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Bioengineering

माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके जीन डिलीवरी के लिए लिपिड नैनोकणों को तैयार करना और उनकी विशेषता करना

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/62226
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts
* These authors contributed equally

Summary

लिपिड नैनोकणों को एमआरएनए और डीएनए एनकैप्सुलेशन के लिए माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग प्लेटफॉर्म दृष्टिकोण का उपयोग करके विकसित किया जाता है।

Abstract

लिपिड आधारित दवा वाहकों का उपयोग उनके छोटे आकार, जैव अनुकूलता और उच्च एनकैप्सुलेशन दक्षता के कारण चिकित्सकीय और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वितरण प्रणालियों के लिए किया गया है। न्यूक्लिक एसिड को समाहित करने के लिए लिपिड नैनोकणों (एलएनपी) का उपयोग आरएनए या डीएनए को गिरावट से बचाने के लिए लाभप्रद है, जबकि सेलुलर तेज को भी बढ़ावा देता है। एलएनपी में अक्सर एक आयनित लिपिड, सहायक लिपिड, कोलेस्ट्रॉल और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) संयुग्मित लिपिड सहित कई लिपिड घटक होते हैं। एलएनपी आयनित लिपिड उपस्थिति के कारण न्यूक्लिक एसिड को आसानी से समाहित कर सकता है, जो कम पीएच पर cationic है और नकारात्मक रूप से चार्ज आरएनए या डीएनए के साथ जटिलता के लिए अनुमति देता है। यहां एलएनपी एक कार्बनिक चरण में लिपिड घटकों के तेजी से मिश्रण और एक जलीय चरण में न्यूक्लिक एसिड घटक का उपयोग करके मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) या प्लाज्मिड डीएनए (पीडीएनए) को एनकैप्सुलेट करके बनते हैं। यह मिश्रण एक सटीक माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण मंच का उपयोग करके किया जाता है, जो लैमिनार प्रवाह को बनाए रखते हुए नैनोपार्टिकल सेल्फ-असेंबली की अनुमति देता है। हाइड्रोडायनामिक आकार और पॉलीडिस्पर्सिटी को डायनेमिक लाइट स्कैटरिंग (डीएलएस) का उपयोग करके मापा जाता है। एलएनपी पर प्रभावी सतह प्रभारी जीटा क्षमता को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। एनकैप्सुलेशन दक्षता को फ्लोरसेंट डाई का उपयोग करके फंसाए गए न्यूक्लिक एसिड की मात्रा निर्धारित करने के लिए विशेषता है। प्रतिनिधि परिणाम इस विधि की पुनरुत्पादनता और विकसित एलएनपी पर विभिन्न निर्माण और प्रक्रिया मापदंडों के प्रभाव को प्रदर्शित करते हैं।

Introduction

दवा वाहकों का उपयोग कम साइटोटॉक्सीसिटी, जैव उपलब्धता में वृद्धि औरबेहतरस्थिरता 1, 2, 3सहित विशिष्ट अनुकूल गुणों के साथ चिकित्सीय की रक्षा और वितरित करने के लिए कियाजाताहै। पॉलीमेरिक नैनोकणों, माइकल्स और लिपिड आधारित कणों को पहले न्यूक्लिक एसिड एनकैप्सुलेशन और डिलीवरी4, 5,6,7के लिए खोजा गया है। लिपिड का उपयोग विभिन्न प्रकार के नैनोकैरियर प्रणालियों में किया गया है, जिनमें लिपोसोम और लिपिड नैनोकण शामिल हैं, क्योंकि वे उच्चस्थिरता 8के साथ जैव संगत हैं। एलएनपी जीन डिलीवरी9,10के लिए न्यूक्लिक एसिड को आसानी से समाहित कर सकता है । वे प्रणालीगत परिसंचरण11 के दौरान सीरम प्रोटीज द्वारा नाभिक एसिड को गिरावट से बचाते हैं और विशिष्ट साइटों को वितरण में सुधार कर सकते हैं, क्योंकि एलएनपी की सतह स्थलाकृति और भौतिक गुण उनके बायोडिलिएब्यूशन12को प्रभावित करते हैं। एलएनपी भी ऊतक प्रवेश और सेलुलर तेज9में सुधार । पिछले अध्ययनों ने एलएनपी13के भीतर सिरना एनकैप्सुलेशन की सफलता का प्रदर्शन किया है, जिसमें पहले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलएनपी शामिल हैं, जिसमें वंशानुगत ट्रांसथाइरेटिन-मध्यस्थता एमिलॉयडोसिस14 उपचार के उपचार पॉलीन्यूरोपैथी के लिए सिरर्ना चिकित्सीय शामिल है जिसे संयुक्त राज्य अमेरिका खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) और यूरोपीय दवाओं की एजेंसी द्वारा 2018 में अनुमोदित किया गया था। हाल ही में, बड़े न्यूक्लिक एसिड मोइलिएजियों, अर्थात् एमआरएनए और डीएनए9के वितरण के लिए एलएनपी का अध्ययन किया जा रहा है। 2018 तक, नैदानिक परीक्षणों के दौर से गुजर रहे ~ 22 लिपिड-आधारित न्यूक्लिक एसिड डिलीवरी सिस्टमथे। इसके अतिरिक्त, एलएनपी युक्त एमआरएनए वर्तमान में उम्मीदवारों का नेतृत्व कर रहे हैं और उन्हें COVID-19 वैक्सीन15, 16के लिएनियोजितकिया गया है। इन गैर वायरल जीन चिकित्सा के लिए संभावित सफलता के लिए छोटे (~ 100 एनएम), स्थिर, और न्यूक्लिक एसिड के उच्च encapsulation के साथ समान कणों के गठन की आवश्यकता है।

एलएनपी फॉर्मूलेशन में एक मुख्य घटक के रूप में एक आयनित लिपिड का उपयोग जटिलता, एनकैप्सुलेशन और डिलीवरी एफिलिएंसी14के लिए फायदे दिखाए गए हैं। आयनिज्य लिपिड में आमतौर पर 7 < एक एसिड वियोजन स्थिर (पीकेए) होता है; उदाहरण के लिए, एफडीए अनुमोदित एलएनपी फॉर्मूलेशन में उपयोग किए जाने वाले आयनीकृत लिपिड में 6.44 17 का एक पीकेए है, डिनोलेलेमेमेथाइल-4-डाइमेथिलमिनोब्यूटिरेट (डी-लिन-एमसी3-डीएमए), 6.4417का एक पीसीए है। कम पीएच पर, आयनिज्य लिपिड पर अमीन समूह प्रोटोनेटेड और सकारात्मक रूप से चार्ज हो जाते हैं, जिससे एमआरएनए और डीएनए पर नकारात्मक रूप से चार्ज फॉस्फेट समूहों के साथ असेंबली के लिए अनुमति मिलती है। अमीन का अनुपात, "एन", समूहों को फॉस्फेट, "पी", समूहों का उपयोग असेंबली को अनुकूलित करने के लिए किया जाता है। एन/पी अनुपात लिपिड और न्यूक्लिक एसिड पर निर्भर करता है, जो फॉर्मूलेशन18के आधार पर बदलता रहता है । गठन के बाद, पीएच चिकित्सकीय प्रशासन के लिए अनुमति देने के लिए एक तटस्थ या शारीरिक पीएच के लिए समायोजित किया जा सकता है। इन पीएच मूल्यों पर, आयनज्जित लिपिड को भी कम किया जाता है जो एलएनपी को तटस्थ सतह प्रभार प्रदान करता है।

आयनजित लिपिड भी एंडोसोमल एस्केप19,20में एड्स करता है । एलएनपी को सेलुलर तेज के दौरान एंडोसाइटोसिस से गुजरना पड़ता है और एमआरएनए कार्गो को कोशिका साइटोप्लाज्म या डीएनए कार्गो में नाभिक21तक पहुंचाने के लिए एंडोसोम से छोड़ा जाना चाहिए । एंडोसोम के अंदर आमतौर पर बाह्य माध्यम की तुलना में अधिक अम्लीय वातावरण होता है, जो आयनजम्य लिपिड को सकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है22,23। सकारात्मक रूप से चार्ज आयनजी योग्य लिपिड एंडोसोम लिपिड झिल्ली पर नकारात्मक आरोपों के साथ बातचीत कर सकता है, जो एलएनपी और न्यूक्लिक एसिड की रिहाई के लिए अनुमति देने वाले एंडोसोम के अस्थिर हो सकते हैं। वर्तमान में एलएनपी वितरण दोनों की प्रभावकारिता में सुधार के साथ-साथ एंडोसोमल एस्केप14के लिए विभिन्न आयनित लिपिड का अध्ययन किया जा रहा है ।

एलएनपी के अन्य विशिष्ट घटकों में सहायक लिपिड शामिल हैं, जैसे कि फॉस्फेटिडिलकोलिन (पीसी) या फॉस्फोथेनोलामाइन (पीई) लिपिड। 1,2-डायोलियोल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोएनेलामाइन (डोप), 1,2-डिटेरोइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीएसपीसी), और 1,2-डायोलियोल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (डीओपीसी) आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले लिपिड2425हैं। डोप को एक उल्टे षट्कोणीय द्वितीय (एचआईआई) चरण बनाने और झिल्ली संलयन26द्वारा ट्रांसफेक्शन को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, जबकि डीएसपीसी को अपनी बेलनाकार ज्यामिति27के साथ एलएनपी को स्थिर करने के लिए सोचा गया है । झिल्ली कठोरता को बढ़ाने के लिए कोलेस्ट्रॉल को निर्माण में भी शामिल किया जाता है, बाद में एलएनपी की स्थिरता में सहायता करता है। अंत में, लिपिड-संयुग्मित पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) को निर्माण में शामिल किया गया है ताकि कण आत्म-असेंबली27में सहायता के लिए आवश्यक स्टीरिक बाधा प्रदान की जा सके। खूंटी एकत्रीकरण को रोककर एलएनपी की भंडारण स्थिरता में भी सुधार करता है । इसके अलावा, खूंटी अक्सर एक चुपके घटक के रूप में प्रयोग किया जाता है और एलएनपी के लिए परिसंचरण समय बढ़ा सकते हैं। हालांकि, यह विशेषता एपोलीपोप्रोटीन ई (एपोई)28द्वारा संचालित एक अंतर्जात लक्ष्यीकरण तंत्र के माध्यम से हेपेटोसाइट्स को एलएनपी की भर्ती के लिए चुनौतियां भी पैदा कर सकती है। इस प्रकार, अध्ययनों ने एलएनपी से खूंटी के प्रसार के लिए एसील चेन लंबाई की जांच की है, यह पाते हुए कि एलएनपी से कम लंबाई (सी8-14) अलग हो जाती है और लंबे समय तक एसील लंबाई28की तुलना में एपोई भर्ती के लिए अधिक उत्तरदायी हैं। इसके अलावा, लिपिड पूंछ के संतृप्ति की डिग्री जिसे खूंटी को संयुग्मित किया गया है, एलएनपी29के ऊतक वितरण को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। हाल ही में, ट्वीन 20, जो जैविक दवा उत्पाद योगों में आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला एक लंबे समय से असंतृप्त लिपिड पूंछ है, को खूंटी-डीएसपीई की तुलना में लिम्फ नोड्स को निकालने में उच्च ट्रांसफेक्शन दिखाया गया था, जो काफी हद तक इंजेक्शन साइट29पर मांसपेशियों को संक्रमित करता है। वांछित एलएनपी बायोडिलिएब्यूशन प्राप्त करने के लिए इस पैरामीटर को अनुकूलित किया जा सकता है।

एलएनपी बनाने के पारंपरिक तरीकों में पतली फिल्म हाइड्रेशन विधि और इथेनॉल-इंजेक्शन विधि27शामिल हैं। हालांकि ये आसानी से उपलब्ध तकनीकें हैं, वे श्रम गहन भी हैं, जिसके परिणामस्वरूप कम एनकैप्सुलेशन दक्षता हो सकती है, और27को स्केल करना चुनौतीपूर्ण है। मिश्रण तकनीकों में प्रगति के परिणामस्वरूप अधिक समान कणों को विकसित करते हुए, स्केल करने के लिए अधिक उत्तरदायी तरीकेहुएहैं। इन तरीकों में टी-जंक्शन मिश्रण, कंपित हेरिंगबोन मिश्रण, और माइक्रोफ्लुइडिक हाइड्रोडायनामिक फोकसिंग27शामिल हैं। प्रत्येक विधि में एक अनूठी संरचना होती है, लेकिन सभी लिपिड घटकों वाले कार्बनिक चरण के साथ न्यूक्लिक एसिड युक्त जलीय चरण के तेजी से मिश्रण के लिए अनुमति देते हैं, जिसके परिणामस्वरूप न्यूक्लिक एसिड27का उच्च एनकैप्सुलेशन होता है। इस प्रोटोकॉल में, माइक्रोफ्लुइडिक कारतूस के माध्यम से तेजी से और नियंत्रित मिश्रण का उपयोग किया जाता है, जो कंपित हेरिंगबोन मिश्रण डिजाइन को नियोजित करता है। यह प्रोटोकॉल एलएनपी युक्त न्यूक्लिक एसिड की तैयारी, असेंबली और लक्षण वर्णन को रेखांकित करता है।

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Protocol

चित्रा 1में समग्र प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रदान किया जाता है ।

1. बफ़र्स की तैयारी

नोट: बफ़र्स की बाँझ फ़िल्टरिंग यहां किसी भी कण को हटाने के लिए अत्यधिक सुझाव दिया जाता है जो न्यूक्लिक एसिड और एलएनपी गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है।

  1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)
    1. 8 एमएम एनए 2 एचपीओ4, 2एमएम केएच2पीओ4, 137 एमएम एनएसीएल और 2.7 एमएम केसीएल का उपयोग करके न्यूक्लियस फ्री वॉटर में 1x पीबीएस तैयार करें और पीएच को 7.4 में एडजस्ट करें।
    2. 0.22 माइक्रोन पोर-आकार फिल्टर का उपयोग करके वैक्यूम फिल्ट्रेशन द्वारा स्टरलाइज करें।
  2. साइट्रेट बफर
    1. 5 एमएम सोडियम साइट्रेट, 5 एमएम साइट्रिक एसिड, और न्यूक्लियस फ्री वॉटर में 150 एमएम सोडियम क्लोराइड का इस्तेमाल करते हुए साइट्रेट बफर तैयार करें और पीएच 4.5 में एडजस्ट करें।
    2. 0.22 माइक्रोन पोर-आकार फिल्टर का उपयोग करके वैक्यूम फिल्ट्रेशन द्वारा स्टरलाइज करें।
      नोट: साइट्रेट बफर को केवल तैयार करने की आवश्यकता है यदि एमआरएनए न्यूक्लिक एसिड है जिसे एलएनपी में समझाया जाएगा। यदि डीएनए समझाया जाएगा 1.2 छोड़ दें और 1.3 करने के लिए आगे बढ़ें।
  3. मैलिक एसिड बफर
    1. न्यूक्लियस फ्री वॉटर में 20 एमएम मैलिक एसिड और 30 एमएम सोडियम क्लोराइड का इस्तेमाल करते हुए मैलिक एसिड बफर तैयार करें और पीएच 3.0 में एडजस्ट करें।
    2. 0.22 माइक्रोन पोर-आकार फिल्टर का उपयोग करके वैक्यूम फिल्ट्रेशन द्वारा स्टरलाइज करें।
      नोट: मैलिक एसिड बफर को केवल तभी तैयार करने की जरूरत है जब डीएनए न्यूक्लिक एसिड है जिसे एलएनपी में समझाया जाएगा । यदि एमआरएनए को समझाया जाना है तो 1.3 छोड़ें। साइट्रेट बफर का उपयोग एमआरएनए एनकैप्सुलेशन के लिए किया जाता है, क्योंकि मैलिक एसिड बफर के साथ 3.0 के निचले पीएच से एमआरएनए के क्षरण की संभावना बढ़ सकती है। यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।

2. लिपिड मिश्रण की तैयारी

  1. यदि स्टॉक लिपिड पाउडर के रूप में हैं, तो शुद्ध 200 प्रूफ इथेनॉल में घुलनशील करें।
  2. वांछित मोलर अनुपात के आधार पर लिपिड घटकों के आवश्यक मिश्रण की गणना करें। 50:10:39:1 का एक मोलर अनुपात (आयनिज्य लिपिड: सहायक लिपिड: कोलेस्ट्रॉल: खूंटी) का उपयोग यहां 10 mm की कुल लिपिड एकाग्रता के लिए एक उदाहरण के रूप में किया जाएगा। तालिका 1 इन घटकों में से प्रत्येक के लिए आवश्यक सांद्रता और मात्रा को दर्शाता है।
    नोट: माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर के लिए इथेनॉल (एटोह) में लिपिड मिश्रण एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करते समय, कुल मात्रा यह सुनिश्चित करने के लिए हिसाब है कि एटोह का जोड़ लिपिड सांद्रता को प्रभावित नहीं करता है। उदाहरण के लिए, 68.5 माइक्रोन की एक आयनित लिपिड मात्रा की गणना इथेनॉल में 5 एमएमएस एकाग्रता को 533 माइक्रोन की कुल लिपिड मिश्रण मात्रा से गुणा करके और फिर 38.9 m M के स्टॉक लिपिड एकाग्रता द्वारा विभाजित करके की जाती है।
  3. घटकों को आंतरायिक भंवर के साथ मिश्रण करने की अनुमति देने के लिए प्रत्येक लिपिड स्टॉक समाधान की उचित मात्रा को कांच की शीशी में जोड़ें। 533 माइक्रोन के कुल मिश्रण के लिए 200 प्रूफ इथेनॉल जोड़ें। तालिका 1में उदाहरण के लिए, यह इथेनॉल का 254 माइक्रोन है।
    नोट: एलएनपी के 1 एमसीएल का उत्पादन करने के लिए एक ही रन के लिए, लिपिड समाधान के 342.5 माइक्रोन की आवश्यकता है। यह नमूना संग्रह से पहले और बाद में कुछ मात्रा के साथ कार्बनिक लिपिड समाधान के लिए जलीय न्यूक्लिक एसिड के 3:1 मिश्रण के कारण है। ओवरएज के रूप में भरपाई के लिए 533 माइक्रोन का मिश्रण बनाया जाता है।

3. न्यूक्लिक एसिड समाधान की तैयारी

नोट: जहां भी संभव हो, न्यूक्लिक एसिड समाधानों की तैयारी और हैंडलिंग को बाँझ और RNase-मुक्त वातावरण में किया जाना है। न्यूक्लिक एसिड के साथ जब भी संभव हो जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करें।

  1. एन/पी अनुपात की गणना करें । एन/पी अनुपात नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए न्यूक्लिक एसिड फॉस्फेट समूहों (पी) की कुल संख्या के लिए आयनिज्य लिपिड अमीन समूहों (एन) की कुल संख्या है । एन/पी अनुपात अक्सर एक पैरामीटर है जिसे एलएनपी गठन के दौरान अनुकूलित किया जा सकता है । नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. नीचे दिए गए सूत्र का उपयोग करके एन इकाइयों की संख्या की गणना करें:
      Equation 1
      नोट: आयनिज्य लिपिड एकाग्रता(तालिका 1)5 mM है, जो 5 x10-6 मोल/एमएल के बराबर है । आवश्यक लिपिड इंजेक्शन की मात्रा 0.3425 एमएल है। उदाहरण के लिए, यदि उपरोक्त समीकरण का उपयोग करके प्रति अणु एन इकाइयों की संख्या 1 है, तो लिपिड मिश्रण में 1.03 x10 18 एन इकाइयां हैं।
    2. वांछित एन/पी अनुपात के लिए पी इकाइयों की गणना करें। यहां एक N/P = ३६ उदाहरण के लिए प्रयोग किया जाता है ।
      Equation 2
  2. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके 2.86 x 1016 पी इकाइयों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता की गणना करें।
    Equation 3
    जहां, एमआरएनए के लिए प्रति बेस पेयर पी यूनिट्स की संख्या 1 और डीएनए 2 है। 1,200 ठिकानों के साथ एक एमआरएनए के लिए, एन/पी = 36 के लिए आवश्यक एमआरएनए की मात्रा 3.96 x 10-11 मॉल है।
  3. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके एन/पी = 36 के लिए आवश्यक एमआरएनए की सामूहिक एकाग्रता की गणना करें।
    Equation 4
    रिबोन्यूक्लियोटाइड मोनोफॉस्फेट इकाई का औसत आणविक भार 322 ग्राम / मोल30है . 1,200-बेस एमआरएनए के साथ, एमआरएनए का आणविक वजन 386,400 ग्राम/मोल है। न्यूक्लिक एसिड समाधान के आवश्यक इंजेक्शन की मात्रा 1.028 एमएल है। इस प्रकार, एमआरएनए की आवश्यकता 1.488x10-5 ग्राम/एमएल है, जो 14.88 माइक्रोग्राम/एमएल है।
  4. साइट्रेट बफर में एमआरएनए के 14.88 μg/mL के 1.5 एमएल बनाओ।
    नोट: जब डीएनए न्यूक्लिक एसिड समझाया जाएगा, मैलिक एसिड बफर का उपयोग करने के लिए नाभिक एसिड समाधान बनाने के लिए ।

4. माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को भड़काना

नोट: यह प्रोटोकॉल साधन निर्माता के दिशानिर्देशों से अनुकूलित है।

  1. उपयुक्त फ़ील्ड(टेबल 2)पर क्लिक करके इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर में प्राइमिंग पैरामीटर इनपुट करें।
    नोट: 3:1 के प्रवाह अनुपात और 4-12 एमएल/न्यूनतम के प्रवाह दर की सिफारिश की जाती है27,31 । यह यहां प्रस्तुत अध्ययनों के साथ-साथ निर्माता द्वारा इष्टतम दिखाया गया है। यदि यह आवेदन के प्रति रुचि का है तो यह विविध हो सकता है।
  2. उपकरण ढक्कन खोलें और घूर्णन ब्लॉक में एक माइक्रोफ्लुइडिक कारतूस रखें।
  3. 1 एमएल सिरिंज में इथेनॉल के कम से कम 0.5 मिलीएल ड्रा करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सिरिंज टिप पर कोई बुलबुले या हवा अंतराल नहीं हैं। कारतूस के दाहिने प्रवेश में इस सिरिंज लोड।
  4. जलीय बफर (डीएनए के लिए आरएनए और मैलिक एसिड के लिए साइट्रेट) के 1.5 एमएल के साथ 3 एमएल सिरिंज भरें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई हवा के बुलबुले या अंतराल नहीं हैं। कारतूस के बाएं प्रवेश में इस सिरिंज लोड करें।
  5. अपशिष्ट कंटेनरों के रूप में सेवा करने के लिए क्लिप धारकों में दो 15 एमएल शंकु ट्यूब डालें।
  6. मिश्रण शुरू करने के लिए इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर में रन पर क्लिक करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पैरामीटर सही ढंग से इनपुट हैं।
  7. जब उपकरण भड़काना बंद हो जाता है, नीचे नीली रोशनी बंद करके संकेत दिया, ढक्कन खोलने और ठीक से शंकु ट्यूबों और सीरिंज का निपटान ।

5. एलएनपी गठन

नोट: यह प्रोटोकॉल साधन निर्माता के दिशानिर्देशों से अनुकूलित है।

  1. उपयुक्त फ़ील्ड(टेबल 2)पर क्लिक करके फॉर्मूलेशन मापदंडों के साथ सॉफ्टवेयर को अपडेट करें।
  2. लिपिड मिश्रण (चरण 2 में तैयार) के साथ एक 1 एमएल सिरिंज भरें। सिरिंज टिप पर किसी भी हवा अंतराल या बुलबुले को हटा दें और कारतूस के दाईं ओर सिरिंज डालें।
  3. न्यूक्लिक एसिड समाधान (चरण 3 में तैयार) को 3 एमएल सिरिंज में खींचें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सिरिंज टिप में कोई बुलबुले या हवा अंतराल नहीं हैं। कारतूस के बाएं प्रवेश में सिरिंज डालें।
    नोट: एलएनपी का 1 एमएलए समाधान बनाने के लिए वॉल्यूम प्रदान किए जाते हैं। यह उपकरण 10 एमएल तक सिरिंज के आकार को शामिल कर सकता है, और परिणाम पर कोई प्रभाव नहीं होने के साथ मात्रा को तदनुसार बढ़ाया जा सकता है। एक तैयारी में तैयार किए जा सकते हैं कि एलएनपी की अधिकतम मात्रा 12 ml है।
  4. नमूना नाम के साथ एक 15 एमएल RNase मुक्त शंकु ट्यूब लेबल और बाईं ट्यूब क्लिप में डालें । सही ट्यूब क्लिप में 15 एमएल वेस्ट कोनिकल रखें।
  5. मापदंडों के सही इनपुट की पुष्टि करने के बाद, इंस्ट्रूमेंट ढक्कन और क्लिक रनको बंद करें।
  6. उपकरण चलने के बाद, कचरे के कंटेनर और कारतूस को ठीक से त्याग दें। एलएनपी नमूने के साथ शंकु नली बनाए रखें।
  7. <5% (v/v) के लिए इथेनॉल को कम करने के लिए पीबीएस के साथ एलएनपी 5x को पतला करें।
    नोट: गिरावट को रोकने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण के बाद जितनी जल्दी हो सके पीबीएस में एलएनपी को पतला करना महत्वपूर्ण है। हमेशा एक जैवसेफ्टी कैबिनेट में कमजोर पड़ने और बफर एक्सचेंजों में जैवसेफ्टी कैबिनेट में काम करना जारी रखते हैं।

6. बफर एक्सचेंज

नोट: अल्ट्रा-सेंट्रलाइज फ़िल्टर का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। हालांकि इस विधि के परिणामस्वरूप बफ़र्स का अधिक समय कुशल आदान-प्रदान होता है, डायलिसिस को यहां प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

  1. पीबीएस के 2 एमएल के साथ 5 मिनट के लिए 1000 एक्स जी पर सेंट्रलाइज करके एक अल्ट्रा-सेंट्रलाइज फिल्टर (100 केडीए पोर आकार) को प्री-वॉश करें। नीचे के डिब्बे से पीबीएस खाली करें।
    नोट: PBS को पीएच को 7.4 ± 0.2 तक बढ़ाने के लिए चुना जाता है, जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक है और इसके परिणामस्वरूप तटस्थ शुल्क होने वाले आयनिज़ योग्य लिपिड होंगे।
  2. 12 मिनट के लिए 1000 x g पर पूर्व-धोए गए अल्ट्रा-सेंट्रलाइज फिल्टर और सेंट्रलाइज के शीर्ष डिब्बे में पतला एलएनपी जोड़ें।
  3. नीचे के डिब्बे से प्रवाह के माध्यम से त्यागें। हर बार अल्ट्रा-सेंट्रलाइज फिल्टर में पीबीएस के 5 एमएल जोड़कर दो और वॉश करें। एक ही मापदंडों पर सेंट्रलाइज। कोई अधिकतम मात्रा नहीं है जिसे बनाए रखने की आवश्यकता है ।
    नोट: यदि एलएनपी की एक स्केल्ड-अप मात्रा तैयार की गई थी, तो तदनुसार प्रत्येक धोने के लिए पीबीएस की मात्रा बढ़ाएं। उदाहरण के लिए, यदि एलएनपी के 2 मिलीएल एक ही रन में तैयार किए गए थे, तो प्रति वॉश 10 एमएल पीबीएस का सुझाव दिया जाता है।
  4. एलएनपी नुकसान को कम करने के लिए कई बार अल्ट्रा-सेंट्रलाइज फिल्टर की दीवारों के खिलाफ एलएनपी समाधान को पिपेट करें। एलएनपी समाधान को अल्ट्रा-सेंट्रलाइज फिल्टर से निकालें और नाभिक मुक्त शीशी में स्टोर करें। 1 मिलीएल के एलएनपी समाधान की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए आवश्यक होने पर पीबीएस जोड़ें।
  5. यदि आवश्यक हो तो प्री-वेट 0.2 माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

7. उपाय एनकैप्सुलेशन दक्षता

  1. पीबीएस में काम करने वाले न्यूक्लिक एसिड समाधान के 2 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने से एक मानक वक्र तैयार करें, जो 500 एनजी/एमएल की उच्चतम एकाग्रता के साथ शुरू होता है, और कम से कम पांच कमजोर पड़ने लगता है। एक खाली के रूप में पीबीएस का उपयोग करें।
  2. एलएनपी नमूना कमजोर पड़ने की तैयारी करें। पीबीएस के साथ एलएनपी नमूनों को पतला करें, एक अनुमानित सैद्धांतिक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जो मानक वक्र के मध्य बिंदु के आसपास स्थित है (उदाहरण के लिए प्रारंभिक एकाग्रता से अनुमानित न्यूक्लिक एसिड का ~ 250 एनजी/एमएल)।
  3. एलएनपी को बाधित करने और एलएनपी के अंदर और बाहर न्यूक्लिक एसिड की कुल मात्रा को मापने के लिए ट्राइटनएक्स-100 के साथ आरएनए क्वांटिफिकेशन रीएजेंट (एमआरएनए माप के लिए) का समाधान तैयार करें। इस समाधान में 0.5% (v/v) आरएनए रिएजेंट, 0.4% (v/v) ट्राइटनएक्स-100, और 99.1% (v/v) पीबीएस शामिल हैं।
  4. एलएनपी में एनक्लोज नहीं होने वाले न्यूक्लिक एसिड की मात्रा को मापने के लिए ट्राइटनएक्स-100 के बिना रिएजेंट का समाधान तैयार करें। इस समाधान में 0.5% (v/v) आरएनए रिएजेंट और 99.5% (v/v) पीबीएस शामिल हैं।
    नोट: यदि एलएनपी डबल फंसे डीएनए (डीएसडीएनए), जैसे प्लाज्मिड डीएनए को समाहित करते हैं, तो इसी प्रक्रिया का पालन करते हुए 7.3 और 7.4 में डीएसडीएनए रिएजेंट का उपयोग करें।
  5. एक 96-अच्छी तरह से काले फ्लोरेसेंस सक्षम प्लेट में, एलएनपी और न्यूक्लिक एसिड मानक समाधान ों में से प्रत्येक की कम से कम चार प्रतिकृति 7.1 और 7.2 में तैयार लोड करें।
  6. मानकों और नमूनों की प्रतिकृति के आधे करने के लिए, ट्राइटनएक्स-100 युक्त अभिकर्मक की बराबर मात्रा जोड़ें। यह न्यूक्लिक एसिड की कुल मात्रा का आकलन करेगा।
  7. मानकों और नमूनों के शेष कुओं के लिए, ट्राइटनएक्स-100 के बिना रिएजेंट की बराबर मात्रा जोड़ें। यह एलएनपी के अंदर नकसक एसिड की मात्रा का आकलन करेगा।
  8. जोड़ा अभिकर्धित के साथ मानकों और नमूनों के पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए थाली हिला, प्रकाश जोखिम से बचने के लिए सावधानी बरतते हुए ।
  9. एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग कर फ्लोरेसेंस को मापें, जिसमें 480 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 520 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य है।
  10. ट्राइटनएक्स-100 के बिना रिएजेंट के अलावा बने मानक वक्र का उपयोग करके एलएनपी के बाहर न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता की गणना करें। 7.2 में उपयोग किए जाने वाले कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करें।
  11. ट्राइटोनएक्स-100 युक्त रिएजेंट के अलावा बने मानक वक्र का उपयोग करके एलएनपी के अंदर और बाहर दोनों न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता की गणना करें। 7.2 में उपयोग किए जाने वाले कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करें।
  12. न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता को अंदर और बाहर दोनों से बाहर (चरण 7.10 से गणना) से घटाकर अंदर न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता की गणना करें (चरण 7.11 से गणना)
  13. एलएनपी के अंदर न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता के अनुपात से एनकैप्सुलेशन दक्षता की मात्रा निर्धारित करें (चरण 7.12 से गणना) और न्यूक्लिक एसिड की कुल एकाग्रता (चरण 7.11 से गणना)।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

8. एकाग्रता समायोजन

  1. यदि आवश्यक हो, तो एनकैप्सुलेशन दक्षता से परिणामों का उपयोग करके एलएनपी समाधान के भीतर न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता को समायोजित करें।
  2. यदि कम केंद्रित समाधान वांछित है, तो वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पीबीएस के साथ समाधान को पतला करें।
  3. यदि अधिक केंद्रित समाधान वांछित है, तो अल्ट्रा-सेंट्रलाइज फ़िल्टर का उपयोग करके अतिरिक्त अपकेंद्रित्र रन करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

9. एलएनपी हाइड्रोडायनामिक आकार और पॉलीडिसपर्सिटी को मापें

  1. 1 मिलीएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए पीबीएस के साथ एलएनपी समाधान 40x का एक एलिकोट पतला करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो इस कमजोर पड़ने को बदला जा सकता है। यह कमजोर पड़ने मूल्य का सुझाव दिया जाता है क्योंकि यह गुणवत्ता परिणाम प्रदान करते समय एलएनपी स्टॉक समाधान की एक छोटी मात्रा का उपयोग करता है।
  2. एक अर्ध-माइक्रो क्यूवेट का उपयोग करके, हाइड्रोडायनामिक व्यास और पॉलीडिस्परिटी इंडेक्स को मापें। क्यूवेट में एलएनपी समाधान जोड़ें और उपकरण में डालें। माप प्रकार, नमूना विवरण (सामग्री, फैलाव, तापमान, और सेल प्रकार), और माप निर्देश (रन की संख्या) को शामिल करने के लिए उपकरण सॉफ्टवेयर में एक ऑपरेटिंग प्रक्रिया सेट करें। माप अधिग्रहण शुरू करने के लिए तैयार होने पर शुरू करें क्लिक करें।

10. उपाय LNP जीटा क्षमता

  1. 1 मिलीएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए नाभिक मुक्त पानी के साथ एलएनपी समाधान 40x का एक एलिकोट पतला करें।
    नोट: नाभिक मुक्त पानी का उपयोग चालकता पर उच्च नमक बफ़र्स के प्रभाव को कम करने के लिए जीटा संभावित मापों के लिए सॉल्वेंट के रूप में किया जाता है।
  2. एक मुड़ा हुआ केशिका जीटा सेल का उपयोग करके, जीटा क्षमता को मापें।
    1. एलएनपी समाधान को भरने की रेखा तक क्यूवेट में जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि इलेक्ट्रोड उपकरण के साथ संपर्क कर रहे हैं साधन में डालें।
    2. माप प्रकार, नमूना विवरण (सामग्री, फैलाव, तापमान, और सेल प्रकार), और माप निर्देश (रन की संख्या) को शामिल करने के लिए उपकरण सॉफ्टवेयर में एक ऑपरेटिंग प्रक्रिया सेट करें। माप अधिग्रहण शुरू करने के लिए तैयार होने पर शुरू करें क्लिक करें।

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Representative Results

तकनीक की प्रजनन क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए एक ही लिपिड फॉर्मूलेशन और 6 के एन/पी अनुपात के साथ एलएनपी के कई बैच अलग-अलग दिनों में विकसित किए गए थे। बैच 1 और 2 के परिणामस्वरूप समान पॉलीडिसपरिटी के साथ ओवरलैपिंग आकार वितरण हुआ(चित्रा 2 ए)दो अलग-अलग बैचों(चित्रा 2 B)के बीच आकार या एनकैप्सुलेशन दक्षता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। प्रत्येक बैच (>98.5%) के लिए एनकैप्सुलेशन दक्षता अधिक थी और आकार 77 एनएम एलएनपी व्यास के समान थे। यह कण बैच 1 के लिए 015 और बैच 2 के लिए 0.18 के औसत पॉलीडिस्पिटी इंडेक्स (पीडीआई) के साथ एक समान थे।

निर्माण मापदंडों में परिवर्तन एन/पी अनुपात, आयनित लिपिड का इस्तेमाल किया, और नाभिक एसिड समझाया के संबंध में कुछ छोटे, अभी तक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद दिखाया । जबकि मतभेदों पर चर्चा की जाती है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सभी एलएनपी का गठन 80% से अधिक है, जिसमें अधिकांश फॉर्मूलेशन 95% से अधिक हैं, और कण का आकार 110 एनएम से कम है, जिससे जीन वितरण के लिए यहां सभी फॉर्मूलेशन विकसित होते हैं। सबसे पहले, आयनाइजेबल लिपिड ए का उपयोग 10 और ३६ के एन/पी में एलएनपी विकसित करने के लिए किया गया था । एन/पी अनुपात को कम करने के परिणामस्वरूप एनकैप्सुलेशन दक्षता में 4% की कमी आई और एलएनपी के हाइड्रोडायनामिक व्यास में एन/पी = ३६ से १०९ एनएम तक एन/पी = 10(चित्रा 3 ए)में वृद्धि हुई । आयनित लिपिड ए के साथ एलएनपी की तुलना एक अलग आयनित लिपिड बी से करें और 36 के एन/पी को बनाए रखने के परिणामस्वरूप एनकैप्सुलेशन दक्षता में महत्वपूर्ण परिवर्तन हुआ, जहां 100% पीडीएनए को आयनिज्य लिपिड ए का उपयोग करके गठित एलएनपी के साथ समझाया गया था और पीडीएनए का 81% आईएनज़बल लिपिड(चित्रा 3 बीबी)का उपयोग करके एलएनपीएस के साथ समझाया गया था। Ionizable लिपिड बी एलएनपी के परिणामस्वरूप 95 एनएम के हाइड्रोडायनामिक व्यास के साथ थोड़ा छोटे कण भी हुए। अंत में, एलएनपी का गठन एमआरएनए और पीडीएनए दोनों के साथ आयनिज्य लिपिड ए का उपयोग करके किया गया था। एलएनपी ने पीडीएनए को समाहित करने के परिणामस्वरूप 91 एनएम व्यास(चित्रा 3सी)के साथ एमआरएनए एलएनपी के साथ तुलना में 119 एनएम व्यास वाले बड़े कणों का परिणाम हुआ। पीडीएनए और एमआरएनए एलएनपी दोनों के परिणामस्वरूप ~ 91-94% पर समान एनकैप्सुलेशन दक्षता हुई।

अंत में, प्रवाह दर प्रक्रिया पैरामीटर में परिवर्तन ने यहां परीक्षण की गई प्रवाह दरों पर विकसित एलएनपी को प्रभावित नहीं किया। 4 एमएल/मिन और 12 एमएल/मिन दोनों में एलएनपी को विकसित किया गया था और इसकी विशेषता है कि उन्होंने ९६% पीडीएनए को समझाया है और ११० एनएम व्यास(चित्रा 4)है । प्रक्रिया पैरामीटर या फॉर्मूलेशन पैरामीटर की परवाह किए बिना सभी एलएनपी के परिणामस्वरूप चार्ज न्यूट्रल जेटा संभावित माप हुए।

Figure 1
चित्रा 1:एलएनपी विकास और लक्षण वर्णन कार्यप्रवाह। सबसे पहले, लिपिड मिश्रण और न्यूक्लिक एसिड समाधान(1 और 2)बनाए जाते हैं। लिपिड मिश्रण में इथेनॉल में आयनिज्य लिपिड, हेल्पर लिपिड, कोलेस्ट्रॉल और खूंटी होता है, जबकि न्यूक्लिक एसिड समाधान में बफर में या तो एमआरएनए या डीएनए होता है। समाधान एक माइक्रोफ्लुइडिक कारतूस(3)का उपयोग करके मिश्रित किए जाते हैं, जो एलएनपी(4)बनाता है। इसके बाद, इथेनॉल को हटाने और समाधान पीएच को तटस्थ(5)में वृद्धि करने के लिए एक बफर एक्सचेंज की आवश्यकता होती है। एलएनपी का लक्षण वर्णन क्रमशः(6 और 7)फ्लोरेसेंस माइक्रोप्लेट परख और जेटाइज़र का उपयोग करके एनकैप्सुलेशन दक्षता और कण आकार, पॉलीडिस्परिटी और जीटा क्षमता निर्धारित करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2-अलग-अलग दिनों में गठित एलएनपी की बैच टू इंप्रूवमेंट क्षमता। (ए)बैच 1 बनाम बैच 2(बी)एनकैप्सुलेशन एफिशिएंसी (%) और एमआरएनए और एन/पी = 6 के साथ प्रत्येक बैच के लिए हाइड्रोडायनामिक व्यास (एनएम) के लिए आकार वितरण । त्रुटि बार मानक विचलन नोट करते हैं। α = 0.05 के साथ दो तरह के एनोवा का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय विश्लेषण कोई महत्व नहीं दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-निर्माण मापदंडों में भिन्नता। (ए)एलएनपी एन/पी = 10 और 36 में गठित पीडीएनए के साथ आयनिज्य लिपिड ए का उपयोग करके। (ख)एलएनपी ने पीडीएनए के साथ एन/पी = ३६ दोनों में आयनिज्य लिपिड ए और आयनाइजेबल लिपिड बी के साथ गठित किया । (C)एलएनपी्स या तो एमआरएनए या पीडीएनए के साथ गठित एन/पी = 6 में आयनित लिपिड सी का उपयोग करके । त्रुटि बार मानक विचलन नोट करते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण α = 0.05 के साथ दो तरह से ANOVA का उपयोग कर किया गया था; * पी<0.05; **p<0.01; पी<0.001; पी<0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:प्रक्रिया मापदंडों की भिन्नता। एलएनपी 4 और 12 एमएल/मिन की प्रवाह दर पर गठित एन/पी = 10 में पीडीएनए के साथ आयनाइज्ड लिपिड ए का उपयोग करके । त्रुटि बार मानक विचलन नोट करते हैं। α = 0.05 के साथ दो तरह के एनोवा का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय विश्लेषण कोई महत्व नहीं दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लिपिड मोलर अनुपात स्टॉक लिपिड एकाग्रता (एमएन) लिपिड मिश्रण (एमएमएम) के लिए इथेनॉल में एकाग्रता वॉल्यूम (माइक्रोन)
आयनज़योग्य लिपिड 50 38.9 5 68.5
हेल्पर लिपिड 10 10 1 53.3
कोलेस्ट्रॉल 39 20 3.9 103.9
सी-14 खूंटी 1 1 0.1 53.3
एटोह 254
कुल 533

तालिका 1: एलएनपी के 1 एमसीएल तैयार करने के लिए उदाहरण लिपिड मिश्रण। प्रदान की गई इथेनॉल में लिपिड स्टॉक सांद्रता को लिपिड को इथेनॉल में घुलनशील करने की अनुमति देने के लिए दिखाया गया है, लेकिन अन्य स्टॉक सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है और जब तक लिपिड को घुलनशील नहीं किया जाता है तब तक परिणाम प्रभावित नहीं होगा। माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण के लिए इथेनॉल में लिपिड की सांद्रता भी प्रदान की जाती है। ये सांद्रता मोलर अनुपात पर आधारित हैं, जिसे वांछित एलएनपी तैयारी के आधार पर विविध किया जा सकता है।

भड़काना सूत्रीकरण
वॉल्यूम (एमएल) 2 1.37
प्रवाह दर अनुपात (जलीय: EtOH) 3:1 3:1
कुल प्रवाह दर (एमएल/न्यूनतम) 12 4
लेफ्ट सिरिंज का आकार (एमएल) 3 3
सही सिरिंज आकार (एमएल) 1 1
स्टार्ट वेस्ट वॉल्यूम (एमएल) 0.35 0.25
एंड वेस्ट वॉल्यूम (एमएल) 0.05 0.05

तालिका 2: माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग बेंचटॉप इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर प्राइमिंग और एलएनपी फॉर्मूलेशन उदाहरण पैरामीटर

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Discussion

प्रजनन, गति और कम मात्रा स्क्रीनिंग अन्य मौजूदा तरीकों (जैसे, लिपिड फिल्म हाइड्रेशन और इथेनॉल इंजेक्शन) की तुलना में एलएनपी बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण का उपयोग करने के महत्वपूर्ण फायदे हैं। हमने इस विधि की प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन किया है जिसमें विभिन्न एलएनपी बैचों के साथ एनकैप्सुलेशन दक्षता या कण आकार पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा है। यह एलएनपी सहित किसी भी चिकित्सीय के लिए चिकित्सकीय रूप से उपलब्ध होने का एक अनिवार्य मापदंड है ।

यहां वर्णित तकनीक कंपित हेरिंगबोन माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण को रोजगार देती है, जिसके परिणामस्वरूप एलएनपी गठन केवल कुछ मिनटों के समय पैमाने पर होता है। इस मिश्रण में अराजक ऐडवेक्शन का उपयोग किया गया है जो नियंत्रण और छोटा समय27के मिश्रण के लिए लाभप्रद है । यह मिक्सर जलीय और जैविक चरणों को एक दूसरे के चारों ओर प्रभावीढंगसे लपेटने में सक्षम बनाता है । कंपित हेरिंगबोन मिश्रण का उपयोग करते हुए, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कण सबसे छोटे थर्मोडायनामिक रूप से स्थिर आकार32पर बनते हैं, जिसका अर्थ है कि संरचना एलएनपी27, 32,33के आकार और बहुविषरी को प्रभावित करती है। यह प्रतिनिधि परिणामों में देखा गया, जहां एन/पी अनुपात, आयनित लिपिड का उपयोग किया जाता है, और न्यूक्लिक एसिड एनकैप्सुलेशन दक्षता और कण आकार में परिवर्तन पर प्रभावी कारक थे । प्रवाह दर और मिश्रण अनुपात जैसे ऑपरेटिंग पैरामीटर एक निश्चित सीमा से ऊपर के आकार को भी प्रभावित कर सकते हैं, जहां बाद में कण का आकार अपने सबसे छोटे स्थिर आकार27,33पर होता है। जब 4 एमएल/मिन बनाम 12 एमएल/मिन की प्रवाह दर का उपयोग किया गया तो एनकैप्सुलेशन दक्षता या कण आकार में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया । इस प्रकार, संभावना दोनों प्रवाह दरों दहलीज है कि LNP परिणाम को प्रभावित करेगा ऊपर हैं । उदाहरण प्रयोग, और ऊपर वर्णित परिणाम, लिपिड ए और pDNA का इस्तेमाल किया । यह संभव है कि विभिन्न आयनित लिपिड और न्यूक्लिक एसिड प्रवाह दर के संबंध में एलएनपी विशेषताओं पर अधिक प्रभाव डाल सकते हैं। अन्य प्रकार के माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण में टी-जंक्शन शामिल है, जो अशांत प्रवाह और माइक्रोफ्लुइडिक हाइड्रोडायनामिक फोकसिंग विधि का उपयोग करता है जो संवहनी-विसारक मिश्रण27पर आधारित है। एलएनपी विकास के लिए इन अन्य प्रकार की माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण तकनीकों की तुलना में, कंपित हेरिंगबोन मिश्रण तीन महत्वपूर्ण मानदंडों के संयोजन को सक्षम बनाता है: तेजी से मिश्रण, बैच परिवर्तनशीलता के लिए बैच को कम करना, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध27है। माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण विधियों के सभी तीन पारंपरिक लिपिड फिल्म हाइड्रेशन या इथेनॉल इंजेक्शन विधियों की तुलना में उच्च encapsulation दक्षता और नियंत्रित आकार के लिए अनुमति देते हैं27.

अंत में, अनुसंधान और विकास के स्तर पर विभिन्न एलएनपी योगों की कम मात्रा का उत्पादन करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण लाभ है । एलएनपी विकसित करने की एक चुनौती उन चरों की संख्या है जिनका परीक्षण किया जा सकता है और वांछित परिणाम और प्रभावकारिता प्राप्त करने के लिए प्रति निर्माण का अनुकूलन किया जा सकता है। लिपिड और न्यूक्लिक एसिड स्क्रीन, समस्या निवारण, और कई निर्माण मापदंडों (जैसे, मोलर अनुपात, एन/पी अनुपात, प्रक्रिया मापदंडों, आदि) को संशोधित करने के लिए एक दिए गए आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त LNP खोजने के लिए लागत निषेधात्मक हो सकता है । जबकि कम मात्रा में एक बड़े पैमाने पर एक अंतिम निर्माण के उत्पादन के लिए एक सीमा हो सकती है, बड़े microfluidic मिश्रण उपकरणों के साथ तकनीक को पैमाने पर करने की क्षमता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ।

प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम निर्माता की सिफारिश पर लिपिड स्टॉक समाधानों के उचित भंडारण के साथ शुरू होते हैं। एलएनपी को तब 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए जब तक कि आगे का उपयोग न हो जाए। न्यूक्लिक एसिड की तैयारी के लिए, प्रस्तुत परिणामों से यह प्रदर्शित होता है कि साइट्रेट बफर और मैलिक एसिड बफर उच्च न्यूक्लिक एसिड एनकैप्सुलेशन34, 35के साथ एलएनपी को सफलतापूर्वक बनाने में प्रभावी हैं। यदि वांछित हो तो अन्य बफ़र्स का उपयोग किया जा सकता है। यदि एक और बफर चुना जाता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए आयनिज्य लिपिड के पीसीए के नीचे पीएच बनाए रखना महत्वपूर्ण है कि लिपिड cationic है और न्यूक्लिक एसिड के साथ जटिल हो सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण उपकरण का उपयोग करते समय, एलएनपी गठन से पहले कारतूस को प्राइम करना महत्वपूर्ण है, निर्माता द्वारा अनुशंसित कारतूस के उपयोग से अधिक नहीं, और विभिन्न निर्माण रचनाओं के बीच में कारतूस को बदलने के लिए। जलीय के गठन के लिए सबसे आम प्रवाह अनुपात: कार्बनिक समाधान 3:1 है; हालांकि, जरूरत पड़ने पर इसे बदला जा सकता है। प्रवाह दर को भी वांछित के रूप में समायोजित किया जा सकता है। अंत में, पूरी प्रक्रिया में RNase-मुक्त वातावरण सुनिश्चित करने के लिए एमआरएएनए के साथ काम करते समय यह महत्वपूर्ण है। यदि वांछित आकार या encapsulation दक्षता प्राप्त नहीं है, कुछ स्थानों पर समस्या निवारण शुरू करने के लिए N/P अनुपात का इस्तेमाल किया या लिपिड मोलर प्रतिशत बदलना शामिल हैं । यहां वर्णित उपकरण प्रक्रिया एक बेंचटॉप मॉडल का उपयोग करती है जिसमें अधिकतम मात्रा सीमा 12 एमएल है, हालांकि यह प्रक्रिया विभिन्न माइक्रोफ्लुइडिक मिश्रण मॉडल का उपयोग करके बड़ी मात्रा में स्केलेबल है। इस प्रक्रिया को विभिन्न नैदानिक संकेतों के लिए एलएनपी विकसित करने में उपयोग के लिए लिपिड मिश्रण और न्यूक्लिक एसिड में परिवर्तन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस लचीलेपन के साथ, विभिन्न वांछित योगों का उत्पादन करने के लिए एलएनपी के साथ भविष्य के कई अनुप्रयोगों को प्राप्त किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग अन्य प्रकार के नैनोकणों को विकसित करने के लिए भी किया गया है, जिनमें लिपोसोम और पॉलीमेरिक नैनोकण शामिल हैं। कुछ पैरामीटर परिवर्तनों के साथ, इस विधि का उपयोग विभिन्न प्रकार के नैनोपार्टिकल फॉर्मूलेशन के लिए किया जा सकता है।

यहां विस्तृत प्रोटोकॉल एमआरएन या डीएनए एनक्लोजर एलएनपी को प्राप्त करने के लिए एक प्रजनन विधि का वर्णन करता है। प्रक्रिया मापदंडों के अलावा, अतिरिक्त विचार एलएनपी परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। पिछले काम में विभिन्न न्यूक्लिक एसिड, आयनिज्य लिपिड, एन/पी अनुपात, खूंटी लिंकर लंबाई आदि के साथ एलएनपी का उत्पादन करने के लिए समान तरीकों का भी उपयोग किया गया है । ये पैरामीटर कणों की एनकैप्सुलेशन दक्षता, आकार और आवेश को प्रभावित कर सकते हैं। साधन निर्माता ने भी इन मापदंडों के आधार पर इसी तरह के परिवर्तन किए हैं जिन्हें18,36अनुकूलित किया जा सकता है . ये पैरामीटर न्यूक्लिक एसिड के बायोवितरण और प्रभावकारिता को और प्रभावित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, अध्ययनों ने हाइड्रोकार्बन चेन लंबाई (C14, C16, और C18) की जांच की है जो खूंटी के लिए संयुग्मित है और पाया गया कि C14 की छोटी एसील चेन के परिणामस्वरूप लंबी एसील चेन की तुलना में जिगर का तेज उच्च स्तर हुआ, जो28वर्ष की लंबी अवधि के लिए प्रचलन में रहा । यह प्रोटोकॉल विभिन्न रचनाओं के साथ एलएनपी के गठन, अनुकूलन और परीक्षण की अनुमति देता है, जो इसे एक बहुमुखी प्रक्रिया बनाता है।

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Disclosures

सभी लेखक सनोफी के कर्मचारी हैं। लेखकों की घोषणा है कि वे हितों का कोई टकराव या प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

एलएनपी विकास के प्रति उनके मार्गदर्शन और योगदान के लिए अतुल सलूजा, यतिन गोकरन, मारिया-टेरेसा पेराचिया, वाल्टर श्वेंगर और फिलिप जैकस को धन्यवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) Avanti Polar Lipids 880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) Sigma-Aldrich C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) Thermo Fisher Scientific 23-021-020
Benchtop Centrifuge Beckman coulter
Black 96 well plates Thermo Fisher Scientific 14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 14-380-813
Citric Acid Fisher Scientific 02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore Corning 430769
Disposable folded capillary cells Malvern DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof Sigma-Aldrich 459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette Thermo Fisher Scientific 14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) Thermo Fisher Scientific AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units Thermo Fisher Scientific UFC901024
NanoAssemblr Benchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific R11490
Sodium Chloride Fisher Scientific 02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular Fisher Scientific 02-004-056
SpectraMax i3x Molecular Devices
Zetasizer Nano Malvern

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 168 लिपिड नैनोपार्टिकल न्यूक्लिक एसिड मैसेंजर आरएनए डीएनए माइक्रोफ्लुइडिक कंपित हेरिंगबोन मिक्सर
माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके जीन डिलीवरी के लिए लिपिड नैनोकणों को तैयार करना और उनकी विशेषता करना
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Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform. J. Vis. Exp. (168), e62226, doi:10.3791/62226 (2021).

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