Summary
Här metoder som används för att studera den funktionella effekten av RYR1 mutationer endogent uttryckt i Epstein Barr Virus odödliggjorda mänskliga B-lymfocyter och muskel biopsi härledda satellitceller differentieras i myotubes beskrivs.
Abstract
Mer än 700 varianter i RYR1 genen har identifierats hos patienter med olika neuromuskulära störningar inklusive maligna hypertermi mottaglighet, kärna myopathies och centronuclear myopati. På grund av de olika fenotyper kopplade till RYR1 mutationer är det grundläggande att karakterisera deras funktionella effekter för att klassificera varianter som bärs av patienter för framtida terapeutiska interventioner och identifiera icke-patogena varianter. Många laboratorier har varit intresserade av att utveckla metoder för att funktionellt karakterisera RYR1-mutationer uttryckta i patienternas celler. Detta tillvägagångssätt har många fördelar, inklusive: mutationer uttrycks endogent, RyR1 är inte överexpresserad, användning av heterologous RyR1 uttrycker celler undviks. Men eftersom patienter kan presentera mutationer i olika gener bortsett från RYR1, är det viktigt att jämföra resultat från biologiskt material från individer som hyser samma mutation, med olika genetiska bakgrunder. Detta manuskript beskriver metoder som utvecklats för att studera de funktionella effekterna av endogent uttryckta RYR1-varianter i: a) Epstein Barr virus odödliggjorda mänskliga B-lymfocyter och (b) satellitceller som härrör från muskelbiopsier och differentieras i myotubes. Förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen som utlöses av tillsats av farmakologiska RyR1-aktivatorer övervakas sedan. Den valda celltypen är laddad med en ratiometrisk fluorescerande kalciumindikator och intracellulära [Ca2+] förändringar övervakas antingen på encellig cellnivå genom fluorescensmikroskopi eller i cellpopulationer med hjälp av en spektrofluorometer. Vilo [Ca2+], agonist dosresponskurvor jämförs sedan mellan celler från friska kontroller och patienter som hyser RYR1-varianter som leder till insikt i den funktionella effekten av en given variant.
Introduction
Hittills har mer än 700 RYR1-varianter identifierats i den mänskliga populationen och kopplats till olika neuromuskulära störningar inklusive maligna hypertermikänslighet (MHS), motion inducerad rabdomyolys, central kärnsjukdom (CCD), multi-minicore sjukdom (MmD), centronukleär myopati (CNM)1,2,3 ; studier för att karakterisera deras funktionella effekter släpar efter och endast cirka 10% av mutationerna har testats funktionellt. Olika experimentella metoder kan användas för att bedöma effekten av en given RyR1-variant, inklusive transfektion av heterologa celler som HEK293 och COS-7 celler med plasmidkodning för WT och mutant RYR1 cDNA4,5,transduktion av dyspediska musfibblaster med plasmider och vektorer som kodar för WT och mutant RYR1 cDNA, följt av transduktion med myo-D och differentiering till myo-D och differentiering i my , generering av transgena djurmodeller som bär mutanta RyR1s7,8,9, karakterisering av celler från patienter som uttrycker RYR1-varianten endogent10,11,12. Sådana metoder har hjälpt till att fastställa hur olika mutationer funktionellt påverkar RyR1 Ca2 + kanalen.
Här beskrivs metoder som utvecklats för att bedöma de funktionella effekterna av RYR1 mutationer. Olika parametrar för intracellulära kalciumhomeostas undersöks i mänskliga celler endogent uttrycker RyR1 kalciumkanalen, inklusive myotubes och Epstein Barr Virus (EBV) odödliggjorda B-lymfocyter. Celler erhålls från patienter, expanderas i kultur och laddas med ratiometriska fluorescerande kalciumanklagare som Fura-2 eller indo-1. Parametrar som har rapporterats vara ändrade på grund av patogena RYR1-mutationer inklusive vilo [Ca2+], känsligheten för olika farmakologiska agonister och storleken på de intracellulära Ca2+ butikerna mäts antingen på encellig cellnivå, med hjälp av fluorescensmikroskopi eller i cellpopulationer med hjälp av en fluorimeter. Resultat som erhålls i celler från mutation bärare jämförs sedan med de som erhållits från friska kontroll familjemedlemmar. Detta tillvägagångssätt har visat att i) många mutationer kopplade till MHS leder till en ökning av vila [Ca2+] och en förskjutning till vänster i dosresponskurvan till antingen KCl-inducerad depolarisering eller farmakologisk RyR1-aktivering med 4-kloro-m-cresol10,11,12,13; ii) Mutationer kopplade till CCD leder till en minskning av toppen [Ca2+] som frigörs genom farmakologisk aktivering av RyR1 och minskad storlek om den intracellulära Ca2+ lagrar12,13,14,15; iii) Vissa varianter påverkar inte Ca2+ homeostas13. Fördelarna med detta experimentella tillvägagångssätt är: RyR1-proteinet är inte över uttryckt och fysiologiska nivåer är närvarande, celler kan förevigas (både muskelceller och B-lymfocyter) som ger cellinjer som innehåller mutationer. Vissa nackdelar gäller det faktum att patienter kan bära mutationer i mer än en gen kodning proteiner som är involverade i kalcium homeostas och/eller excitation sammandragning koppling (ECC) och detta kan komplicera experimentella slutsatser. Till exempel identifierades två JP-45-varianter i MHS- och kontrollpopulationen och deras närvaro visade sig påverka känsligheten hos dihydropyridinreceptorn (DHPR) för aktivering16. Patienter måste vara tillgängliga, biologiskt material måste samlas in på nytt och etiska tillstånd måste erhållas från de lokala etiska nämnderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen nedan överensstämmer med ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ etiska riktlinjer.
1. Beredning av Epstein Barr odödliggjorda B-lymfocyt cellinjer11
- Efter informerat samtycke samla in 30 ml helblod i EDTA-behandlade sterila rör från proband som bär en RYR1 mutation och från friska familjemedlemmar utan mutation.
OBS: Håll alla lösningar sterila och arbeta i en mjukpappershusva. - Isolera mononukleära celler från helblod genom densitetsgradientalcentrationsmedium (t.ex. Ficoll-Hypaque, .077 g/L).
- Placera 30 ml sterilt blod i ett koniskt sterilt rör på 50 ml.
- Placera spetsen på en Pasteur-pipett som innehåller densitetscentrifugeringsmediet längst ner på röret och skikt 20 ml sterilt av densitetsgradientcentrifugeringsmedielösningen långsamt under blodet.
- Centrifugera i 30 min vid 900 x g vid 18°-20°C, utan avbrott.
OBS: Det mononukleära cellskiktet visas som en grumlig ring vid interfasen mellan densitetsgradientcentreringsmedieskiktet och det översta lagret som innehåller trombocytberikad plasma.
- Med en steril pipett ta försiktigt bort det interfasskiktet som innehåller mononukleära celler (ca 3-5 ml) och överför lösningen till ett rent 50 ml sterilt koniskt rör.
- Tillsätt 20 ml fosfatbuffertsaltlösning (PBS) för att skölja cellerna, centrifugera i 10 min vid 600 x g vid rumstemperatur och återanvänd pelleten i PBS. Upprepa i totalt tre gånger; Detta säkerställer att alla medier tas bort.
- Efter den sista tvätten, återupplivna celler i 1-2 ml vävnadsodling medium (RPMI medium kompletterat med 10% fetala kalv serum, 2 mM L-glutamin och 100 enheter penicillin och streptomycin). Placera mononukleära celler (cirka 1 x 106 celler) i en T125 vävnadskulturkolv som innehåller 20 ml vävnadsodlingsmedium.
- Infektera mononukleära celler med Epstein-Barr virus.
- Använd supernatanter från B95.8-cellinjekulturer (innehållande 102-103 transformerande enheter/ml som finns i lager vid -80 °C) som källa till EBV.
- Resuspend 1 x 106 mononukleära celler från steg 1,5 i 20 ml vävnadsodlingsmedium och exponera dem för 2 ml supernatant från B95,8-cellinjen i närvaro av cyklosporin A (0, 2 μg/ml slutlig koncentration) för infektion.
- Placera kolven i en 37 °C cellodlingsinkubator och låt cellerna växa. Efter en vecka ändra kulturmediet.
OBS: När B-celler börjar sprida sig bildar de igenkännliga klumpar och växer snabbt så att kulturerna kan expanderas och frysas. - Extrahera det genomiska DNA från EBV odödliggjorda B-lymfocyt cellinjer11 för att bekräfta förekomsten eller frånvaron av den givna mutationen.
2. Intracellulära Ca2+ mätningar
OBS: Förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen hos de EBV-omvandlade B-lymfocytcelllinjerna kan övervakas i cellpopulationer, med en spektrofluorometer utrustad med en magnetisk omrörare och cuvettehållare inställd på 37 °C. Alternativt ca2+ förändringar kan övervakas i enstaka celler genom fluorescensmikroskopi. I båda fallen avlägsnas cellerna från vävnadsodlingskoven, tvättas två gånger med Krebs Ringers lösning (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4,5,5 mM glukos, pH 7,4 innehållande 1 mM CaCl2) och räknas .
- För experiment i cellpopulationer med hjälp av en spektrofluorometer11,13,14
- Resuspendceller vid en slutlig koncentration av 1 x 107 celler/ ml i Krebs Ringers lösning och inkuberar vid 37°C i 30 min med en slutlig koncentration på 5 μM Fura-2/AM.
- Centrifugceller vid 900 x g i 10 min och återanvänd dem i Krebs Ringers lösning i en koncentration av 2 x 106 celler/ml.
- Mät fluorescensförändringar (förhållande 340/380 nm) med hjälp av en spektrofluorometer utrustad med en magnetisk omrörare inställd på maximal hastighet och inställd på 37 °C.
- Strax före experimentet snurrar cellerna på 900 x g i 5 min i en mikrocentrifuge och återanvänder snabbt pelleten i 1,5 ml Krebs Ringers lösning med 0,5 mM EGTA men ingen tillsatt Ca2+.
- Placera cellerna i en 3 ml glasspektrofluorometer cuvette och registrera fluorescensförhållandet (340 nm/380 nm excitation, 510 nm emission).
- Uppnå en stabil baslinje (cirka 30 sekunder), tillsätt den valda koncentrationen av RyR1-agonist (4-kloro-m-cresol eller 4 cmc) och registrera kalciumövergående.
OBS: En 300 mM lagerlösning på 4 cmc tillverkad i DMSO används som startreagens. Denna lösning kan göras i förväg, aliquoted och lagras vid -20 °C i flera månader. - Utför experiment för olika 4-cmc koncentrationer.
OBS: Inkludera 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM till 1 mM för att generera en dosresponskurva av agonist kontra förändring i [Ca2+]. De olika 4 cmc koncentrationerna erhålls genom att tillsätta lämplig volym av 4 cmc från stamlösningen, direkt i cuvette som innehåller Fura-2-laddade celler. Till exempel, för en slutlig koncentration av 300 μM 4-cmc tillsätts 1,5 μL av stamlösningen till cuvettet som innehåller 1,5 ml celler i Krebs Ringers lösning. För lägre agonistkoncentrationer bör stamlösningen på 300 mM spädas ut till 75 mM med DMSO och lämplig volym tillsättas till cuvettet som innehåller 1,5 ml celler i Krebs Ringers lösning. - Tillsätt 400 nM thapsigargin till celler för att beräkna den totala mängden Ca2+ som finns i intracellulära butiker. Spela in toppen Ca2+.
- Plotta toppkalciumet inducerat av en given 4-cmc-koncentration jämfört med den toppkalcium som induceras av thapsigargin, som anses vara 100% och konstruera en 4 cmc dosresponskurva som jämför celler från en proband och frisk släkting
- För experiment på enstaka celler13
- Späd poly-L-lysin 1:10 i steril H2O och förbehandla glasöverdraget i 30 minuter. Låt lufttorka under en steril mjukpapperskulturhuva.
- Suspendera EBV-omvandlade B-lymfocyter till en slutlig koncentration av 1 x 106 celler/ml i Krebs Ringers lösning som innehåller 1 mM CaCl2 och tillsätt en slutlig koncentration på 5 μM Fura-2/AM.
- Placera 1 ml celler på de poly-L-lysinbehandlade täcksliparna och inkubera vid 37 °C i en fuktad cellodlingsinkubator i 30 minuter så att EBV-cellerna kan hålla sig till glastäcket under lastning.
- Placera täcket i perfusionskammaren och starta perfusion (med en hastighet av 2 ml/min) med Krebs Ringers lösning som innehåller 1 mM Ca2+.
- Använd ett inverterat fluorescerande mikroskop (utrustat med ett 40x oljesänkningsmål (0,17 numerisk bländare), filter (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) för att spela in onlinemätningar, med en programvarustyrd laddningskopplad kamerafäste .Use averted microscope (40x oil-immersion objective (0.17 numerical aperture), filters (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) för att spela in onlinemätningar, med en programvarustyrd laddningskopplad enhet (CCD) kamerafäste.
- Hämta bilder med 1 s intervall vid en fast exponeringstid (100 ms för både 340- och 380 nm excitationsvåglängder. Använd bildbehandlingsprogram för att analysera förändringar i fluorescens. Mät det genomsnittliga pixelvärdet för varje cell vid excitationsvåglängder på 340 och 380 nm13.
- För att uppnå cellstimulering, använd en cellperfusionsstimulator med 12 ventiler och tillsätt olika koncentrationer av 4-cmc. Spolventilen innehåller Krebs Ringers lösning utan tillsats ca2+ plus 100 μM La3+ för att endast övervaka kalciumfrisättning från intracellulära butiker.
- Konstruera en dosresponskurva på 4 cmc jämfört med förändring i [Ca2+], enligt beskrivningen ovan.
3. Förberedelse av mänskliga myotuber från muskelbiopsier10,12,15
OBS: Olika metoder har använts av olika laboratorier för att erhålla satellitcell-härledda myoblaster och myotubes. Nedan följer beskrivningen av den metod som används i Basel.
- Skölj muskelbiopsi med steril PBS för att ta bort överflödigt blod och skär i små fragment på ca 0,5-1 mm.
- Förbered 6 väl vävnadskulturrätter med insats. Tillsätt 1,5 ml mänsklig muskeltillväxt medium till varje brunn och 0,5 ml mänsklig muskeltillväxt medium till varje insats.
OBS: Tillväxtmediet består av följande: 500 ml av Dulbeccos modifierade Eagles medium med hög glukos, eller DMEM (4,5 mg/ml), innehållande 10% hästserum, 5 ng/ml insulin, 3 mM glutamin, 600 ng/mL penicillin G och streptomycin, och 7 mM HEPES, pH 7,4. Kommersiellt tillgängliga skelettmuskulaturtillväxt medium kan också användas. - Placera 2-3 små muskelfragment i varje insats(figur 1A) och placera odlingsrätter i cellodlingsinkubatorn (5% CO2,37 °C). Efter cirka 8-10 dagar kan satellitceller ses växa ut ur och omge muskelbiopsin, fäst vid insatsen (figur 1, B och C, pilar).
- Släpp ett tillräckligt antal celler från biopsin (efter cirka 10-14 dagar), trypsinize enligt följande:
- Ta bort allt odlingsmedium, skölj cellerna en gång med 1 ml PBS, tillsätt 0,5 ml trypsin/EDTA-lösning (0,025% trypsin och 0,01% EDTA) och inkubera vid 37 °C i 5 min.
- Tillsätt 1 ml tillväxtmedium till cellerna för att neutralisera effekten av trypsin och överföra satellitcellerna till en ny T25-cellodlingskolv; tillsätt 3 ml tillväxtmedium och placera cellerna i en cellodlingsinkubator (5% CO2,37 °C).
- Ändra tillväxtmediet nästa dag för att ta bort EDTA och byt sedan medium en gång i veckan.
- När myoblaster är cirka 75% sammanflöde, trypsinize och överför dem till lamininbehandlat glasskydd.
OBS: Som andel bör celler som växer i en T25-kolv överföras till ett lamininbehandlat glasöverdrag med en diameter på 43 mm. Glasöverdraget ska placeras inom en vävnadsodlingsplatta med diametern 60 mm som innehåller 3 ml tillväxtmedium. - Odla celler på glastäcket i tillväxtmedium i encellodlingsinkubator(5% CO 2 , 37 °C) som byter medium en gång i veckan. Vid 90% confluency, byt till differentieringsmedium som består av följande: högt glukos DMEM (4,5 mg/ml), 0,5% bovint serumalbumin, 10 ng/mL epidermal tillväxtfaktor, 0,15 mg/ml kreatin, 5 ng/mL insulin, 200 mM glutamin, 600 ng/mL penicillin G och streptomycin, pH. Kommersiellt tillgängligt differentieringsmedium kan också användas. Ändra differentieringsmediet en gång i veckan.
- Efter 7-10 dagar i differentieringsmedium är multinukleära myotuber synliga. Utvärdera för förändringar i [Ca2+] inom en vecka, enligt beskrivningen nedan.
4. [Ca2+]i förhållandemätningar som bestäms med Fura-2
- Lasta glastäcke odlade myotuber med Fura-2/AM (slutlig koncentration på 5 μM) utspädd i DMEM i 30 min vid 37 °C. Ta kort, ta bort differentieringsmediet från glastäcket odlade celler och tillsätt 2 ml färsk differentieringsmedium. Tillsätt 10 μL Fura-2 AM från en stamlösning på 1 mM och inkubera 30 min i en cellodlingsinkubator (5% CO2,37 °C).
- Överför glasöverdrag till perfusionskammaren och skölj cellerna med Krebs Ringers lösning som innehåller 2 mM CaCl2.
- Utför mätningar online [Ca2+] enligt beskrivningen ovan i EBV:s encellssektion med användning av ett 20x vattensänknings-FLUAR-mål (0,17 numerisk bländare).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[Ca2+]i mätningar i populationer av EBV-odödliga B-lymfocyter
Primära B-lymfocyter uttrycker RyR1-isoformen som fungerar som en Ca2 + frisättningskanal under B-cellsantigenreceptor stimulerade signalprocesser17. Immortalization av B-celler med EBV, ett förfarande som rutinmässigt används av genetiker för att erhålla cellinjer som innehåller genomisk information om patienter, ger fördelen att generera cellinjer som uttrycker mutanta RyR1 Ca2 + kanaler hos patienter som hyser RYR1 mutationer11,13. [Ca2+] i förändringar som orsakas av tillsats av specifika RyR1-agonister som 4-kloro-m-cresol18 och koffein kan lätt övervakas för att fastställa om en given RYR1-mutation ändrar känsligheten för en agonist, mängden kalcium som frigörs, vila [Ca2+] eller andra parametrar som har visat sig påverkas av mutationer. [Ca2+] i förändringar kan övervakas antingen i populationer av Fura-2-laddade celler i suspension med en spektrofluorometer eller på grupper av celler som fästs vid glasöverdrag och undersöks med epifluorescens. Figur 2 visar ett representativt experiment som utförts på cellavstängningar. Omedelbart innan de placerades i cuvettet snurrades celler för att ta bort Fura-2 som kan ha läckt ut; celler återanvändes sedan till en slutlig koncentration av 1 x 106 celler/ml i varm (37°C) Krebs Ringers lösning som inte innehåller någon ytterligare Ca2+ plus 0,5 mM EGTA och placeras i spektrofluorometern. Magnetomröraren sattes på till position 4 (den högsta positionen) för att hålla cellerna i suspension och fluorescens registrerades. Efter att ett stabilt spår erhållits tillsattes den valda agonisten (i figur 2A var detta 300 μM 4-kloro-m-cresol) vilket ledde till en snabb Ca2 + ökning som sedan långsamt minskade tillbaka till vilonivåerna. Den övergående karaktären av förändringen i fluorescens är viktig eftersom det indikerar (i) att det inte är en artefakt som orsakas av tillsats av en fluorescerande eller släckande förening, (ii) att det inte beror på kalciumbindning till extracellulära Fura-2 och (iii) att cellerna är friska och aktivt kan avlägsna kalcium från sin cytoplasma.
Samma experiment måste upprepas flera gånger för att analyseras statistiskt. För varje cellinje och varje dag utförs experimenten och den totala mängden snabbt utlösbart kalcium i butikerna måste bestämmas genom att lägga till SERCA-hämmaren thapsigargin11,13,14. Som visas i figur 2Borsakar tillsatsen av 400 nM thapsigargin ett stort kalcium som övergående når ett toppfluorescensvärde på 2,4 godtyckliga enheter (a.u.); Således är den totala mängden kalcium som kan frigöras från de intracellulära butikerna hos de EBV-odödliga B- cellerna som visas i figur 2B lika med 2,4 a.u. (thapsigargintoppen) - 1,45 a.u. (viloförhållande) eller 0,95 Detta fluorescensvärde ansågs vara 100% vid konstruktionen av dosresponskurvan som visas i figur 2C.
Encelliga [Ca2+]i mätningar i EBV-odödliga B-lymfocyter
Detta andra tillvägagångssätt bygger på tillgången till ett fluorescensmikroskop och mikroperfusion som möjliggör stimulering av en enda cell eller små grupper av celler med en given koncentration av agonist och samtidig registrering av fluorescensförändringar. Sprutorna i mikroperfusionssystemet är laddade med olika koncentrationer av den valda RyR1-agonisten (antingen koffein eller 4-kloro-m-cresol) som kommer att användas för att generera dosresponskurvor. I exemplet som visas i figur 3stimulerades cellerna med 0,5-10 mM koffein upplöst i Krebs Ringers lösning som inte innehåller något tillsatt kalcium plus 100 μM La3 + för att övervaka Ca2 + frisättning från intracellulära butiker. Glasöverdrag på vilka Fura-2 laddade EBV-odödliga B-lymfocyter tilläts fästas placeras i perfusionskammaren och perfunderas med Krebs Ringers lösning som innehåller 1 mM Ca2+. De flesta av cellerna kommer att ha följt det poly-L-lysinbehandlade täckslipet och små grupper av celler bör identifieras och kontrolleras för Fura-2-belastning. Spetsen på perfusionssystemet placeras nära cellerna för att bada dem (och inte alla celler på täcket) med koffein. Normalt stimuleras celler från den lägsta till den högsta koncentrationen av koffein; För varje koncentration väljs en ny cell eller grupp av celler. Ratiometriska fluorescensmätningar (excitation vid 340 nm och 380 nm, emission vid 510 nm) registreras varje sekund i upp till 2 min. Några bilder erhålls före perfusion för att få en stadig baslinje, därefter initieras cellperfusion, först genom att spola celler med en lösning av Krebs Ringers lösning som innehåller 100 μM La3+ i 5 sekunder. Detta bör inte leda till en förändring av blomställningen och är en kontroll för att säkerställa att cellen eller cellerna håller sig till täcket under hela experimentet. därefter spolas en lösning som innehåller den valda agonistkoncentrationen över cellen/cellerna. I exemplet som visas i figur 3Astimulerades cellerna med 5 mM koffein i 20 sekunder. Pilen som visas indikerar när koffeinventilen öppnades och detta resulterar i en omedelbar ökning av 340/380 nm fluorescerande förhållandet. Efter 20 sekunder stängs koffeinventilen och cellerna spolas med Krebs Ringers lösning som innehåller 100 μM La3+; fluorescens registreras tills baslinjen har uppnåtts. För varje koffeinkoncentration beräknas ΔF, det vill säga den koffeininducerade topp 340/380 nm fluorescens - den ursprungliga vilo 340/380 nm fluorescensen beräknas och används för att konstruera en dosresponskurva enligt figur 3B. Medelvärde ΔF från 5-10 celler är medelvärde för varje koffeinkoncentration. Mängden kalcium i intracellulära butiker kan också övervakas. I detta fall sköljs cellerna med Krebs Ringers lösning som innehåller 0,5 mM EGTA och en lösning på 1 μM thapsigargin, 1 μM jonomycin och 0,5 mM EGTA tillsätts för hand till cellerna (inte genom mikroperfusionssystemet som jonomycinpinnar på slangen och kan inte tvättas av) och fluorescensen registreras i cirka 4-5 min. För att beräkna ΔF erhålls en region av intresse (ROI) som beskriver en cell och förändringarna i fluorescens inom ROI beräknas med hjälp av en bildprogramvara.
Sammanfattningsvis, när EBV används odödliggjorda B-celler för att mäta ryr1:s känslighet för en specifik agonist, bör upprepade experiment utföras på celler från en individ, på olika dagar. För mätningar på cellpopulationer måste statusen för de intracellulära kalciumlagren bedömas och EC50 till agonist inducerad kalciumfrisättning plottas i förhållande till den totala mängden kalcium som kan frigöras från butikerna. En fördel med att använda den här metoden är att [Ca2+] svaret för miljontals celler är genomsnittligt. Dessutom behövs inget mikroperfusionssystem och fluorescerande mikroskop. Metoden med en cell gör det möjligt att använda ett mindre antal celler och onlinevisualisering av ändringar i [Ca2+] av markerade celler.
Encelliga [Ca2+]i mätningar i mänskliga satellitceller härledda myotuber
Glasöverdrag odlade och differentierade myotuber är laddade med Fura-2, överförs till perfusionskammaren och badar i Krebs Ringers lösning som innehåller 2 mM Ca2+ enligt beskrivningen ovan för EBV-celler. Sprutorna i perfusionssystemet fylls med den valda agonisten och myotuber stimuleras enligt beskrivningen ovan. Eftersom inte alla celler på täckslipet är flernukleära myotuber är det viktigt att välja lämpliga celler som ska mätas. Små grupper av myotuber kan stimuleras samtidigt. I exemplet som visas i figur 4spolades en enda myotube med en lösning som innehåller KCl, olika koncentrationer av 4-kloro-m-cresol och slutligen koffein, men normalt dosresponskurvor till agonister konstrueras, som anges i föregående avsnitt, för att jämföra den agonistiska känsligheten hos celler från olika individer12,15,16 . KCl används som ett sätt att depolarisera plasmamembranet. I skelettet avkänns muskelplasmamembrandepolarisering av spänningsavkänningEN DHPR som därmed genomgår en konformationsförändring som leder till aktivering och öppning av RyR1. Å andra sidan är 4-kloro-m-cresol och koffein direkta farmakologiska aktivatorer av RyR1.
Figur 1: Generering av primära humana muskelbiopsi-härledda myoblastkulturer. (A) Små fragment av muskler (pilar) placeras i insatser som innehåller 0,5 ml tillväxtmedium. Efter 7-14 dagar kan satellitceller ses (små pilar) intill muskelvävnaden och växa på botten av insatsen. Bild tagen genom ett 10x-mål (B) och 20x mål (C). De grå lådorna i panel A användes för att täcka patientens identitet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Kalciumfrisättningsexperiment i EBV odödliggjorda B-lymfocyter. Ratiometric [Ca2+]i mätningar i en population av Fura-2 laddade celler i suspension. A) Tillsatsen av 300 μM 4-kloro-m-cresol (pil) orsakar en omedelbar ökning av cytoplasmic [Ca2+], som därefter sönderfaller tillbaka till vilonivåer inom 500 sekunder. I detta exempel är ΔF inducerad genom tillsats av 300 μM 4-kloro-m-cresol 1,7 fluorescensenheter- 1,4 fluorescensenheter = 0,3 fluorescensenheter. B) Tillsatsen av SERCA-hämmaren thapsigargin (400 nM, pil) orsakar en större ökning av Fura-2 fluorescensförhållandet som toppar vid 2,4 fluorescensenheter och därefter sönderfaller till vilonivåer vid 1,45 fluorescensenheter. Thapsigargin inducerad [Ca2+] transient representerar den totala mängden snabbt utlösbar kalcium i de intracellulära butiker som finns i cellpopulationen. Den högsta övergående erhöll (2,4-1,45= 0,95 enheter) används för att beräkna den procentandel kalcium som frigörs genom en given koncentration av 4-kloro-m-cresol. C) Representativa dosresponskurvor som korrelerar ΔF i procent av den totala mängden snabbt utsättningsbart kalcium i intracellulära butiker. För 300 μM 4-kloro-m-cresol är detta värde 0,3/0,95x100=31,6%. Varje symbol representerar medelvärdet± SEM% av 5-10 värden från EBV odödliggjorda celler från en kontroll (slutna cirklar, prickad linje) och en MHS-individ (stängda rutor, kontinuerlig linje) som bär en RYR1-mutation. Kurvorna genererades med hjälp av en sigmoidal dos-respons kurva funktion. Panelerna A och B är anpassade från Girard et al.11. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Koffeininducerad Ca2+ frisättning i enskilda EBV-odödliga B-lymfocyter från en kontrollperson. A) Topppaneler, tidsfördröjningsbilder (A) Faskontrast; (B-E), encelliga [Ca2+]I mätningar av fura-2-laddade EBV-odödliga lymfocyter: (B) t =0, (C) t=36 s, (D) t=50 s och (E) t=77 s efter applicering av 5 mM koffein. Cellerna stimulerades individuellt av tillsats av koffein utspädd i Krebs-Ringer lösning. Skala bar=10 μm. Nedre panel, representativa spår erhålls efter stimulering av en enda cell med 5 mM koffein (pil). B) Dosresponskurvor som visar den koffeinberoende förändringen i [Ca2+]i, uttryckt som förändring i fluorescensförhållande (toppförhållande 340/380 nm−viloförhållande 340/380 nm). Varje punkt representerar medelvärdet ± SEM av förändringen i fluorescens av 4-15 celler. Kurvorna genererades med hjälp av en sigmoidal dos-respons kurva funktion. Stängda rutor, prickad linje, kontrollceller; slutna trianglar, kontinuerlig linje, MHS individ bär en RYR1 mutation. Denna siffra är en anpassning från Ducreux et al.13. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Kalciumfrisättning stimulerad av KCl, 4-kloro-m-cresol och koffein i mänskliga myotuber från en kontrollperson. Vänster paneler: A) faskontrast (B-H), encelliga intracellulära Ca2+ mätningar av Fura-2-laddade mänskliga myotuber. B) vila [Ca2+]i ; C) t=2 s efter applicering av 150 mM KCl. D) t= 2 s efter applicering av 150 μM 4-kloro-m-cresol; E) t=2 s efter applicering av 300 μM 4-kloro-m-cresol; F) t=2 s efter applicering av 600 μM 4-kloro-m-kresol; G) t=2 s efter applicering av 10 mM koffein; H) t=20 s efter applicering av koffein. Höger panel: Tidsfördelning (s) kontra fluorescensförhållande (340/380 nm) i den stimulerade cellen. Myotuber stimulerades individuellt genom tillsats av agonisten i Krebs-Ringer buffert som innehåller 100 μM La3 +, så ökningen av [Ca2 +]i representerar endast frisättning av kalcium från intracellulära butiker. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som beskrivs i detta dokument har framgångsrikt använts av flera laboratorier för att studera effekten av RYR1 mutationer på kalciumhomeostas. De kritiska stegen i de tillvägagångssätt som beskrivs i detta dokument handlar om sterilitet, cellodlingsförmåga och tekniker och tillgänglighet av biologiskt material. I princip är användningen av EBV-odödliggjorda B-lymfocyter enklare och gör det möjligt att generera cellinjer som innehåller mutanta RyR1-kanaler. Cellerna kan frysas och lagras i flytande kväve i många år och kulturer kan när som helst startas igen. Dessutom kan man välja om man vill övervaka kalciumhomeostas i cellpopulationer eller på encellsnivå. Den tidigare metoden är enklare, kräver inget fluorescensmikroskop och gör det möjligt för prövaren att testa cellinjer som genereras från olika individer inom en kort tidsperiod. Begränsningen är hastigheten på celltillväxten och tillgången till en fullt utrustad (uppvärmd och med magnetisk omrörare) spektrofluorometer. Som ett alternativt tillvägagångssätt kan flödescytometri i kombination med fluorescerande kalciumindikatorer användas för att mäta kalciumflöden i EBV-odödliga B-lymfocyter; på ett sådant sätt kan förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen bestämmas19. Om det finns ett fluorescerande mikroskop, perfusionskammare och mikroperfusionssystem, har encellig avbildning fördelen att vara känsligare och ge mer detaljerad information, inklusive cell-till-cellvariation, kinetisk analys och identifiering av subcellulära domäner som är involverade i kalciumfrisättning. Det senare tillvägagångssättet är tekniskt mer utmanande och kräver mer utrustning.
Det finns flera fördelar med att använda EBV-odödliga B-lymfocyter, inklusive att andra parametrar åt sidan [Ca2 +]i homeostas kan mätas. Till exempel har 4-kloro-m-kresol inducerad försurning av B-celler använts för att skilja celler från kontrollpersoner från kontrollpersoner från MHS-patienter20,21. Ändå måste man komma ihåg (i) att B-celler inte uttrycker många av de proteiner som är involverade i skelettmuskulaturexcitationskoppling som indirekt kan påverka kalciumfrisättning, (ii) de är icke-exciterbara celler således inte kan aktiveras fysiologiskt genom plasmamembrandepolarisering, och slutligen fann en rapport från Monnier et al. att en mutation som identifierats hos en patient inte uttrycktes i EBV-odödliga B-celler på grund av en kryptisk skarvplats2.
Patient härledda primära muskelcellskulturer har använts av flera grupper som är intresserade av att studera effekten av mutationer i olika gener som kodar proteiner involverade i kalciumhomeostas10,23,24. Dessa celler kan differentieras till multinukleära myotuber, svara på plasmamembran depolarisering och kan bedömas med elektrofysiologiska medel. Dessutom kan de odödligas för att få cellinjer som bär RYR1 mutationer25, även om förfarandet är mycket mer komplext än för B-lymfocyter. Även om det också är sant att muskelcellerna växer långsamt och den tid som krävs från att ta en biopsi till att ha ett tillräckligt antal celler kan vara mer än en månad, är det också möjligt att lagra de små bitarna av muskelbiopsier i frysmedium i flytande kväve för att få myoblaster år senare. De långa odlingstiderna har den ökade risken för kontaminering av bakterier, jäst eller mögel och så snart ett tillräckligt stort antal myoblaster har erhållits är det viktigt att frysa och lagra dem i flytande kväve. Vårt laboratorium har framgångsrikt tillämpat samma teknik som beskrivs ovan för myotuber, för att studera kalciumförändringar i mänskliga hudbaserade fibroblaster transduced med myoD och differentierade i myotubes26. Detta gjordes för att studera den funktionella effekten av RYR1 mutationer när muskel biopsi-härledda myoblaster inte var tillgängliga. När det gäller B-lymfocyter har 4-kloro-m-cresol inducerad försurning av myotuber från patienter med RYR1 mutationer kopplade till MHS testats framgångsrikt27.
Sammanfattningsvis har användningen av biologiskt material från patienter för att studera genotyp-fenotyp korrelationen många fördelar nackdelen och kan användas framgångsrikt för att studera effekten av mutationer i RYR1. Vid användning av detta tillvägagångssätt är det dock viktigt att komma ihåg att mutationer som finns i andra gener kan påverka kalciumhomeostas; Därför bör användningen av celler från olika familjer som hyser samma mutation samt från familjemedlemmar som inte hyser RYR1-mutationen som kontroller utföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet som beskrivs i detta manuskript stöddes av bidrag från Swiss National Science Foundation (SNF) och Swiss Muscle Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
