Summary
这里描述了用于研究RYR1突变的功能效应的方法,这些突变在爱泼斯坦巴尔病毒中内源性表达,使人B淋巴细胞永生化,肌肉活检衍生的卫星细胞分化成肌管。
Abstract
RYR1基因的700多种变异已经在患有不同神经肌肉疾病的患者中被发现,包括恶性高热易感性,核心肌病和中心核肌病。由于与RYR1突变相关的表型多种多样,因此表征其功能效应以对患者携带的变异进行分类以用于未来的治疗干预并识别非致病性变异是至关重要的。许多实验室一直对开发功能表征患者细胞中表达的RYR1突变的方法感兴趣。这种方法具有许多优点,包括:突变是内源性表达的,RyR1不会过度表达,避免使用异源RyR1表达细胞。然而,由于患者可能在RYR1以外的不同基因中表现出突变,因此比较具有不同遗传背景的具有相同突变的个体的生物材料的结果非常重要。本手稿描述了为研究内源性表达的RYR1变体的功能效应而开发的方法:(a)爱泼斯坦巴尔病毒永生化的人B淋巴细胞和(b)来自肌肉活检并分化成肌管的卫星细胞。然后监测由添加药理学RyR1激活剂触发的细胞内钙浓度的变化。所选细胞类型加载比例荧光钙指示剂,并通过荧光显微镜在单细胞水平或使用光谱荧光计监测细胞内[Ca2 +]变化。然后比较来自健康对照组的细胞和携带RYR1变异的患者之间的静息[Ca2 +]激动剂剂量反应曲线,从而深入了解给定变异的功能效应。
Introduction
迄今为止,已在人群中鉴定出700多种RYR1变体,并与各种神经肌肉疾病有关,包括恶性高热易感性(MHS),运动诱导的横纹肌溶解,中枢核心疾病(CCD),多微核疾病(MmD),中心核肌病(CNM)1,2,3;然而,表征其功能效应的研究滞后,只有大约10%的突变进行了功能测试。可以使用不同的实验方法来评估给定RyR1变体的影响,包括用编码WT的质粒和突变的RYR1 cDNA4,5转染异源细胞,如HEK293和COS-7细胞,转导呼吸不良的小鼠成纤维细胞与质粒和编码WT的载体和突变的RYR1 cDNA,然后转导肌-D并分化成肌管6,产生携带突变RyR1s的转基因动物模型7,8,9,表征来自内源性表达RYR1变异的患者的细胞10,11,12。这些方法有助于确定不同的突变如何在功能上影响RyR1 Ca2 +通道。
在这里,描述了为评估RYR1突变的功能效应而开发的方法。在内源性表达RyR1钙通道的人细胞中研究了细胞内钙稳态的各种参数,包括肌管和爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)永生化的B淋巴细胞。从患者身上获得细胞,在培养物中扩增并加载成比例的荧光钙指示剂,如Fura-2或indo-1。据报道,由于致病性RYR1突变而改变的参数,包括静息[Ca2 +],对不同药理激动剂的敏感性以及细胞内Ca2 +储存的大小,可以在单细胞水平上,使用荧光显微镜或使用荧光计在细胞群中测量。然后将从突变携带者的细胞中获得的结果与从健康对照家族成员获得的结果进行比较。这种方法已经证明:(i)许多与MHS相关的突变导致静息[Ca2 +]的增加,并且剂量反应曲线向左移动,以KCl诱导的去极化或药理学RyR1激活与4-氯-m-甲酚10,11,12,13;(ii)与CCD相关的突变导致RyR1的药理学激活释放的峰[Ca2 +]降低,并且如果细胞内Ca2 +存储12,13,14,15,则尺寸减小;(iii)某些变体不影响Ca2 +稳态13。这种实验方法的优点是:RyR1蛋白不过度表达并且存在生理水平,细胞可以被永生化(肌肉细胞和B淋巴细胞)提供含有突变的细胞系。一些缺点与患者可能携带参与钙稳态和/或激发收缩偶联(ECC)的多个编码蛋白的基因突变有关,这可能会使实验结论复杂化。例如,在MHS和对照人群中鉴定出两种JP-45变体,并且它们的存在被证明会影响二氢吡啶受体(DHPR)对激活16的敏感性。患者需要可用,生物材料需要新鲜收集,并且需要从当地道德委员会获得道德许可。
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Protocol
下面描述的协议符合Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ的道德准则。
1. 爱泼斯坦巴尔永生化B淋巴细胞系的制备11
- 在知情同意后,在EDTA处理的无菌管中收集30毫升全血,这些无菌管来自携带RYR1突变的先证者和没有突变的健康家庭成员。
注意:保持所有溶液无菌,并在组织培养罩中工作。 - 通过密度梯度离心培养基(例如,Ficoll-Hypaque,0.077 g/L)从全血中分离出单核细胞。
- 将30 mL无菌血液放入50 mL锥形无菌管中。
- 将含有密度梯度离心培养基的巴斯德移液管的尖端置于管底部,并在血液下方缓慢放置20mL无菌的密度梯度离心培养基溶液。
- 在18°-20°C下以900×g离心30分钟,无中断。
注:单核细胞层在密度梯度离心培养基层和含有富集血小板血浆的顶层之间的间相处呈浑浊环状。
- 使用无菌移液器轻轻除去含有单核细胞(约3-5mL)的相间层,并将溶液转移到干净的50mL无菌锥形管中。
- 加入20mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞,在室温下以600×g离心10分钟,并将沉淀重悬于PBS中。 重复总共三次;这将确保所有介质都被移出。
- 最后一次洗涤后,将细胞重悬于1-2mL组织培养基(补充有10%胎儿小牛血清,2mM L-谷氨酰胺和100单位青霉素和链霉素的RPMI培养基)中。将单核细胞(约1×106 个细胞)置于含有20mL组织培养基的T125组织培养瓶中。
- 用爱泼斯坦-巴尔病毒感染单核细胞。
- 使用来自B95.8细胞系培养物的上清液(含有10个2-10个3转化单位/mL,储存在-80°C)作为EBV的来源。
- 将步骤1.5中的1×10 6 个单核细胞重悬于20mL组织培养基中,并在环孢菌素A(0.2μg/ mL终浓度)存在下将其暴露于B95.8细胞系的2mL上清液中以进行感染。
- 将烧瓶置于37°C细胞培养箱中,让细胞生长。一周后更换培养基。
注意:一旦B细胞开始增殖,它们就会形成可识别的团块并迅速生长,以便培养物可以扩增和冷冻。 - 从EBV永生化的B淋巴细胞系11 中提取基因组DNA以确认给定突变的存在与否。
2. 细胞内 Ca2+ 测量
注意:EBV转化的B淋巴细胞系的细胞内钙浓度的变化可以在细胞群中监测,配备磁力搅拌器和比色皿支架的分光荧光计设置为37°C。 或者,可以通过荧光显微镜监测单个细胞中的Ca2 + 变化。在这两种情况下,从组织培养瓶中取出细胞,用克雷布斯林格溶液(140mM NaCl,5 mM KCl,1 mM MgCl2,20mM HEPES,1 mM NaHPO4,5.5mM葡萄糖,pH 7.4含1mM CaCl2)洗涤两次并计数。
- 对于使用光谱荧光计在细胞群中的实验11,13,14
- 将细胞以1 x 107 个细胞/ mL的终浓度重悬于克雷布斯林格溶液中,并在37°C下孵育30分钟,终浓度为5μM Fura-2 / AM。
- 将细胞以900×g离心10分钟,并以2×106个细胞/ mL的浓度重悬于克雷布斯林格溶液中。
- 使用配备磁力搅拌器的光谱荧光计测量荧光变化(比率340/380 nm),该光谱仪设置为最大速度并设置为37°C。
- 就在实验之前,在微量离心机中以900×g旋转细胞5分钟,并迅速将沉淀重悬于1.5mL的克雷布斯林格溶液中,EGTA为0.5mM,但不添加Ca2 +。
- 将细胞置于3mL玻璃荧光计比色皿中并记录荧光比(340nm / 380nm激发,510nm发射)。
- 达到稳定的基线(约30秒),加入所选浓度的RyR1激动剂(4-氯-m-甲酚,或4-cmc)并记录钙瞬时。
注:使用DMSO制成的300 mM 4-cmc储备溶液用作起始试剂。该溶液可以提前制成,等分并储存在-20°C下数月。 - 对不同的4-cmc浓度进行实验。
注:包括75μM,150μM,300μM,450μM,600μM,750μM至1mM,以产生激动剂与[Ca2 +]变化的剂量反应曲线。通过将来自储备溶液的适当体积的4-cmc直接添加到含有Fura-2加载电池的比色皿中来获得不同的4-cmc浓度。例如,对于终浓度为300μM 4-cmc,将1.5μL储备溶液加入到含有Krebs Ringer溶液中1.5mL细胞的比色皿中。对于较低的激动剂浓度,应用DMSO稀释300mM储备溶液至75mM,并将适当体积加入到含有1.5mL细胞的比色皿中。 - 向细胞中加入400nM他西加宁,以计算细胞内储存中存在的Ca2 + 的总量。记录峰值 Ca2+。
- 绘制给定的 4-cmc 浓度诱导的峰值钙与 thapsigargin 诱导的峰值钙(被认为是 100%),并构建 4-cmc 剂量反应曲线,比较来自先证和健康亲属的细胞
- 用于单细胞实验13
- 在无菌H2O中稀释聚-L-赖氨酸1:10,并预处理玻璃盖玻片30分钟。在无菌组织培养罩下风干。
- 将EBV转化的B淋巴细胞在含有1mM CaCl2的Krebs Ringer溶液中重新悬浮至1 x 106个细胞/ mL的终浓度,并加入5μM Fura-2 / AM的终浓度。
- 将1mL细胞放在聚-L-赖氨酸处理的盖玻片上,并在37°C下在加湿的细胞培养箱中孵育30分钟,以使EBV细胞在加载过程中粘附在玻璃盖玻片上。
- 将盖玻片放入灌注室中,然后用含有1mM Ca 2 +的克雷布斯林格溶液开始灌注(以2mL/ min的速度)。
- 使用倒置荧光显微镜(配备40倍油浸物镜(0.17数值孔径))、滤光片(BP 340/380、FT 425、BP 500/530)记录在线测量结果,并附有软件控制的电荷耦合器件(CCD)相机附件。
- 以固定曝光时间以1秒的间隔采集图像(340和380nm激发波长均为100 ms)。使用成像软件分析荧光的变化。在激发波长为340和380 nm13时测量每个细胞的平均像素值。
- 要实现细胞刺激,请使用具有12个瓣膜的细胞灌注刺激器,并添加不同浓度的4-cmc。冲洗阀含有克雷布斯铃声的溶液,不添加Ca2 + 加上100μM La3 +, 仅用于监测细胞内储存的钙释放。
- 如上所述,构建4-cmc与[Ca2+]变化的剂量反应曲线。
3. 从肌肉活检中制备人肌管10,12,15
注意:不同的实验室使用不同的方法来获得卫星细胞衍生的成肌细胞和肌管。以下是巴塞尔协议中所用方法的说明。
- 用无菌PBS冲洗肌肉活检,以去除多余的血液并切成约0.5-1mm的小碎片。
- 准备6孔组织培养皿与插入物。向每个孔中加入1.5 mL人肌肉生长培养基,向每个插入物中加入0.5 mL人肌肉生长培养基。
注意:生长培养基组成如下:500 mL Dulbecco改良的鹰高葡萄糖培养基或DMEM(4.5 mg / mL),含有10%的马血清,5 ng / mL胰岛素,3 mM谷氨酰胺,600 ng / mL青霉素G和链霉素,以及7 mM HEPES,pH 7.4。也可以使用市售的骨骼肌生长培养基。 - 将2-3个小肌肉碎片放入每个插入物中(图1A),并将培养皿放入细胞培养箱(5%CO 2,37°C)。大约8-10天后,可以看到卫星细胞从肌肉活检中生长出来并围绕肌肉活检,附着在插入物上(图1,B和C,箭头)。
- 从活检中释放足够数量的细胞(约10-14天后),胰蛋白酶消化如下:
- 除去所有培养基,用1mL PBS冲洗细胞一次,加入0.5mL胰蛋白酶/ EDTA溶液(0.025%胰蛋白酶和0.01%EDTA),并在37°C下孵育5分钟。
- 向细胞中加入1mL生长培养基以中和胰蛋白酶的作用,并将卫星细胞转移到新的T25细胞培养瓶中;加入3mL生长培养基,将细胞置于细胞培养箱(5%CO 2,37°C)中。
- 第二天更换生长培养基以去除EDTA,随后每周更换一次培养基。
- 当成肌细胞汇合约75%时,胰蛋白酶消化并转移到层粘连蛋白处理的玻璃盖玻片上。
注意:按比例,在一个T25烧瓶中生长的细胞应转移到一个直径为43毫米的夹层蛋白处理玻璃盖玻片上。玻璃盖玻片应置于含有3mL生长培养基的60mm直径组织培养板内。 - 在细胞培养箱(5%CO 2,37°C)的生长培养基中的玻璃盖玻片上生长细胞,每周更换一次培养基。在90%汇合时,切换到分化培养基,组成如下:高葡萄糖DMEM(4.5mg / mL),0.5%牛血清白蛋白,10ng / mL表皮生长因子,0.15mg / mL肌酸,5 ng / mL胰岛素,200 mM谷氨酰胺,600ng / mL青霉素G和链霉素,以及7 mM HEPES,pH 7.4)。也可以使用市售的分化培养基。每周更换一次分化培养基。
- 在分化培养基中7-10天后,多核肌管可见。在一周内评估 [Ca2+] 的变化,如下所述。
4. [Ca2+]i 使用 Fura-2 测定的比率测量
- 加载玻璃盖玻片生长的肌管,在37°C下在DMEM中稀释30分钟Fura-2 / AM(终浓度为5μM)。 简而言之,从玻璃盖玻片生长的细胞中除去分化培养基,并加入2mL新鲜分化培养基。从1mM的储备溶液中加入10μLFura-2 AM,并在细胞培养箱(5%CO2,37°C)中孵育30分钟。
- 将玻璃盖玻片转移到灌注室,并用含有2mMCaCl2的克雷布斯林格溶液冲洗细胞。
- 使用20x水浸式FLUAR物镜(0.17数值孔径)执行EBV单细胞部分所述的在线[Ca2+]测量。
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Representative Results
[Ca2+]i 在EBV永生化B淋巴细胞群体中的测量
原代B淋巴细胞表达RyR1同种型,其在B细胞抗原受体刺激的信号传导过程中起到Ca2+释放通道的作用17。用EBV对B细胞进行永生化,这是遗传学家经常用于获得含有患者基因组信息的细胞系的程序,它提供了在携带RYR1突变的患者中产生表达突变RyR1 Ca2 +通道的细胞系的优势11,13。[约2+]添加特定的RyR1激动剂(如4-氯-m-甲酚18和咖啡因)带来的变化可以很容易地监测,以确定给定的RYR1突变是否改变了对激动剂的敏感性,释放的钙量,静息[Ca2 +]或其他已被证明受突变影响的参数。[约2+]i变化可以在用光谱荧光计悬浮液中的Fura-2加载细胞群中或在附着在玻璃盖玻片上的细胞组上监测,并通过落射荧光进行检查。图2显示了在细胞悬浮液上进行的代表性实验。在放入比色皿之前,立即旋转细胞以除去可能泄漏的Fura-2;然后将细胞重悬至1 x 106个细胞/ mL的热(37°C)克雷布斯林格溶液中,不含额外的Ca2 +加0.5mM EGTA并置于光谱荧光计中。将磁力搅拌器打开到位置4(最高位置)以保持细胞悬浮并记录荧光。在获得稳定的痕量后,加入选定的激动剂(在图2A中为300μM 4-氯-m-甲酚),导致Ca2 +快速增加,然后缓慢下降回静止水平。荧光变化的瞬态性质很重要,因为它表明(i)它不是由添加荧光或淬灭化合物引起的人工制品,(ii)它不是由于钙与细胞外Fura-2的结合和(iii)细胞健康并且可以积极地从其细胞质中除去钙。
相同的实验需要重复几次才能进行统计分析。对于每个细胞系和每天,进行实验,并且需要通过添加SERCA抑制剂thapsigargin11,13,14来确定存储中快速释放的钙的总量。如图2B所示,添加400 nM他西加宁会导致大钙瞬变达到2.4个任意单位(a.u.)的峰值荧光值;因此,图2B所示的EBV永生化B-细胞的细胞内储存中可释放的钙总量等于2.4 a.u.(他西加宁峰)-1.45 a.u.(静息比)或0.95在构建图2C所示的剂量反应曲线时,该荧光值被认为是100%。
EBV永生化B淋巴细胞中的单细胞[Ca2+]i测量
第二种方法依赖于荧光显微镜和微灌注设置的可用性,允许用给定浓度的激动剂刺激单个细胞或小组细胞并同时记录荧光变化。微灌注系统的注射器装载有不同浓度的所选RyR1激动剂(咖啡因或4-氯-m-甲酚),其将用于产生剂量反应曲线。在 图3所示的例子中,用0.5-10mM咖啡因刺激细胞溶解在克雷布斯林格溶液中,不添加钙加100μM La3 +, 以监测Ca2 + 从细胞内储存释放。将Fura-2负载的EBV永生化B淋巴细胞附着在其上的玻璃盖玻片放置在灌注室中,并用含有1mM Ca2 +的克雷布斯林格溶液灌注。大多数细胞将粘附在聚-L-赖氨酸处理的盖玻片上,并且应鉴定并检查小组细胞的Fura-2负载。灌注系统的尖端靠近细胞,用咖啡因沐浴它们(而不是盖玻片上的所有细胞)。通常,细胞从最低到最高浓度的咖啡因开始受到刺激;对于每个浓度,选择一个新的细胞或一组细胞。每秒记录一次比例荧光测量(在 340 nm 和 380 nm 处激发,在 510 nm 处发射),最长可达 2 分钟。在灌注前获得一些图像以获得稳定的基线,随后开始细胞灌注,首先用含有100μM La3 + 的Krebs Ringer溶液冲洗细胞5秒钟。这不应该导致荧光的变化,并且是确保细胞在整个实验过程中粘附在盖玻片上的对照;随后将含有所选激动剂浓度的溶液冲洗到细胞上。在 图3A所示的例子中,细胞被5 mM咖啡因刺激20秒。显示的箭头表示咖啡因瓣膜何时打开,这导致340/380nm荧光比立即增加。20秒后,咖啡因瓣膜关闭,并用含有100μM La3 +的克雷布斯林格溶液冲洗细胞;记录荧光,直到达到基线。对于每个咖啡因浓度的ΔF,即咖啡因诱导的峰值340/380nm荧光 - 计算初始静止的340/380nm荧光并用于构建剂量响应曲线 ,如图3B所示。对于每个咖啡因浓度,5-10个细胞的平均ΔF。细胞内储存中的钙含量也可以监测。在这种情况下,用含有0.5mM EGTA的Krebs Ringer溶液冲洗细胞,并将1μM thapsigargin,1μM Ionomycin和0.5mM EGTA的溶液手动添加到细胞中(不是通过微灌注系统,因为ionomycin粘附在管子上并且不能被洗掉),并且荧光被记录约4-5分钟。为了计算ΔF,获得概述细胞的感兴趣区域(ROI),并使用成像软件计算ROI内荧光的变化。
总之,当使用EBV永生化的B细胞来测量RyR1对特定激动剂的敏感性时,应该在不同的日子里对一个个体的细胞进行重复实验。对于细胞群的测量,需要评估细胞内钙储存的状态,并相对于可从储存中释放的钙总量绘制EC50 激动剂诱导的钙释放图。使用这种方法的一个优点是数百万个细胞的[Ca2 +]反应是平均的;此外,不需要微灌注系统和荧光显微镜。单细胞方法允许使用较少数量的细胞和在线可视化所选细胞的[Ca2 +]的变化。
单细胞 [Ca2+]i 在人类卫星细胞来源肌管中的测量
玻璃盖玻片生长和分化的肌管加载Fura-2,转移到灌注室并沐浴在含有2mM Ca2 +的Krebs Ringer溶液中,如上所述用于EBV细胞。灌注系统的注射器充满选定的激动剂,并如上所述刺激肌管。由于盖玻片上并非所有细胞都是多核肌管,因此选择将要测量的适当细胞非常重要。可以同时刺激小群肌管。在图4所示的示例中,用含有KCl的溶液冲洗单个肌管,不同浓度的4-氯-m-甲酚,最后是咖啡因,然而,通常构建对激动剂的剂量反应曲线,如上一节所示,以比较来自不同个体的细胞的激动剂敏感性12,15,16.KCl被用作质膜去极化的一种方式。在骨骼中,肌肉质膜去极化由电压传感DHPR感测,从而经历构象变化,导致RyR1的激活和打开。另一方面,4-氯-m-甲酚和咖啡因是RyR1的直接药理激活剂。
图1:生成原代人肌肉活检衍生的成肌细胞培养物 (A)将小块肌肉(箭头)放置在含有0.5mL生长培养基的插入物中。7-14天后,可以看到卫星细胞(小箭头)靠近肌肉组织并在插入物的底部生长。通过10倍物镜(B)和20倍物镜(C)拍摄的图像。面板A中的灰色框用于掩盖患者的身份。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2:EBV永生化B淋巴细胞的钙释放实验。比例 [Ca2+]i在悬浮液中的 Fura-2 加载传感器群体中进行测量。A)添加300μM 4-氯-m-甲酚(箭头)导致细胞质[Ca2 +]立即增加,随后在500秒内衰变回静止水平。在本例中,通过添加300 μM 4-氯-m-甲酚诱导的ΔF为1.7个荧光单位-1.4个荧光单位=0.3个荧光单位。B)添加SERCA抑制剂他西加宁(400nM,箭头)导致Fura-2荧光比的较大增加,其峰值为2.4个荧光单位,随后在1.45个荧光单位处衰变至静止水平。他西加宁诱导的[Ca2 +]瞬时代表细胞群中存在的细胞内储存中快速释放的钙的总量。获得的峰值瞬变(2.4-1.45= 0.95单位)用于计算给定浓度的4-氯-m-甲酚释放的钙的百分比。C)代表性剂量反应曲线,将ΔF与细胞内储存中快速释放的钙总量的百分比相关联。对于300μM 4-氯-间甲酚,该值为0.3 / 0.95x100 = 31.6%。每个符号代表来自对照(闭环,虚线)和携带RYR1突变的MHS个体(闭合正方形,连续线)的EBV永生化细胞的5-10个值的平均值±SEM%。使用乙状量剂量- 反应曲线函数生成曲线。图A和B改编自Girard等人。请点击此处查看此图的放大版本。
图3:咖啡因诱导的Ca2 +在来自对照个体的单个EBV永生化的B淋巴细胞中释放。A)顶板,延时图像(A)相差;(B-E), 单细胞[Ca2+]I测量呋喃-2负载EBV永生化淋巴细胞:(B)t=0,(C)t=36 s,(D)t=50 s和(E)t=77 s施用5 mM咖啡因后。通过加入在克雷布斯- 林格溶液中稀释的咖啡因单独刺激细胞。比例尺=10 μm。底部面板,用5mM咖啡因刺激单个细胞后获得的代表性痕迹(箭头)。B)剂量反应曲线显示咖啡因依赖性变化[Ca2+]i,表示为荧光比的变化(峰值比340/380 nm-静息比340/380 nm)。每个点代表4-15个细胞荧光变化的平均±SEM。使用乙状量剂量- 反应曲线函数生成曲线。闭合方块,虚线,对照单元;闭合三角形,连续线,携带RYR1突变的MHS个体。这个数字改编自Ducreux等人13。请点击此处查看此图的放大版本。
图4:来自对照个体的KCl,4-氯-m-甲酚和咖啡因在人肌管中刺激的钙释放。左图:A)相差(B-H),单细胞内Ca2 +测量Fura-2负载的人肌管。B)休息 [Ca2+]i ;C)施用150 mM KCl后t=2 s,D)施用150 μM 4-氯-间甲酚后t=2 s;e)施用300 μM 4-氯-间甲酚后t=2 s;f)施用600 μM 4-氯-间甲酚后t=2 s;g)施用10 mM咖啡因后t=2 s;H)施用咖啡因后t=20 s。右图:受刺激细胞中时间(s)与荧光比(340/380nm)的曲线。肌管通过在含有100μM La3 +的克雷布斯-林格缓冲液中加入激动剂单独刺激,因此[Ca2 +]i的增加仅代表从细胞内储存释放钙。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
本文中描述的方案已被几个实验室成功用于研究RYR1突变对钙稳态的影响。本文概述的方法的关键步骤涉及无菌性,细胞培养技能和技术以及生物材料的可用性。原则上,EBV永生化的B淋巴细胞的使用更简单,并允许产生含有突变RyR1通道的细胞系。细胞可以冷冻并在液氮中储存多年,并且可以随时重新开始培养。此外,可以选择是在细胞群中还是在单细胞水平上监测钙稳态。前一种方法更简单,不需要荧光显微镜,并允许研究人员在短时间内测试来自不同个体的细胞系。限制是细胞生长的速度和配备齐全(加热和磁力搅拌器)光谱荧光计的可用性。作为替代方法,流式细胞术与荧光钙指示剂的组合可用于测量EBV永生化B淋巴细胞中的钙通量;以这种方式可以确定细胞内钙浓度的变化19.如果荧光显微镜、灌注室和微灌注系统可用,则单细胞成像具有更灵敏的优点,并提供更详细的信息,包括细胞间变异性、动力学分析和参与钙释放的亚细胞结构域的鉴定。后一种方法在技术上更具挑战性,需要更多的设备。
使用EBV永生化的B淋巴细胞具有多种优点,包括可以测量除[Ca2 +]i稳态之外的其他参数。例如,4-氯-m-甲酚诱导的B细胞酸化已被用于将细胞与对照个体与MHS患者区分开来20,21。然而,必须记住(i)B细胞不表达许多参与骨骼肌兴奋收缩耦合的蛋白质,这些蛋白质可能间接影响钙的释放,(ii)它们是不可兴奋的细胞,因此不能通过质膜去极化在生理上激活,最后Monnier等人的一份报告发现,由于隐匿的剪接位点22,在患者中发现的突变在EBV永生化的B细胞中没有表达。
患者来源的原代肌肉细胞培养物已被几个小组使用,他们有兴趣研究编码参与钙稳态的蛋白质的不同基因突变的影响10,23,24。这些细胞可以分化成多核肌管,对质膜去极化作出反应,并且可以通过电生理手段进行评估。此外,它们可以永生化以获得携带RYR1突变25的细胞系,尽管该过程比B淋巴细胞复杂得多。虽然肌肉细胞生长缓慢,从活检到拥有足够数量的细胞所需的时间可能超过一个月,但也可以将小块肌肉活检储存在液氮中的冷冻培养基中,以便在几年后获得成肌细胞。培养时间长增加了细菌,酵母菌或霉菌污染的风险,一旦获得足够数量的成肌细胞,将其冷冻并储存在液氮中非常重要。我们的实验室已成功将上述相同技术应用于肌管,以研究用myoD转导并分化为肌管26的人皮肤衍生成纤维细胞中的钙变化。这样做是为了研究当肌肉活检衍生的成肌细胞不可用时RYR1突变的功能效应。至于B淋巴细胞,4-氯-m-甲酚诱导的与MHS相关的RYR1突变患者的肌管酸化已成功测试27。
综上所述,利用患者的生物材料研究基因型-表型相关性具有诸多优点和缺点,可以成功地用于研究RYR1突变的影响。然而,当使用这种方法时,重要的是要记住,其他基因中存在的突变可能会影响钙稳态;因此,应使用来自不同家族的细胞以及携带相同突变的家族成员作为对照。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本手稿中描述的工作得到了瑞士国家科学基金会(SNF)和瑞士肌肉基金会的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
caffeine | Merk | 102584 | |
Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
DMSO | Sigma | 41639 | |
EGTA | Fluka | 3778 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Lanthanum | Fluka | 61490 | |
Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
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