Summary
Qui vengono descritti i metodi utilizzati per studiare l'effetto funzionale delle mutazioni RYR1 endogenamente espresse nel virus di Epstein Barr immortalato nei linfociti B umani e nelle cellule satelliti derivate dalla biopsia muscolare differenziate in miotubi.
Abstract
Più di 700 varianti del gene RYR1 sono state identificate in pazienti con diversi disturbi neuromuscolari tra cui suscettibilità all'ipertermia maligna, miopatie core e miopatia centronucleare. A causa dei diversi fenotipi legati alle mutazioni RYR1 è fondamentale caratterizzare i loro effetti funzionali per classificare le varianti trasportate dai pazienti per futuri interventi terapeutici e identificare le varianti non patogene. Molti laboratori sono stati interessati a sviluppare metodi per caratterizzare funzionalmente le mutazioni RYR1 espresse nelle cellule dei pazienti. Questo approccio presenta numerosi vantaggi, tra cui: le mutazioni sono espresse endogenamente, RyR1 non è sovraespresso, l'uso di cellule eterologhe che esprimono RyR1 è evitato. Tuttavia, poiché i pazienti possono presentare mutazioni in geni diversi oltre a RYR1, è importante confrontare i risultati di materiale biologico di individui che ospitano la stessa mutazione, con background genetici diversi. Il presente manoscritto descrive i metodi sviluppati per studiare gli effetti funzionali delle varianti RYR1 espresse endogenamente in: (a) il virus di Epstein Barr ha immortalato i linfociti B umani e (b) le cellule satelliti derivate da biopsie muscolari e differenziate in miotubi. Vengono quindi monitorate le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio innescate dall'aggiunta di un attivatore RyR1 farmacologico. Il tipo di cellula selezionato viene caricato con un indicatore di calcio fluorescente raziometrico e le variazioni intracellulari [Ca2+] vengono monitorate a livello di singola cellula mediante microscopia a fluorescenza o in popolazioni cellulari utilizzando uno spettrofluorometro. Le curve di risposta alla dose agonista [Ca2+], a riposo vengono quindi confrontate tra cellule provenienti da controlli sani e pazienti che ospitano varianti RYR1 portando a comprendere l'effetto funzionale di una determinata variante.
Introduction
Ad oggi sono state identificate più di 700 varianti di RYR1 nella popolazione umana e legate a vari disturbi neuromuscolari tra cui la suscettibilità all'ipertermia maligna (MHS), la rabdomiolisi indotta dall'esercizio, la malattia del nucleo centrale (CCD), la malattia multi-minicore (MmD), la miopatia centronucleare (CNM)1,2,3 ; tuttavia, gli studi per caratterizzare i loro effetti funzionali sono in ritardo e solo circa il 10% delle mutazioni sono state testate funzionalmente. Diversi approcci sperimentali possono essere utilizzati per valutare l'impatto di una data variante di RyR1, compresa la trasfezione di cellule eterologhe come cellule HEK293 e COS-7 con plasmide che codifica per il WT e mutante RYR1 cDNA4,5, trasduzione di fibroblasti di topo dispedici con plasmidi e vettori che codificano per il WT e il cDNA RYR1 mutante, seguita da trasduzione con mio-D e differenziazione in miotubi6 , generazione di modelli animali transgenici portatori mutanti RyR1s7,8,9,caratterizzazione di cellule da pazienti che esprimono la variante RYR1 endogenamente10,11,12. Tali metodi hanno contribuito a stabilire come diverse mutazioni influiscano funzionalmente sul canale RyR1 Ca2+.
Qui vengono descritti i metodi sviluppati per valutare gli effetti funzionali delle mutazioni RYR1. Vari parametri dell'omeostasi intracellulare del calcio sono studiati nelle cellule umane che esprimono endogenamente il canale del calcio RyR1, compresi i miotubi e i linfociti B immortalati del virus di Epstein Barr (EBV). Le cellule sono ottenute da pazienti, espanse in coltura e caricate con indicatori di calcio fluorescenti raziometrici come Fura-2 o indo-1. I parametri che sono stati segnalati per essere alterati a causa di mutazioni patogenetiche di RYR1 tra cui il riposo [Ca2+],la sensibilità a diversi agonisti farmacologici e la dimensione delle riserve intracellulari di Ca2+ sono misurati a livello di singola cellula, usando la microscopia a fluorescenza, o in popolazioni cellulari usando un fluorimetro. I risultati ottenuti in cellule da portatori di mutazioni vengono quindi confrontati con quelli ottenuti da membri sani della famiglia di controllo. Questo approccio ha dimostrato che: (i) molte mutazioni legate alla MHS portano ad un aumento del riposo [Ca2+]e ad uno spostamento a sinistra nella curva dose-risposta alla depolarizzazione indotta da KCl o all'attivazione farmacologica di RyR1 con 4-cloro-m-cresolo10,11,12,13; (ii) le mutazioni legate alla CCD portano ad una diminuzione del picco [Ca2+] rilasciato dall'attivazione farmacologica del RyR1 e alla diminuzione delle dimensioni se il Ca2+ intracellulare immagazzina12,13,14,15; (iii) alcune varianti non influiscono sull'omeostasi del Ca2+13. I vantaggi di questo approccio sperimentale sono: la proteina RyR1 non è sovraespressa e sono presenti livelli fisiologici, le cellule possono essere immortalate (sia cellule muscolari che linfociti B) fornendo linee cellulari contenenti mutazioni. Alcuni svantaggi riguardano il fatto che i pazienti possono portare mutazioni in più di un gene che codifica per proteine coinvolte nell'omeostasi del calcio e/o nell'accoppiamento di contrazione dell'eccitazione (ECC) e questo può complicare le conclusioni sperimentali. Ad esempio, due varianti di JP-45 sono state identificate nella mhS e nella popolazione di controllo e la loro presenza ha dimostrato di influire sulla sensibilità del recettore della diidropiridina (DHPR) all'attivazione16. I pazienti devono essere disponibili, il materiale biologico deve essere appena raccolto e i permessi etici devono essere ottenuti dai comitati etici locali.
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Protocol
I protocolli descritti di seguito sono conformi alle linee guida etiche dell'Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. Preparazione delle linee cellulari dei linfociti B immortalati di Epstein Barr11
- Dopo il consenso informato, raccogliere 30 ml di sangue intero in tubi sterili trattati con EDTA dal proband portatore di una mutazione RYR1 e da membri sani della famiglia senza mutazione.
NOTA: Mantenere tutte le soluzioni sterili e lavorare in una cappa di coltura di tessuto. - Isolare le cellule mononucleate dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità (ad esempio, Ficoll-Hypaque, .077 g/L).
- Posizionare 30 ml di sangue sterile in un tubo sterile conico da 50 ml.
- Posizionare la punta di una pipetta Pasteur contenente il mezzo di centrifugazione a gradiente di densità sul fondo del tubo e lo strato 20 mL sterile di soluzione di centrifugazione a gradiente di densità lentamente sotto il sangue.
- Centrifuga per 30 min a 900 x g a 18°-20°C, senza interruzioni.
NOTA: Lo strato di cellule mononucleate appare come un anello torbido nell'interfase tra lo strato di centrifugazione a gradiente di densità e lo strato superiore contenente plasma arricchito di piastrine.
- Con una pipetta sterile rimuovere delicatamente lo strato interfase contenente cellule mononucleate (circa 3-5 ml) e trasferire la soluzione in un tubo conico sterile pulito da 50 ml.
- Aggiungere 20 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS) per risciacquare le cellule, centrifugare per 10 minuti a 600 x g a temperatura ambiente e risospese il pellet in PBS. Ripeti per un totale di tre volte; questo assicura che tutti i supporti vengano rimossi.
- Dopo l'ultimo lavaggio, risospese le cellule in 1-2 mL di terreno di coltura tissutale (mezzo RPMI integrato con il 10% di siero fetale del vitello, 2 mM di L-glutammina e 100 unità di penicillina e streptomicina). Collocare le cellule mononucleate (circa 1 x 10 6 cellule) in un pallone dicoltura tissutale T125 contenente 20 ml di terreno di coltura tissutale.
- Infettare le cellule mononucleate con il virus di Epstein-Barr.
- Utilizzare supernatanti provenienti da colture cellulari B95.8 (contenenti10 2-103 unità trasformanti/mL stoccate a -80 °C) come fonte di EBV.
- Sospendere 1 x 106 cellule mononucleate dallo stadio 1,5 in 20 mL di terreno di coltura tissutale ed esporle a 2 mL di surnatante dalla linea cellulare B95.8 in presenza di ciclosporina A (concentrazione finale di 0,2 μg/mL) per l'infezione.
- Posizionare il matraccio in un incubatore di colture cellulari a 37 °C e consentire alle cellule di crescere. Dopo una settimana cambia il mezzo culturale.
NOTA: Una volta che le cellule B iniziano a proliferare, formano grumi riconoscibili e crescono rapidamente in modo che le colture possano essere espanse e congelate. - Estrarre il DNA genomico dalle linee cellulari di linfociti B immortalizzate EBV11 per confermare la presenza o l'assenza della mutazione data.
2. Misurazioni intracellulari di Ca2+
NOTA: Le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio delle linee cellulari dei linfociti B trasformate in EBV possono essere monitorate nelle popolazioni cellulari, con uno spettrofluorometro dotato di agitatore magnetico e portacuvette impostato a 37 °C. In alternativa, le variazioni di Ca2+ possono essere monitorate in singole cellule mediante microscopia a fluorescenza. In entrambi i casi le cellule vengono rimosse dal pallone di coltura tissutale, lavate due volte con la soluzione di Krebs Ringer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4,5,5 mM glucosio, pH 7,4 contenente 1 mM CaCl2)e contate.
- Per esperimenti in popolazioni cellulari utilizzando uno spettrofluorometro11,13,14
- Risospendare le cellule ad una concentrazione finale di 1 x 107 cellule/mL nella soluzione di Krebs Ringer e incubare a 37°C per 30 min con una concentrazione finale di 5 μM Fura-2/AM.
- Centrifugare le celle a 900 x g per 10 minuti e risospendarle nella soluzione di Krebs Ringer ad una concentrazione di 2 x 106 celle/ml.
- Misurare le variazioni di fluorescenza (rapporto 340/380 nm) utilizzando uno spettrofluorometro dotato di un agitatore magnetico impostato alla massima velocità e impostato su 37 °C.
- Poco prima dell'esperimento spin le celle a 900 x g per 5 minuti in una microcentrifuga e risospende rapidamente il pellet in 1,5 ml di soluzione di Krebs Ringer con 0,5 mM EGTA ma senza Aggiunta di Ca2+.
- Posizionare le cellule in una cuvetta spettrofluorometrica di vetro da 3 mL e registrare il rapporto di fluorescenza (eccitazione 340 nm/380 nm, emissione 510 nm).
- Raggiungere una linea di base stabile (circa 30 secondi), aggiungere la concentrazione selezionata di agonista RyR1 (4-cloro-m-cresolo o 4-cmc) e registrare il transitorio di calcio.
NOTA: Una soluzione madre da 300 mM di 4-cmc prodotta in DMSO viene utilizzata come reagente di partenza. Questa soluzione può essere preparata in anticipo, aliquotata e conservata a -20 °C per diversi mesi. - Eseguire esperimenti per diverse concentrazioni di 4 cmc.
NOTA: Includere 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, da 750 μM a 1 mM per generare una curva dose-risposta dell'agonista rispetto alla variazione in [Ca2+]. Le diverse concentrazioni di 4-cmc si ottengono aggiungendo il volume appropriato di 4-cmc dalla soluzione madre, direttamente nella cuvetta contenente le celle caricate Fura-2. Ad esempio, per una concentrazione finale di 300 μM 4-cmc, 1,5 μL della soluzione madre vengono aggiunti alla cuvetta contenente 1,5 mL di cellule nella soluzione di Krebs Ringer. Per concentrazioni di agonisti più basse, la soluzione madre da 300 mM deve essere diluita a 75 mM con DMSO e il volume appropriato aggiunto alla cuvetta contenente 1,5 mL di cellule nella soluzione di Krebs Ringer. - Aggiungere 400 nM thapsigargin alle cellule per calcolare la quantità totale di Ca2+ presente nei depositi intracellulari. Registrare il picco Ca2+.
- Tracciare il picco di calcio indotto da una data concentrazione di 4-cmc rispetto al picco di calcio indotto da thapsigargin, che è considerato al 100% e costruire una curva di risposta alla dose di 4 cmc confrontando le cellule di un proband e di un parente sano
- Per esperimenti su singole cellule13
- Diluire la poli-L-lisina 1:10 in H2O sterile e pretrattare le coperture in vetro per 30 min. Lasciare asciugare all'aria sotto un cappuccio sterile per la coltura del tessuto.
- Sospendere nuovamente i linfociti B trasformati in EBV ad una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL nella soluzione di Krebs Ringer contenente 1 mM di CaCl2 e aggiungere una concentrazione finale di 5 μM Fura-2/AM.
- Posizionare 1 mL di cellule sui coverslip trattati con poli-L-lisina e incubare a 37 °C in un incubatore di colture cellulari umidificate per 30 minuti per consentire alle cellule EBV di aderire al coperchio di vetro durante il carico.
- Posizionare il coverslip nella camera di perfusione e iniziare la perfusione (ad una velocità di 2 mL/min) con la soluzione di Krebs Ringer contenente 1 mM Ca2+.
- Utilizzare un microscopio fluorescente invertito (dotato di un obiettivo ad immersione in olio 40x (apertura numerica 0,17), filtri (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) per registrare misurazioni in linea, con un attacco per telecamera CCD (Charge Coupled Device) controllato da software.
- Acquisire immagini a intervalli di 1 s a un tempo di esposizione fisso (100 ms per entrambe le lunghezze d'onda di eccitazione a 340 e 380 nm. Utilizzare un software di imaging per analizzare i cambiamenti nella fluorescenza. Misurare il valore medio dei pixel per ogni cella a lunghezze d'onda di eccitazione di 340 e 380 nm13.
- Per ottenere la stimolazione cellulare, utilizzare uno stimolatore di perfusione cellulare con 12 valvole e aggiungere diverse concentrazioni di 4-cmc. La valvola di scarico contiene la soluzione di Krebs Ringer senza aggiunta di Ca2+ più 100 μM La3+ per monitorare il rilascio di calcio solo dalle riserve intracellulari.
- Costruire una curva dose-risposta di 4-cmc rispetto alla variazione in [Ca2+], come descritto sopra.
3. Preparazione di miotubi umani da biopsie muscolari10,12,15
NOTA: Diversi metodi sono stati utilizzati da diversi laboratori per ottenere mioblasti e miotubi derivati da cellule satelliti. Di seguito è riportata la descrizione del metodo utilizzato a Basilea.
- Risciacquare la biopsia muscolare con PBS sterile per rimuovere il sangue in eccesso e tagliare in piccoli frammenti di circa 0,5-1 mm.
- Preparare 6 piatti di coltura di tessuti ben con inserto. Aggiungere 1,5 ml di terreno di crescita muscolare umano a ciascun pozzetto e 0,5 ml di terreno di crescita muscolare umano a ciascun inserto.
NOTA: Il mezzo di crescita è composto come segue: 500 mL di eagle modificato di Dulbecco con glicemia alta, o DMEM (4,5 mg / mL), contenente il 10% di siero di cavallo, 5 ng / mL di insulina, 3 mM di glutammina, 600 ng / mL di penicillina G e streptomicina e 7 mM HEPES, pH 7,4. Può essere utilizzato anche un mezzo di crescita muscolare scheletrica disponibile in commercio. - Posizionare 2-3 piccoli frammenti muscolari in ogni inserto (Figura 1A) e posizionare i piatti di coltura nell'incubatore di colture cellulari (5% CO2, 37 ° C). Dopo circa 8-10 giorni si possono vedere cellule satelliti crescere fuori e intorno alla biopsia muscolare, attaccate all'inserto(Figura 1,B e C, frecce).
- Rilasciare un numero sufficiente di cellule dalla biopsia (dopo circa 10-14 giorni), tripsinizzare come segue:
- Rimuovere tutto il terreno di coltura, sciacquare le cellule una volta con 1 mL di PBS, aggiungere 0,5 mL di soluzione di tripsina/EDTA (0,025% tripsina e 0,01% EDTA) e incubare a 37 °C per 5 minuti.
- Aggiungere 1 mL di terreno di crescita alle cellule per neutralizzare l'effetto della tripsina e trasferire le cellule satelliti in un nuovo pallone di coltura cellulare T25; aggiungere 3 ml di terreno di coltura e collocare le cellule in un incubatore di colture cellulari (5% CO2,37 °C).
- Cambiare il mezzo di crescita il giorno successivo per rimuovere l'EDTA e successivamente cambiare il mezzo una volta alla settimana.
- Quando i mioblasti sono confluenti per circa il 75%, tripsilizzarli e trasferirli su un coperchio di vetro trattato con laminina.
NOTA: in proporzione, le cellule che crescono in un pallone T25 devono essere trasferite su un coperchio di vetro trattato con laminina di 43 mm di diametro. Il coperchio di vetro deve essere posizionato all'interno di una piastra di coltura tissutale di 60 mm di diametro contenente 3 ml di terreno di coltura. - Coltivare cellule sul coperchio di vetro nel mezzo di crescita in un incubatore di colture cellulari (5% CO2, 37 ° C) cambiando il mezzo una volta alla settimana. Con una confluenza del 90%, passare al mezzo di differenziazione costituito come segue: DMEM ad alto contenuto di glucosio (4,5 mg/mL), albumina sierica bovina allo 0,5%, fattore di crescita epidermico 10 ng/mL, 0,15 mg/mL di creatina, 5 ng/mL di insulina, 200 mM di glutammina, 600 ng/mL di penicillina G e streptomicina e 7 mM HEPES, pH 7,4). Può essere utilizzato anche un mezzo di differenziazione disponibile in commercio. Cambia il mezzo di differenziazione una volta alla settimana.
- Dopo 7-10 giorni nel mezzo di differenziazione, sono visibili i miotubi multinucleati. Valutare le modifiche in [Ca2+] entro una settimana, come descritto di seguito.
4. [Ca2+]i misure del rapporto determinate con Fura-2
- Caricare miotubi cresciuti con copertura di vetro con Fura-2/AM (concentrazione finale di 5 μM) diluito in DMEM per 30 minuti a 37 °C. In breve, rimuovere il mezzo di differenziazione dalle cellule coltivate in vetro e aggiungere 2 ml di terreno di differenziazione fresco. Aggiungere 10 μL di Fura-2 AM da una soluzione madre di 1 mM e incubare 30 minuti in un incubatore di colture cellulari (5% CO2, 37 °C).
- Trasferire il coperchio di vetro nella camera di perfusione e risciacquare le cellule con la soluzione di Krebs Ringer contenente 2 mM di CaCl2.
- Eseguire misurazioni on-line [Ca2+] come descritto sopra nella sezione A cella singola EBV con l'uso di un obiettivo FLUAR ad immersione in acqua 20x (apertura numerica 0,17).
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Representative Results
[Ca2+]i misurazioni in popolazioni di linfociti B immortalizzati EBV
I linfociti B primari esprimono l'isoforma RyR1 che funziona come canale di rilascio di Ca2+ durante i processi di segnalazione stimolati dal recettore dell'antigene delle cellule B17. L'immortalizzazione delle cellule B con EBV, una procedura abitualmente utilizzata dai genetisti per ottenere linee cellulari contenenti informazioni genomiche dei pazienti, fornisce il vantaggio di generare linee cellulari che esprimono canali mutanti RyR1 Ca2+ in pazienti che ospitano mutazioni RYR111,13. [Ca2+] I cambiamenti causati dall'aggiunta di specifici agonisti RyR1 come il 4-cloro-m-cresolo18 e la caffeina possono essere facilmente monitorati al fine di stabilire se una data mutazione RYR1 altera la sensibilità ad un agonista, la quantità di calcio rilasciato, il riposo [Ca2+], o altri parametri che hanno dimostrato di essere influenzati dalle mutazioni. [Ca2+] I cambiamenti possono essere monitorati sia in popolazioni di celle caricate Fura-2 in sospensione con uno spettrofluorometro o su gruppi di cellule attaccate a coperture di vetro ed esaminate mediante epifluorescenza. La Figura 2 mostra un esperimento rappresentativo condotto su sospensioni cellulari. Immediatamente prima di essere collocate nella cuvetta, le cellule sono state filate per rimuovere Fura-2 che potrebbe essere fuoriuscito; le cellule sono state quindi risospese ad una concentrazione finale di 1 x 106 celle/mL in soluzione calda (37°C) di Krebs Ringer non contenente Ca2+ aggiuntivo più 0,5 mM EGTA e poste nello spettrofluorometro. L'agitatore magnetico è stato acceso in posizione 4 (la posizione più alta) per mantenere le celle in sospensione ed è stata registrata la fluorescenza. Dopo aver ottenuto una traccia stabile, è stato aggiunto l'agonista selezionato (nella Figura 2A si trattava di 300 μM 4-cloro-m-cresolo) portando ad un rapido aumento di Ca2+ che poi lentamente è tornato ai livelli di riposo. La natura transitoria del cambiamento nella fluorescenza è importante in quanto indica (i) che non è un artefatto causato dall'aggiunta di un composto fluorescente o dissetante, (ii) che non è dovuto al legame del calcio al Fura-2 extracellulare e (iii) che le cellule sono sane e possono rimuovere attivamente il calcio dal loro citoplasma.
Lo stesso esperimento deve essere ripetuto più volte per essere analizzato statisticamente. Per ogni linea cellulare e ogni giorno, gli esperimenti vengono effettuati e la quantità totale di calcio rapidamente rilasciabile nelle scorte deve essere determinata aggiungendo l'inibitore SERCA thapsigargin11,13,14. Come mostrato nella Figura 2B,l'aggiunta di 400 nM di thapsigargin provoca un grande transitorio di calcio che raggiunge un valore di fluorescenza di picco di 2,4 unità arbitrarie (u.a.); quindi la quantità totale di calcio che può essere rilasciata dalle riserve intracellulari delle cellule B immortalizzate EBV mostrate nella Figura 2B è pari a 2,4 a.u. (picco thapsigargin) - 1,45 a.u. (rapporto di riposo) o 0,95 Questo valore di fluorescenza è stato considerato al 100% quando si costruisce la curva dose-risposta mostrata nella Figura 2C.
Misurazioni a singola cellula [Ca2+]i in linfociti B immortalizzati EBV
Questo secondo approccio si basa sulla disponibilità di un microscopio a fluorescenza e di un set up di microperfusione che consente la stimolazione di una singola cellula o di piccoli gruppi di cellule con una data concentrazione di agonista e la registrazione simultanea dei cambiamenti di fluorescenza. Le siringhe del sistema di microperfusione sono caricate con diverse concentrazioni dell'agonista RyR1 selezionato (caffeina o 4-cloro-m-cresolo) che verranno utilizzate per generare curve di risposta alla dose. Nell'esempio mostrato nella Figura 3,le cellule sono state stimolate con 0,5-10 mM di caffeina disciolta nella soluzione di Krebs Ringer senza calcio aggiunto più 100 μM La3+ al fine di monitorare il rilascio di Ca2+ dalle riserve intracellulari. Le coperture di vetro su cui i linfociti B immortalizzati EBV caricati da Fura-2 sono state lasciate attaccare sono poste nella camera di perfusione e perfuse con la soluzione di Krebs Ringer contenente 1 mM Ca2+. La maggior parte delle cellule avrà aderito al coverslip trattato con poli-L-lisina e piccoli gruppi di cellule dovrebbero essere identificati e controllati per il carico di Fura-2. La punta del sistema di perfusione è posizionata vicino alle cellule per bagnarle (e non tutte le cellule sul coperchio) con caffeina. Normalmente le cellule vengono stimolate a partire dalla più bassa alla più alta concentrazione di caffeina; per ogni concentrazione, viene selezionata una nuova cellula o un gruppo di cellule. Le misure di fluorescenza raziometrica (eccitazione a 340 nm e 380 nm, emissione a 510 nm) vengono registrate ogni secondo per un massimo di 2 minuti. Alcune immagini vengono ottenute prima della perfusione per ottenere una linea di base costante, successivamente viene avviata la perfusione cellulare, prima lavando le cellule con una soluzione di soluzione di Krebs Ringer contenente 100 μM La3+ per 5 secondi. Ciò non dovrebbe comportare un cambiamento nella fioritura ed è un controllo per assicurare che le cellule si attacchino al coverslip durante l'esperimento; successivamente una soluzione contenente la concentrazione di agonista selezionata viene lavata sulla cellula o sulle cellule. Nell'esempio mostrato nella Figura 3A,le cellule sono state stimolate con 5 mM di caffeina per 20 secondi. La freccia mostrata indica quando è stata aperta la valvola della caffeina e questo si traduce in un aumento immediato del rapporto fluorescente 340/380 nm. Dopo 20 secondi, la valvola della caffeina si chiude e le cellule vengono lavate con la soluzione di Krebs Ringer contenente 100 μM La3+; la fluorescenza viene registrata fino al raggiungimento della linea di base. Per ogni concentrazione di caffeina viene calcolato il ΔF, cioè il picco di fluorescenza 340/380 nm indotto dalla caffeina - viene calcolata la fluorescenza iniziale di 340/380 nm a riposo e utilizzata per costruire una curva dose-risposta come mostrato in Figura 3B. Il ΔF medio da 5-10 cellule è mediato per ogni concentrazione di caffeina. Anche la quantità di calcio nei depositi intracellulari può essere monitorata. In questo caso, le cellule vengono risciacquate con la soluzione di Krebs Ringer contenente 0,5 mM di EGTA e una soluzione di 1 μM di thapsigargin, 1 μM di ionomicina e 0,5 mM di EGTA viene aggiunta a mano alle cellule (non attraverso il sistema di microperfusione poiché la ionomicina si attacca al tubo e non può essere lavata via) e la fluorescenza viene registrata per circa 4-5 minuti. Per calcolare il ΔF, si ottiene una regione di interesse (ROI) che delinea una cella e le variazioni di fluorescenza all'interno del ROI vengono calcolate utilizzando un software di imaging.
In sintesi, quando si utilizzano cellule B immortalizzate EBV per misurare la sensibilità del RyR1 a un agonista specifico, devono essere eseguiti esperimenti ripetuti su cellule di un individuo, in giorni diversi. Per le misurazioni sulle popolazioni cellulari, è necessario valutare lo stato delle riserve intracellulari di calcio e il rilascio di calcio indotto da EC50 ad agonista è tracciato rispetto alla quantità totale di calcio che può essere rilasciata dalle riserve. Un vantaggio dell'utilizzo di questo approccio è che la risposta [Ca2+] di milioni di cellule è mediata; inoltre, non sono necessari sistemi di microperfusione e microscopi fluorescenti. Il metodo a cella singola consente l'utilizzo di un numero minore di celle e la visualizzazione on-line dei cambiamenti in [Ca2+] di celle selezionate.
Misurazioni a cella singola [Ca2+]i in miotubi derivati da cellule satelliti umane
I miotubi di vetro coltivati e differenziati vengono caricati con Fura-2, trasferiti nella camera di perfusione e immersi nella soluzione di Krebs Ringer contenente 2 mM Ca2+ come descritto sopra per le cellule EBV. Le siringhe del sistema di perfusione sono riempite con l'agonista selezionato e i miotubi vengono stimolati come descritto sopra. Poiché non tutte le cellule sul coverslip sono miotubi multinucleati, è importante selezionare le cellule appropriate che verranno misurate. Piccoli gruppi di miotubi possono essere stimolati contemporaneamente. Nell'esempio mostrato in Figura 4,un singolo miotubo è stato lavato con una soluzione contenente KCl, diverse concentrazioni di 4-cloro-m-cresolo e infine caffeina, tuttavia, normalmente vengono costruite curve di risposta alla dose agli agonisti, come indicato nella sezione precedente, al fine di confrontare la sensibilità agonista di cellule di diversi individui12,15,16 . KCl è usato come un modo per depolarizzare la membrana plasmatica. Nella depolarizzazione scheletrica della membrana plasmatica muscolare viene rilevata dal DHPR con rilevamento della tensione che subisce quindi un cambiamento conformazionale che porta all'attivazione e all'apertura del RyR1. D'altra parte, il 4-cloro-m-cresolo e la caffeina sono attivatori farmacologici diretti del RyR1.
Figura 1: Generazione di colture di mioblasti derivate dalla biopsia muscolare umana primaria. (A) Piccoli frammenti di muscolo (frecce) sono collocati in inserti contenenti 0,5 ml di terreno di crescita. Dopo 7-14 giorni si possono vedere cellule satelliti (piccole frecce) adiacenti al tessuto muscolare e che crescono sul fondo dell'inserto. Immagine scattata attraverso un obiettivo 10x (B) e un obiettivo 20x (C). Le scatole grigie nel pannello A sono state utilizzate per coprire l'identità del paziente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esperimenti di rilascio di calcio in linfociti B immortalati EBV. Misurazioni raziometriche [Ca2+]i in una popolazione di celle caricate Fura-2 in sospensione. A) L'aggiunta di 300 μM 4-cloro-m-cresolo (freccia) provoca un immediato aumento del citoplasmatico [Ca2+],che successivamente decade a livelli di riposo entro 500 secondi. In questo esempio il ΔF indotto dall'aggiunta di 300 μM 4-cloro-m-cresolo è 1,7 unità di fluorescenza- 1,4 unità di fluorescenza = 0,3 unità di fluorescenza. B) L'aggiunta dell'inibitore SERCA thapsigargin (400 nM, freccia) provoca un maggiore aumento del rapporto di fluorescenza Fura-2 che raggiunge il picco a 2,4 unità di fluorescenza e successivamente decade a livelli di riposo a 1,45 unità di fluorescenza. Il transitorio indotto da thapsigargin [Ca2+]rappresenta la quantità totale di calcio rapidamente rilasciabile nelle riserve intracellulari presenti nella popolazione cellulare. Il picco transitorio ottenuto (2,4-1,45= 0,95 unità) viene utilizzato per calcolare la percentuale di calcio rilasciata da una data concentrazione di 4-cloro-m-cresolo. C) Curve rappresentative di risposta alla dose correlando il ΔF come percentuale della quantità totale di calcio rapidamente rilasciabile nelle riserve intracellulari. Per 300 μM 4-cloro-m-cresolo questo valore è 0,3/0,95x100=31,6%. Ogni simbolo rappresenta la media± SEM% di 5-10 valori da cellule immortalizzate EBV da un controllo (cerchi chiusi, linea tratteggiata) e un individuo MHS (quadrati chiusi, linea continua) portatore di una mutazione RYR1. Le curve sono state generate utilizzando una funzione sigmoidale della curva dose-risposta. I pannelli A e B sono adattati da Girard et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rilascio di Ca2+ indotto da caffeina in singoli linfociti B immortalizzati EBV da un individuo di controllo. A) Pannelli superiori, immagini time lapse (A) Contrasto di fase; (B-E), monocellulare [Ca2+]I misure di linfociti immortalizzati EBV caricati con fura-2: (B) t=0, (C) t=36 s, (D) t=50 s e (E) t=77 s dopo l'applicazione di 5 mM di caffeina. Le cellule sono state stimolate individualmente dall'aggiunta di caffeina diluita in soluzione krebs-Ringer. Scala bar=10 μm. Pannello inferiore, traccia rappresentativa ottenuta dopo stimolazione di una singola cellula con 5 mM di caffeina (freccia). B) Curve dose-risposta che mostrano la variazione caffeina-dipendente in [Ca2+]i, espressa come variazione del rapporto di fluorescenza (rapporto di picco 340/380 nm-rapporto a riposo 340/380 nm). Ogni punto rappresenta la media ± SEM della variazione di fluorescenza di 4-15 cellule. Le curve sono state generate utilizzando una funzione sigmoidale della curva dose-risposta. Quadrati chiusi, linea tratteggiata, celle di controllo; triangoli chiusi, linea continua, MHS individuale portatore di una mutazione RYR1. Questa figura è un adattamento da Ducreux et al.13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rilascio di calcio stimolato da KCl, 4-cloro-m-cresolo e caffeina nei miotubi umani da un individuo di controllo. Pannelli di sinistra: A) contrasto di fase (B-H), misurazioni intracellulari a singola cellula di Ca2+ di miotubi umani caricati con Fura-2. B) riposo [Ca2+]i ; C) t=2 s dopo l'applicazione di 150 mM KCl. D) t= 2 s dopo l'applicazione di 150 μM 4-cloro-m-cresolo; E) t=2 s dopo l'applicazione di 300 μM 4-cloro-m-cresolo; F) t=2 s dopo l'applicazione di 600 μM 4-cloro-m-cresolo; G) t=2 s dopo l'applicazione di 10 mM di caffeina; H) t=20 s dopo l'applicazione della caffeina. Pannellodi destra : Trama del tempo (s) rispetto al rapporto di fluorescenza (340/380 nm) nella cellula stimolata. I miotubi sono stati stimolati individualmente dall'aggiunta dell'agonista nel tampone Krebs-Ringer contenente 100 μM La3+, quindi l'aumento di [Ca2+]i rappresenta solo il rilascio di calcio dalle riserve intracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I protocolli descritti in questo articolo sono stati utilizzati con successo da diversi laboratori per studiare l'impatto delle mutazioni RYR1 sull'omeostasi del calcio. I passaggi critici degli approcci delineati in questo documento riguardano la sterilità, le capacità e le tecniche di coltivazione cellulare e la disponibilità di materiale biologico. In linea di principio, l'uso di linfociti B immortalizzati EBV è più semplice e consente di generare linee cellulari contenenti canali RyR1 mutanti. Le cellule possono essere congelate e conservate in azoto liquido per molti anni e le colture possono essere riavviate in qualsiasi momento. Inoltre, si può scegliere se monitorare l'omeostasi del calcio nelle popolazioni cellulari o a livello di singola cellula. Il primo metodo è più semplice, non richiede un microscopio a fluorescenza e consente allo sperimentatore di testare linee cellulari generate da individui diversi in un breve periodo di tempo. La limitazione è la velocità di crescita cellulare e la disponibilità di uno spettrofluorometro completamente attrezzato (riscaldato e con agitatore magnetico). Come approccio alternativo la citometria a flusso in combinazione con indicatori fluorescenti di calcio può essere utilizzata per misurare i flussi di calcio nei linfociti B immortalizzati EBV; in tal modo i cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio possono esseredeterminati 19. Se sono disponibili un microscopio fluorescente, una camera di perfusione e un sistema di microperfusione, l'imaging a singola cellula ha il vantaggio di essere più sensibile e di fornire informazioni più dettagliate, tra cui la variabilità da cellula a cellula, l'analisi cinetica e l'identificazione dei domini subcellulari coinvolti nel rilascio di calcio. Quest'ultimo approccio è tecnicamente più impegnativo e richiede più attrezzature.
Ci sono molteplici vantaggi nell'uso di linfociti B immortalizzati EBV, incluso il fatto che altri parametri a parte [Ca2+]i omeostasi possono essere misurati. Ad esempio, l'acidificazione indotta da 4-cloro-m-cresolo delle cellule B è stata utilizzata per differenziare le cellule dagli individui di controllo dai pazienti MHS20,21. Tuttavia si deve tenere presente (i) che le cellule B non esprimono molte delle proteine coinvolte nell'accoppiamento di contrazione dell'eccitazione del muscolo scheletrico che può influenzare indirettamente il rilascio di calcio, (ii) sono cellule non eccitabili quindi non possono essere attivate fisiologicamente dalla depolarizzazione della membrana plasmatica, e infine un rapporto di Monnier et al. ha scoperto che una mutazione identificata in un paziente non è stata espressa nelle cellule B immortalizzate EBV a causa di un sito di giunzione criptico22.
Colture di cellule muscolari primarie derivate dal paziente sono state utilizzate da diversi gruppi interessati a studiare l'effetto delle mutazioni in diversi geni che codificano proteine coinvolte nell'omeostasi del calcio10,23,24. Queste cellule possono essere differenziate in miotubi multinucleati, rispondono alla depolarizzazione della membrana plasmatica e possono essere valutate con mezzi elettrofisiologici. Inoltre, possono essere immortalati per ottenere linee cellulari portatrici di mutazioni RYR125, anche se la procedura è molto più complessa rispetto ai linfociti B. Mentre è anche vero che le cellule muscolari sono a crescita lenta e il tempo necessario da fare una biopsia ad avere un numero sufficiente di cellule può essere più di un mese, è anche possibile conservare i piccoli pezzi di biopsie muscolari nel mezzo di congelamento in azoto liquido per ottenere mioblasti anni dopo. I lunghi tempi di coltura hanno l'ulteriore rischio di contaminazione da batteri, lieviti o muffe e non appena si è ottenuto un numero sufficientemente elevato di mioblasti, è importante congelarli e conservarli in azoto liquido. Il nostro laboratorio ha applicato con successo la stessa tecnica sopra descritta per i miotubi, per studiare i cambiamenti del calcio nei fibroblasti derivati dalla pelle umana trasdotti con myoD e differenziati in miotubi26. Questo è stato fatto per studiare l'effetto funzionale delle mutazioni RYR1 quando i mioblasti derivati dalla biopsia muscolare non erano disponibili. Per quanto riguarda i linfociti B, l'acidificazione indotta da 4-cloro-m-cresolo dei miotubi da pazienti con mutazioni RYR1 legate a MHS è stata testata con successo27.
In conclusione, l'uso di materiale biologico da parte dei pazienti per studiare la correlazione genotipo-fenotipo ha molti vantaggi lo svantaggio e può essere utilizzato con successo per studiare l'effetto delle mutazioni in RYR1. Quando si utilizza questo approccio, tuttavia, è importante tenere presente che le mutazioni presenti in altri geni possono influenzare l'omeostasi del calcio; pertanto, deve essere eseguito l'uso di cellule di famiglie diverse che ospitano la stessa mutazione e di membri della famiglia che non ospitano la mutazione RYR1 come controlli.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato sostenuto da sovvenzioni del Fondo nazionale svizzero (FNS) e della Fondazione svizzera per i muscoli.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
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