo(C). As caixas cinzas no painel A foram usadas para cobrir a identidade do paciente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Experimentos de liberação de cálcio em linfócitos B imortalizados do EBV. Ratiometric [Ca2+]i medições em uma população de células carregadas Fura-2 em suspensão. A) A adição de 300 μM 4-cloro-m-cresol (seta) causa um aumento imediato na citoplasmática [Ca2+], que posteriormente se deteriora para níveis de repouso dentro de 500 segundos. Neste exemplo, o ΔF induzido pela adição de 300 μM 4-cloro-m-cresol é de 1,7 unidades de fluorescência- 1,4 unidades de fluorescência = 0,3 unidades de fluorescência. B) A adição do inibidor serca thapsigargin (400 nM, seta) causa um aumento maior na razão de fluorescência Fura-2, que atinge 2,4 unidades de fluorescência e, posteriormente, decai para níveis de repouso em 1,45 unidades de fluorescência. O tápsigargin induzido [Ca2+] transitório representa a quantidade total de cálcio rapidamente liberado nas lojas intracelulares presentes na população celular. O pico transitório obtido (2,4-1,45= 0,95 unidades) é utilizado para calcular a porcentagem de cálcio liberada por uma dada concentração de 4-cloro-m-cresol. C) Curvas representativas de resposta de dose correlacionando o ΔF como uma porcentagem da quantidade total de cálcio rapidamente liberado em lojas intracelulares. Para 300 μM 4-cloro-m-cresol este valor é de 0,3/0,95x100 =31,6%. Cada símbolo representa a média± SEM% dos valores de 5-10 de células imortalizadas do EBV a partir de um controle (círculos fechados, linha pontilhada) e um indivíduo MHS (quadrados fechados, linha contínua) carregando uma mutação RYR1. As curvas foram geradas utilizando-se uma função de curva de dose-resposta sigmoidal. Os painéis A e B são adaptados de Girard et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Liberação ca2+ induzida pela cafeína em linfócitos B imortais individuais do EBV de um indivíduo de controle. A) Painéis superiores, imagens de lapso de tempo(A)Contraste de fase; (B-E), célula única [Ca2+]I medições de linfócitos ebv-imortalizados fura-2-carregados: (B) t=0, (C) t=36 s, (D) t=50 s e (E) t=77 s após a aplicação de 5 mM de cafeína. As células foram estimuladas individualmente pela adição de cafeína diluída na solução Krebs-Ringer. Barra de escala=10 μm. Painel inferior, traço representativo obtido após a estimulação de uma única célula com 5 mM de cafeína (seta). B) Curvas de resposta de dose mostrando a alteração dependente da cafeína em [Ca2+]i, expressas como mudança na razão da fluorescência (proporção de pico 340/380 nm−taxa de repouso 340/380 nm). Cada ponto representa a média ± SEM da mudança na fluorescência de 4-15 células. As curvas foram geradas utilizando-se uma função de curva de dose-resposta sigmoidal. Quadrados fechados, linha pontilhada, células de controle; triângulos fechados, linha contínua, indivíduo MHS carregando uma mutação RYR1. Este número é uma adaptação de Ducreux et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Liberação de cálcio estimulada por KCl, 4-cloro-m-cresol e cafeína em miotubes humanos de um indivíduo de controle. Painéis esquerdos: A) contraste de fase (B-H), medidas intracelulares de célula única Ca2+ de miótubos humanos carregados fura-2. B) repouso [Ca2+]i; C) t=2 s após a aplicação de 150 mM KCl. D) t= 2 s após a aplicação de 150 μM 4-cloro-m-cresol; E) t=2 s após a aplicação de 300 μM 4-cloro-m-cresol; F) t=2 s após a aplicação de 600 μM 4-cloro-m-cresol; G) t=2 s após a aplicação de cafeína de 10 mM; H) t=20 s após a aplicação da cafeína. Painel direito: Parcela de tempo (s) versus relação fluorescência (340/380 nm) na célula estimulada. Os miótubos foram estimulados individualmente pela adição do agonista no tampão Krebs-Ringer contendo 100 μM La3+,assim o aumento em [Ca2+]i representa apenas a liberação de cálcio de lojas intracelulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os protocolos descritos neste artigo foram utilizados com sucesso por vários laboratórios para estudar o impacto das mutações RYR1 na homeostase do cálcio. As etapas críticas das abordagens descritas neste artigo tratam da esterilidade, habilidades e técnicas de cultivo celular e disponibilidade de material biológico. Em princípio, o uso de linfócitos B imortalizados pelo EBV é mais simples e permite gerar linhas celulares contendo canais mutantes RyR1. As células podem ser congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido por muitos anos e culturas podem ser reinseridas a qualquer momento. Além disso, pode-se escolher se deve monitorar a homeostase do cálcio em populações celulares ou no nível único das células. O método anterior é mais simples, não requer um microscópio de fluorescência e permite que o pesquisador teste linhas celulares geradas de diferentes indivíduos em um curto período de tempo. A limitação é a velocidade do crescimento celular e a disponibilidade de um espectrômetro totalmente equipado (aquecido e com agitador magnético). Como uma abordagem alternativa, a citometria de fluxo de fluxo em combinação com indicadores fluorescentes de cálcio pode ser usada para medir fluxos de cálcio em linfócitos B imortalizados pelo EBV; dessa forma, podem ser determinadas alterações na concentração intracelular de cálcio19. Se um microscópio fluorescente, câmara de perfusão e sistema de microperfusão estiverem disponíveis, então a imagem celular única tem a vantagem de ser mais sensível e dar informações mais detalhadas, incluindo variabilidade celular para célula, análise cinética e identificação de domínios subcelulares envolvidos na liberação de cálcio. Esta última abordagem é tecnicamente mais desafiadora e requer mais equipamentos.
Existem várias vantagens em usar linfócitos B imortalizados pelo EBV, incluindo que outros parâmetros de lado [Ca2+]i homeostasis podem ser medidos. Por exemplo, a acidificação induzida por cloro-m-cresol das células B tem sido usada para diferenciar células de indivíduos de controle de pacientes com SM20,21. No entanto, deve-se ter em mente (i) que as células B não expressam muitas das proteínas envolvidas no acoplamento de excitação muscular esquelética que pode influenciar indiretamente a liberação de cálcio, (ii) são células não excitáveis, portanto, não podem ser ativadas fisiologicamente pela despolarização da membrana plasmática, e finalmente um relatório de Monnier et al. descobriu que uma mutação identificada em um paciente não foi expressa em células B imortalizadas pelo EBV por causa de um local de emenda enigmática22.
Culturas de células musculares primárias derivadas do paciente têm sido utilizadas por vários grupos interessados em estudar o efeito de mutações em diferentes genes que codificam proteínas envolvidas na homeostase de cálcio10,23,24. Essas células podem ser diferenciadas em mofubos multinucleados, responder à despolarização da membrana plasmática e podem ser avaliadas por meios eletrofisiológicos. Além disso, eles podem ser imortalizados a fim de obter linhas celulares portadoras de mutações RYR125, embora o procedimento seja muito mais complexo do que para linfócitos B. Embora também seja verdade que as células musculares estão crescendo lentamente e o tempo necessário de fazer uma biópsia para ter um número suficiente de células pode ser de mais de um mês, também é possível armazenar os pequenos pedaços de biópsias musculares em meio de congelamento em nitrogênio líquido, a fim de obter myoblasts anos depois. Os longos tempos de cultivo têm o risco adicional de contaminação por bactérias, leveduras ou moldes e assim que um número suficientemente grande de míobios foram obtidos, é importante congelá-los e armazená-los em nitrogênio líquido. Nosso laboratório aplicou com sucesso a mesma técnica descrita acima para motubes, para estudar alterações de cálcio em fibroblastos derivados da pele humana transduzidos com mioD e diferenciados em mobos26. Isso foi feito para estudar o efeito funcional das mutações RYR1 quando as míbios derivadas da biópsia muscular não estavam disponíveis. Quanto aos linfócitos B, a acidificação induzida por 4-cloro-m-cresol de miotubes de pacientes com mutações RYR1 ligadas ao MHS foi testada com sucesso27.
Em conclusão, o uso de material biológico de pacientes para estudar a correlação genótipo-fenótipo tem muitas vantagens na desvantagem e pode ser usado com sucesso para estudar o efeito de mutações no RYR1. Ao usar essa abordagem, no entanto, é importante ter em mente que mutações presentes em outros genes podem influenciar a homeostase do cálcio; portanto, deve ser realizado o uso de células de diferentes famílias que abrigam a mesma mutação, bem como de familiares que não abrigam a mutação RYR1 como controles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho descrito neste manuscrito foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência da Suíça (SNF) e da Fundação Suíça de Músculos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
