Summary
Hier worden methoden beschreven die worden gebruikt om het functionele effect van RYR1-mutaties te bestuderen die endogeen tot expressie komen in epstein barr-virus vereeuwigde menselijke B-lymfocyten en spierbiopsie afgeleide satellietcellen gedifferentieerd in myotubes.
Abstract
Meer dan 700 varianten in het RYR1-gen zijn geïdentificeerd bij patiënten met verschillende neuromusculaire aandoeningen, waaronder maligne hyperthermiegevoeligheid, kernmyopathieën en centronucleaire myopathie. Vanwege de diverse fenotypen die verband houden met RYR1-mutaties is het van fundamenteel belang om hun functionele effecten te karakteriseren om varianten te classificeren die door patiënten worden gedragen voor toekomstige therapeutische interventies en niet-pathogene varianten te identificeren. Veel laboratoria zijn geïnteresseerd in het ontwikkelen van methoden om RYR1-mutaties in cellen van patiënten functioneel te karakteriseren. Deze aanpak heeft tal van voordelen, waaronder: mutaties worden endogeen tot expressie gebracht, RyR1 wordt niet overexpressie gegeven, het gebruik van heterologe RyR1-expressiecellen wordt vermeden. Omdat patiënten echter naast RYR1 mutaties in verschillende genen kunnen vertonen, is het belangrijk om resultaten van biologisch materiaal te vergelijken van personen met dezelfde mutatie, met verschillende genetische achtergronden. Het huidige manuscript beschrijft methoden die zijn ontwikkeld om de functionele effecten van endogene tot expressie gebrachte RYR1-varianten te bestuderen in: (a) Epstein Barr-virus vereeuwigde menselijke B-lymfocyten en (b) satellietcellen afgeleid van spierbiopten en gedifferentieerd in myotubes. Veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie veroorzaakt door de toevoeging van een farmacologische RyR1-activatoren worden vervolgens gecontroleerd. Het geselecteerde celtype wordt geladen met een ratiometrische fluorescerende calciumindicator en intracellulaire [Ca2+] veranderingen worden gecontroleerd op het niveau van één cel door fluorescentiemicroscopie of in celpopulaties met behulp van een spectrofluorometer. De rust [Ca2+], agonist dosisresponscurven worden vervolgens vergeleken tussen cellen van gezonde controles en patiënten met RYR1-varianten, wat leidt tot inzicht in het functionele effect van een bepaalde variant.
Introduction
Tot op heden zijn meer dan 700 RYR1-varianten geïdentificeerd in de menselijke populatie en gekoppeld aan verschillende neuromusculaire aandoeningen, waaronder maligne hyperthermiegevoeligheid (MHS), door inspanning geïnduceerde rabdomyolyse, centrale kernziekte (CCD), multi-minicoreziekte (MmD), centronucleaire myopathie (CNM)1,2,3 ; niettemin blijven studies om hun functionele effecten te karakteriseren achter en slechts ongeveer 10% van de mutaties is functioneel getest. Verschillende experimentele benaderingen kunnen worden gebruikt om de impact van een bepaalde RyR1-variant te beoordelen, waaronder transfectie van heterologe cellen zoals HEK293- en COS-7-cellen met plasmidecodering voor de WT en mutant RYR1 cDNA4,5, transductie van dyspedische muisfibroblasten met plasmiden en vectoren die coderen voor de WT en mutant RYR1 cDNA, gevolgd door transductie met myo-D en differentiatie in myotubes6 , generatie van transgene diermodellen met mutant RyR1s7,8,9, karakterisering van cellen van patiënten die de RYR1-variant endogeen tot expressie brengen10,11,12. Dergelijke methoden hebben geholpen vast te stellen hoe verschillende mutaties functioneel van invloed zijn op het RyR1 Ca2+ kanaal.
Hier worden methoden beschreven die zijn ontwikkeld om de functionele effecten van RYR1-mutaties te beoordelen. Verschillende parameters van intracellulaire calciumhomeostase worden onderzocht in menselijke cellen die endogeen het RyR1-calciumkanaal tot expressie brengen, waaronder myotubes en epstein barr-virus (EBV) vereeuwigde B-lymfocyten. Cellen worden verkregen van patiënten, uitgebreid in cultuur en geladen met ratiometrische fluorescerende calciumindicatoren zoals Fura-2 of indo-1. Parameters waarvan is gemeld dat ze zijn gewijzigd als gevolg van pathogene RYR1-mutaties, waaronder de rust [Ca2+], de gevoeligheid voor verschillende farmacologische agonisten en de grootte van de intracellulaire Ca2+-winkels, worden gemeten op het niveau van één cel, met behulp van fluorescentiemicroscopie, of in celpopulaties met behulp van een fluorimeter. Resultaten verkregen in cellen van mutatiedragers worden vervolgens vergeleken met die verkregen van gezonde controlefamilieleden. Deze benadering heeft aangetoond dat: (i) veel mutaties gekoppeld aan MHS leiden tot een toename van de rust [Ca2+] en een verschuiving naar links in de dosisresponscurve naar ofwel KCl-geïnduceerde depolarisatie of farmacologische RyR1-activering met 4-chloor-m-cresol10,11,12,13; ii) mutaties in verband met CCD leiden tot een afname van de piek [Ca2+ ]die vrijkomt door farmacologische activering van de RyR1 en een afname van de omvang als het intracellulaire Ca2+ 12,13,14,15opslaat; (iii) sommige varianten hebben geen invloed op Ca2+ homeostase13. Voordelen van deze experimentele aanpak zijn: het RyR1-eiwit is niet overexpressie en fysiologische niveaus zijn aanwezig, cellen kunnen worden vereeuwigd (zowel spiercellen als B-lymfocyten) en cellijnen met mutaties leveren. Sommige nadelen hebben betrekking op het feit dat patiënten mutaties kunnen dragen in meer dan één gen dat codeert voor eiwitten die betrokken zijn bij calciumhomeostase en / of excitatiecontractiekoppeling (ECC) en dit kan experimentele conclusies bemoeilijken. Er werden bijvoorbeeld twee JP-45-varianten geïdentificeerd in de MHS- en controlepopulatie en hun aanwezigheid bleek de gevoeligheid van de dihydropyridinereceptor (DHPR) voor activering te beïnvloeden16. Patiënten moeten beschikbaar zijn, biologisch materiaal moet vers worden ingezameld en ethische vergunningen moeten worden verkregen van de lokale ethische raden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hieronder beschreven protocollen voldoen aan de ethische richtlijnen van de Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. Bereiding van Epstein Barr vereeuwigde B-lymfocyten cellijnen11
- Verzamel na geïnformeerde toestemming 30 ml volbloed in met EDTA behandelde steriele buisjes uit de proband met een RYR1-mutatie en van gezonde familieleden zonder mutatie.
OPMERKING: Houd alle oplossingen steriel en werk in een weefselkweekkap. - Isoleer mononucleaire cellen uit volbloed door middel van dichtheidsgradiënt centrifugatiemedia (bijv. Ficoll-Hypaque, .077 g / L).
- Plaats 30 ml steriel bloed in een conische steriele buis van 50 ml.
- Plaats de punt van een Pasteur-pipet met de dichtheidsgradiëntcentrifugatiemedia aan de onderkant van de buis en laag 20 ml steriele dichtheidsgradiëntcentrifugatiemedia-oplossing langzaam onder het bloed.
- Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 900 x g bij 18°-20°C, zonder onderbreking.
OPMERKING: De mononucleaire cellaag verschijnt als een troebele ring in de interfase tussen de dichtheidsgradiënt centrifugatiemedialaag en de bovenste laag met met bloedplaatjes verrijkt plasma.
- Verwijder met een steriele pipet voorzichtig de interfaselaag met mononucleaire cellen (ongeveer 3-5 ml) en breng de oplossing over in een schone steriele conische buis van 50 ml.
- Voeg 20 ml fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) toe aan spoelcellen, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 600 x g bij kamertemperatuur en resuspend de pellet in PBS. Herhaal dit in totaal drie keer; dit zorgt ervoor dat alle media worden verwijderd.
- Na de laatste wassing resuspend cellen in 1-2 ml weefselkweekmedium (RPMI-medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 2 mM L-glutamine en 100 eenheden penicilline en streptomycine). Breng mononucleaire cellen (ongeveer 1 x 106 cellen) in een T125 weefselkweekkolf met 20 ml weefselkweekmedium.
- Infecteer mononucleaire cellen met het Epstein-Barr-virus.
- Gebruik supernatanten uit B95.8 cellijnculturen (met 102-10 3 transformerende eenheden/ml gevuld bij -80 °C) als bron van EBV.
- Resuspend 1 x 106 mononucleaire cellen uit stap 1.5 in 20 ml weefselkweekmedium en stel ze bloot aan 2 ml supernatant uit de B95.8-cellijn in aanwezigheid van ciclosporine A (0,2 μg / ml eindconcentratie) voor infectie.
- Plaats de kolf in een celkweekincubator van 37 °C en laat de cellen groeien. Na een week verander je het cultuurmedium.
OPMERKING: Zodra B-cellen zich beginnen te vermenigvuldigen, vormen ze herkenbare klonten en groeien ze snel, zodat de culturen kunnen worden uitgebreid en bevroren. - Extraheer het genomische DNA uit de EBV vereeuwigde B-lymfocytencellijnen11 om de aan- of afwezigheid van de gegeven mutatie te bevestigen.
2. Intracellulaire Ca2+ metingen
OPMERKING: Veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie van de EBV-getransformeerde B-lymfocytencellijnen kunnen worden gevolgd in celpopulaties, met een spectrofluorometer uitgerust met een magnetische roerder en cuvettehouder ingesteld op 37 °C. Als alternatief kunnen Ca2+ veranderingen in afzonderlijke cellen worden gevolgd door fluorescentiemicroscopie. In beide gevallen worden cellen uit de weefselkweekkolf verwijderd, tweemaal gewassen met Krebs Ringer's oplossing (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4,5,5 mM glucose, pH 7,4 met 1 mM CaCl2) en geteld.
- Voor experimenten in celpopulaties met behulp van een spectrofluorometer11,13,14
- Resuspend cellen in een eindconcentratie van 1 x 107 cellen/ml in de oplossing van Krebs Ringer en incubeer bij 37°C gedurende 30 minuten met een eindconcentratie van 5 μM Fura-2/AM.
- Centrifugeer cellen bij 900 x g gedurende 10 minuten en resuspend ze in de oplossing van Krebs Ringer in een concentratie van 2 x 106 cellen/ml.
- Meet fluorescentieveranderingen (verhouding 340/380 nm) met behulp van een spectrofluorometer die is uitgerust met een magneetroerder die is ingesteld op maximale snelheid en is ingesteld op 37 °C.
- Spincellen vlak voor het experiment bij 900 x g gedurende 5 minuten in een microcentrifuge en resuspend de pellet snel in 1,5 ml Krebs Ringer's oplossing met 0,5 mM EGTA maar geen toegevoegde Ca2+.
- Plaats cellen in een 3 ml glazen spectrofluorometer cuvette en registreer de fluorescentieverhouding (340 nm/380 nm excitatie, 510 nm emissie).
- Bereik een stabiele basislijn (ongeveer 30 seconden), voeg de geselecteerde concentratie RyR1-agonist (4-chloor-m-kresol of 4-cmc) toe en noteer de calciumtransiënt.
OPMERKING: Een 300 mM stockoplossing van 4 cmc gemaakt in DMSO wordt gebruikt als startreagens. Deze oplossing kan van tevoren worden gemaakt, aliquoteerd en gedurende enkele maanden bij -20 °C worden bewaard. - Voer experimenten uit voor verschillende 4-cmc-concentraties.
OPMERKING: Inclusief 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM tot 1 mM om een dosisresponscurve van agonist versus verandering in [Ca2+ ]te genereren. De verschillende 4-cmc-concentraties worden verkregen door het juiste volume van 4-cmc uit de stamoplossing rechtstreeks toe te voegen aan het cuvet dat de Fura-2-geladen cellen bevat. Voor een eindconcentratie van 300 μM 4 cmc wordt bijvoorbeeld 1,5 μL van de stamoplossing toegevoegd aan het cuvet met 1,5 ml cellen in de oplossing van Krebs Ringer. Voor lagere agonistenconcentraties moet de 300 mM stockoplossing worden verdund tot 75 mM met DMSO en moet het juiste volume worden toegevoegd aan het cuvet dat 1,5 ml cellen bevat in de oplossing van Krebs Ringer. - Voeg 400 nM thapsigargin toe aan cellen om de totale hoeveelheid Ca2+ te berekenen die aanwezig is in intracellulaire winkels. Noteer de piek Ca2+.
- Plot de piekcalcium geïnduceerd door een gegeven 4-cmc-concentratie versus de piekcalcium geïnduceerd door thapsigargin, die als 100% wordt beschouwd en construeer een 4-cmc dosisresponscurve waarin cellen uit een proband en gezonde relatieve
- Voor experimenten op afzonderlijke cellen13
- Verdun poly-L-lysine 1:10 in steriel H2O en behandel de glazen afdekplaten gedurende 30 minuten voor. Laat aan de lucht drogen onder een steriele weefselkweekkap.
- Suspensie van EBV-getransformeerde B-lymfocyten opnieuw tot een eindconcentratie van 1 x10 6 cellen/ml in de oplossing van Krebs Ringer met 1 mM CaCl2 en voeg een eindconcentratie van 5 μM Fura-2/AM toe.
- Plaats 1 ml cellen op de met poly-L-lysine behandelde coverslips en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator gedurende 30 minuten zodat de EBV-cellen tijdens het laden aan de glazen afdekplaat kunnen blijven plakken.
- Plaats de coverslip in de perfusiekamer en start de perfusie (met een snelheid van 2 ml/min) met krebs ringer's oplossing die 1 mM Ca2+bevat.
- Gebruik een omgekeerde fluorescerende microscoop (uitgerust met een 40x olie-onderdompelingsobjectief (0,17 numeriek diafragma), filters (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) om online metingen op te nemen, met een softwaregestuurde CCD-camerabevestiging (Charge Coupled Device).
- Verkrijg beelden met intervallen van 1 s op een vaste belichtingstijd (100 ms voor zowel 340- als 380-nm excitatiegolflengten. Gebruik beeldvormingssoftware om veranderingen in fluorescentie te analyseren. Meet de gemiddelde pixelwaarde voor elke cel bij excitatiegolflengten van 340 en 380 nm13.
- Om celstimulatie te bereiken, gebruikt u een celperfusiestimulator met 12 kleppen en voegt u verschillende concentraties van 4 cmc toe. De spoelklep bevat de oplossing van Krebs Ringer zonder toegevoegde Ca2+ plus 100 μM La3+ om de calciumafgifte uit intracellulaire winkels alleen te controleren.
- Construeer een dosisresponscurve van 4 cmc versus verandering in [Ca2+], zoals hierboven beschreven.
3. Bereiding van menselijke myotubes uit spierbiopten10,12,15
OPMERKING: Verschillende methoden zijn gebruikt door verschillende laboratoria om satellietcel-afgeleide myoblasten en myotubes te verkrijgen. Hieronder vindt u de beschrijving van de methode die in Basel wordt gebruikt.
- Spoel spierbiopsie met steriel PBS om overtollig bloed te verwijderen en snijd in kleine fragmenten van ongeveer 0,5-1 mm.
- Bereid 6 goed weefselkweekschalen met insert. Voeg 1,5 ml menselijk spiergroeimedium toe aan elke put en 0,5 ml menselijk spiergroeimedium aan elke insert.
OPMERKING: Het groeimedium is als volgt opgebouwd: 500 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium met hoge glucose, of DMEM (4,5 mg / ml), met 10% paardenserum, 5 ng / ml insuline, 3 mM glutamine, 600 ng / ml penicilline G en streptomycine, en 7 mM HEPES, pH 7,4. Commercieel verkrijgbaar skeletspiergroeimedium kan ook worden gebruikt. - Plaats 2-3 kleine spierfragmenten in elke insert(figuur 1A)en plaats kweekschalen in de celkweekincubator (5% CO2,37 °C). Na ongeveer 8-10 dagen kunnen satellietcellen worden gezien die uit en rond de spierbiopsie groeien, bevestigd aan de insert(figuur 1,B en C, pijlen).
- Laat een voldoende aantal cellen uit de biopsie los (na ongeveer 10-14 dagen), trypsine als volgt:
- Verwijder alle kweekmedium, spoel de cellen eenmaal met 1 ml PBS, voeg 0,5 ml trypsine/EDTA-oplossing (0,025% trypsine en 0,01% EDTA) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten.
- Voeg 1 ml groeimedium toe aan de cellen om het effect van trypsine te neutraliseren en breng de satellietcellen over in een nieuwe T25-celkweekkolf; voeg 3 ml groeimedium toe en plaats de cellen in een celkweekincubator (5% CO2,37 °C).
- Verander het groeimedium de volgende dag om de EDTA te verwijderen en verander vervolgens het medium eenmaal per week.
- Wanneer myoblasten ongeveer 75% confluent zijn, trypsiniseren en overbrengen op met laminine behandelde glazen afdekkingsplaat.
OPMERKING: In verhouding moeten cellen die in één T25-kolf groeien, worden overgebracht op één met laminine behandelde glazen afdekplaat met een diameter van 43 mm. De glazen afdekplaat moet worden geplaatst in een weefselkweekplaat met een diameter van 60 mm die 3 ml groeimedium bevat. - Kweekcellen op de glazen afdekking in groeimedium in een celkweekincubator (5% CO2,37 °C) die het medium eenmaal per week ververst. Bij 90% confluentie, schakel over op differentiatiemedium dat als volgt is opgebouwd: hoge glucose DMEM (4,5 mg / ml), 0,5% runderserumalbumine, 10 ng / ml epidermale groeifactor, 0,15 mg / ml creatine, 5 ng / ml insuline, 200 mM glutamine, 600 ng / ml penicilline G en streptomycine, en 7 mM HEPES, pH 7,4). In de handel verkrijgbare differentiatiemedia kunnen ook worden gebruikt. Verander het differentiatiemedium eenmaal per week.
- Na 7-10 dagen in differentiatiemedium zijn multinucleaire myotubes zichtbaar. Beoordeel binnen een week op veranderingen in [Ca2+],zoals hieronder beschreven.
4. [Ca2+]i verhoudingsmetingen bepaald met Fura-2
- Load glass coverslip gekweekte myotubes met Fura-2/AM (eindconcentratie van 5 μM) verdund in DMEM gedurende 30 min bij 37 °C. Verwijder kort het differentiatiemedium uit de glazen coverslip gekweekte cellen en voeg 2 ml vers differentiatiemedium toe. Voeg 10 μL Fura-2 AM toe uit een stamoplossing van 1 mM en incubeer 30 min in een celkweekincubator (5% CO2,37 °C).
- Breng de afdekkingen van het glas over naar de perfusiekamer en spoelcellen met de oplossing van Krebs Ringer die 2 mM CaCl2bevat.
- Voer online [Ca2+ ]metingen uit zoals hierboven beschreven in de EBV-sectie met één cel met behulp van een FLUAR-objectief van 20x waterdompeling (0,17 numeriek diafragma).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[Ca2+]i metingen in populaties van EBV-vereeuwigde B-lymfocyten
Primaire B-lymfocyten drukken de RyR1-isovorm uit die functioneert als een Ca2+ afgiftekanaal tijdens B-cel antigeenreceptor gestimuleerde signaleringsprocessen17. Onsterfelijkheid van B-cellen met EBV, een procedure die routinematig door genetici wordt gebruikt om cellijnen te verkrijgen die genomische informatie van patiënten bevatten, biedt het voordeel van het genereren van cellijnen die mutante RyR1 Ca2 + -kanalen tot expressie brengen bij patiënten met RYR1-mutaties11,13. [Ca2+] i veranderingen veroorzaakt door de toevoeging van specifieke RyR1-agonisten zoals 4-chloor-m-kresol18 en cafeïne kunnen gemakkelijk worden gecontroleerd om vast te stellen of een bepaalde RYR1-mutatie de gevoeligheid voor een agonist, de hoeveelheid calcium die vrijkomt, de rust [Ca2+ ]of andere parameters waarvan is aangetoond dat ze door mutaties worden beïnvloed, verandert. [Ca2+] i veranderingen kunnen worden gevolgd in populaties van Fura-2 geladen cellen in suspensie met een spectrofluorometer of op groepen cellen bevestigd aan glazen coverslips en onderzocht door epifluorescentie. Figuur 2 toont een representatief experiment uitgevoerd op celsuspensies. Vlak voordat ze in de cuvette werden geplaatst, werden cellen gesponnen om Fura-2 te verwijderen die mogelijk was uitgelekt; cellen werden vervolgens geresuspendeerd tot een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml in warme (37 °C) Krebs Ringer-oplossing zonder extra Ca2+ plus 0,5 mM EGTA en in de spectrofluorometer geplaatst. De magneetroerder werd ingeschakeld op positie 4 (de hoogste positie) om cellen in suspensie te houden en fluorescentie werd geregistreerd. Nadat een stabiel spoor was verkregen, werd de geselecteerde agonist toegevoegd (in figuur 2A was dit 300 μM 4-chloor-m-kresol), wat leidde tot een snelle Ca2+ toename die vervolgens langzaam terugviel tot rustniveaus. De voorbijgaande aard van de verandering in fluorescentie is belangrijk omdat het aangeeft (i) dat het geen artefact is dat wordt veroorzaakt door de toevoeging van een fluorescerende of blusverbinding, (ii) dat het niet te wijten is aan calciumbinding aan extracellulaire Fura-2 en (iii) dat de cellen gezond zijn en actief calcium uit hun cytoplasma kunnen verwijderen.
Hetzelfde experiment moet meerdere keren worden herhaald om statistisch te worden geanalyseerd. Voor elke cellijn en elke dag worden de experimenten uitgevoerd en moet de totale hoeveelheid snel vrij te geven calcium in de winkels worden bepaald door toevoeging van de SERCA-remmer thapsigargin11,13,14. Zoals weergegeven in figuur 2Bveroorzaakt de toevoeging van 400 nM thapsigargin een grote calciumtransiënt die een piekfluorescentiewaarde van 2,4 willekeurige eenheden (a.u.) bereikt; dus de totale hoeveelheid calcium die kan vrijkomen uit de intracellulaire voorraden van de EBV-onsterfelijke B-cellen weergegeven in figuur 2B is gelijk aan 2,4 a.u. (thapsigargin peak) - 1,45 a.u. (rustverhouding) of 0,95 Deze fluorescentiewaarde werd als 100% beschouwd bij het construeren van de dosisresponscurve weergegeven in figuur 2C.
Eencellige [Ca2+]i metingen in EBV-vereeuwigde B-lymfocyten
Deze tweede benadering is gebaseerd op de beschikbaarheid van een fluorescentiemicroscoop en microperfusie-opstelling die de stimulatie van een enkele cel of kleine groepen cellen met een bepaalde concentratie van agonist en de gelijktijdige registratie van de fluorescentieveranderingen mogelijk maakt. De spuiten van het microperfusiesysteem zijn geladen met verschillende concentraties van de geselecteerde RyR1-agonist (cafeïne of 4-chloor-m-kresol) die zal worden gebruikt om dosisresponscurven te genereren. In het voorbeeld in figuur 3werden cellen gestimuleerd met 0,5-10 mM cafeïne opgelost in de oplossing van Krebs Ringer die geen toegevoegd calcium plus 100 μM La3+ bevat om de afgifte van Ca2+ uit intracellulaire winkels te controleren. Glazen afdekplaten waarop Fura-2 geladen EBV-vereeuwigde B-lymfocyten zich mochten hechten, worden in de perfusiekamer geplaatst en doordrenkt met Krebs Ringer's oplossing met 1 mM Ca2+. De meeste cellen zullen zich hebben gehecht aan de met poly-L-lysine behandelde coverslip en kleine groepen cellen moeten worden geïdentificeerd en gecontroleerd op Fura-2-belasting. De punt van het perfusiesysteem wordt dicht bij de cellen geplaatst om ze (en niet alle cellen op de coverslip) te baden met cafeïne. Normaal gesproken worden cellen gestimuleerd vanaf de laagste tot de hoogste concentratie cafeïne; voor elke concentratie wordt een nieuwe cel of groep cellen geselecteerd. Ratiometrische fluorescentiemetingen (excitatie bij 340 nm en 380 nm, emissie bij 510 nm) worden elke seconde geregistreerd gedurende maximaal 2 minuten. Enkele beelden worden verkregen vóór de perfusie om een stabiele uitgangswaarde te verkrijgen, vervolgens wordt celperfusie geïnitieerd, eerst door cellen te spoelen met een oplossing van Krebs Ringer's oplossing die 100 μM La3+ gedurende 5 seconden bevat. Dit mag niet leiden tot een verandering in de bloei en is een controle om ervoor te zorgen dat de cel (en) gedurende het hele experiment aan de coverslip blijven plakken; vervolgens wordt een oplossing met de geselecteerde agonistenconcentratie over de cel(en) gespoeld. In het voorbeeld in figuur 3Awerden de cellen gedurende 20 seconden gestimuleerd met 5 mM cafeïne. De getoonde pijl geeft aan wanneer de cafeïneklep werd geopend en dit resulteert in een onmiddellijke toename van de 340/380 nm fluorescerende verhouding. Na 20 seconden sluit de cafeïneklep en worden de cellen gespoeld met de oplossing van Krebs Ringer die 100 μM La3+ bevat; fluorescentie wordt geregistreerd totdat de uitgangswaarde is bereikt. Voor elke cafeïneconcentratie de ΔF, dat wil zeggen de cafeïne-geïnduceerde piek 340/380 nm fluorescentie - de initiële rust 340/380 nm fluorescentie wordt berekend en gebruikt om een dosisresponscurve te construeren zoals weergegeven in figuur 3B. Gemiddelde ΔF van 5-10 cellen wordt gemiddeld voor elke cafeïneconcentratie. De hoeveelheid calcium in intracellulaire winkels kan ook worden gecontroleerd. In dit geval worden cellen gespoeld met Krebs Ringer's oplossing die 0,5 mM EGTA bevat en een oplossing van 1 μM thapsigargin, 1 μM ionomycine en 0,5 mM EGTA wordt met de hand aan de cellen toegevoegd (niet via het microperfusiesysteem omdat ionomycine aan de slang kleeft en niet kan worden afgewassen) en de fluorescentie wordt gedurende ongeveer 4-5 minuten geregistreerd. Om de ΔF te berekenen, wordt een regio van belang (ROI) verkregen waarin een cel wordt geschetst en worden de veranderingen in fluorescentie binnen de ROI berekend met behulp van een beeldvormingssoftware.
Kortom, bij het gebruik van EBV-vereeuwigde B-cellen om de gevoeligheid van de RyR1 voor een specifieke agonist te meten, moeten herhaalde experimenten worden uitgevoerd op cellen van één persoon, op verschillende dagen. Voor metingen aan celpopulaties moet de status van de intracellulaire calciumvoorraden worden beoordeeld en wordt de EC50 tot agonist geïnduceerde calciumafgifte uitgezet ten opzichte van de totale hoeveelheid calcium die uit de winkels kan worden vrijgegeven. Een voordeel van het gebruik van deze aanpak is dat de [Ca2+] respons van miljoenen cellen gemiddeld is; bovendien zijn er geen microperfusiesysteem en fluorescerende microscopen nodig. De methode met één cel maakt het gebruik van een kleiner aantal cellen en de online visualisatie van veranderingen in [Ca2+] van geselecteerde cellen mogelijk.
Eencellige [Ca2+]i metingen in menselijke satellietcel afgeleide myobuizen
Glazen coverslip gekweekte en gedifferentieerde myotubes worden geladen met Fura-2, overgebracht naar de perfusiekamer en gebaad in Krebs Ringer's oplossing met 2 mM Ca2+ zoals hierboven beschreven voor EBV-cellen. De spuiten van het perfusiesysteem worden gevuld met de geselecteerde agonist en myotubes worden gestimuleerd zoals hierboven beschreven. Aangezien niet alle cellen op de coverslip multinucleaire myotubes zijn, is het belangrijk om de juiste cel (en) te selecteren die zal worden gemeten. Kleine groepjes myotubes kunnen tegelijkertijd gestimuleerd worden. In het voorbeeld in figuur 4werd een enkele myotube gespoeld met een oplossing die KCl, verschillende concentraties 4-chloor-m-kresol en ten slotte cafeïne bevatte, maar normaal gesproken worden dosisresponscurven op agonisten geconstrueerd, zoals aangegeven in de vorige sectie, om de agonistengevoeligheid van cellen van verschillende individuen te vergelijken12,15,16 . KCl wordt gebruikt als een manier om het plasmamembraan te depolariseren. In het skelet wordt spierplasmamembraandepolarisatie waargenomen door de spanningsgevoelige DHPR die daardoor een conformatieverandering ondergaat die leidt tot activering en opening van de RyR1. Aan de andere kant zijn 4-chloor-m-kresol en cafeïne directe farmacologische activatoren van de RyR1.
Figuur 1: Generatie van primaire menselijke spierbiopsie-afgeleide myoblastculturen. (A) Kleine fragmenten van spieren (pijlen) worden geplaatst in inserts die 0,5 ml groeimedium bevatten. Na 7-14 dagen zijn satellietcellen te zien (kleine pijlen) naast het spierweefsel en groeien op de bodem van de insert. Afbeelding gemaakt via een 10x objectief (B) en 20x objectief (C). De grijze dozen in paneel A werden gebruikt om de identiteit van de patiënt te bedekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Calciumafgifte-experimenten in EBV-vereeuwigde B-lymfocyten. Ratiometrische [Ca2+]i metingen in een populatie van Fura-2 geladen cellen in suspensie. A) De toevoeging van 300 μM 4-chloor-m-kresol (pijl) veroorzaakt een onmiddellijke toename van het cytoplasmatisch [Ca2+], dat vervolgens binnen 500 seconden weer tot rustniveaus vervalt. In dit voorbeeld is de ΔF geïnduceerd door de toevoeging van 300 μM 4-chloor-m-kresol 1,7 fluorescentie-eenheden- 1,4 fluorescentie-eenheden = 0,3 fluorescentie-eenheden. B) De toevoeging van de SERCA-remmer thapsigargin (400 nM, pijl) veroorzaakt een grotere toename van de Fura-2 fluorescentieverhouding die piekt bij 2,4 fluorescentie-eenheden en vervolgens vervalt tot rustniveaus bij 1,45 fluorescentie-eenheden. De thapsigargin geïnduceerde [Ca2+ ]transiënt vertegenwoordigt de totale hoeveelheid snel vrij te geven calcium in de intracellulaire winkels die aanwezig zijn in de celpopulatie. De verkregen piektransiënt (2,4-1,45 = 0,95 eenheden) wordt gebruikt om het percentage calcium te berekenen dat vrijkomt bij een bepaalde concentratie van 4-chloor-m-kresol. C) Representatieve dosisresponscurven die de ΔF correleren als percentage van de totale hoeveelheid snel vrij te geven calcium in intracellulaire winkels. Voor 300 μM 4-chloor-m-kresol is deze waarde 0,3/0,95x100=31,6%. Elk symbool vertegenwoordigt het gemiddelde± SEM% van 5-10 waarden van EBV vereeuwigde cellen van een controle (gesloten cirkels, stippellijn) en een MHS-individu (gesloten vierkanten, doorlopende lijn) met een RYR1-mutatie. De curven werden gegenereerd met behulp van een sigmoïdale dosis-responscurvefunctie. Panelen A en B zijn aangepast van Girard et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cafeïne-geïnduceerde Ca2+ afgifte in individuele EBV-vereeuwigde B-lymfocyten van een controlepersoon. A) Bovenpanelen, timelapse-afbeeldingen (A) Fasecontrast; (B-E), eencellige [Ca2+]I metingen van fura-2-geladen EBV-onsterfelijk gemaakte lymfocyten: (B) t=0, (C) t=36 s, (D) t=50 s en (E) t=77 s na de toepassing van 5 mM cafeïne. Cellen werden individueel gestimuleerd door de toevoeging van cafeïne verdund in Krebs-Ringer oplossing. Schaal bar=10 μm. Onderste paneel, representatief spoor verkregen na stimulatie van een enkele cel met 5 mM cafeïne (pijl). B) Dosisresponscurven die de cafeïne-afhankelijke verandering in [Ca2+ ]i, uitgedrukt als verandering in fluorescentieverhouding (piekverhouding 340/380 nm−rustverhouding 340/380 nm) weergeven. Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM van de verandering in fluorescentie van 4-15 cellen. De curven werden gegenereerd met behulp van een sigmoïdale dosis-responscurvefunctie. Gesloten vierkanten, stippellijn, controlecellen; gesloten driehoeken, doorlopende lijn, MHS-individu dat een RYR1-mutatie draagt. Deze figuur is een bewerking van Ducreux et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Calciumafgifte gestimuleerd door KCl, 4-chloor-m-kresol en cafeïne in menselijke myotubes van een controlepersoon. Linker panelen: A) fasecontrast (B-H), eencellige intracellulaire Ca2+ metingen van Fura-2-geladen menselijke myotubes. B) rusten [Ca2+ ]i ; C) t=2 s na het aanbrengen van 150 mM KCl. D) t= 2 s na het aanbrengen van 150 μM 4-chloor-m-kresol; E) t=2 s na het aanbrengen van 300 μM 4-chloor-m-kresol; F) t=2 s na het aanbrengen van 600 μM 4-chloor-m-kresol; G) t=2 s na het aanbrengen van 10 mM cafeïne; H) t=20 s na het aanbrengen van cafeïne. Rechterpaneel: Plot van tijd(en) versus fluorescentieverhouding (340/380 nm) in de gestimuleerde cel. Myotubes werden individueel gestimuleerd door toevoeging van de agonist in Krebs-Ringer-buffer met 100 μM La3+, dus de toename van [Ca2+]i vertegenwoordigt alleen de afgifte van calcium uit intracellulaire winkels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protocollen die in dit artikel worden beschreven, zijn met succes gebruikt door verschillende laboratoria om de impact van RYR1-mutaties op calciumhomeostase te bestuderen. De kritische stappen van de benaderingen die in dit artikel worden beschreven, hebben betrekking op steriliteit, celkweekvaardigheden en -technieken en beschikbaarheid van biologisch materiaal. In principe is het gebruik van EBV-vereeuwigde B-lymfocyten eenvoudiger en kan men cellijnen genereren die mutante RyR1-kanalen bevatten. De cellen kunnen vele jaren worden ingevroren en opgeslagen in vloeibare stikstof en culturen kunnen op elk moment opnieuw worden gestart. Bovendien kan men kiezen of calciumhomeostase in celpopulaties of op het niveau van één cel wordt gecontroleerd. De eerste methode is eenvoudiger, vereist geen fluorescentiemicroscoop en stelt de onderzoeker in staat om cellijnen te testen die binnen korte tijd door verschillende individuen zijn gegenereerd. De beperking is de snelheid van celgroei en de beschikbaarheid van een volledig uitgeruste (verwarmde en met magneetroerder) spectrofluorometer. Als alternatieve benadering kan flowcytometrie in combinatie met fluorescerende calciumindicatoren worden gebruikt om calciumfluxen in EBV-onsterfelijke B-lymfocyten te meten; op een dergelijke manier kunnen veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie worden bepaald19. Als een fluorescerende microscoop, perfusiekamer en microperfusiesysteem beschikbaar zijn, heeft beeldvorming met één cel het voordeel dat het gevoeliger is en meer gedetailleerde informatie geeft, waaronder cel-tot-celvariabiliteit, kinetische analyse en identificatie van subcellulaire domeinen die betrokken zijn bij calciumafgifte. Deze laatste aanpak is technisch uitdagender en vereist meer apparatuur.
Er zijn meerdere voordelen aan het gebruik van EBV-onsterfelijke B-lymfocyten, waaronder dat andere parameters terzijde [Ca2 +]i homeostase kunnen worden gemeten. Bijvoorbeeld 4-chloor-m-cresol geïnduceerde verzuring van B-cellen is gebruikt om cellen te onderscheiden van controlepersonen van MHS-patiënten20,21. Niettemin moet men in gedachten houden (i) dat B-cellen niet veel van de eiwitten tot expressie brengen die betrokken zijn bij skeletspierexcitatiecontractiekoppeling die indirect de calciumafgifte kunnen beïnvloeden, (ii) het zijn niet-exciteerbare cellen die dus niet fysiologisch kunnen worden geactiveerd door plasmamembraandepolarisatie, en ten slotte bleek uit een rapport van Monnier et al. dat een mutatie geïdentificeerd bij een patiënt niet tot expressie kwam in EBV-onsterfelijke B-cellen vanwege een cryptische spliceplaats22.
Patiënt afgeleide primaire spiercelculturen zijn gebruikt door verschillende groepen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van het effect van mutaties in verschillende genen die coderen voor eiwitten die betrokken zijn bij calciumhomeostase10,23,24. Deze cellen kunnen worden gedifferentieerd tot multinucleaire myotubes, reageren op plasmamembraandepolarisatie en kunnen worden beoordeeld met elektrofysiologische middelen. Bovendien kunnen ze worden vereeuwigd om cellijnen te verkrijgen die RYR1-mutatiesdragen 25, hoewel de procedure veel complexer is dan voor B-lymfocyten. Hoewel het ook waar is dat de spiercellen langzaam groeien en de tijd die nodig is van het nemen van een biopsie tot het hebben van een voldoende aantal cellen meer dan een maand kan zijn, is het ook mogelijk om de kleine stukjes spierbiopten op te slaan in vriesmedium in vloeibare stikstof om jaren later myoblasten te verkrijgen. De lange kweektijden hebben het extra risico op besmetting door bacteriën, gisten of schimmels en zodra een voldoende groot aantal myoblasten is verkregen, is het belangrijk om ze in te vriezen en op te slaan in vloeibare stikstof. Ons laboratorium heeft met succes dezelfde techniek toegepast die hierboven is beschreven voor myotubes, om calciumveranderingen te bestuderen in van de menselijke huid afgeleide fibroblasten die zijn getransduceerd met myoD en gedifferentieerd in myotubes26. Dit werd gedaan om het functionele effect van RYR1-mutaties te bestuderen wanneer spierbiopsie-afgeleide myoblasten niet beschikbaar waren. Wat B-lymfocyten betreft, is 4-chloor-m-cresol geïnduceerde verzuring van myotubes van patiënten met RYR1-mutaties gekoppeld aan MHS met succes getest27.
Kortom, het gebruik van biologisch materiaal van patiënten om de genotype-fenotype correlatie te bestuderen heeft veel voordelen het nadeel en kan met succes worden gebruikt om het effect van mutaties in RYR1 te bestuderen. Bij het gebruik van deze aanpak is het echter belangrijk om in gedachten te houden dat mutaties in andere genen de calciumhomeostase kunnen beïnvloeden; daarom moet het gebruik van cellen uit verschillende families met dezelfde mutatie en van familieleden die de RYR1-mutatie niet als controles herbergen, worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk beschreven in dit manuscript werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Science Foundation (SNF) en de Swiss Muscle Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
