Summary
כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.
Abstract
יותר מ -700 גרסאות בגן RYR1 זוהו בחולים עם הפרעות עצביות-שריריות שונות כולל רגישות היפרתרמיה ממאירה, מיופתיות ליבה ומיופתיה centronuclear. בגלל פנוטיפים מגוונים הקשורים מוטציות RYR1 זה בסיסי לאפיין את ההשפעות התפקודיות שלהם כדי לסווג וריאנטים נישאים על ידי חולים להתערבויות טיפוליות עתידיות ולזהות וריאנטים שאינם פתוגניים. מעבדות רבות התעניינו בפיתוח שיטות לאפיון תפקודי של מוטציות RYR1 המתבטאות בתאי המטופלים. לגישה זו יתרונות רבים, כולל: מוטציות מתבטאות באנדוגניות, RyR1 אינו מתבטא יתר על המידה, השימוש בתאי RyR1 הטרולוגיים המבטאים נמנע. עם זאת, מאז חולים עשויים להציג מוטציות בגנים שונים מלבד RYR1, חשוב להשוות תוצאות מחומר ביולוגי מאנשים מחסה אותה מוטציה, עם רקע גנטי שונה. כתב היד הנוכחי מתאר שיטות שפותחו כדי לחקור את ההשפעות התפקודיות של גרסאות RYR1 המובעות באנדוגניות ב: (א) וירוס אפשטיין בר הנציח לימפוציטים B אנושיים ו -(ב) תאי לווין הנגזרים ביופסיות שרירים ומובחנים לתוך מיוטיוב. שינויים בריכוז הסידן התאי המופעלים על ידי תוספת מפעילי RyR1 פרמקולוגיים מנוטרים לאחר מכן. סוג התא שנבחר נטען עם מחוון סידן פלואורסצנטי יחסטרי ושינויים תאיים [Ca2+] מנוטרים או ברמת התא הבודד על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או באוכלוסיות תאים באמצעות ספקטרופלואורומטר. המנוחה [Ca2+], עקומות תגובת מינון אגוניסטיות משווות לאחר מכן בין תאים משליטה בריאה וחולים מחסה וריאנטים RYR1 המוביל תובנה לתוך ההשפעה התפקודית של גרסה נתונה.
Introduction
עד כה זוהו יותר מ-700 גרסאות RYR1 באוכלוסייה האנושית וקשורות להפרעות נוירו-שריריות שונות, כולל רגישות היפרתרמיה ממאירה (MHS), פעילות גופנית המושרה rhabdomyolysis, מחלת ליבה מרכזית (CCD), מחלת רב-מיני-קור (MmD), מיופתיה סנטרונוקלארית (CNM)1,2,3 ; עם זאת, מחקרים לאפיון ההשפעות התפקודיות שלהם מפגרים ורק כ -10% מהמוטציות נבדקו באופן פונקציונלי. ניתן להשתמש בגישות ניסיוניות שונות כדי להעריך את ההשפעה של גרסה RyR1 נתון, כולל transfection של תאים הטרולוגיים כגון HEK293 ו COS-7 תאים עם קידוד plasmid עבור WT מוטציה RYR1 cDNA4,5, טרנסדוקציה של פיברובלסטים עכבר דיפדי עם plasmids וקטורים קידוד עבור WT מוטציה RYR1 cDNA, ואחריו טרנסדוקציה עם myo-D ובידול לתוך myotubes6 דור של מודלים חייתיים מהונדסים הנושאים מוטציה RyR1s7,8,9, אפיון תאים מחולים המבטאים את גרסת RYR1 אנדוגני10,11,12. שיטות כאלה עזרו לקבוע כיצד מוטציות שונות משפיעות מבחינה פונקציונלית על ערוץ RyR1 Ca2+ .
כאן, שיטות שפותחו כדי להעריך את ההשפעות הפונקציונליות של מוטציות RYR1 מתוארים. פרמטרים שונים של הומאוסטזיס סידן תאי נחקרים בתאים אנושיים מבטאים אנדוגני את ערוץ הסידן RyR1, כולל מיוטיוב ווירוס אפסטין בר (EBV) לימפוציטים מונצחים B. תאים מתקבלים מחולים, מורחבים בתרבית ועמוסים במדדי סידן פלואורסצנטיים יחסטריים כגון Fura-2 או indo-1. פרמטרים אשר דווחו להיות שונה בגלל מוטציות RYR1 פתוגניים כולל מנוחה [Ca2 +], הרגישות אגוניסטים רוקח שונים ואת הגודל של מאגרי Ca2 + תאי נמדדים או ברמת התא הבודד, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, או באוכלוסיות תאים באמצעות פלואורימטר. לאחר מכן, התוצאות המתקבלות בתאים מנשאי מוטציה משווות את התוצאות של בני משפחה בשליטה בריאה. גישה זו הוכיחה כי: (i) מוטציות רבות הקשורות ל- MHS מובילות לעלייה במנוחה [Ca2+] ומעבר שמאלה בעקומת תגובת המינון להפעלה של דה-קוטביות הנגרמת על ידי KCl או להפעלת RyR1 פרמקולוגית עם 4-כלורו-m-קרסול10,11,12,13; (ii) מוטציות הקשורות ל- CCD מובילות לירידה בשיא [Ca2+] שפורסמו על ידי הפעלה פרמקולוגית של RyR1 וירידה בגודל אם Ca2 + תאיים חנויות12,13,14,15; (iii) גרסאות מסוימות אינן משפיעות על Ca2 + הומאוסטזיס13. היתרונות של גישה ניסיונית זו הם: חלבון RyR1 אינו מבוטא יתר על המידה ורמות פיזיולוגיות קיימות, ניתן להנציח תאים (הן תאי שריר והן לימפוציטים B) המספקים קווי תאים המכילים מוטציות. חסרונות מסוימים מתייחסים לעובדה כי חולים עשויים לשאת מוטציות ביותר מחלבונים קידוד גן אחד המעורבים סידן הומאוסטזיס ו /או צימוד התכווצות עירור (ECC) וזה עלול לסבך מסקנות ניסיוניות. לדוגמה, שתי גרסאות JP-45 זוהו ב- MHS ואוכלוסיית הבקרה ונוכחותם הוכחו כמשפיעות על הרגישות של קולטן הדיהידרופרידין (DHPR) להפעלה16. חולים צריכים להיות זמינים, חומר ביולוגי צריך להיות שנאסף טרי ויש לקבל היתרים אתיים מוועדת האתיקה המקומית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקולים המתוארים להלן תואמים את הנחיות האתיקה של Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. הכנת אפשטיין בר מונצח B-לימפוציט קווים11
- לאחר הסכמה מדעת, לאסוף 30 מ"ל של דם שלם בצינורות סטריליים שטופלו EDTA מן proband נושא מוטציה RYR1 ומבני משפחה בריאים ללא מוטציה.
הערה: שמור על כל הפתרונות סטריליים ועבוד במכסה המנוע של תרבית הרקמות. - לבודד תאים מונונוקלאריים מדם שלם על ידי צפיפות של מדיית צנטריפוגה הדרגתית (למשל, פיקול-היפק, .077 גרם/ ליטר).
- מניחים 30 מ"ל של דם סטרילי בצינור סטרילי חרוט 50 מ"ל.
- מניחים את הקצה של פיפטת פסטר המכילה את מדיית צנטריפוגת שיפוע הצפיפות בתחתית הצינור ושכבה 20 מ"ל סטרילית של תמיסת מדיה שיפועית בצפיפות לאט מתחת לדם.
- צנטריפוגה למשך 30 דקות ב-900 x גרם ב-18°-20 מעלות צלזיוס, ללא הפסקה.
הערה: שכבת התא המונונוקלארי מופיעה כטבעת מעוננת באינטרפאזה שבין שכבת המדיה של צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות לבין השכבה העליונה המכילה פלזמה מועשרת בטסיות דם.
- עם פיפטה סטרילית להסיר בעדינות את השכבה הבין-פאזית המכילה תאים מונונוקלאריים (כ 3-5 מ"ל) ולהעביר את הפתרון לצינור חרוט סטרילי נקי 50 מ"ל.
- הוסיפו 20 מ"ל של תמיסת מלח פוספט (PBS) לשטיפת תאים, צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-600 x גרם בטמפרטורת החדר והגדילו מחדש את הכדור ב-PBS. חזור על הפעולה במשך שלוש פעמים בסך הכל; פעולה זו מבטיחה שכל המדיה תוסר.
- לאחר השטיפה האחרונה, תאים resuspend ב 1-2 מ"ל של מדיום תרבית רקמות (RPMI בינוני בתוספת 10% סרום עגל עוברי, 2 mM L-גלוטמין, ו 100 יחידות של פניצילין וסטרפטומיצין). מקם תאים מונונוקלאריים (כ 1 x 106 תאים) בבקבוק תרבית רקמות T125 המכיל 20 מ"ל של מדיום תרבית רקמות.
- להדביק תאים מונונוקלריים עם וירוס אפשטיין-בר.
- השתמש בנתחי-על מתרביות קווי תאים B95.8 (המכילים 10 יחידות טרנספורמציה של10-2-103 יחידות טרנספורמציה/מ"ל המצוידות ב- -80 °C (70 °F) כמקור ל- EBV.
- Resuspend 1 x 106 תאים מונונוקלאריים בשלב 1.5 ב 20 מ"ל של מדיום תרבית רקמות לחשוף אותם 2 מ"ל של supernatant מקו התא B95.8 בנוכחות cyclosporin A (0.2 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי) לזיהום.
- מניחים את הבקבוקון באינקובטור תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס ומאפשרים לתאים לגדול. אחרי שבוע לשנות את המדיום התרבותי.
הערה: ברגע שתאי B מתחילים להתרבות הם יוצרים גושים מוכרים וגדלים במהירות כך שניתן להרחיב ולהקפיא את התרביות. - לחלץ את ה- DNA הגנומי מן EBV מונצח B-לימפוציט קווים11 כדי לאשר את נוכחות או היעדר המוטציה הנתונה.
2. מדידות תאיות Ca2+
הערה: שינויים בריכוז הסידן התאי של קווי תאי B-לימפוציטים שעברו טרנספורמציה של EBV ניתנים לניטור באוכלוסיות תאים, עם ספקטרופלואורומטר המצויד במפזר מגנטי ומחזיק cuvette להגדיר 37 °C (50 °F). לחלופין, ניתן לעקוב אחר שינויים של Ca2+ בתאים בודדים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בשני המקרים תאים מוסרים מבקבוק תרבית הרקמה, נשטפים פעמיים עם הפתרון של קרבס רינגר (140 מ"מ NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4, 5.5 מ"ר גלוקוז, pH 7.4 המכיל 1 mM CaCl2) ונספר .
- לניסויים באוכלוסיות תאים באמצעות ספקטרופלואורומטר11,13,14
- תאים resuspend בריכוז סופי של 1 x 107 תאים / מ"ל בתמיסה של קרבס רינגר ודגורה ב 37 °C במשך 30 דקות עם ריכוז סופי של 5 μM Fura-2/AM.
- תאי צנטריפוגה ב 900 x g במשך 10 דקות ו resuspened אותם בתמיסה של קרבס רינגר בריכוז של 2 x 106 תאים / מ"ל.
- מדוד שינויים פלואורסצנטיים (יחס 340/380 ננומטר) באמצעות ספקטרופלואורומטר המצויד ב stirrer מגנטי להגדיר במהירות מקסימלית להגדיר 37 °C (37 °F).
- רגע לפני הניסוי ספין תאים ב 900 x g במשך 5 דקות ב microcentrifuge במהירות resuspend הכדור ב 1.5 מ"ל של הפתרון של קרבס רינגר עם 0.5 מ"מ EGTA אבל לא הוסיף Ca2 +.
- מקם את התאים ב cuvette cuvette זכוכית 3 מ"ל ולרשום את יחס פלואורסצנטיות (340 ננומטר / 380 ננומטר עירור, פליטה 510 ננומטר).
- להשיג קו בסיס יציב (כ 30 שניות), להוסיף את הריכוז הנבחר של אגוניסט RyR1 (4-כלורו-m-cresol, או 4-cmc) ולתעד את סידן חולף.
הערה: פתרון מלאי של 300 מ"מ של 4 ס"מ המיוצר ב- DMSO משמש כמחזר מתחיל. פתרון זה יכול להיעשות מראש, aliquoted ומאוחסן ב -20 °C (50 °F) במשך מספר חודשים. - בצע ניסויים בריכוזים שונים של 4 cmc.
הערה: כלול 75 מיקרומטר, 150 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 450 מיקרומטר, 600 מיקרומטר, 750 מיקרומטר עד 1 מ"מ כדי ליצור עקומת תגובת מינון של אגוניסט לעומת שינוי ב [ Ca2 +]. ריכוזי 4-cmc השונים מתקבלים על ידי הוספת הנפח המתאים של 4-cmc מפתרון המלאי, ישירות לתוך cuvette המכיל את התאים הטעונים Fura-2. לדוגמה, לריכוז סופי של 300 μM 4-cmc, 1.5 μL של פתרון המלאי מתווספים cuvette המכיל 1.5 מ"ל של תאים בפתרון של קרבס רינגר. לריכוזים אגוניסטיים נמוכים יותר, פתרון המלאי של 300 מ"מ צריך להיות מדולל ל- 75 מ"מ עם DMSO ואת הנפח המתאים שנוסף ל- cuvette המכיל 1.5 מ"ל של תאים בתמיסה של קרבס רינגר. - הוסף 400 nM thapsigargin לתאים כדי לחשב את הסכום הכולל של Ca2 + נוכח בחנויות תאיות. תעד את השיא Ca2+.
- התווה את שיא הסידן המושרה על ידי ריכוז נתון של 4 cmc לעומת שיא הסידן המושרה על ידי thapsigargin, אשר נחשב 100% ולבנות עקומת תגובה מינון 4 cmc השוואת תאים מ proband וקרוב משפחה בריא
- לניסויים בתאים בודדים13
- לדלל פולי-L-ליצין 1:10 סטרילי H2O ולטפל מראש כיסויי הזכוכית במשך 30 דקות. אפשר לייבש אוויר מתחת למכסה המנוע סטרילי של תרבית הרקמות.
- להשעות מחדש EBV-לימפוציטים B-לימפוציטים לריכוז סופי של 1 x 106 תאים / מ"ל בתמיסה של קרבס רינגר המכיל 1 mM CaCl2 ולהוסיף ריכוז סופי של 5 מיקרומטר Fura-2/AM.
- מניחים 1 מ"ל של תאים על כיסויים שטופלו בפולי-L-ליסין ודגרה ב 37 °C בחממה תרבית תאים לח במשך 30 דקות כדי לאפשר לתאי EBV להיצמד כיסוי זכוכית במהלך הטעינה.
- מניחים את כיסוי תא הזילוף ומתחילים זלוף (בקצב של 2 מ"ל לדקה) עם הפתרון של קרבס רינגר המכיל 1 מ"מ Ca2 +.
- השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (המצויד במטרה טבילת שמן פי 40 (צמצם מספרי 0.17), מסננים (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) כדי להקליט מדידות און-ליין, עם קובץ מצורף למצלמה מצמידה להתקן (CCD) הנשלט על-ידי תוכנה.
- השג תמונות במרווחי זמן של 1 שניות בזמן חשיפה קבוע (100 מילישניות עבור אורכי גל של 340 ו- 380 ננומטר. השתמש בתוכנת הדמיה כדי לנתח שינויים בפלואורסצנטיות. מדוד את ערך הפיקסלים הממוצע עבור כל תא לאורכי גל של 340 ו- 380 ננומטר13.
- כדי להשיג גירוי התא, להשתמש ממריץ זלוף תא עם 12 שסתומים ולהוסיף ריכוזים שונים של 4-cmc. שסתום סומק מכיל הפתרון של קרבס רינגר ללא תוספת Ca2 + בתוספת 100 μM La3+ כדי לפקח על שחרור סידן מחנויות תאיות בלבד.
- לבנות עקומת תגובת מינון של 4-cmc לעומת שינוי ב [Ca2+], כמתואר לעיל.
3. הכנת מיוטיוב אנושי מביופסיותשרירים 10,12,15
הערה: שיטות שונות שימשו מעבדות שונות כדי להשיג myoblasts שמקורם בתא לווין myotubes. להלן תיאור השיטה המשמשת בבאזל.
- לשטוף ביופסיה שריר עם PBS סטרילי כדי להסיר עודף דם לחתוך לרסיסים קטנים של כ 0.5-1 מ"מ.
- הכן 6 מנות תרבית רקמות היטב עם להכניס. הוסף 1.5 מ"ל של בינוני צמיחת שריר אנושי לכל באר ו 0.5 מ"ל של מדיום צמיחת שריר אנושי לכל הוספה.
הערה: מדיום הצמיחה מורכב כדלקמן: 500 מ"ל של המדיום של נשר שונה של Dulbecco עם גלוקוז גבוה, או DMEM (4.5 מ"ג / מ"ל), המכיל 10% סרום סוס, 5 ננוגרם / מ"ל אינסולין, 3 mM גלוטמין, 600 ng / mL פניצילין G וסטרפטומיצין, ו 7 mM HEPES, pH 7.4. ניתן להשתמש גם במדיום צמיחת שריר השלד הזמינה מסחרית. - מניחים 2-3 שברי שרירים קטנים בכל תוספת(איור 1A)ומכניסים מנות תרבות לאינקובטור תרבית התאים (5% CO2, 37 °C (37 °F). לאחר כ-8-10 ימים ניתן לראות תאי לוויין צומחים מתוך הביופסיה של השרירים, המחוברים לתוספת(איור 1,B ו-C, חצים).
- לשחרר מספר מספיק של תאים מן הביופסיה (לאחר כ 10-14 ימים), trypsinize כדלקמן:
- הסר את כל המדיום תרבית, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS, להוסיף 0.5 מ"ל של פתרון טריפסין / EDTA (0.025% טריפסין ו 0.01% EDTA) ודגרה ב 37 °C (5 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של מדיום צמיחה לתאים כדי לנטרל את ההשפעה של טריפסין ולהעביר את תאי הלוויין לתוך בקבוקון חדש של תרבית תא T25; להוסיף 3 מ"ל של בינוני צמיחה ומניחים את התאים באינקובטור תרבית תאים (5% CO2, 37 °C ).
- שנה את מדיום הצמיחה למחרת כדי להסיר את EDTA ולאחר מכן לשנות את המדיום פעם בשבוע.
- כאשר myoblasts הם כ 75% מפגש, trypsinize ולהעביר אותם על כיסוי זכוכית לטיפול למינין.
הערה: כפרופורציה, תאים הגדלים בבקבוק T25 אחד יש להעביר על כיסוי זכוכית אחד בקוטר 43 מ"מ למינין. כיסוי הזכוכית צריך להיות ממוקם בתוך צלחת תרבית רקמות בקוטר 60 מ"מ המכיל 3 מ"ל של מדיום צמיחה. - לגדל תאים על מכסה הזכוכית במדיום צמיחה באינקובטור תרבית התא (5% CO2, 37 °C) שינוי המדיום פעם בשבוע. ב 90% השפעה, לעבור בידול בינוני מורכב כדלקמן: DMEM גלוקוז גבוה (4.5 מ"ג / מ"ל), 0.5% אלבומין סרום בקר, 10 ng / mL גורם גדילה אפידרמיס, 0.15 מ"ג / מ"ל קריאטין, 5 ng / mL אינסולין, 200 mM גלוטמין, 600 ng / mL פניצילין G וסטרפטומיצין, ו 7 mM HEPES, pH 7.4). ניתן להשתמש גם במדיום בידול זמין מסחרית. שנה את מדיום הבידול פעם בשבוע.
- לאחר 7-10 ימים בבידול בינוני, מיוטיובים מרובי נוקלים נראים. הערכה עבור שינויים ב- [Ca2+] בתוך שבוע אחד, כמתואר להלן.
4. [Ca2+] מדידות יחסi נקבעות עם Fura-2
- כיסויי זכוכית עומס למיוטיובים שגדלו עם Fura-2/AM (ריכוז סופי של 5 מיקרומטר) מדולל ב- DMEM למשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F). בקצרה, להסיר את מדיום הבידול מן זכוכית מכסה תאים גדל ולהוסיף 2 מ"ל בינוני בידול טרי. הוסף 10 μL של Fura-2 AM מפתרון מלאי של 1 mM ודגרה 30 דקות בחממה תרבית תא (5% CO2,37 °C (37 °C).
- העבר כיסוי זכוכית לתא הזלוף ושטוף תאים עם הפתרון של קרבס רינגר המכיל 2 מ"מ CaCl2.
- בצע מדידות און-ליין [Ca2+] כמתואר לעיל בסעיף תא בודד EBV עם המטרה FLUAR טבילת מים 20x (צמצם מספרי 0.17).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[Ca2+]i מדידות באוכלוסיות של לימפוציטים B מונצחים EBV
לימפוציטים B-לימפוציטים ראשוניים מבטאים את איזופורם RyR1 המתפקד כערוץ שחרור Ca2 + במהלך קולטן אנטיגן של תאי B מגורה תהליכי איתות17. הנצחה של תאי B עם EBV, הליך המשמש באופן שגרתי על ידי גנטיקאים כדי להשיג קווי תאים המכילים מידע גנומי של חולים, מספק את היתרון של יצירת קווי תאים המבטאים מוטציה RyR1 Ca2 + ערוצים בחולים מחסה מוטציות RYR111,13. [כ-2+] i שינויים שנגרמו על ידי תוספת של אגוניסטים ספציפיים RyR1 כגון 4-כלורו-m-cresol18 וקפאין ניתן לפקח בקלות על מנת לקבוע אם מוטציה RYR1 נתון משנה את הרגישות לאגוניסט, את כמות הסידן ששוחרר, את המנוחה [Ca2+], או פרמטרים אחרים שהראו להיות מושפעים על ידי מוטציות. [כ-2+] i שינויים ניתן לפקח או באוכלוסיות של תאים טעונים Fura-2 בהשעיה עם ספקטרופלואורומטר או על קבוצות של תאים המחוברים כיסויי זכוכית ונבדק על ידי אפיפלואורסצנטיות. איור 2 מראה ניסוי מייצג שבוצע על השעיות תאים. מיד לפני שהוצבו בקובט, התאים סובבו כדי להסיר את Fura-2 שייתכן שדלף החוצה; לאחר מכן התאים הוכנסו לריכוז סופי של 1 x 106 תאים/מ"ל בתמיסה חמה (37°C) של קרבס רינגר, ללא תוספת Ca2+ בתוספת 0.5 מ"מ EGTA ומוצבים בספקטרופלואורומטר. המערבב המגנטי הוחלף למיקום 4 (המיקום הגבוה ביותר) כדי לשמור על תאים בהשעיה ופלואורסצנטיות נרשמה. לאחר שהתקבל עקבות יציבים, נוספה האגוניסטית שנבחרה (באיור 2A זה היה 300 מיקרומטר 4-כלורו-מ-קרסול) מה שהוביל לעלייה מהירה של Ca2+ אשר ירדה לאט חזרה לרמות המנוחה. האופי החולף של השינוי בפלואורסצנטיות חשוב שכן הוא מציין (i) כי הוא אינו חפץ הנגרם על ידי הוספת תרכובת פלואורסצנטית או מרווה, (ii) כי זה לא בגלל סידן מחייב Fura-2 חוץ תאי ו (iii) כי התאים בריאים והוא יכול להסיר באופן פעיל סידן מן הציטופלסמה שלהם.
אותו ניסוי צריך לחזור על עצמו מספר פעמים כדי שניתח אותו סטטיסטית. עבור כל קו תא וכל יום, הניסויים מתבצעים ואת הכמות הכוללת של סידן שחרור במהירות בחנויות צריך להיקבע על ידי הוספת מעכב SERCA thapsigargin11,13,14. כפי שניתן לראות באיור 2B, התוספת של 400 ננומטר thapsigargin גורמת לסידן ארעי גדול להגיע לערך פלואורסצנטי שיא של 2.4 יחידות שרירותיות (a.u.); לפיכך הכמות הכוללת של סידן שניתן לשחרר מהחנויות התאיות של תאי B המונצחים EBV המוצגים באיור 2B שווה 2.4 a.u. (שיא thapsigargin) - 1.45 בבוקר (יחס מנוחה) או 0.95 ערך פלואורסצנטי זה נחשב 100% בעת בניית עקומת תגובת המינון המוצגת באיור 2C.
תאים בודדים [Ca2+]i מדידות בלימפוציטים B מונצחים EBV
גישה שנייה זו מסתמכת על זמינותו של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומיקרופרפוזיה שהוקמה ומאפשרת גירוי של תא בודד או קבוצות קטנות של תאים עם ריכוז נתון של אגוניסט והקלטה סימולטנית של השינויים הפלואורסצנטיים. המזרקים של מערכת microperfusion עמוסים בריכוזים שונים של אגוניסט RyR1 שנבחר (או קפאין או 4-כלורו-m-cresol) אשר ישמש ליצירת עקומות תגובת מינון. בדוגמה המוצגת באיור 3, תאים היו מגורה עם 0.5-10 mM קפאין מומס בתמיסה של קרבס רינגר המכיל סידן נוסף בתוספת 100 μM La3+ על מנת לפקח על שחרור Ca2 + מחנויות תאיות. כיסויי זכוכית שעליהם הורשו לחבר לימפוציטים B מונצחים של Fura-2 שהונצחו EBV ממוקמים בתא הזלוף ומונעים בתמיסה של קרבס רינגר המכילה 1 מ"מ Ca2+. רוב התאים ידבקו בכיסויים שטופלו בפולי-ל-ליסין ויש לזהות קבוצות קטנות של תאים ולבדוק אם יש לטעון פורה-2. קצה מערכת ההשתפכות ממוקם קרוב לתאים כדי לרחוץ אותם (ולא את כל התאים על כיסוי) עם קפאין. בדרך כלל תאים מגורה החל מהנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר של קפאין; עבור כל ריכוז, נבחרים תא או קבוצת תאים חדשים. מדידות פלואורסצנטיות רצומטריות (עירור ב-340 ננומטר ו-380 ננומטר, פליטה ב-510 ננומטר) נרשמות בכל שנייה למשך עד 2 דקות. כמה תמונות מתקבלות לפני זלוף על מנת להשיג בסיס יציב, לאחר מכן זלוף התא מופעל, תחילה על ידי שטיפה תאים עם פתרון של קרבס רינגר המכיל 100 μM La3 + במשך 5 שניות. זה לא אמור לגרום לשינוי פלורסנס והוא בקרה כדי להבטיח כי התאים(ים) מקל על כיסוי לאורך כל הניסוי; לאחר מכן, פתרון המכיל את הריכוז האגוניסטי שנבחר מסומק מעל התאים. בדוגמה המוצגת באיור 3A, התאים היו מגורה עם 5 mM קפאין במשך 20 שניות. החץ המוצג מציין מתי שסתום הקפאין נפתח וזה גורם לעלייה מיידית ביחס הפלואורסצנטי של 340/380 ננומטר. לאחר 20 שניות, שסתום הקפאין נסגר, ותאים הם סמוקים עם הפתרון של קרבס רינגר המכיל 100 μM La3 +; פלואורסצנטיות נרשמת עד להגעה לקו הבסיס. עבור כל ריכוז קפאין ΔF, כלומר קפאין המושרה שיא 340/380 ננומטר פלואורסצנטיות - הנחות הראשונית 340/380 ננומטר פלואורסצנטיות מחושבת ומשמשת לבניית עקומת תגובת מינון כפי שמוצג באיור 3B. ממוצע ΔF מ 5-10 תאים הוא ממוצע עבור כל ריכוז קפאין. ניתן גם לפקח על כמות הסידן במאגרים תאיים. במקרה זה, תאים נשטפים עם הפתרון של קרבס רינגר המכיל 0.5 mM EGTA ופתרון של 1 μM thapsigargin, 1 μM ionomycin ו 0.5 mM EGTA מתווסף ביד לתאים (לא דרך מערכת microperfusion כמו ionomycin מקלות לאמבטיה ולא ניתן לשטוף) ואת פלואורסצנטיות נרשמת כ 4-5 דקות. כדי לחשב את ה- ΔF, מתקבל אזור עניין (ROI) המתאר תא והשינויים בפלואורסצנטיות בתוך ה- ROI מחושבים באמצעות תוכנת הדמיה.
לסיכום, בעת שימוש EBV מונצח B-תאים כדי למדוד את הרגישות של RyR1 לאגוניסט מסוים, ניסויים חוזרים ונשנים צריכים להתבצע על תאים מאדם אחד, בימים שונים. עבור מדידות על אוכלוסיות התאים, יש להעריך את מצבן של מאגרי הסידן התאיים ואת שחרור הסידן המושרה של EC50 לאגוניסט ביחס לכמות הכוללת של סידן שניתן לשחרר מהחנויות. אחד היתרונות של שימוש בגישה זו הוא שהתגובה [Ca2+] של מיליוני תאים היא ממוצעת; בנוסף, אין צורך במערכת מיקרופרפוזיה ומיקרוסקופים פלואורסצנטיים. שיטת התא הבודד מאפשרת שימוש במספר קטן יותר של תאים ובפריט חזותי מקוון של שינויים ב- [Ca2+] של תאים נבחרים.
תא יחיד [Ca2+]i מדידות בתא לווין אנושי נגזר myotubes
כיסויי זכוכית הגדלים ומבדלים מיוטיובים עמוסים ב-Fura-2, מועברים לתא הזלוף ושטופים בתמיסה של קרבס רינגר המכילה 2 מ"מ Ca2+ כמתואר לעיל לתאי EBV. המזרקים של מערכת הזילוף מלאים אגוניסט שנבחר myotubes מגורה כמתואר לעיל. מכיוון שלא כל התאים על כיסוי הם מיוטיובים רב-גרעיניים, חשוב לבחור את התאים המתאימים שיימדדו. קבוצות קטנות של myotubes ניתן לעורר בו זמנית. בדוגמה המוצגת באיור 4, מיוטיוב יחיד נשטף עם פתרון המכיל KCl, ריכוזים שונים של 4-כלורו-m-cresol ולבסוף קפאין, עם זאת, בדרך כלל עקומות תגובה במינון אגוניסטים בנויים, כפי שצוין בסעיף הקודם, על מנת להשוות את הרגישות האגוניסטית של תאים מאנשים שונים12,15,16 . KCl משמש כדרך כדי depolarize קרום הפלזמה. בשלד, דה-קוטביות קרום פלזמה שריר מורגש על ידי מתח חישת DHPR אשר ובכך עובר שינוי קונפורמציה המוביל להפעלה ופתיחת RyR1. מצד שני, 4-כלורו-m-cresol וקפאין הם מפעילים פרמקולוגיים ישירים של RyR1.
איור 1: יצירת תרביות מיובלסט ראשוניות שמקורן בביופסיה של שרירים אנושיים. (A)שברי שרירים קטנים (חצים) ממוקמים בתוספות המכילות מדיום צמיחה של 0.5 מ"ל. לאחר 7-14 ימים ניתן לראות תאי לוויין (חצים קטנים) בסמוך לרקמת השריר וגדלים בתחתית ההוספה. תמונה שצולמה דרך מטרה 10x (B) ו 20x אובייקט (C). הקופסאות האפורות בלוח א' שימשו לכיסוי זהות המטופל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניסויי שחרור סידן בלימפוציטים B מונצחים EBV. רצומטרי [Ca2+]i מדידות באוכלוסייה של תאים טעונים Fura-2 בהשעיה. A) התוספת של 300 מיקרומטר 4-כלורו-m-cresol (חץ) גורמת לעלייה מיידית בציטופלסמי [Ca2+], אשר לאחר מכן נרקב בחזרה לרמות מנוחה בתוך 500 שניות. בדוגמה זו ΔF המושרה על ידי תוספת של 300 מיקרומטר 4-כלורו-m-cresol הוא 1.7 יחידות פלואורסצנטיות - 1.4 יחידות פלואורסצנטי = 0.3 יחידות פלואורסצנטיות. B) התוספת של thapsigargin מעכב SERCA (400 ננומטר, חץ) גורם לעלייה גדולה יותר ביחס פלואורסצנטיות Fura-2 אשר מגיע לשיא של 2.4 יחידות פלואורסצנטיות, ולאחר מכן נרקב לרמות מנוחה ב 1.45 יחידות פלואורסצנטיות. thapsigargin המושרה [Ca2+] ארעי מייצג את הכמות הכוללת של סידן המשתחרר במהירות בחנויות התאיות הקיימות באוכלוסיית התא. שיא ארעי המתקבל (2.4-1.45 = 0.95 יחידות) משמש לחישוב אחוז הסידן ששוחרר על ידי ריכוז נתון של 4-כלורו-m-cresol. C) עקומות תגובת מינון מייצגות בקורלציה ΔF כאחוז מהכמות הכוללת של סידן המשתחרר במהירות בחנויות תאיות. עבור 300 מיקרומטר 4-כלורו-m-cresol ערך זה הוא 0.3/0.95x100 = 31.6%. כל סמל מייצג את הממוצע± SEM% של 5-10 ערכים תאים מונצחים EBV מתוך פקד (עיגולים סגורים, קו מנוקד) ואדם MHS (ריבועים סגורים, קו רציף) הנושא מוטציה RYR1. העקומות נוצרו באמצעות פונקציית עקומת תגובת מינון סיגמויאלית. לוחות A ו- B מותאמים מג'רארד ואח'11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שחרור של Ca2+ המושרה בקפאין בלימפוציטים B מונצחים בודדים מאדם שליטה. A) לוחות עליונים, תמונות לשגות זמן (A)חדות פאזה; (B-E), תא יחיד [Ca2+]אני מדידות של לימפוציטים מונצחים EBV-2-טעון: (B) t = 0, (C) t = 36 s, (D) t = 50 s ו - (E) t = 77 s לאחר היישום של 5 mM קפאין. תאים היו מגורה בנפרד על ידי תוספת של קפאין מדולל בתמיסת קרבס-רינגר. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לוח תחתון, עקבות מייצגים שהתקבלו לאחר גירוי של תא בודד עם 5 mM קפאין (חץ). B) עקומות תגובת מינון המציגות את השינוי התלוי בקפאין ב- [Ca2+]i,המתבטא כשינוי ביחס הפלואורסצנטיות (יחס שיא 340/380 ננומטר−יחס מנוחה 340/380 ננומטר). כל נקודה מייצגת את המשמעות ± SEM של השינוי בפלואורסצנטיות של 4-15 תאים. העקומות נוצרו באמצעות פונקציית עקומת תגובת מינון סיגמויאלית. ריבועים סגורים, קו מנוקד, תאי בקרה; משולשים סגורים, קו רציף, MHS אדם נושא מוטציה RYR1. נתון זה הוא עיבוד של Ducreux ואח'13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שחרור סידן מגורה על ידי KCl, 4-כלורו-m-קרסול וקפאין במיוטיוב אנושי מאדם שליטה. לוחות שמאליים: A) ניגודיות פאזה (B-H), תאי תא יחיד Ca2+ מדידות של מיוטיוב אנושי טעון Fura-2. ב) נח [Ca2+]i ; C) t = 2 s לאחר היישום של 150 mM KCl. D) t = 2 s לאחר היישום של 150 μM 4-כלורו-m-cresol; E) t = 2 s לאחר היישום של 300 μM 4-כלורו-m-קרסול; F) t = 2 s לאחר היישום של 600 μM 4-כלורו-m-קרסול; ז) t=2 s לאחר היישום של 10 mM קפאין; H) t=20 s לאחר השימוש של קפאין. החלונית הימנית: התוויית זמן (ים) לעומת יחס פלואורסצנטיות (340/380 ננומטר) בתא מגורה. Myotubes היו מגורה בנפרד על ידי תוספת של אגוניסט במאגר קרבס-רינגר המכיל 100 μM La3 +, ובכך הגידול [Ca2 +]אני מייצג רק שחרור של סידן מחנויות תאיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה נוצלו בהצלחה על ידי מספר מעבדות כדי לחקור את ההשפעה של מוטציות RYR1 על הומאוסטזיס סידן. הצעדים הקריטיים של הגישות המתוארות במאמר זה עוסקים בעקרות, מיומנויות וטכניקות פולחן תאים וזמינות של חומר ביולוגי. באופן עקרוני, השימוש בלימפוציטים B מונצחים EBV הוא פשוט יותר ומאפשר אחד ליצור קווי תאים המכילים ערוצי RyR1 מוטנטי. התאים יכולים להיות קפואים ומאוחסנים בחנקן נוזלי במשך שנים רבות ותרבויות ניתן להתחיל מחדש בכל עת. בנוסף, ניתן לבחור אם לפקח על הומאוסטזיס סידן באוכלוסיות תאים או ברמת התא הבודד. השיטה הקודמת פשוטה יותר, אינה דורשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומאפשרת לחוקר לבדוק קווי תאים שנוצרו מאנשים שונים בתוך פרק זמן קצר. המגבלה היא המהירות של צמיחת התא והזמינות של ספקטרופלואורומטר מאובזר (מחומם ועם מערבב מגנטי). כציטומטריית זרימת גישה חלופית בשילוב עם אינדיקטורים סידן פלואורסצנטי ניתן להשתמש כדי למדוד שטפי סידן בלימפוציטים B מונצחים EBV; באופן כזה שינויים בריכוז הסידן התאי ניתן לקבוע19. אם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תא זלוף ומערכת מיקרופרפוזיה זמינים, אז הדמיית תא יחיד יש את היתרון של להיות רגיש יותר ולתת מידע מפורט יותר כולל שונות תא לתא, ניתוח קינטי וזיהוי של תחומים תת-תאיים המעורבים בשחרור סידן. הגישה האחרונה היא טכנית מאתגרת יותר ודורש ציוד נוסף.
ישנם יתרונות מרובים באמצעות לימפוציטים B מונצחים EBV, כולל כי פרמטרים אחרים בצד [Ca2 +]i הומאוסטזיס ניתן למדוד. לדוגמה 4-כלורו-m-cresol המושרה החמצה של תאי B שימש כדי להבדיל תאים מאנשים שליטה מחולים MHS20,21. עם זאת, יש לזכור (i) שתאי B אינם מבטאים רבים מהחלבונים המעורבים בצימוד התכווצות עירור שרירי השלד שעשויים להשפיע בעקיפין על שחרור הסידן, (ii) הם תאים לא נרגשים ולכן לא ניתן להפעילם מבחינה פיזיולוגית על ידי דה-קוטביות של קרום פלזמה, ולבסוף דו"ח של Monnier et al. מצא כי מוטציה שזוהתה בחולה לא באה לידי ביטוי בתאי B מונצחים EBV בגלל אתר splice נסתר22.
תרביות תאי שריר ראשוניות נגזר המטופל שימשו על ידי מספר קבוצות המעוניינות לחקור את ההשפעה של מוטציות בגנים שונים קידוד חלבונים המעורבים בסידן הומאוסטזיס10,23,24. תאים אלה ניתן להבדיל לתוך מיוטיובים רב-גרעיניים, להגיב depolarization קרום פלזמה והוא יכול להיות מוערך על ידי אמצעים אלקטרופיזיולוגיים. בנוסף, הם יכולים להיות מונצחים על מנת להשיג קווי תאים הנושאים מוטציות RYR125, אם כי ההליך הוא הרבה יותר מורכב מאשר עבור B-לימפוציטים. אמנם נכון גם כי תאי השריר גדלים לאט ואת הזמן הדרוש מלקחת ביופסיה יש מספר מספיק של תאים יכול להיות יותר מחודש אחד, ניתן גם לאחסן את חתיכות קטנות של ביופסיות שרירים בינוני קפוא בחנקן נוזלי על מנת לקבל myoblasts שנים מאוחר יותר. הזמנים פולחניים ארוכים יש את הסיכון הנוסף של זיהום על ידי חיידקים, שמרים או תבניות וברגע מספר גדול מספיק של myoblasts הושגו, חשוב להקפיא ולאחסן אותם חנקן נוזלי. המעבדה שלנו יישמת בהצלחה את אותה טכניקה שתוארה לעיל עבור myotubes, כדי לחקור שינויים סידן פיברובלסטים שמקורם בעור אנושי transduced עם myoD מובחן לתוך myotubes26. זה נעשה כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 כאשר myoblasts ביופסיה נגזר שריר לא היו זמינים. באשר לימפוציטים B, 4-כלורו-m-cresol המושרה החמצה של myotubes מחולים עם מוטציות RYR1 הקשורים MHS נבדק בהצלחה27.
לסיכום, השימוש בחומר ביולוגי מחולים כדי לחקור את מתאם הגנוטיפ-פנוטיפ יש יתרונות רבים החיסרון והוא יכול לשמש בהצלחה כדי ללמוד את ההשפעה של מוטציות ב RYR1. עם זאת, בעת שימוש בגישה זו, חשוב לזכור כי מוטציות הקיימות בגנים אחרים עשויות להשפיע על הומאוסטזיס סידן; לכן, יש לבצע שימוש בתאים ממשפחות שונות המטפחות את אותה מוטציה, כמו גם מבני משפחה שאינם מעניקים מחסה למוטציה RYR1 כפקדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
העבודה המתוארת בכתב יד זה נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית השוויצרית למדע (SNF) ומקרן השרירים השוויצרית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
