Summary
ここでは、エプスタインバーウイルスで内因的に発現するRYR1変異の機能的効果を研究するために用いられる方法について、ヒトBリンパ球および筋生検由来衛星細胞をミオチューブに分化した不死生のヒトリンパ球が説明されている。
Abstract
RYR1遺伝子の700以上の変異体は、悪性温熱療法感受性、コアミオパシーおよび中心核筋症を含む異なる神経筋障害を有する患者において同定されている。RYR1突然変異に関連する多様な型素型のために、将来の治療介入のために患者が運んだ変異体を分類し、非病原性変異体を同定するために、その機能的効果を特徴付けるのが基本である。多くの研究室では、患者の細胞に発現するRYR1変異を機能的に特徴付ける方法の開発に関心を持っています。このアプローチは、多くの利点を有する:変異が内因的に発現し、RyR1は過剰発現せず、異種のRyR1発現細胞の使用は避ける。しかし、患者はRYR1を除いて異なる遺伝子に変異を提示する可能性があるため、同じ突然変異を有する個体の生物学的物質の結果を、異なる遺伝的背景を有する場合に比較することが重要である。本稿は、(a)エプスタインバーウイルス不死化ヒトBリンパ球および(b)筋肉生検に由来する衛星細胞および筋管内に分化された、内因的に発現したRYR1変異体の機能的効果を研究するために開発された方法を説明する。次に、薬理学的なRyR1活性化剤の添加によって引き起こされる細胞内カルシウム濃度の変化をモニターする。選択した細胞タイプには、レシオメトリック蛍光カルシウム指標がロードされ、細胞内[Ca2+]変化は、蛍光顕微鏡検査によって単一細胞レベルまたは分光蛍光計を用いた細胞集団のいずれかで監視される。休息[Ca2+]では、アゴニスト用量応答曲線を、健康なコントロールからの細胞と、特定の変異体の機能的効果に関する洞察をもたらすRYR1変異体を有する患者との間で比較される。
Introduction
現在までに700以上のRYR1変異体がヒト集団で同定され、悪性温熱症感受性(MHS)、運動誘発横紋筋融解症、中核疾患(CCD)、マルチミニコア病(MmD)、心筋症(CNM)1、2、3を含む様々な神経筋疾患に関連している;しかし、その機能効果を特徴付ける研究は遅れており、突然変異の約10%だけが機能的にテストされている。異なる実験的アプローチを使用して、特定のRyR1バリアントの影響を評価することができます。 WTおよび変異体RYR1 cDNA4、5に対するプラスミドコードを有するヘクロスミドおよびCOS-7細胞などの異種細胞のトランスフェクションを含む、WTおよび変異型RYR1 cDNAをコードするプラスミドおよびベクターを用いた異端マウス線維芽細胞の導入、続いてmyo-DとのトランスダクションとmyoTubetubeへの分化、変異体RyR1s7、8、9を担持するトランスジェニック動物モデルの生成は、10、11、12の内在的にRYR1変異体を発現する患者からの細胞の特徴付けである。このような方法は、異なる突然変異が機能的にRyR1 Ca2+チャネルに与える影響を確立するのに役立っています。
ここでは、RYR1変異の機能的効果を評価するために開発された方法について説明する。細胞内カルシウム恒常性の様々なパラメータは、ヒト細胞において、ミオチューブやエプスタインバーウイルス(EBV)を含む、YR1カルシウムチャネルを内発的に発現し、Bリンパ球を不死化した。細胞は患者から得られ、培養中に拡大され、フラ-2またはインド-1などのレシオメトリック蛍光カルシウムインジクターを装填する。休養期[Ca2+]を含む病原性RYR1突然変異のために変化することが報告されているパラメータは、異なる薬理学的アゴニストに対する感受性および細胞内Ca2+ストアのサイズは、蛍光顕微鏡を用いて、または蛍光計を用いた細胞集団において、単一細胞レベルで測定される。突然変異担体から得られた細胞で得られた結果は、次いで、健康な対照ファミリーメンバーから得られたものと比較される。このアプローチは、(i)MHSに関連する多くの突然変異が休息[Ca2+]の増加につながり、4-クロロm-クレゾール10、11、12、13でKCl誘導脱分極または薬理学的RyR1活性化のいずれかに用量応答曲線の左へのシフトにつながることを実証した。(ii) CCDに関連する変異は、ライR1の薬理学的活性化によって放出されるピークの減少につながる [Ca2+] 細胞内Ca2+が12,13,14,15を格納する場合のサイズを減少させる;(iii) いくつかの変異体は、Ca2+ホメオスタシス13に影響を与えない。この実験的アプローチの利点は、RyR1タンパク質が過剰発現せず、生理学的レベルが存在し、細胞(筋肉細胞およびBリンパ球の両方)が変異を含む細胞株を提供することができる。いくつかの欠点は、患者がカルシウム恒常性および/または励起収縮結合(ECC)に関与するタンパク質をコードする複数の遺伝子に変異を運ぶ可能性があり、これは実験的結論を複雑にする可能性があるという事実に関連する。例えば、2つのJP-45変異体がMHSおよび対照集団において同定され、それらの存在は、ジヒドロピリジン受容体(DHPR)の感受性に影響を与える16を活性化する。患者は利用可能である必要があり、生物学的材料は新たに収集される必要があり、倫理的許可は地元の倫理委員会から取得する必要があります。
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Protocol
以下に説明するプロトコルは、エティッコムミッションノルトウェスト・ウント・ツェントラルシュヴァイツEKNZの倫理ガイドラインに準拠しています。
エプスタインバー不死化Bリンパ球細胞株の調製11
- インフォームド・コンセントの後、RYR1突然変異を運ぶプロビンから、および変異のない健康な家族からEDTA処理された無菌管に全血の30 mLを集める。
注:すべてのソリューションを無菌に保ち、組織培養フードで作業してください。 - 密度勾配遠心分離媒体(例えば、フィコール・ヒパック、.077 g/L)によって全血から単核細胞を単離する。
- 50 mLの円錐形のチューブに30 mLの無菌血液を入れる。
- 密度勾配遠心分離培地を含むパスツールピペットの先端をチューブの底に置き、血液の下にゆっくりと密度勾配遠心分離培地溶液の無菌の20 mL無菌を置きます。
- 18°-20°Cで900 x g で30分間の遠心分離機、中断なし。
注:単核細胞層は、密度勾配遠心媒体層と血小板濃縮プラズマを含む最上層との間相で白濁リングとして現れます。
- 滅菌ピペットを使用して、単核細胞(約3〜5 mL)を含む相間層を静かに取り除き、溶液をクリーンな50 mLの滅菌結腸管に移します。
- リン酸緩衝塩水(PBS)を20mL加えて細胞をすすいだし、遠心分離機を室温で600xgで10分間、PBSでペレットを再懸濁させた。合計 3 回繰り返します。これにより、すべてのメディアが確実に削除されます。
- 最後の洗浄後、細胞を組織培養培地(RPMI培地に10%の胎児子牛血清、2 mM L-グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン100単位を補充)に再懸濁させる。20 mLの組織培養培地を含むT125組織培養フラスコに単核細胞(約1 x106 細胞)を入れる。
- エプスタインバーウイルスで単核細胞に感染する。
- EBVの供給源としてB95.8細胞株培養物(-80°Cでストックされた102-103変換単位/mLを含む)の上清を使用してください。
- 20mLの組織培養培地中のステップ1.5から1 x106個 の単核細胞を再懸濁し、感染のためのシクロスポリンA(0.2 μg/mL最終濃度)の存在下でB95.8細胞株から2mLの上清に曝露する。
- フラスコを37°Cの細胞培養インキュベーターに入れ、細胞を増殖させます。1週間後に培地を変更する。
注:B細胞が増殖し始めると、認識可能な塊を形成し、培養物を拡大して凍結できるように急速に成長します。 - EBV不死化Bリンパ球細胞株11 からゲノムDNAを抽出し、与えられた変異の有無を確認する。
2. 細胞内Ca2+ 測定
注:EBV形質転換Bリンパ球細胞株の細胞内カルシウム濃度の変化は、磁気スターラーとキュベットホルダーを搭載した分光器数計を37°Cに設定して、細胞集団で監視することができます。 あるいは、Ca2+の変化は、蛍光顕微鏡法により単一細胞でモニターすることができる。いずれの場合も細胞は、組織培養フラスコから除去され、クレブスリンガー溶液(140mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、20mM HEPES、1 mM NaHPO 4、5.5mMグルコース、pH7.41mM CaCl2を含む)で2回洗浄した。
- 分光フルオロメーター11,13,14を用いた細胞集団の実験
- クレブスリンガー溶液中の1 x 107 細胞/mLの最終濃度で細胞を再懸濁し、37°Cで30分間、最終濃度5 μM Fura-2/AMでインキュベートします。
- 遠心分離細胞は900 x g で10分間、2 x 106 細胞/mLの濃度でクレブスリンガー溶液中で再懸濁します。
- 最大速度で設定した磁気撹拌機を搭載した分光蛍光計を用いて蛍光変化(340/380nm)を測定し、37°Cに設定します。
- 実験の直前に、実験はマイクロ遠心分離機で5分間900 x g で細胞を回転させ、0.5 mM EGTAでクレブスリンガーの溶液の1.5 mLでペレットを素早く再懸濁したが、Ca2+は添加しなかった。
- 細胞を3mLガラス分光蛍光計キュベットに入れ、蛍光比(340 nm/380 nm励起、510 nmの発光)を記録します。
- 安定した基線(約30秒)を達成し、選択したRyR1アゴニスト(4-クロロm-クレゾール、または4-cmc)の濃度を加え、カルシウム過渡性を記録します。
注:DMSOで作られた4-cmcの300 mMストック溶液は、開始試薬として使用されます。このソリューションは、事前に作ることができ、数ヶ月間-20°Cで保存します。 - 異なる4-cmc濃度の実験を行います。
注:75 μM、150 μM、300 μM、450 μM、600 μM、750 μM ~ 1 mM を含め、[Ca2+]のアゴニストとの間の変化の線量応答曲線を生成します。異なる4-cmc濃度は、フルラ-2を装填した細胞を含むキュベットに、ストック溶液から4-cmcの適切な体積を加えることによって得られる。例えば、300 μM 4-cmc の最終濃度の場合、1.5 μL のストック溶液が、クレブスリンガーの溶液中の細胞の 1.5 mL を含むキュベットに添加されます。低アゴニスト濃度の場合、300 mMストック溶液はDMSOで75mMに希釈し、適切な容積はクレブスリンガー溶液中の細胞の1.5 mLを含むキュベットに加える必要があります。 - 細胞に400 nMのタプシガジンを加えて、細胞内店舗に存在するCa2+ の総量を計算する。ピーク Ca2+を記録します。
- 100%と考えられるタプシガルギンによって誘発されるピークカルシウムに対して、与えられた4-cmc濃度によって誘導されるピークカルシウムをプロットし、確率と健康な相対からの細胞を比較する4-cmc用量応答曲線を構築する
- 単一細胞の実験用13
- ポリL-リジンを滅菌H2Oで1:10希釈し、ガラスカバーリップを30分間前処理します。無菌組織培養フードの下で空気乾燥を可能にする。
- EBV形質転換Bリンパ球を1 mMCaCl2を含むクレブスリンガーの溶液中の1 x 106細胞/mLの最終濃度に再中断し、5 μMフラ2/AMの最終濃度を加える。
- ポリL-リジン処理カバースリップに1 mLの細胞を置き、37°Cで37°Cで加湿した細胞培養器を30分間インキュベートし、EBV細胞がロード中にガラスカバースリップにくっつくようにします。
- 灌流チャンバにカバースリップを置き、1 mM Ca2+を含むクレブスリンガーの溶液で(2 mL /分の速度で)灌流を開始します。
- 反転蛍光顕微鏡(40x油浸し物(0.17個の開口)を装備)、フィルタ(BP 340/380、FT 425、BP 500/530)を使用して、ソフトウェア制御電荷結合装置(CCD)カメラ取り付け具付きのオンライン測定を記録します。
- 一定の露光時間(340-nm励起波長の両方で100ミリ秒)で1秒間隔で画像を取得します。イメージングソフトウェアを使用して蛍光の変化を分析します。励起波長340および380 nm13の各セルの平均ピクセル値を測定する。
- 細胞刺激を達成するために、12バルブの細胞灌流刺激剤を使用し、4-cmcの異なる濃度を追加します。フラッシュバルブには、Ca2+ に加えて100 μM La3+ を加えたクレブスリンガーの溶液が含まれ、細胞内店舗からのカルシウム放出のみを監視します。
- 上記のように[Ca2+]における4-cmc対変化の用量応答曲線を構築する。
3. 筋肉生検10、12、15からのヒト筋管の調製
注:衛星細胞由来の筋芽細胞と筋管を得るために、さまざまな実験室で異なる方法が使用されています。以下はバーゼルで使用される方法の説明です。
- 無菌PBSで筋肉生検をすすぎ、余分な血液を除去し、約0.5〜1mmの小さな断片に切断する。
- インサートで6井戸組織培養料理を準備します。各井戸にヒトの筋肉成長培地の1.5 mLと各挿入物に人間の筋肉の成長培地の0.5 mLを追加します。
注:成長培地は、高グルコースを有するダルベッコの修飾イーグル培地の500mL、または10%の馬血清、5 ng/mLインスリン、3mMグルタミン、600ng/mLペニシリンGおよびストレプトマイシン、および7mHEPES、p.7.4.p.4.p.p.4.p.4.p.4.p.4.p.4.4を含む。市販の骨格筋成長培地も使用できる。 - 各インサート(図1A)に2〜3個の小さな筋肉片を入れ、培養器を培養インキュベーター(5%CO2、37°C)に入れる。約8〜10日後に、人工衛星細胞が筋肉生検の外に成長し、挿入物(図1、BおよびC、矢印)に取り付けられているのが見える。
- 十分な数の細胞を生検から放出(約10〜14日後)、トリプシン化するには以下のようにします。
- すべての培養培地を取り出し、1 mLのPBSで細胞を1回リンスし、0.5 mLのトリプシン/EDTA溶液(0.025%トリプシンおよび0.01%EDTA)を加え、37°Cで5分間インキュベートします。
- 細胞に1 mLの増殖培地を加えてトリプシンの効果を中和し、衛星細胞を新しいT25細胞培養フラスコに移す。3 mLの増殖培地を加え、細胞を細胞培養インキュベーター(5%CO2、37°C)に入れる。
- 次の日に成長培地を変更してEDTAを削除し、その後週に1回培地を変更します。
- 筋芽細胞が約75%コンフルエントである場合、トリプシン化し、ラミニン処理ガラスカバースリップに移します。
注:1つのT25フラスコで成長する細胞は、直径43mmのラミニン処理ガラスカバースリップに移す必要があります。ガラスカバースリップは、3 mLの成長培地を含む直径60mmの組織培養プレート内に配置する必要があります。 - 培養インキュベーター(5%CO2、37°C)でガラスカバースリップ上の細胞を培養培養器(5%CO2、37°C)で増殖させ、培地を週1回変化させる。90%の合流度で、次のように構成される分化培地に切り替える:高グルコースDMEM(4.5mg/mL)、0.5%ウシ血清アルブミン、 10 ng/mL 表皮成長因子、0.15 mg/mL クレアチン、5 ng/mLインスリン、200 mM グルタミン、600 ng/mL ペニシリン Gおよびストレプトマイシン、および 7 mM HEPES、pH 7.4)。市販の分化培地も使用することができる。分化媒体を週に1回変更します。
- 分化培地で7〜10日後、多核化ミオチューブが見える。以下に説明するとおり、1週間以内に[Ca2+]の変更を評価します。
4. [Ca2+]I比測定は、Fura-2で測定
- DMEMで37°Cで30分間希釈したFura-2/AM(最終濃度5μM)で、ガラスカバースリップを成長させたミオチューブをロードしました。 簡単に言えば、ガラスカバースリップ成長細胞から分化培地を取り出し、2 mL新鮮な分化培地を加える。1 mMのストック溶液から10 μLの相良い-2 AMを加え、培養インキュベーター(5%CO2、37°C)で30分間インキュベートします。
- ガラスカバースリップを灌流チャンバーに移し、2 mM CaCl 2を含むクレブスリンガーの溶液で細胞をすすい込みます。
- 20x水浸水のFLUAR目標(0.17数値開口)を使用して、EBV単細胞セクションで上述したとおりに、オンライン[Ca2+]測定を行います。
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Representative Results
[Ca2+] EBV不死化Bリンパ球の集団におけるi測定
原発性Bリンパ球は、B細胞抗原受容体刺激シグナル伝達プロセス中にCa2+放出チャネルとして機能するRyR1アイソフォームを発現する。EBVを用いたB細胞の不死化は、遺伝学者が患者のゲノム情報を含む細胞株を得るために日常的に使用される手順であり、RYR1変異11、13を収容する患者において変異型RyR1Ca2+チャネルを発現する細胞株を生成する利点を提供する。[Ca2+]i 4-クロロ-m-クレゾール18やカフェインなどの特定のRyR1アゴニストの添加によってもたらされた変化は、与えられたRYR1突然変異がアゴニストに対する感受性、放出されるカルシウムの量、残りの[Ca2+]、または突然変異によって影響を受けることを示している他のパラメータを変化させるかどうかを確立するために容易に監視することができる。[Ca2+]i変化は、分光蛍光計を用いた懸濁液中のFura-2装填細胞の集団、またはガラスカバースリップに取り付けられ、発蛍光によって調べられる細胞群のいずれかで監視することができる。図2は、細胞懸濁液に対して行われる代表的な実験を示す。キュベットに入れられる直前に、細胞を紡ぎ出して漏出した可能性のあるFura-2を除去した。その後、細胞を、追加のCa2+プラス0.5 mM EGTAを含む、温かい(37°C)クレブスリンガー溶液で1 x 106細胞/mLの最終濃度に再懸濁し、分光蛍光計に入れた。磁気スターラーを4位(最高位)に切り替えて細胞を懸濁状態に保ち、蛍光を記録した。安定した痕跡が得られた後、選択されたアゴニストを添加し(図2Aでは300μM 4-クロロm-クレゾール)、急速なCa2+増加を招き、その後ゆっくりと安静レベルまで低下した。蛍光変化の一過性の性質は、(i)蛍光化合物またはクエンチン化化合物の添加によって引き起こされるアーティファクトではないことを示す重要であり、(ii)細胞外フラ2および(iii)細胞が健康であり、細胞質から積極的にカルシウムを除去できることに起因する。
統計的に分析するには、同じ実験を数回繰り返す必要があります。各細胞株および毎日について、実験が行われ、店舗内での急速に放出可能なカルシウムの総量は、SERCA阻害剤のタプシガギン11、13、14を添加することによって決定する必要がある。図2Bに示すように、400 nMのタプシガルギンを添加すると、大きなカルシウム過渡期が2.4任意単位(a.u.)のピーク蛍光値に達する。したがって、図2Bに示すEBV不死化B-細胞の細胞内ストアから放出され得るカルシウムの総量は、2.4a.u(タプシガルギンピーク)~1.45a.u(安静率)または0.95に相当するこの蛍光値は、図2Cに示す線量応答曲線を構築する際に100%と考えられた。
EBV不死化Bリンパ球における単細胞[Ca2+]i測定
この第2のアプローチは、蛍光顕微鏡とマイクロ灌流の設定の可用性に依存し、アゴニストの所定の濃度を有する単一細胞または小群の細胞の刺激と蛍光変化の同時記録を可能にする。マイクロ灌流系の注射器は、選択されたRyR1アゴニスト(カフェインまたは4-クロロm-クレゾールのいずれか)の異なる濃度でロードされ、用量応答曲線を生成するために使用されます。図3に示す例では、細胞を、細胞内の店舗からのCa2+放出を監視するために、カルシウムを加えたカルシウムを含み、100μM La3+を含むクレブスリンガー溶液に溶解した0.5〜10 mMのカフェインで刺激を受けた。Fura-2に装填されたEBV不死化Bリンパ球が付着することを許されたガラスカバーリップは、灌流チャンバーに入れられ、1mMCa2+を含むクレブスリンガーの溶液と浸透している。ほとんどの細胞はポリL-リジン処理カバースリップに付着しており、細胞の小さなグループを特定して、Fura-2の負荷をチェックする必要があります。灌流システムの先端は、カフェインでそれらを浴びるために細胞の近くに配置されます (そして、カバースリップ上のすべての細胞ではありません).通常、細胞はカフェインの最も低い濃度から最も高い濃度に開始して刺激されます。;濃度ごとに、新しい細胞または細胞のグループが選択されます。レシオメトリック蛍光測定(340nmおよび380 nmで励起、510nmで発光)は毎秒2分まで記録されます。いくつかの画像は、安定したベースラインを得るために灌流前に得られ、その後細胞灌流が開始され、最初に100μMLa3+を含むクレブスリンガー溶液の溶液を5秒間洗浄することによって細胞を洗い流す。これは、蛍光の変化を生じるべきではなく、細胞が実験全体を通してカバースリップに固執することを保証するためのコントロールです。その後、選択したアゴニスト濃度を含む溶液が細胞上にフラッシュされます。図3Aに示す例では、細胞を5mMカフェインで20秒間刺激した。示された矢印は、カフェインバルブが開かれた時点を示し、これが340/380 nm蛍光比の即時増加をもたらす。20秒後、カフェインバルブが閉じ、細胞は100 μM La3+を含むクレブスリンガーの溶液で洗い流されます。蛍光はベースラインに達するまで記録される。各カフェイン濃度ΔFについて、すなわちカフェイン誘発ピーク340/380nm蛍光−初期安静340/380nm蛍光が計算され、図3Bに示すように用量応答曲線を構築するために使用される。5~10細胞からの平均ΔFは、各カフェイン濃度について平均される。細胞内店舗のカルシウム量もモニタリングできます。この場合、細胞は0.5 mM EGTAを含むクレブスリンガーの溶液と1μMのタプシガルギンの溶液でリンスされ、1 μMイオノマイシンおよび0.5 mM EGTAが細胞に手作業で添加される(ヨノマイシンがチューブに付着し、洗浄できないマイクロ灌流系を介してではない)ΔFを計算するために、細胞の概要を示す対象領域(ROI)が得られ、ROI内の蛍光の変化をイメージングソフトウェアを用いて計算します。
要約すると、特定のアゴニストに対するRyR1の感受性を測定するためにEBV不死化B細胞を使用する場合、異なる日に1人の個体からの細胞に対して繰り返し実験を行うべきである。細胞集団の測定では、細胞内カルシウムストアの状況を評価する必要があり、EC50 からアゴニストへのカルシウム放出は、店舗から放出できるカルシウムの総量に対してプロットされます。この方法を使用する利点の 1 つは、数百万のセルの [Ca2+] 応答が平均化されるということです。また、マイクロ灌流システムや蛍光顕微鏡は必要ありません。単一セル法では、セル数を少ない数にし、選択したセルの[Ca2+]の変化をオンラインで視覚化できます。
ヒト衛星細胞由来ミオチューブにおける単一細胞[Ca2+]i測定
ガラスカバースリップは、成長し、分化されたミオチューブは、Fura-2を装填し、灌流チャンバーに移され、EBV細胞について上記の2mMCa2+を含むクレブスリンガーの溶液を浴びる。灌流系の注射器は、選択されたアゴニストと筋管で満たされ、上記のように刺激される。カバースリップ上のすべての細胞が多核筋であるわけではないので、測定される適切な細胞を選択することが重要です。ミオチューブの小グループを同時に刺激することができます。図4に示す例では、単一のミオチューブをKCl、4-クロロmクレゾールの異なる濃度、そして最後にカフェインを含む溶液で洗い流したが、しかし、アゴニストに対する通常の用量応答曲線は、前のセクションで示されるように、異なる個体12、15、16からの細胞のアゴニスト感受性を比較するために構築される.KClは、プラズマ膜を脱分極する方法として使用される。骨格では、筋肉血漿膜脱分極は、それによってRyR1の活性化および開放につながる立体構造変化を受ける電圧感知DHPRによって感知される。一方、4-クロロm-クレゾールおよびカフェインは、RyR1の直接薬理学的活性化因子である。
図1:ヒトの初代筋生検由来筋芽細胞培養物の生成(A)0.5mL増殖培地を含むインサートに配置される筋肉の小断片(矢印)7〜14日後に、人工衛星細胞が筋肉組織に隣接し、挿入物の底部に成長(小さな矢印)が見える。10倍の目的(B)と20倍の目的(C)を通して撮影した画像。パネルAの灰色の箱は、患者の身元をカバーするために使用された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:EBV不死化Bリンパ球におけるカルシウム放出実験 レシオメトリック [Ca2+]i は、懸濁液中のフラ-2ロードされた細胞の集団における測定を行う。 A) 300 μM 4-クロロm-クレゾール(矢印)を添加すると、細胞質[Ca2+]が即座に増加し、その後500秒以内に安静レベルに戻ります。この例では、300 μM 4-クロロm-クレゾールを添加することによって誘導されるΔFは、1.7蛍光単位−1.4蛍光単位=0.3蛍光単位である。 B) SERCA阻害剤のタプシガーギン(400 nM、矢印)を添加すると、2.4の蛍光単位でピークに達するフラ-2蛍光比の増加が大きく、その後1.45の蛍光単位で安静レベルまで減衰する。タプシガーギン誘導[Ca2+]過渡性とは、細胞集団中に存在する細胞内ストアにおける急速に放出可能なカルシウムの総量を表す。得られたピーク過渡期(2.4-1.45= 0.95単位)は、4-クロロ-m-クレゾールの所定の濃度によって放出されるカルシウムの割合を計算するために使用されます。 C) 代表的な用量応答曲線は、ΔFを細胞内店舗における急速に放出可能なカルシウムの総量に対する割合として相関する。300 μM 4-クロロm-クレゾールの場合、この値は 0.3/0.95x100=31.6% です。各シンボルは±コントロール(閉じた円、点線)からのEBV不死化細胞からの5〜10の値の平均のSEM%およびRYR1突然変異を運ぶMHS個体(閉じた正方形、連続線)を表します。この曲線は、シグモイド線量応答曲線関数を用いて生成した。パネルAおよびBはジラードら11から適応される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:コントロール個体由来の個々のEBV不死化Bリンパ球におけるカフェイン誘発Ca2+放出A)トップパネル、タイムラプス画像(A)位相コントラスト。(B-E)、単細胞 [Ca2+]Iフラ-2積載 EBV 不死変化リンパ球の測定: (B) t=0, (C) t=36 s, (D) t=50 s および (E) t=77 s 5 mMカフェインの適用後.細胞は、クレブスリンガー溶液で希釈されたカフェインの添加によって個別に刺激された。スケールバー=10 μm。下パネルは、5 mMカフェイン(arrow)を有する単一細胞の刺激後に得られた代表的なトレースである。 B)[Ca2+]iにおけるカフェイン依存変化を示す用量応答曲線は、蛍光比(ピーク比340/380 nm-安静率340/380nm)の変化として表される。各点は、4〜15細胞の蛍光変化の平均±SEMを表す。この曲線は、シグモイド線量応答曲線関数を用いて生成した。閉じた正方形、点線、コントロールセル。閉じた三角形、連続線、RYR1突然変異を運ぶMHS個体。この図は、Ducreuxら13からの適応です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:コントロール個体由来のヒトミオチューブにおけるKCl、4-クロロm-クレゾールおよびカフェインによって刺激されるカルシウム放出。左パネル:A)位相コントラスト(B-H)、単細胞細胞内Ca2+のフラ-2装填ヒトミオチューブの測定B)休養 [Ca2+]i ;C) t=2 s 150 mM KCl. D) t= 2 s の適用後 150 μM 4-クロロm-クレゾールの適用後;E) t=2 s 300 μM 4-クロロ-ムクレゾールの適用後;F) t=2 s 600 μM 4-クロロ-ムクレゾールの適用後;G) t=2 s 10 mM カフェインの適用後;H) t=20 s カフェインの適用後.右パネル: 刺激細胞における時間(複数可)対蛍光比(340/380 nm)のプロット。100μMLa3+を含むクレブスリンガーバッファーにアゴニストを添加することにより、ミオチューブは個別に刺激を受け、従って[Ca2+]iの増加は細胞内ストアからのカルシウムの放出のみを表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本論文に記載されているプロトコルは、いくつかの研究所で、カルシウム恒常性に対するRYR1変異の影響を研究するために有効に活用されている。この論文で概説されているアプローチの重要なステップは、生物材料の無菌性、細胞培養技術および技術および入手可能性を扱う。原則として、EBV不死化Bリンパ球の使用は、より簡単であり、変異型RyR1チャネルを含む細胞株を生成することを可能にする。細胞は、冷凍し、長年液体窒素に保存することができ、培養はいつでも再開始することができます。さらに、カルシウムホメオスタシスを細胞集団で監視するか、単一細胞レベルで監視するかを選択できます。前者の方法は、より簡単であり、蛍光顕微鏡を必要とせず、研究者が短期間で異なる個体から生成された細胞株を試験することを可能にする。制限は、細胞増殖の速度と完全装備(加熱され、磁気攪拌機付き)分光フルオロメーターの可用性です。蛍光カルシウム指標と組み合わせた代替アプローチフローサイトメトリーは、EBV不死化Bリンパ球のカルシウムフラックスを測定するために使用することができます;このような方法で細胞内カルシウム濃度の変化は19を決定することができる。蛍光顕微鏡、灌流室、マイクロ灌流システムが利用可能な場合、単一細胞イメージングはより敏感であり、細胞から細胞への変動性、運動学的分析、カルシウム放出に関与する細胞内領域の同定など、より詳細な情報を提供するという利点があります。後者のアプローチは技術的に難しく、より多くの機器を必要とします。
EBV不死化Bリンパ球を使用することには複数の利点があり、他のパラメータは別として[Ca2+]i恒常性を測定することができる。例えばB細胞の4−クロロm-クレゾール誘導酸性化は、MHS患者20,21からコントロール個体から細胞を分化するために用いられている。それにもかかわらず、B細胞はカルシウム放出に間接的に影響を与える可能性のある骨格筋励起収縮結合に関与するタンパク質の多くを発現しないことに留意しなければならない、(ii)それらは非興奮性細胞であり、したがって、形質膜脱分極によって生理学的に活性化することができず、最後にMonnierらの報告は、患者で同定された突然変異がEBV不死変B細胞で発現していないことを発見した。
患者由来の原発性筋細胞培養は、カルシウム恒常性10,23,24に関与するタンパク質をコードする異なる遺伝子における変異の影響を研究することに関心を持ついくつかのグループによって使用されてきた。これらの細胞は、多核化ミオチューブに分化され、細胞膜脱分極に応答し、電気生理学的手段によって評価することができる。さらに、RYR1突然変異25を担う細胞株を得るために不死化することができるが、この手順はBリンパ球よりもはるかに複雑である。筋肉細胞は成長が遅く、生検を受けることから十分な数の細胞を持つことまで必要な時間が1ヶ月以上になることも事実ですが、数年後に筋芽細胞を得るために、少量の筋肉生検を液体窒素中の凍結培地に保存することも可能です。培養時間が長いと、細菌、酵母、カビによる汚染のリスクが高まり、十分に多くの筋芽細胞が得られるとすぐに、凍結して液体窒素に貯蔵することが重要です。当研究室は、上記と同じ手法をmyotubesに適用し、myoDを導入し、筋管26に分化したヒト皮膚由来線維芽細胞のカルシウム変化を研究することに成功した。これは、筋肉生検由来の筋芽細胞が利用できなかったときにRYR1突然変異の機能的効果を研究するために行われた。Bリンパ球に関しては、MHSに連結したRYR1変異を有する患者から4-クロロm-クレゾール誘発型のミオチューブの酸性化が27に成功して試験された。
結論として、患者からの生物材料を使用して遺伝子型・表現型相関を研究することは、多くの利点を欠点とし、RYR1の突然変異の効果を研究するためにうまく使用することができる。しかし、この方法を使用する場合、他の遺伝子に存在する突然変異がカルシウム恒常性に影響を与える可能性があることを覚えておいてください。したがって、同じ突然変異を持つ異なる家族の細胞の使用と、RYR1突然変異をコントロールとして収容していない家族からの細胞の使用が行われるべきである。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この原稿に記載されている研究は、スイス国立科学財団(SNF)とスイスマッスル財団からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
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