Summary
Ici, les méthodes utilisées pour étudier l’effet fonctionnel des mutations RYR1 exprimées de manière endogène dans les lymphocytes B humains immortalisés par le virus d’Epstein Barr et les cellules satellites dérivées de la biopsie musculaire différenciées en myotubes sont décrites.
Abstract
Plus de 700 variantes du gène RYR1 ont été identifiées chez des patients atteints de différents troubles neuromusculaires, notamment une susceptibilité à l’hyperthermie maligne, des myopathies centrales et une myopathie centronucléaire. En raison des divers phénotypes liés aux mutations RYR1, il est fondamental de caractériser leurs effets fonctionnels pour classer les variantes portées par les patients pour de futures interventions thérapeutiques et identifier les variantes non pathogènes. De nombreux laboratoires se sont intéressés au développement de méthodes pour caractériser fonctionnellement les mutations RYR1 exprimées dans les cellules des patients. Cette approche présente de nombreux avantages, notamment: les mutations sont exprimées de manière endogène, RyR1 n’est pas surexprimé, l’utilisation de cellules hétérologues exprimant RyR1 est évitée. Cependant, étant donné que les patients peuvent présenter des mutations dans différents gènes en dehors de RYR1, il est important de comparer les résultats du matériel biologique d’individus hébergeant la même mutation, avec des antécédents génétiques différents. Le présent manuscrit décrit les méthodes développées pour étudier les effets fonctionnels des variantes de RYR1 exprimées de manière endogène dans: (a) le virus d’Epstein Barr immortalisé les lymphocytes B humains et (b) les cellules satellites dérivées de biopsies musculaires et différenciées en myotubes. Les changements dans la concentration intracellulaire de calcium déclenchés par l’ajout d’un activateur pharmacologique RyR1 sont ensuite surveillés. Le type de cellule sélectionné est chargé d’un indicateur de calcium fluorescent ratiométrique et les changements intracellulaires [Ca2+]sont surveillés soit au niveau de la cellule unique par microscopie à fluorescence, soit dans les populations cellulaires à l’aide d’un spectrofluoromètre. Les courbes dose-réponse agoniste au repos [Ca2+] sont ensuite comparées entre les cellules de témoins sains et les patients hébergeant des variantes de RYR1, ce qui permet de mieux comprendre l’effet fonctionnel d’une variante donnée.
Introduction
À ce jour, plus de 700 variantes de RYR1 ont été identifiées dans la population humaine et liées à divers troubles neuromusculaires, notamment la susceptibilité à l’hyperthermie maligne (MHS), la rhabdomyolyse induite par l’exercice, la maladie du noyau central (CCD), la maladie multi-minicore (MmD), la myopathie centronucléaire (CNM)1,2,3 ; néanmoins, les études visant à caractériser leurs effets fonctionnels sont à la traîne et seulement environ 10% des mutations ont été testées fonctionnellement. Différentes approches expérimentales peuvent être utilisées pour évaluer l’impact d’une variante donnée de RyR1, y compris la transfection de cellules hétérologues telles que les cellules HEK293 et COS-7 avec un codage plasmidique pour le WT et l’ADNc4mutant RYR1,5,la transduction de fibroblastes de souris dyspédiques avec des plasmides et des vecteurs codant pour le WT et l’ADNc RYR1 mutant, suivie d’une transduction avec myo-D et d’une différenciation en myotubes6 , génération de modèles animaux transgéniques porteurs du mutant RyR1s7,8,9, caractérisation de cellules de patients exprimant la variante RYR1 de manière endogène10,11,12. De telles méthodes ont permis d’établir l’impact fonctionnel de différentes mutations sur le canal RyR1 Ca2+.
Ici, les méthodes développées pour évaluer les effets fonctionnels des mutations RYR1 sont décrites. Divers paramètres de l’homéostasie calcique intracellulaire sont étudiés dans des cellules humaines exprimant de manière endogène le canal calcique RyR1, y compris les myotubes et les lymphocytes B immortalisés par le virus d’Epstein Barr (EBV). Les cellules sont obtenues à partir de patients, développées en culture et chargées d’indicateurs de calcium fluorescents ratiométriques tels que Fura-2 ou indo-1. Les paramètres qui ont été signalés comme étant modifiés en raison de mutations pathogènes de RYR1, y compris le repos [Ca2+],la sensibilité à différents agonistes pharmacologiques et la taille des réserves intracellulaires de Ca2+ sont mesurés soit au niveau de la cellule unique, en utilisant la microscopie à fluorescence, soit dans les populations cellulaires à l’aide d’un fluorimètre. Les résultats obtenus dans les cellules des porteurs de mutations sont ensuite comparés à ceux obtenus auprès de membres sains de la famille témoin. Cette approche a démontré que : (i) de nombreuses mutations liées à la MHS entraînent une augmentation du repos [Ca2+] et un déplacement vers la gauche de la courbe dose-réponse à la dépolarisation induite par KCl ou à l’activation pharmacologique de RyR1 avec le 4-chloro-m-crésol10,11,12,13; (ii) les mutations liées au CCD entraînent une diminution du pic [Ca2+]libéré par l’activation pharmacologique du RyR1 et une diminution de la taille si le Ca2+ intracellulaire stocke12,13,14,15; (iii) certaines variantes n’ont pas d’impact sur l’homéostasie Ca2+13. Les avantages de cette approche expérimentale sont: la protéine RyR1 n’est pas surexprimée et des niveaux physiologiques sont présents, les cellules peuvent être immortalisées (à la fois les cellules musculaires et les lymphocytes B) fournissant des lignées cellulaires contenant des mutations. Certains inconvénients sont liés au fait que les patients peuvent être porteurs de mutations dans plus d’un gène codant pour des protéines impliquées dans l’homéostasie du calcium et / ou le couplage de contraction d’excitation (ECC), ce qui peut compliquer les conclusions expérimentales. Par exemple, deux variantes de JP-45 ont été identifiées dans la population MHS et témoin et leur présence a eu un impact sur la sensibilité du récepteur de la dihydropyridine (DHPR) à l’activation16. Les patients doivent être disponibles, le matériel biologique doit être fraîchement collecté et les permis éthiques doivent être obtenus auprès des conseils éthiques locaux.
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Protocol
Les protocoles décrits ci-dessous sont conformes aux directives éthiques de l’Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. Préparation des lignées cellulaires de lymphocytes B immortalisées d’Epstein Barr11
- Après consentement éclairé, prélever 30 mL de sang total dans des tubes stériles traités à l’EDTA dans la bande porteuse d’une mutation RYR1 et chez des membres sains de la famille sans mutation.
REMARQUE: Gardez toutes les solutions stériles et travaillez dans une hotte de culture tissulaire. - Isoler les cellules mononucléaires du sang total par des milieux de centrifugation à gradient de densité (p. ex. Ficoll-Hypaque, 0,077 g/L).
- Placer 30 mL de sang stérile dans un tube stérile conique de 50 mL.
- Placer l’extrémité d’une pipette Pasteur contenant le milieu de centrifugation à gradient de densité au fond du tube et superposer lentement sous le sang 20 mL de solution stérile de milieu de centrifugation à gradient de densité.
- Centrifuger pendant 30 min à 900 x g à 18°-20°C, sans pause.
REMARQUE: La couche cellulaire mononucléaire apparaît comme un anneau trouble à l’interphase entre la couche de milieu de centrifugation du gradient de densité et la couche supérieure contenant du plasma enrichi en plaquettes.
- À l’aide d’une pipette stérile, retirez doucement la couche interphasée contenant des cellules mononucléaires (environ 3 à 5 mL) et transférez la solution dans un tube conique stérile propre de 50 mL.
- Ajouter 20 mL de solution saline tampon phosphate (PBS) pour rincer les cellules, centrifuger pendant 10 min à 600 x g à température ambiante et remettre la pastille en suspension dans du PBS. Répétez l’opération pour un total de trois fois; cela garantit que tous les médias sont supprimés.
- Après le dernier lavage, remettre les cellules en suspension dans 1 à 2 mL de milieu de culture tissulaire (milieu RPMI complété par 10% de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine et 100 unités de pénicilline et de streptomycine). Placer les cellules mononucléaires (environ 1 x 106 cellules) dans une fiole de culture tissulaire T125 contenant 20 mL de milieu de culture tissulaire.
- Infecter les cellules mononucléaires avec le virus d’Epstein-Barr.
- Utiliser des surnageants provenant de cultures de lignées cellulaires B95.8 (contenant10 2à10 3 unités transformatrices/mL stockées à -80 °C) comme source d’EBV.
- Remettre en suspension 1 x 106 cellules mononucléaires de l’étape 1,5 dans 20 mL de milieu de culture tissulaire et les exposer à 2 mL de surnageant de la lignée cellulaire B95,8 en présence de cyclosporine A (concentration finale de 0,2 μg/mL) pour l’infection.
- Placez la fiole dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et laissez les cellules se développer. Après une semaine, changez le milieu de culture.
REMARQUE: Une fois que les cellules B commencent à proliférer, elles forment des amas reconnaissables et se développent rapidement afin que les cultures puissent être étendues et congelées. - Extraire l’ADN génomique des lignées cellulaires B immortalisées par l’EBV11 pour confirmer la présence ou l’absence de la mutation donnée.
2. Mesures intracellulaires de Ca2+
REMARQUE: Les changements dans la concentration intracellulaire de calcium des lignées cellulaires de lymphocytes B transformées par EBV peuvent être surveillés dans les populations cellulaires, avec un spectrofluoromètre équipé d’un agitateur magnétique et d’un porte-cuvette réglés à 37 ° C. Alternativement, les changements de Ca2+ peuvent être surveillés dans des cellules individuelles par microscopie à fluorescence. Dans les deux cas, les cellules sont retirées de la fiole de culture tissulaire, lavées deux fois avec la solution de Krebs Ringer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4,5,5 mM de glucose, pH 7,4 contenant 1 mM caCl2)et comptées.
- Pour les expériences dans les populations cellulaires à l’aide d’un spectrofluoromètre11,13,14
- Remettre en suspension des cellules à une concentration finale de 1 x 107 cellules/mL dans la solution de Krebs Ringer et incuber à 37°C pendant 30 min avec une concentration finale de 5 μM de Fura-2/AM.
- Centrifuger les cellules à 900 x g pendant 10 min et les remettre en suspension dans la solution de Krebs Ringer à une concentration de 2 x 106 cellules/mL.
- Mesurer les changements de fluorescence (rapport 340/380 nm) à l’aide d’un spectrofluoromètre équipé d’un agitateur magnétique réglé à la vitesse maximale et réglé à 37 °C.
- Juste avant l’expérience, les cellules tournent à 900 x g pendant 5 min dans une microcentrifugeuse et remettent rapidement en suspension la pastille dans 1,5 mL de solution de Krebs Ringer avec 0,5 mM d’EGTA mais pas de Ca2+ajouté.
- Placez les cellules dans une cuvette spectrofluoromètre en verre de 3 mL et enregistrez le rapport de fluorescence (excitation de 340 nm/380 nm, émission de 510 nm).
- Obtenir une ligne de base stable (environ 30 secondes), ajouter la concentration sélectionnée d’agoniste RyR1 (4-chloro-m-crésol, ou 4-cmc) et enregistrer le transitoire de calcium.
REMARQUE: Une solution mère de 300 mM de 4-cmc fabriquée en DMSO est utilisée comme réactif de départ. Cette solution peut être faite à l’avance, aliquote et conservée à -20 °C pendant plusieurs mois. - Effectuer des expériences pour différentes concentrations de 4-cmc.
REMARQUE: Inclure 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM à 1 mM pour générer une courbe dose-réponse de l’agoniste par rapport au changement de [Ca2+]. Les différentes concentrations de 4-cmc sont obtenues en ajoutant le volume approprié de 4-cmc de la solution mère, directement dans la cuvette contenant les cellules chargées de Fura-2. Par exemple, pour une concentration finale de 300 μM 4-cmc, 1,5 μL de la solution mère est ajouté à la cuvette contenant 1,5 mL de cellules dans la solution de Krebs Ringer. Pour des concentrations agonistes plus faibles, la solution mère de 300 mM doit être diluée à 75 mM avec du DMSO et le volume approprié ajouté à la cuvette contenant 1,5 mL de cellules dans la solution de Krebs Ringer. - Ajouter 400 nM de thapsigargin aux cellules pour calculer la quantité totale de Ca2+ présente dans les réserves intracellulaires. Enregistrez le pic Ca2+.
- Tracer le pic de calcium induit par une concentration donnée de 4-cmc par rapport au pic de calcium induit par la thapsigargin, qui est considéré comme 100% et construire une courbe dose-réponse de 4-cmc comparant les cellules d’une proband et d’un parent sain
- Pour les expériences sur des cellules individuelles13
- Diluer la poly-L-lysine 1:10 dans H2O stérile et prétraiter les couvercles en verre pendant 30 min. Laisser sécher à l’air libre sous une hotte de culture tissulaire stérile.
- Remettez en suspension les lymphocytes B transformés par EBV à une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL dans la solution de Krebs Ringer contenant 1 mM de CaCl2 et ajoutez une concentration finale de 5 μM de Fura-2/AM.
- Placer 1 mL de cellules sur les couvercles traités à la poly-L-lysine et incuber à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié pendant 30 minutes pour permettre aux cellules EBV de coller au couvercle en verre pendant le chargement.
- Placez le couvercle dans la chambre de perfusion et commencez la perfusion (à raison de 2 mL/min) avec la solution de Krebs Ringer contenant 1 mM de Ca2+.
- Utilisez un microscope fluorescent inversé (équipé d’un objectif d’immersion dans l’huile 40x (ouverture numérique de 0,17), des filtres (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) pour enregistrer des mesures en ligne, avec un dispositif de couplage de charge (CCD) contrôlé par logiciel.
- Acquérir des images à des intervalles de 1 s à un temps d’exposition fixe (100 ms pour les longueurs d’onde d’excitation de 340 et 380 nm). Utilisez un logiciel d’imagerie pour analyser les changements de fluorescence. Mesurer la valeur moyenne des pixels pour chaque cellule à des longueurs d’onde d’excitation de 340 et 380 nm13.
- Pour obtenir une stimulation cellulaire, utilisez un stimulateur de perfusion cellulaire avec 12 valves et ajoutez différentes concentrations de 4-cmc. La valve de rinçage contient la solution de Krebs Ringer sans ajout de Ca2+ plus 100 μM La3+ pour surveiller la libération de calcium des réserves intracellulaires uniquement.
- Construire une courbe dose-réponse de 4-cmc par rapport au changement de [Ca2+], comme décrit ci-dessus.
3. Préparation de myotubes humains à partir de biopsies musculaires10,12,15
NOTE: Différentes méthodes ont été utilisées par différents laboratoires pour obtenir des myoblastes et des myotubes dérivés de cellules satellites. Vous trouverez ci-dessous la description de la méthode utilisée à Bâle.
- Rincer la biopsie musculaire avec du PBS stérile pour éliminer l’excès de sang et couper en petits fragments d’environ 0,5-1 mm.
- Préparez 6 plats de culture tissulaire bien avec insert. Ajouter 1,5 mL de milieu de croissance musculaire humaine à chaque puits et 0,5 mL de milieu de croissance musculaire humaine à chaque insert.
REMARQUE: Le milieu de croissance est composé comme suit: 500 mL du milieu d’Eagle modifié de Dulbecco avec un taux élevé de glucose, ou DMEM (4,5 mg / mL), contenant 10% de sérum de cheval, 5 ng / mL d’insuline, 3 mM de glutamine, 600 ng / mL de pénicilline G et de streptomycine, et 7 mM HEPES, pH 7,4. Un milieu de croissance musculaire squelettique disponible dans le commerce peut également être utilisé. - Placer 2-3 petits fragments musculaires dans chaque insert(Figure 1A)et placer des boîtes de culture dans l’incubateur de culture cellulaire (5% CO2,37 °C). Après environ 8 à 10 jours, on peut voir des cellules satellites se développer hors de la biopsie musculaire et entourant celle-ci, attachée à l’insert(Figure 1,B et C, flèches).
- Libérer un nombre suffisant de cellules de la biopsie (après environ 10-14 jours), trypsiniser comme suit:
- Retirer tout milieu de culture, rincer les cellules une fois avec 1 mL de PBS, ajouter 0,5 mL de solution de trypsine/EDTA (0,025 % de trypsine et 0,01 % d’EDTA) et incuber à 37 °C pendant 5 min.
- Ajouter 1 mL de milieu de croissance aux cellules pour neutraliser l’effet de la trypsine et transférer les cellules satellites dans une nouvelle fiole de culture cellulaire T25; ajouter 3 mL de milieu de croissance et placer les cellules dans un incubateur de culture cellulaire (5% CO2,37 °C).
- Changez le milieu de croissance le lendemain pour supprimer l’EDTA et changez ensuite le milieu une fois par semaine.
- Lorsque les myoblastes sont confluents à environ 75%, essayez-les et transférez-les sur des couvercles en verre traité à la laminine.
REMARQUE: En proportion, les cellules qui poussent dans une fiole T25 doivent être transférées sur un couvercle en verre traité à la laminine de 43 mm de diamètre. Le couvercle en verre doit être placé dans une plaque de culture tissulaire de 60 mm de diamètre contenant 3 mL de milieu de croissance. - Cultiver des cellules sur le revêtement en verre dans un milieu de croissance dans un incubateur de culture cellulaire (5% CO2,37 ° C) en changeant le milieu une fois par semaine. À 90 % de confluence, passer à un milieu de différenciation composé comme suit : DMEM à haute teneur en glucose (4,5 mg/mL), albumine sérique bovine à 0,5 %, facteur de croissance épidermique de 10 ng/mL, créatine à 0,15 mg/mL, insuline à 5 ng/mL, glutamine de 200 mM, pénicilline G et streptomycine de 600 ng/mL, et 7 mM d’HEPES, pH 7,4). Un support de différenciation disponible dans le commerce peut également être utilisé. Changez le support de différenciation une fois par semaine.
- Après 7-10 jours dans le milieu de différenciation, des myotubes multinucléés sont visibles. Évaluez les changements dans [Ca2+] dans un délai d’une semaine, comme décrit ci-dessous.
4. [Ca2+]i mesures de rapport déterminées avec Fura-2
- Chargez des myotubes cultivés avec du Fura-2/AM (concentration finale de 5 μM) dilués dans du DMEM pendant 30 min à 37 °C. En bref, retirez le milieu de différenciation des cellules cultivées en verre et ajoutez 2 mL de milieu de différenciation frais. Ajouter 10 μL de Fura-2 AM à partir d’une solution mère de 1 mM et incuber 30 min dans un incubateur de culture cellulaire (5% CO2,37 °C).
- Transférer le couvercle de verre dans la chambre de perfusion et rincer les cellules avec la solution de Krebs Ringer contenant 2 mM de CaCl2.
- Effectuer des mesures en ligne [Ca2+] comme décrit ci-dessus dans la section EBV à cellule unique avec l’utilisation d’un objectif FLUAR à immersion dans l’eau 20x (ouverture numérique de 0,17).
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Representative Results
[Ca2+]i mesures dans des populations de lymphocytes B immortalisés par le VEB
Les lymphocytes B primaires expriment l’isoforme RyR1 qui fonctionne comme un canal de libération de Ca2+ au cours des processus de signalisation stimulés par le récepteur de l’antigène des cellules B17. L’immortalisation des lymphocytes B avec EBV, une procédure couramment utilisée par les généticiens pour obtenir des lignées cellulaires contenant des informations génomiques de patients, offre l’avantage de générer des lignées cellulaires qui expriment des canaux mutants RyR1 Ca2+ chez les patients porteurs de mutationsRYR1 11,13. [Ca2+] i les changements provoqués par l’ajout d’agonistes RyR1 spécifiques tels que le 4-chloro-m-crésol18 et la caféine peuvent être facilement surveillés afin d’établir si une mutation RYR1 donnée modifie la sensibilité à un agoniste, la quantité de calcium libérée, le repos [Ca2+], ou d’autres paramètres qui se sont révélés être affectés par des mutations. [Ca2+] i les changements peuvent être surveillés soit dans des populations de cellules chargées de Fura-2 en suspension avec un spectrofluoromètre, soit sur des groupes de cellules attachées à des couvercles en verre et examinés par épifluorescence. La figure 2 montre une expérience représentative réalisée sur des suspensions cellulaires. Immédiatement avant d’être placées dans la cuvette, des cellules ont été filées pour éliminer Fura-2 qui pourrait avoir fui; les cellules ont ensuite été remises en suspension à une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL dans la solution chaude (37 °C) de Krebs Ringer ne contenant pas de Ca2+ plus 0,5 mM d’EGTA supplémentaire et placées dans le spectrofluoromètre. L’agitateur magnétique a été allumé en position 4 (la position la plus élevée) pour maintenir les cellules en suspension et la fluorescence a été enregistrée. Après avoir obtenu une trace stable, l’agoniste sélectionné a été ajouté (sur la figure 2A, il s’agissait de 300 μM de 4-chloro-m-crésol), ce qui a entraîné une augmentation rapide du Ca2+ qui a ensuite lentement diminué pour revenir aux niveaux de repos. La nature transitoire du changement de fluorescence est importante car elle indique (i) qu’il ne s’agit pas d’un artefact causé par l’ajout d’un composé fluorescent ou de trempe, (ii) qu’il n’est pas dû à la liaison du calcium à la fura-2 extracellulaire et (iii) que les cellules sont en bonne santé et peuvent éliminer activement le calcium de leur cytoplasme.
La même expérience doit être répétée plusieurs fois pour être analysée statistiquement. Pour chaque lignée cellulaire et chaque jour, les expériences sont effectuées et la quantité totale de calcium rapidement libérable dans les réserves doit être déterminée en ajoutant l’inhibiteur SERCA thapsigargin11,13,14. Comme le montre la figure 2B,l’ajout de 400 nM de thapsigargin provoque un grand transitoire de calcium atteignant une valeur de fluorescence maximale de 2,4 unités arbitraires (u.a.); ainsi, la quantité totale de calcium pouvant être libérée par les réserves intracellulaires des cellules B immortalisées par l’EBV illustrées à la figure 2B est égale à 2,4 u.a. (pic de thapsigargin) - 1,45 ua (rapport au repos) ou 0,95 Cette valeur de fluorescence a été considérée comme 100% lors de la construction de la courbe dose-réponse illustrée à la figure 2C.
Mesures unicellulaires [Ca2+]i dans les lymphocytes B immortalisés par l’EBV
Cette seconde approche repose sur la disponibilité d’un microscope à fluorescence et d’une microperfusion mise en place permettant la stimulation d’une seule cellule ou de petits groupes de cellules avec une concentration donnée d’agoniste et l’enregistrement simultané des changements de fluorescence. Les seringues du système de microperfusion sont chargées de différentes concentrations de l’agoniste RyR1 sélectionné (caféine ou 4-chloro-m-crésol) qui seront utilisées pour générer des courbes dose-réponse. Dans l’exemple illustré à la figure 3,les cellules ont été stimulées avec 0,5 à 10 mM de caféine dissoute dans la solution de Krebs Ringer ne contenant pas de calcium ajouté plus 100 μM de La3+ afin de surveiller la libération de Ca2+ par les réserves intracellulaires. Les couvercles en verre sur lesquels les lymphocytes B immortalisés par l’EBV chargés de Fura-2 ont été autorisés à se fixer sont placés dans la chambre de perfusion et perfusés avec la solution de Krebs Ringer contenant 1 mM de Ca2+. La plupart des cellules auront adhéré à la lame de couverture traitée en poly-L-lysine et de petits groupes de cellules doivent être identifiés et vérifiés pour la charge en Fura-2. La pointe du système de perfusion est placée près des cellules pour les baigner (et non toutes les cellules sur le couvercle) avec de la caféine. Normalement, les cellules sont stimulées à partir de la concentration la plus faible à la plus élevée de caféine; pour chaque concentration, une nouvelle cellule ou un nouveau groupe de cellules est sélectionné. Les mesures de fluorescence ratiométrique (excitation à 340 nm et 380 nm, émission à 510 nm) sont enregistrées chaque seconde jusqu’à 2 min. Quelques images sont obtenues avant la perfusion afin d’obtenir une ligne de base stable, puis la perfusion cellulaire est initiée, d’abord en rinçant les cellules avec une solution de la solution de Krebs Ringer contenant 100 μM La3+ pendant 5 secondes. Cela ne devrait pas entraîner de changement de floraison et constitue un contrôle pour s’assurer que la ou les cellules adhèrent à la bascule tout au long de l’expérience; par la suite, une solution contenant la concentration d’agonistes sélectionnée est rincée sur la ou les cellules. Dans l’exemple illustré à la figure 3A,les cellules ont été stimulées avec 5 mM de caféine pendant 20 secondes. La flèche affichée indique quand la valve de caféine a été ouverte, ce qui entraîne une augmentation immédiate du rapport fluorescent 340/380 nm. Après 20 secondes, la valve de caféine se ferme et les cellules sont rincées avec la solution de Krebs Ringer contenant 100 μM La3+; la fluorescence est enregistrée jusqu’à ce que la ligne de base soit atteinte. Pour chaque concentration de caféine, le ΔF, c’est-à-dire le pic de fluorescence 340/380 nm induit par la caféine - la fluorescence initiale au repos de 340/380 nm est calculée et utilisée pour construire une courbe dose-réponse comme le montre la figure 3B. Le ΔF moyen de 5 à 10 cellules est moyenné pour chaque concentration de caféine. La quantité de calcium dans les réserves intracellulaires peut également être surveillée. Dans ce cas, les cellules sont rincées avec la solution de Krebs Ringer contenant 0,5 mM d’EGTA et une solution de 1 μM de thapsigargin, 1 μM d’ionomycine et 0,5 mM d’EGTA est ajoutée à la main aux cellules (pas à travers le système de microperfusion car l’ionomycine adhère au tube et ne peut pas être lavée) et la fluorescence est enregistrée pendant environ 4-5 min. Pour calculer le ΔF, une région d’intérêt (ROI) décrivant une cellule est obtenue et les changements de fluorescence dans le ROI sont calculés à l’aide d’un logiciel d’imagerie.
En résumé, lors de l’utilisation de cellules B immortalisées par EBV pour mesurer la sensibilité du RyR1 à un agoniste spécifique, des expériences répétées doivent être effectuées sur des cellules d’un individu, à des jours différents. Pour les mesures sur les populations cellulaires, l’état des réserves intracellulaires de calcium doit être évalué et la libération de calcium induite par l’EC50 par les agonistes est tracée par rapport à la quantité totale de calcium qui peut être libérée par les réserves. L’un des avantages de l’utilisation de cette approche est que la réponse [Ca2+]de millions de cellules est moyennée; de plus, aucun système de microperfusion et microscopes fluorescents ne sont nécessaires. La méthode à cellule unique permet l’utilisation d’un plus petit nombre de cellules et la visualisation en ligne des changements dans [Ca2+] des cellules sélectionnées.
Mesures à cellule unique [Ca2+]i dans des myotubes dérivés de cellules satellites humaines
Les myotubes de verre cultivés et différenciés sont chargés de Fura-2, transférés dans la chambre de perfusion et baignés dans la solution de Krebs Ringer contenant 2 mM ca2+ comme décrit ci-dessus pour les cellules EBV. Les seringues du système de perfusion sont remplies de l’agoniste sélectionné et les myotubes sont stimulés comme décrit ci-dessus. Étant donné que toutes les cellules du couvercle ne sont pas des myotubes multinucléés, il est important de sélectionner la ou les cellules appropriées qui seront mesurées. De petits groupes de myotubes peuvent être stimulés simultanément. Dans l’exemple illustré à la figure 4,un seul myotube a été rincé avec une solution contenant du KCl, différentes concentrations de 4-chloro-m-crésol et enfin de caféine, cependant, normalement des courbes dose-réponse aux agonistes sont construites, comme indiqué dans la section précédente, afin de comparer la sensibilité agoniste des cellules de différents individus12,15,16 . KCl est utilisé comme un moyen de dépolariser la membrane plasmique. Dans le squelette, la dépolarisation de la membrane plasmique musculaire est détectée par la détection de tension DHPR qui subit ainsi un changement conformationnel conduisant à l’activation et à l’ouverture du RyR1. D’autre part, le 4-chloro-m-crésol et la caféine sont des activateurs pharmacologiques directs du RyR1.
Figure 1: Génération de cultures de myoblastes primaires dérivées de biopsies musculaires humaines. (A) De petits fragments de muscle (flèches) sont placés dans des inserts contenant un milieu de croissance de 0,5 mL. Après 7-14 jours, des cellules satellites peuvent être vues (petites flèches) adjacentes au tissu musculaire et se développant au bas de l’insert. Image prise à travers un objectif 10x(B)et un objectif 20x(C). Les cases grises du panneau A ont été utilisées pour couvrir l’identité du patient. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Expériences de libération de calcium dans les lymphocytes B immortalisés par l’EBV. Mesures ratiométriques [Ca2+]i dans une population de cellules chargées de Fura-2 en suspension. A) L’ajout de 300 μM de 4-chloro-m-crésol (flèche) provoque une augmentation immédiate du cytoplasmique [Ca2+],qui se désintègre ensuite pour revenir aux niveaux de repos en 500 secondes. Dans cet exemple, le ΔF induit par l’addition de 300 μM de 4-chloro-m-crésol est de 1,7 unité de fluorescence - 1,4 unité de fluorescence = 0,3 unité de fluorescence. B) L’ajout de l’inhibiteur SERCA thapsigargin (400 nM, flèche) provoque une augmentation plus importante du rapport de fluorescence Fura-2 qui culmine à 2,4 unités de fluorescence, puis se désintègre à des niveaux de repos à 1,45 unités de fluorescence. Le transitoire [Ca2+]induit par la thapsigargin représente la quantité totale de calcium rapidement libérable dans les réserves intracellulaires présentes dans la population cellulaire. Le pic transitoire obtenu (2,4-1,45= 0,95 unité) est utilisé pour calculer le pourcentage de calcium libéré par une concentration donnée de 4-chloro-m-crésol. C) Courbes dose-réponse représentatives corrélant le ΔF en pourcentage de la quantité totale de calcium rapidement libérable dans les réserves intracellulaires. Pour 300 μM de 4-chloro-m-crésol, cette valeur est de 0,3/0,95x100=31,6%. Chaque symbole représente la moyenne±% SEM% de 5 à 10 valeurs provenant de cellules immortalisées EBV provenant d’un témoin (cercles fermés, ligne pointillée) et d’un individu MHS (carrés fermés, ligne continue) porteur d’une mutation RYR1. Les courbes ont été générées à l’aide d’une fonction de courbe dose-réponse sigmoïdale. Les panneaux A et B sont adaptés de Girard et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Libération de Ca2+ induite par la caféine dans des lymphocytes B individuels immortalisés par l’EBV par un individu témoin. A) Panneaux supérieurs, images en accéléré (A) Contraste de phase; (B-E), mesures unicellulaires [Ca2+]I de lymphocytes immortalisés par EBV chargés de fura-2: (B) t = 0, (C) t = 36 s, (D) t = 50 s et (E) t = 77 s après l’application de caféine 5 mM. Les cellules ont été stimulées individuellement par l’ajout de caféine diluée dans la solution de Krebs-Ringer. Barre d’échelle = 10 μm. Panneau inférieur, trace représentative obtenue après stimulation d’une seule cellule avec 5 mM de caféine (flèche). B) Courbes dose-réponse montrant le changement dépendant de la caféine dans [Ca2+]i, exprimé en changement dans le rapport de fluorescence (rapport de crête 340/380 nm-rapport repos 340/380 nm). Chaque point représente la moyenne ± MEB du changement de fluorescence de 4 à 15 cellules. Les courbes ont été générées à l’aide d’une fonction de courbe dose-réponse sigmoïdale. Carrés fermés, ligne pointillée, cellules de contrôle; triangles fermés, ligne continue, individu MHS porteur d’une mutation RYR1. Cette figure est une adaptation de Ducreux et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Libération de calcium stimulée par le KCl, le 4-chloro-m-crésol et la caféine dans les myotubes humains d’un individu témoin. Panneaux de gauche: A) contraste de phase (B-H), mesures intracellulaires monocellulaires Ca2+ de myotubes humains chargés de Fura-2. B) au repos [Ca2+]i ; C) t=2 s après l’application de 150 mM de KCl. D) t=2 s après l’application de 150 μM de 4-chloro-m-crésol; E) t=2 s après l’application de 300 μM de 4-chloro-m-crésol; F) t=2 s après l’application de 600 μM de 4-chloro-m-crésol; G) t=2 s après l’application de 10 mM de caféine; H) t = 20 s après l’application de caféine. Panneaude droite : Tracé du rapport temps(s) versus fluorescence (340/380 nm) dans la cellule stimulée. Les myotubes ont été stimulés individuellement par l’ajout de l’agoniste dans le tampon de Krebs-Ringer contenant 100 μM La3+,donc l’augmentation de [Ca2+]i ne représente que la libération de calcium par les réserves intracellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les protocoles décrits dans cet article ont été utilisés avec succès par plusieurs laboratoires pour étudier l’impact des mutations RYR1 sur l’homéostasie du calcium. Les étapes critiques des approches décrites dans le présent document portent sur la stérilité, les compétences et les techniques de culture cellulaire et la disponibilité du matériel biologique. En principe, l’utilisation des lymphocytes B immortalisés par l’EBV est plus simple et permet de générer des lignées cellulaires contenant des canaux RyR1 mutants. Les cellules peuvent être congelées et stockées dans de l’azote liquide pendant de nombreuses années et les cultures peuvent être redémarrées à tout moment. De plus, on peut choisir de surveiller l’homéostasie du calcium dans les populations cellulaires ou au niveau de la cellule unique. La première méthode est plus simple, ne nécessite pas de microscope à fluorescence et permet à l’investigateur de tester des lignées cellulaires générées par différents individus dans un court laps de temps. La limitation étant la vitesse de croissance cellulaire et la disponibilité d’un spectrofluoromètre entièrement équipé (chauffé et avec agitateur magnétique). Comme approche alternative, la cytométrie en flux en combinaison avec des indicateurs de calcium fluorescents peut être utilisée pour mesurer les flux de calcium dans les lymphocytes B immortalisés par l’EBV; de cette manière, les changements dans la concentration intracellulaire de calcium peuvent êtredéterminés 19. Si un microscope fluorescent, une chambre de perfusion et un système de microperfusion sont disponibles, l’imagerie unicellulaire a l’avantage d’être plus sensible et de donner des informations plus détaillées, y compris la variabilité de cellule à cellule, l’analyse cinétique et l’identification des domaines subcellulaires impliqués dans la libération de calcium. Cette dernière approche est techniquement plus difficile et nécessite plus d’équipement.
L’utilisation de lymphocytes B immortalisés par l’EBV présente de multiples avantages, notamment le fait que d’autres paramètres mis à part l’homéostasie [Ca2+] peuvent être mesurés. Par exemple, l’acidification induite par le 4-chloro-m-crésol des cellules B a été utilisée pour différencier les cellules des individus témoins des patients atteints de MHS20,21. Néanmoins, il faut garder à l’esprit (i) que les lymphocytes B n’expriment pas beaucoup de protéines impliquées dans le couplage de contraction de l’excitation musculaire squelettique qui peuvent influencer indirectement la libération de calcium, (ii) ce sont des cellules non excitables qui ne peuvent donc pas être activées physiologiquement par dépolarisation de la membrane plasmique, et enfin un rapport de Monnier et al. a révélé qu’une mutation identifiée chez un patient n’était pas exprimée dans les cellules B immortalisées par l’EBV en raison d’un site d’épissure cryptique22.
Des cultures de cellules musculaires primaires dérivées de patients ont été utilisées par plusieurs groupes intéressés à étudier l’effet de mutations dans différents gènes codant pour des protéines impliquées dans l’homéostasiecalcique 10,23,24. Ces cellules peuvent être différenciées en myotubes multinucléés, répondre à la dépolarisation de la membrane plasmique et peuvent être évaluées par des moyens électrophysiologiques. De plus, ils peuvent être immortalisés afin d’obtenir des lignées cellulaires porteuses des mutations RYR125,bien que la procédure soit beaucoup plus complexe que pour les lymphocytes B. S’il est également vrai que les cellules musculaires se développent lentement et que le temps nécessaire entre la biopsie et la présence d’un nombre suffisant de cellules peut être supérieur à un mois, il est également possible de stocker les petits morceaux de biopsies musculaires dans un milieu de congélation dans de l’azote liquide afin d’obtenir des myoblastes des années plus tard. Les longs temps de culture présentent un risque supplémentaire de contamination par des bactéries, des levures ou des moisissures et dès qu’un nombre suffisamment important de myoblastes a été obtenu, il est important de les congeler et de les stocker dans de l’azote liquide. Notre laboratoire a appliqué avec succès la même technique décrite ci-dessus pour les myotubes, afin d’étudier les changements calciques dans les fibroblastes dérivés de la peau humaine transduis par la myoD et différenciés en myotubes26. Cela a été fait pour étudier l’effet fonctionnel des mutations RYR1 lorsque les myoblastes dérivés de la biopsie musculaire n’étaient pas disponibles. En ce qui concerne les lymphocytes B, l’acidification induite par le 4-chloro-m-crésol des myotubes de patients porteurs de mutations RYR1 liées à MHS a été testée avec succès27.
En conclusion, l’utilisation de matériel biologique de patients pour étudier la corrélation génotype-phénotype présente de nombreux avantages et peut être utilisée avec succès pour étudier l’effet des mutations dans RYR1. Cependant, lors de l’utilisation de cette approche, il est important de garder à l’esprit que les mutations présentes dans d’autres gènes peuvent influencer l’homéostasie du calcium; par conséquent, l’utilisation de cellules de différentes familles hébergeant la même mutation ainsi que de membres de la famille n’hébergeant pas la mutation RYR1 comme témoins, doit être effectuée.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été soutenus par des subventions du Fonds national suisse (FNS) et de la Fondation suisse du muscle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
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