Summary
Her beskrives metoder, der anvendes til at studere den funktionelle effekt af RYR1-mutationer, der endogne udtrykkes i Epstein Barr Virus, humane B-lymfocytter og muskelbiopsi afledte satellitceller, der er differentieret i myotubes.
Abstract
Mere end 700 varianter i RYR1-genet er blevet identificeret hos patienter med forskellige neuromuskulære lidelser, herunder ondartet hypertermi modtagelighed, kerne myopatier og centronuclear myopati. På grund af de forskellige fænotyper forbundet med RYR1 mutationer er det afgørende at karakterisere deres funktionelle virkninger til at klassificere varianter båret af patienter til fremtidige terapeutiske interventioner og identificere ikke-patogene varianter. Mange laboratorier har været interesseret i at udvikle metoder til funktionelt at karakterisere RYR1 mutationer udtrykt i patienternes celler. Denne tilgang har mange fordele, herunder: mutationer udtrykkes endogene, RyR1 er ikke over-udtrykt, brug af heterologe RyR1 udtrykke celler undgås. Men da patienter kan præsentere mutationer i forskellige gener bortset ryr1, er det vigtigt at sammenligne resultater fra biologisk materiale fra personer, der huser den samme mutation, med forskellige genetiske baggrunde. Dette manuskript beskriver metoder udviklet til at studere de funktionelle virkninger af endogene udtrykte RYR1 varianter i: (a) Epstein Barr virus udødeliggjort menneskelige B-lymfocytter og (b) satellitceller stammer fra muskelbiopsier og differentieret i myotubes. Ændringer i den intracellulære calciumkoncentration udløst af tilsætning af en farmakologisk RyR1-aktivatorer overvåges derefter. Den valgte celletype er fyldt med en ratiometrisk fluorescerende calciumindikator, og intracellulære [Ca2+]-ændringerovervåges enten på enkeltcelleniveau ved fluorescensmikroskopi eller i cellepopulationer ved hjælp af et spektrfluorometer. Hvile [Ca2 +], agonistiske dosis respons kurver er derefter sammenlignet mellem celler fra sunde kontroller og patienter huser RYR1 varianter fører til indsigt i den funktionelle effekt af en given variant.
Introduction
Til dato er der identificeret mere end 700 RYR1-varianter i den menneskelige befolkning og forbundet med forskellige neuromuskulære lidelser, herunder ondartet hypertermifølsomhed (MHS), motion induceret rhabdomyolyse, central kernesygdom (CCD), multi-minicore sygdom (MMD), centronuclear myopati (CNM)1,2,3 ; ikke desto mindre er undersøgelser for at karakterisere deres funktionelle virkninger bagud, og kun ca. 10% af mutationerne er blevet testet funktionelt. Forskellige eksperimentelle tilgange kan bruges til at vurdere virkningen af en given RyR1 variant, herunder transfection af heterologe celler såsom HEK293 og COS-7 celler med plasmid kodning for WT og mutant RYR1 cDNA4,5, transduktion af dyspede mus fibroblaster med plasmider og vektorer kodning for WT og mutant RYR1 cDNA, efterfulgt af transduktion med myo-D og differentiering i myotubes6 , generering af transgene dyremodeller , der bærer mutant ryR1s7,8,9, karakterisering af celler fra patienter , der udtrykker RYR1-varianten endogene10,11,12. Sådanne metoder har hjulpet med at fastslå, hvordan forskellige mutationer funktionelt påvirker RyR1 Ca2 + kanalen.
Her beskrives metoder udviklet til at vurdere de funktionelle virkninger af RYR1-mutationer. Forskellige parametre for intracellulær calcium homøostase undersøges i menneskelige celler endogent udtrykke RyR1 calcium kanal, herunder myotubes og Epstein Barr Virus (EBV) udødeliggjort B-lymfocytter. Celler er fremstillet af patienter, udvidet i kultur og fyldt med ratiometriske fluorescerende calcium indiktorer såsom Fura-2 eller indo-1. Parametre, der er rapporteret at blive ændret på grund af patogene RYR1-mutationer, herunder hvile [Ca2+], følsomheden over for forskellige farmakologiske agonister og størrelsen af de intracellulære Ca2+-lagre måles enten på enkeltcelleniveau ved hjælp af fluorescensmikroskopi eller i cellepopulationer ved hjælp af et fluormeter. Resultater opnået i celler fra mutation bærere er derefter sammenlignet med dem, der opnås fra sunde kontrol familiemedlemmer. Denne fremgangsmåde har vist, at: i) mange mutationer forbundet med MHS fører til en stigning i hvile [Ca2+] og et skift til venstre i dosisresponskurven til enten KCl-induceret depolarisering eller farmakologisk RyR1-aktivering med 4-chloro-m-cresol10,11,12,13; ii) mutationer i forbindelse med CCD fører til et fald i toppen [Ca2+],der frigives ved farmakologisk aktivering af RyR1 og nedsættes, hvis det intracellulære Ca2+-område lagrer12,13,14,15; iii) nogle varianter påvirker ikke Ca2+ homøostase13. Fordelene ved denne eksperimentelle tilgang er: RyR1-proteinet er ikke over udtrykt, og fysiologiske niveauer er til stede, celler kan udødeliggøres (både muskelceller og B-lymfocytter), der giver cellelinjer, der indeholder mutationer. Nogle ulemper vedrører det faktum, at patienter kan bære mutationer i mere end ét genkodning af proteiner, der er involveret i calcium homøostase og /eller excitation sammentrækning kobling (ECC), og dette kan komplicere eksperimentelle konklusioner. For eksempel blev to JP-45 varianter identificeret i MHS og kontrolpopulationen, og deres tilstedeværelse viste sig at påvirke følsomheden af dihydropyridinreceptoren (DHPR) til aktivering16. Patienterne skal være til rådighed, biologisk materiale skal indsamles frisk, og etiske tilladelser skal indhentes fra de lokale etiske bestyrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De protokoller, der er beskrevet nedenfor, er i overensstemmelse med etikkommission nordwest- und Zentralschweiz EKNZ' etiske retningslinjer.
1. Forberedelse af Epstein Barr udødeliggjort B-lymfocyt cellelinjer11
- Efter informeret samtykke opsamles 30 mL fuldblod i EDTA-behandlede sterilrør fra probandet med en RYR1-mutation og fra raske familiemedlemmer uden mutation.
BEMÆRK: Hold alle opløsninger sterile og arbejd i en vævskulturhætte. - Isoler mononukleare celler fra fuldblod ved at massegradientcentrifugeringsmedier (f.eks. Ficoll-Hypaque, 0,077 g/L).
- Placer 30 mL sterilt blod i et 50 mL konisk sterilt rør.
- Placer spidsen af en Pasteur pipette, der indeholder densitet gradient centrifugation medier i bunden af røret og lag 20 mL steril af tæthed gradient centrifugering medier løsning langsomt under blodet.
- Centrifuge i 30 min ved 900 x g ved 18 °-20 °C, uden pause.
BEMÆRK: Det mononukleare cellelag fremstår som en overskyet ring ved mellemruden mellem densitetsgradientcentrifugeringsmedielaget og det øverste lag, der indeholder blodpladeberiget plasma.
- Med en steril pipette fjernes det interfase lag, der indeholder mononukleare celler (ca. 3-5 mL), forsigtigt og overfør opløsningen til et rent 50 mL sterilt konisk rør.
- Tilsæt 20 mL fosfatbuffer saltvand (PBS) til skylleceller, centrifuge i 10 min ved 600 x g ved stuetemperatur og resuspend pellet i PBS. Gentag i alt tre gange; dette sikrer, at alle medier fjernes.
- Efter den sidste vask, resuspend celler i 1-2 mL af væv kultur medium (RPMI medium suppleret med 10% føtal kalv serum, 2 mM L-glutamin, og 100 enheder af penicillin og streptomycin). Placer mononukleare celler (ca. 1 x 106 celler) i en T125 vævskulturflaske, der indeholder 20 mL vævskulturmedie.
- Inrmitér mononukleare celler med Epstein-Barr-virus.
- Brug supernatants fra B95.8 cellelinjekulturer (indeholdende 102-103 transformerende enheder/mL lager ved -80 °C) som kilde til EBV.
- Resuspend 1 x 106 mononukleare celler fra trin 1.5 i 20 mL af vævskultur medium og udsætte dem for 2 mL supernatant fra B95.8 celle linje i nærværelse af cyclosporin A (0,2 μg/mL endelig koncentration) for infektion.
- Kolben placeres i en 37 °C cellekulturinkubator, og lad cellerne vokse. Efter en uge ændre kulturmediet.
BEMÆRK: Når B-cellerne begynder at formere sig, danner de genkendelige klumper og vokser hurtigt, så kulturerne kan udvides og fryses. - Uddrag det genomiske DNA fra EBV udødeliggjorte B-lymfocyt cellelinjer11 for at bekræfte tilstedeværelsen eller fraværet af den givne mutation.
2. Intracellulære Ca2+ målinger
BEMÆRK: Ændringer i den intracellulære calciumkoncentration af de EBV-transformerede B-lymfocytcellelinjer kan overvåges i cellepopulationer, med et spektrometer udstyret med en magnetisk omrører og cuvetteholder indstillet til 37 °C. Alternativt ca2 + ændringer kan overvåges i enkelte celler ved fluorescens mikroskopi. I begge tilfælde fjernes cellerne fra vævskulturkolben, vaskes to gange med Krebs Ringers opløsning (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4, 5,5 mM glukose, pH 7,4 indeholdende 1 mM CaCl2) og tælles .
- Til forsøg med cellepopulationer ved hjælp af et spektrfluorometer11,13,14
- Resuspendceller ved en endelig koncentration på 1 x 107 celler/ mL i Krebs Ringers opløsning og inkuberes ved 37 °C i 30 min med en endelig koncentration på 5 μM Fura-2/AM.
- Centrifugeceller ved 900 x g i 10 min og genbruge dem i Krebs Ringers opløsning i en koncentration på 2 x 106 celler/mL.
- Mål fluorescensændringer (forhold 340/380 nm) ved hjælp af et spektrfluorometer, der er udstyret med en magnetisk omrører, der er indstillet til maksimal hastighed og sat til 37 °C.
- Lige før eksperimentet spinceller på 900 x g i 5 min i et mikrocentrifuge og hurtigt genbruge pellet i 1,5 mL krebs Ringer opløsning med 0,5 mM EGTA, men ingen tilsat Ca2 +.
- Placer cellerne i en 3 mL glasspektrometerkuvette, og registrer fluorescensforholdet (340 nm/380 nm excitation, 510 nm emission).
- Opnå en stabil basislinje (ca. 30 sekunder), tilsæt den valgte koncentration af RyR1 agonist (4-chloro-m-cresol eller 4 cmc) og registrer calciumtransienten.
BEMÆRK: En 300 mM lageropløsning på 4 cmc fremstillet i DMSO bruges som startreagens. Denne opløsning kan laves på forhånd, aliquoted og opbevares ved -20 °C i flere måneder. - Udfør eksperimenter for forskellige 4 cmc koncentrationer.
BEMÆRK: Medtag 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM til 1 mM for at generere en dosisresponskurve af agonist versus ændring i [Ca2+]. De forskellige 4 cmc koncentrationer opnås ved at tilføje den passende mængde af 4 cmc fra lageropløsningen, direkte i cuvette indeholdende Fura-2 lastede celler. For eksempel tilsættes 1,5 μL af lageropløsningen til 300 μM 4 cmc til 1,5 μL af lageropløsningen til cuvette, der indeholder 1,5 mL celler i Krebs Ringers opløsning. Ved lavere agonistiske koncentrationer skal 300 mM lageropløsningen fortyndes til 75 mM med DMSO, og det passende volumen tilsættes cuvette, der indeholder 1,5 mL celler i Krebs Ringers opløsning. - Tilføj 400 nM thapsigargin til celler for at beregne den samlede mængde Ca2 + til stede i intracellulære butikker. Optag toppen Ca2+.
- Plot peak calcium induceret af en given 4 cmc koncentration versus peak calcium induceret af thapsigargin, som betragtes som 100% og konstruere en 4-cmc dosis respons kurve sammenligne celler fra et proband og sund relativ
- Til forsøg på enkeltceller13
- Fortynd poly-L-lysin 1:10 i steril H2O og forbehandle glassdækslerne i 30 min. Lad det lufttørre under en steril vævskulturhætte.
- Suspendere EBV-transformerede B-lymfocytter til en endelig koncentration på 1 x 106 celler/mL i Krebs Ringers opløsning, der indeholder 1 mM CaCl2, og tilsæt en endelig koncentration på 5 μM Fura-2/AM.
- Placer 1 mL celler på de poly-L-lysinbehandlede coverslips og inkuberes ved 37 °C i en befugtet cellekulturinkubator i 30 min, så EBV-cellerne kan klæbe til glasovertrækket under lastningen.
- Dækslen placeres i perfusionskammeret, og start perfusion (med en hastighed på 2 mL/min) med Krebs Ringers opløsning, der indeholder 1 mM Ca2+.
- Brug et omvendt fluorescerende mikroskop (udstyret med et 40x oliedypningsmål (0,17 numerisk blænde), filtre (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) til at registrere onlinemålinger med en softwarestyret opladningskoblet enhed (CCD) kameratilbehør.
- Hent billeder med 1 s mellemrum ved en fast eksponeringstid (100 ms for både 340- og 380-nm excitation bølgelængder. Brug billedbehandlingssoftware til at analysere ændringer i fluorescens. Mål den gennemsnitlige pixelværdi for hver celle ved excitationsbølgelængder på 340 og 380 nm13.
- For at opnå cellestimulering skal du bruge en celleperfusionstimulator med 12 ventiler og tilføje forskellige koncentrationer på 4 cmc. Skylleventilen indeholder Krebs Ringers opløsning uden tilsat Ca2+ plus 100 μM La3+ til kun at overvåge calciumudslip fra intracellulære lagre.
- Konstruere en dosis respons kurve på 4-cmc versus ændring i [Ca2 +], som beskrevet ovenfor.
3. Forberedelse af menneskelige myotubes fra muskelbiopsier10,12,15
BEMÆRK: Forskellige metoder er blevet brugt af forskellige laboratorier til at opnå satellitcelle-afledte myoblasts og myotubes. Nedenfor er beskrivelsen af den metode, der anvendes i Basel.
- Skyl muskelbiopsi med steril PBS for at fjerne overskydende blod og skær i små fragmenter på ca. 0,5-1 mm.
- Forbered 6 godt vævskultur retter med indsætte. Tilføj 1,5 mL af menneskelige muskel vækst medium til hver brønd og 0,5 mL af menneskelige muskel vækst medium til hver indsætte.
BEMÆRK: Vækstmediet består som følger: 500 mL af Dulbeccos modificerede Eagles medium med høj glukose eller DMEM (4,5 mg/mL), der indeholder 10% hesteserum, 5 ng/mL insulin, 3 mM glutamin, 600 ng/mL penicillin G og streptomycin og 7 mM HEPES, pH 7,4. Kommercielt tilgængelige skeletmuskulatur vækstmedium kan også bruges. - Placer 2-3 små muskelfragmenter i hver indsats (Figur 1A) og læg kulturskåle i cellekulturinkubatoren (5% CO2, 37 °C). Efter ca 8-10 dage satellitceller kan ses vokser ud af og omkring muskel biopsi, knyttet til indsatsen (Figur 1, B og C, pile).
- Slip et tilstrækkeligt antal celler fra biopsien (efter ca. 10-14 dage), trypsinize som følger:
- Fjern alt kulturmedium, skyl cellerne én gang med 1 mL PBS, tilsæt 0,5 mL trypsin/EDTA-opløsning (0,025% trypsin og 0,01% EDTA) og inkuber ved 37 °C i 5 min.
- Tilsæt 1 mL vækstmedium til cellerne for at neutralisere effekten af trypsin og overføre satellitcellerne til en ny T25-cellekulturkolbe; tilsæt 3 mL vækstmedium og læg cellerne i en cellekulturinkubator (5% CO2, 37 °C).
- Skift vækstmediet den næste dag for at fjerne EDTA og efterfølgende ændre mediet en gang om ugen.
- Når myoblasts er ca 75% sammenløb, trypsinize og overføre dem på laminin-behandlede glas coverlip.
BEMÆRK: I forhold til skal celler, der vokser i en T25-kolbe, overføres til en lamininbehandlet glasovertræk med en diameter på 43 mm. Glasdækslet skal placeres inden for en vævskulturplade med en diameter på 60 mm, der indeholder 3 mm vækstmedium. - Knyt celler på glasovertrækket i vækstmedium i en cellekulturinkubator (5% CO2, 37 °C), der ændrer mediet en gang om ugen. Ved 90% sammenløb skifte til differentiering medium består som følger: høj glukose DMEM (4,5 mg/mL), 0,5% kvæg serum albumin, 10 ng/mL epidermal vækstfaktor, 0,15 mg/mL kreatin, 5 ng/mL insulin, 200 mM glutamin, 600 ng/mL penicillin G og streptomycin, og 7 mM HEPES, pH 7.4). Kommercielt tilgængelige differentiering medium kan også anvendes. Skift differentieringsmedium en gang om ugen.
- Efter 7-10 dage i differentiering medium, multinucleated myotubes er synlige. Vurder for ændringer i [Ca2+] inden for en uge, som beskrevet nedenfor.
4. [Ca2+]i forholdsmålinger bestemt med Fura-2
- Belastning glas coverlip dyrket myotubes med Fura-2/AM (endelig koncentration på 5 μM) fortyndet i DMEM i 30 min ved 37 °C. Fjern kort differentieringsmediet fra glasdækslerne og tilsæt 2 mL frisk differentiering medium. Der tilsættes 10 μL Fura-2 AM fra en lageropløsning på 1 mM og inkuberes 30 min i en cellekulturinkubator (5% CO2, 37 °C).
- Overfør glasovertræk til perfusionskammeret og skyl cellerne med Krebs Ringers opløsning, der indeholder 2 mM CaCl2.
- Udfør online [Ca2+] målinger som beskrevet ovenfor i EBV enkeltcellesektionen med brug af et 20x vanddypning FLUAR-mål (0,17 numerisk blænde).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[Ca2+]i målinger i populationer af EBV-udødeliggjorte B-lymfocytter
Primære B-lymfocytter udtrykker RyR1 isoform, der fungerer som en Ca2 + release kanal under B celle antigen receptor stimuleret signalering processer17. Udødeliggørelse af B-celler med EBV, en procedure, der rutinemæssigt anvendes af genetikere til at opnå cellelinjer, der indeholder genomisk information af patienter, giver fordelen ved at generere cellelinjer, der udtrykker mutant RyR1 Ca2 + kanaler hos patienter, der huser RYR1 mutationer11,13. [Ca2+] i ændringer som følge af tilsætning af specifikke RyR1 agonister såsom 4-chloro-m-cresol18 og koffein let kan overvåges for at fastslå, om en given RYR1 mutation ændrer følsomheden over for en agonist, mængden af calcium frigivet, hvile [Ca2 +], eller andre parametre, der har vist sig at være påvirket af mutationer. [Ca2+] i ændringer kan overvåges enten i populationer af Fura-2 lastede celler i suspension med et spektrometer eller på grupper af celler knyttet til glas coverslips og undersøgt ved epifluorescence. Figur 2 viser et repræsentativt eksperiment udført på celleaffjedring. Umiddelbart før de blev placeret i cuvette, celler blev spundet til at fjerne Fura-2, der kan have lækket ud; cellerne blev derefter ophængt til en endelig koncentration på 1 x 106 celler/mL i varm (37 °C) Krebs Ringers opløsning, der ikke indeholder yderligere Ca2+ plus 0,5 mM EGTA og anbragt i spektrometeret. Den magnetiske omrører blev tændt til position 4 (den højeste position) for at holde cellerne i suspension og fluorescens blev registreret. Efter at der var opnået et stabilt spor, blev den udvalgte agonist tilsat (i figur 2A var dette 300 μM 4-chloro-m-cresol), hvilket førte til en hurtig Ca2+-stigning, som derefter langsomt faldt tilbage til hvileniveauer. Den forbigående karakter af ændringen i fluorescens er vigtig, da det indikerer (i) at det ikke er en artefakt forårsaget af tilsætning af en fluorescerende eller slukkende forbindelse, (ii) at det ikke skyldes calciumbinding til ekstracellulær Fura-2 og (iii) at cellerne er sunde og aktivt kan fjerne calcium fra deres cytoplasma.
Det samme eksperiment skal gentages flere gange for at blive analyseret statistisk. For hver cellelinje og hver dag udføres forsøgene, og den samlede mængde hurtigt frigiveligt calcium i butikkerne skal bestemmes ved at tilføje SERCA-hæmmeren thapsigargin11,13,14. Som vist i figur 2Bforårsager tilsætning af 400 nM thapsigargin en stor calciumtransient, der når en maksimal fluorescensværdi på 2,4 vilkårlige enheder (alias); således er den samlede mængde calcium, der kan frigives fra de intracellulære lagre af ebv-udødeliggjorte B-celler vist i figur 2B lig med 2,4 a.u. (thapsigargin peak) - 1,45 a.u. (hvileforhold) eller 0,95 Denne fluorescensværdi blev betragtet som 100% ved konstruktionen af dosisresponskurven vist i figur 2C.
Enkeltcelle [Ca2+]i målinger i EBV-udødeliggjorte B-lymfocytter
Denne anden tilgang er afhængig af tilgængeligheden af et fluorescensmikroskop og mikroperfusion, der er oprettet, hvilket gør det muligt at stimulere en enkelt celle eller små grupper af celler med en given koncentration af agonist og samtidig registrering af fluorescensændringerne. Sprøjterne i mikroperfusionssystemet er fyldt med forskellige koncentrationer af den valgte RyR1-agonist (enten koffein eller 4-chloro-m-cresol), som vil blive brugt til at generere dosisresponskurver. I eksemplet vist i figur 3blev cellerne stimuleret med 0,5-10 mM koffein opløst i Krebs Ringers opløsning, der ikke indeholdt tilsat calcium plus 100 μM La3+ for at overvåge Ca2+ frigivelse fra intracellulære lagre. Glascoverlips, hvorpå Fura-2 lastede EBV-udødeliggjorte B-lymfocytter fik lov til at fastgøres, placeres i perfusionskammeret og gennemsyret med Krebs Ringers opløsning, der indeholder 1 mM Ca2+. De fleste af cellerne vil have klæbet til poly-L-lysin behandlet coverslip og små grupper af celler bør identificeres og kontrolleres for Fura-2 lastning. Spidsen af perfusionssystemet placeres tæt på cellerne for at bade dem (og ikke alle cellerne på coverlip) med koffein. Normalt stimuleres celler fra den laveste til den højeste koncentration af koffein; for hver koncentration vælges en ny celle eller gruppe af celler. Forholdetometrisk fluorescensmålinger (excitation ved 340 nm og 380 nm, emission ved 510 nm) registreres hvert sekund i op til 2 min. Et par billeder opnås før perfusion for at opnå en stabil baseline, efterfølgende celleperfusion er indledt, først ved at skylle celler med en opløsning af Krebs Ringers opløsning, der indeholder 100 μM La3 + i 5 sekunder. Dette bør ikke resultere i en ændring i florescence og er en kontrol for at sikre, at cellen (r) holde sig til coverlip hele eksperimentet; efterfølgende skylles en opløsning, der indeholder den valgte agonistiske koncentration, hen over cellen eller cellerne. I eksemplet vist i figur 3Ablev cellerne stimuleret med 5 mM koffein i 20 sekunder. Pilen viser, hvornår koffeinventilen blev åbnet, og dette resulterer i en øjeblikkelig stigning i fluorescerende forhold på 340/380 nm. Efter 20 sekunder lukkes koffeinventilen, og cellerne skylles med Krebs Ringers opløsning, der indeholder 100 μM La3+; fluorescens registreres, indtil basislinjen er nået. For hver koffeinkoncentration beregnes ΔF, det vil sige den koffeininducerede top 340/380 nm fluorescens - den oprindelige hvilende 340/380 nm fluorescens beregnes og bruges til at konstruere en dosisresponskurve som vist i figur 3B. Gennemsnitlig ΔF fra 5-10 celler er i gennemsnit for hver koffein koncentration. Mængden af calcium i intracellulære butikker kan også overvåges. I dette tilfælde skylles cellerne med Krebs Ringers opløsning, der indeholder 0,5 mM EGTA, og en opløsning på 1 μM thapsigargin, 1 μM ionomycin og 0,5 mM EGTA tilsættes i hånden til cellerne (ikke gennem mikroperfusionssystemet, da ionomycin klæber til slangen og ikke kan vaskes af) og fluorescensen registreres i ca. 4-5 min. For at beregne ΔF opnås et interesseområde( ROI), der skitserer en celle, og ændringerne i fluorescens i investeringsafkast beregnes ved hjælp af en billedsoftware.
Sammenfattende bør der, når du bruger EBV udødeliggjorte B-celler til at måle RyR1's følsomhed over for en bestemt agonist, udføres gentagne eksperimenter på celler fra en person på forskellige dage. Ved målinger af cellepopulationer skal de intracellulære calciumlagres status vurderes, og EF50 til agonistisk induceret calciumudslip afbildes i forhold til den samlede mængde calcium, der kan frigives fra butikkerne. En fordel ved at bruge denne fremgangsmåde er, at [Ca2 +] respons af millioner af celler er i gennemsnit; Derudover er der ikke behov for mikroperfusionssystem og fluorescerende mikroskoper. Enkeltcellemetoden tillader brug af et mindre antal celler og online visualisering af ændringer i [Ca2+] af markerede celler.
Enkeltcelle [Ca2+]i målinger i human satellitcelle afledte myotubes
Glas coverslip dyrkede og differentierede myotubes er fyldt med Fura-2, overføres til perfusionskammeret og bades i Krebs Ringers opløsning, der indeholder 2 mM Ca2+ som beskrevet ovenfor for EBV-celler. Sprøjterne i perfusionssystemet er fyldt med den valgte agonist, og myotubes stimuleres som beskrevet ovenfor. Da ikke alle celler på coverlip er multinukleated myotubes, er det vigtigt at vælge de relevante celler, der vil blive målt. Små grupper af myotubes kan stimuleres samtidigt. I eksemplet vist i figur 4blev en enkelt myotube skyllet med en opløsning, der indeholder KCl, forskellige koncentrationer af 4-chloro-m-cresol og endelig koffein, men normalt dosisresponskurver til agonister er konstrueret, som angivet i det foregående afsnit, for at sammenligne den agonistiske følsomhed af celler fra forskellige individer12,15,16 . KCl bruges som en måde at afpolarisere plasmamembranen på. I skelet, muskelplasma membran depolarisering fornemmes af spændingen sensing DHPR, som derved gennemgår en kropsbygning ændring, der fører til aktivering og åbning af RyR1. På den anden side er 4-chloro-m-cresol og koffein direkte farmakologiske aktivatorer af RyR1.
Figur 1: Generering af primær human muskelbiopsi-afledte myoblastkulturer. (A) Små muskelfragmenter (pile) anbringes i skær, der indeholder 0,5 mL vækstmedium. Efter 7-14 dage satellitceller kan ses (små pile) støder op til muskelvæv og vokser på bunden af indsatsen. Billedet er taget gennem et 10x mål (B) og 20x mål (C). De grå bokse i panel A blev brugt til at dække patientens identitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Calcium frigivelse eksperimenter i EBV udødeliggjort B lymfocytter. Ratiometriske [Ca2+]i målinger i en population af Fura-2 lastede celler i suspension. A) Tilsætning af 300 μM 4-chloro-m-cresol (pil) medfører en øjeblikkelig stigning i den cytoplasmatiske [Ca2+], som efterfølgende henfalder tilbage til hvileniveauer inden for 500 sekunder. I dette eksempel er ΔF induceret ved tilsætning af 300 μM 4-chloro-m-cresol 1,7 fluorescensenheder- 1,4 fluorescensenheder = 0,3 fluorescensenheder. B) Tilsætning af SERCA-hæmmeren thapsigargin (400 nM, pil) medfører en større stigning i Fura-2 fluorescensforholdet, som topper ved 2,4 fluorescensenheder og efterfølgende henfalder til hvileniveauer ved 1,45 fluorescensenheder. Den optøning af [Ca2+]er forbigående i den samlede mængde hurtigt frigiveligt calcium i de intracellulære lagre, der er til stede i cellepopulationen. Den opnåede spidsbelastning (2,4-1,45= 0,95 enheder) anvendes til at beregne procentdelen af calcium frigivet ved en given koncentration på 4-chloro-m-cresol. C) Repræsentative dosisresponskurver, der korrelerer ΔF som en procentdel af den samlede mængde hurtigt frigiveligt calcium i intracellulære lagre. For 300 μM 4-chloro-m-cresol er denne værdi 0,3/0,95x100=31,6%. Hvert symbol repræsenterer middelværdien± SEM% af 5-10 værdier fra EBV udødeliggjorte celler fra et kontrolelement (lukkede cirkler, prikket linje) og en MHS-person (lukkede firkanter, kontinuerlig linje), der bærer en RYR1-mutation. Kurverne blev genereret ved hjælp af en sigmoidal dosis-respons kurve funktion. Panel A og B er tilpasset fra Girard et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Koffein-induceret Ca2 + frigivelse i individuelle EBV-udødeliggjorte B lymfocytter fra en kontrol person. A) Toppaneler, tidsfordæmning af(A)Fasekontrast; (B-E), encellede [Ca2+]I målinger af fura-2-loaded EBV-udødeliggjorte lymfocytter: (B) t=0, (C) t=36 s, (D) t=50 s og (E) t=77 s efter påføring af 5 mM koffein. Celler blev individuelt stimuleret ved tilsætning af koffein fortyndet i Krebs-Ringer opløsning. Skalalinje=10 μm. Bundpanel, repræsentativt spor opnået efter stimulering af en enkelt celle med 5 mM koffein (pil). B) Dosisresponskurver, der viser den koffeinafhængige ændring i [Ca2+]i, udtrykt som ændring i fluorescensforholdet (topforhold 340/380 nm−hvileforhold 340/380 nm). Hvert punkt repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM af ændringen i fluorescens af 4-15 celler. Kurverne blev genereret ved hjælp af en sigmoidal dosis-respons kurve funktion. Lukkede firkanter, prikket linje, kontrolceller; lukkede trekanter, kontinuerlig linje, MHS person, der bærer en RYR1-mutation. Dette tal er en tilpasning fra Ducreux et al.13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Calcium frigivelse stimuleret af KCl, 4-chloro-m-cresol og koffein i menneskelige myotubes fra en kontrolperson. Venstre paneler: A) fase kontrast (B-H), enkelt celle intracellulære Ca2 + målinger af Fura-2-loaded menneskelige myotubes. B) hvile [Ca2+]i; C) t=2 s efter påføring af 150 mM KCl. D) t= 2 s efter påføring af 150 μM 4-chloro-m-cresol E) t=2 s efter påføring af 300 μM 4-chloro-m-cresol F) t=2 s efter påføring af 600 μM 4-chloro-m-cresol G) t=2 s efter påføring af 10 mM koffein; H) t= 20 s efter påføring af koffein. Højre panel: Tidsplot (r) versus fluorescensforhold (340/380 nm) i den stimulerede celle. Myotubes blev individuelt stimuleret ved tilsætning af agonisten i Krebs-Ringer buffer indeholdende 100 μM La3 +,således at stigningen i [Ca2 +]i repræsenterer kun frigivelse af calcium fra intracellulære butikker. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollerne beskrevet i dette papir er blevet udnyttet med succes af flere laboratorier til at studere virkningen af RYR1 mutationer på calcium homøostase. De kritiske trin i de tilgange, der er skitseret i dette dokument, vedrører sterilitet, cellekulterende færdigheder og teknikker og tilgængelighed af biologisk materiale. I princippet er brugen af EBV-udødeliggjorte B-lymfocytter enklere og gør det muligt at generere cellelinjer, der indeholder mutante RyR1-kanaler. Cellerne kan fryses og opbevares i flydende nitrogen i mange år, og kulturer kan til enhver tid genoptages. Derudover kan man vælge, om man vil overvåge calcium homøostase i cellepopulationer eller på enkeltcelleniveau. Den tidligere metode er enklere, kræver ikke et fluorescensmikroskop og gør det muligt for investigator at teste cellelinjer genereret fra forskellige individer inden for kort tid. Begrænsningen er hastigheden af cellevækst og tilgængeligheden af et fuldt udstyret (opvarmet og med magnetisk omrører) spektrometer. Som en alternativ tilgang flow cytometri i kombination med fluorescerende calcium indikatorer kan bruges til at måle calcium fluxes i EBV-udødeliggjort B lymfocytter; på en sådan måde kan ændringer i den intracellulære calciumkoncentration bestemmes19. Hvis et fluorescerende mikroskop, perfusionskammer og mikroperfusionssystem er tilgængelige, har enkeltcellet billeddannelse den fordel, at det er mere følsomt og giver mere detaljerede oplysninger, herunder celle til cellevariation, kinetisk analyse og identifikation af subcellulære domæner, der er involveret i calciumfrigivelse. Sidstnævnte tilgang er teknisk mere udfordrende og kræver mere udstyr.
Der er flere fordele ved at bruge EBV-udødeliggjorte B-lymfocytter, herunder at andre parametre til side [Ca2+]i homøostase kan måles. For eksempel er 4-chloro-m-cresol induceret forsuring af B-celler blevet brugt til at skelne celler fra kontrolpersoner fra MHS-patienter20,21. Ikke desto mindre må man huske på (i) at B-celler ikke udtrykker mange af de proteiner, der er involveret i skeletmuskulatur excitation sammentrækning kobling, der indirekte kan påvirke calcium frigivelse, (ii) de er ikke-ophidsede celler således ikke kan aktiveres fysiologisk ved plasmamembran depolarization, og endelig en rapport fra Monnier et al. fandt, at en mutation identificeret i en patient ikke blev udtrykt i EBV-udødeliggjort B-celler på grund af en kryptisk splejs site22.
Patient afledte primære muskelcellekulturer er blevet brugt af flere grupper , der er interesseret i at studere effekten af mutationer i forskellige gener, der kodning proteiner involveret i calcium homøostase10,23,24. Disse celler kan differentieres til multinukleated myotubes, reagere på plasmamembrandepolarisering og kan vurderes ved elektrofysiologiske midler. Derudover kan de udødeliggøres for at opnå cellelinjer, der bærer RYR1-mutationer25, selvom proceduren er langt mere kompleks end for B-lymfocytter. Selv om det også er rigtigt, at muskelcellerne er langsomt voksende, og den nødvendige tid fra at tage en biopsi til at have et tilstrækkeligt antal celler kan være mere end en måned, er det også muligt at gemme de små stykker muskelbiopsier i frysemedium i flydende nitrogen for at opnå myoblasts år senere. De lange dyrkningstider har den ekstra risiko for forurening med bakterier, gær eller skimmelsvampe, og så snart der er opnået et tilstrækkeligt stort antal myoblaster, er det vigtigt at fryse og opbevare dem i flydende nitrogen. Vores laboratorium har med succes anvendt den samme teknik, der er skitseret ovenfor for myotubes, at studere calcium ændringer i human hud-afledt fibroblaster transduced med myoD og differentieret i myotubes26. Dette blev gjort for at studere den funktionelle effekt af RYR1 mutationer, når muskelbiopsi-afledte myoblasts ikke var tilgængelige. Med hensyn til B-lymfocytter, 4-chloro-m-cresol induceret forsuring af myotubes fra patienter med RYR1 mutationer knyttet til MHS er blevet testet med succes27.
Afslutningsvis har brugen af biologisk materiale fra patienter til at studere korrelationen genotype-fænotypen mange fordele ulempen og kan med succes bruges til at studere effekten af mutationer i RYR1. Når du bruger denne tilgang dog, Det er vigtigt at huske på, at mutationer til stede i andre gener kan påvirke calcium homøostase; derfor bør brugen af celler fra forskellige familier, der huser den samme mutation, samt fra familiemedlemmer, der ikke huser RYR1-mutationen som kontroller, udføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Det arbejde, der er beskrevet i dette manuskript blev støttet af tilskud fra Swiss National Science Foundation (SNF) og den schweiziske Muscle Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
