Summary
यह प्रोटोकॉल यह दर्शाता है कि क्रायो-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके जैविक क्रायो-संरक्षित नमूनों को कैसे छवि दी जाए। हम U2OS कोशिकाओं के साइटोस्केलेटन इमेजिंग द्वारा कार्यप्रणाली का प्रदर्शन करते हैं।
Abstract
त्रि-आयामी (3 डी) संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की तुलना में उच्च संकल्प पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाली सेलुलर संरचनाओं की इमेजिंग की अनुमति देता है। यह सुपर-रिज़ॉल्यूशन (एसआर) तकनीक पूरी कोशिकाओं में आणविक प्रक्रियाओं के दृश्य को सक्षम बनाती है और संरचनात्मक और कार्यात्मक जानकारी को सहसंबंधित करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और एक्स-रे टोमोग्राफी के साथ संयोजन के रूप में उपयोग करने की क्षमता है। क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित नमूनों (क्रायोसिम) के लिए एक सिम माइक्रोस्कोप हाल ही में यूके सिंक्रोट्रॉन में सहसंबद्ध क्रायो-इमेजिंग बीमलाइन बी 24 में कमीशन किया गया है।
यह विशेष रूप से क्रायोजेनिक तापमान पर जैविक नमूनों की 3 डी इमेजिंग के लिए डिजाइन किया गया था, जो एक्स-रे माइक्रोस्कोपी विधियों जैसे क्रायो-सॉफ्ट एक्स-रे टोमोग्राफी द्वारा एक ही नमूनों के बाद इमेजिंग के साथ संगत तरीके से किया गया था। यह वीडियो लेख क्रायोसिम का उपयोग करके सफल इमेजिंग के लिए विस्तृत तरीके और प्रोटोकॉल प्रदान करता है। क्रायोसिम माइक्रोस्कोप के संचालन के निर्देशों के अलावा, नमूनों, फ्लोरोफोरेस और पैरामीटर सेटिंग्स की पसंद के बारे में सिफारिशों को शामिल किया गया है। प्रोटोकॉल U2OS सेल नमूनों में प्रदर्शित किया जाता है जिसका माइटोकॉन्ड्रिया और ट्यूबलिन फ्लोरोसेंटली लेबल किया गया है ।
Introduction
एसआर इमेजिंग तकनीक पिछले1दशक में जीव विज्ञानियों के लिए व्यापक रूप से सुलभ हो गई है । वे फ्लोरोसेंटली टैग किए गए नमूनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को विवर्तन सीमा से परे अनुमति देते हैं। हालांकि, क्रायोजेनिक तापमान2पर नमूनों के साथ काम करने के लिए एसआर माइक्रोस्कोपी विधियों को अनुकूलित करना चुनौतीपूर्ण रहा है। यह इलेक्ट्रॉन या एक्स-रे टोमोग्राफी के संयोजन में सहसंबद्ध इमेजिंग के लिए लाभप्रद होगा। हाल ही में, सिम को क्रायोजेनिक नमूनों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है और डायमंड लाइट सोर्स सिंक्रोट्रॉन (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html) में सहसंबद्ध क्रायो-इमेजिंग बीमलाइन बी 24 में नरम एक्स-रे टोमोग्राफी(एसएलटी) 3 के साथ मिलकर जैविक कोशिकाओं के सहसंबद्ध अध्ययन को सक्षम करने के लिए सफलतापूर्वक दिखाया गया है। सिम तीन कोणों पर और पांच चरणों में प्रकाश (Moiré किनारे) के धारीदार पैटर्न के साथ नमूना रोशन द्वारा पारंपरिक चौड़े क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के संकल्प को दोगुना कर सकते हैं । इन प्रकाश पैटर्न और नमूना फ्लोरेसेंस के बीच हस्तक्षेप का उपयोग उप-विवर्तन संरचनाओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी को उजागर करने के लिए किया जा सकता है4,5.
क्रायोजेनिक अनुप्रयोगों के लिए अन्य एसआर तकनीकों पर सिम के कई फायदे हैं। सबसे पहले, यह विशेष रूप से डिजाइन किए गए निमिष फ्लोरोफोरस के बिना काम कर सकता है; पारंपरिक फ्लोरोफोरस का उपयोग किया जा सकता है, जिससे संभावित फ्लोरोसेंट टैगिंग एजेंट्स6की एक व्यापक रेंज तक पहुंच मिल सके । इसके अलावा, इसके लिए केवल प्रति जेड स्लाइस (3D; 9 छवियों में 2D) में 15 छवियों की आवश्यकता होती है, जबकि अन्य एसआर विधियों में प्रति स्लाइस लगभग 1000 छवियां होती हैं, जिससे नमूना गर्म होने की संभावना बढ़ आती है और इसलिए बर्फ क्रिस्टल गठन का खतरा बढ़ जाता है, जो कलाकृतियों का कारण बन सकता है। अंत में, इस तकनीक को 10 माइक्रोन से अधिक के मोटे जैविक नमूनों की छवि कर सकते हैं, पूरी कोशिकाओं को उनके पास मूल राज्य6में छवि की अनुमति । क्रायोसिम को मानक ऑप्टिकल घटकों का उपयोग करके और इमेजिंग के लिए ओपन-एक्सेस सॉफ्टवेयर के साथ बनाया गया है, जिससेवांछित 6होने पर दस्तावेज़ और डुप्लिकेट करना आसान हो जाता है। क्रायोसिम में 100x/0.9 संख्यात्मक अपर्चर उद्देश्य है (सामग्रियों की तालिकादेखें); इसके ऑप्टिकल घटकों, डिजाइन मापदंडों और प्रदर्शन के बारे में अधिक जानकारी फिलिप्स एट अल द्वारा वर्णित की गई है।6 यहां, यह प्रोटोकॉल यह दर्शाता है कि क्रायोसिम माइक्रोस्कोप का उपयोग कैसे किया जाए जिसमें क्रायोजेनिक चरण पर नमूनों को लोड और अनलोड किया जाए, माइक्रोस्कोप पर डेटा कैसे एकत्र किया जाए, और सिम छवियों को कैसे पुनर्निर्मित किया जाए।
Protocol
नोट: यह प्रोटोकॉल ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) 3 मिमी फ्लैट गोल्ड ग्रिड पर उगाई जाने वाली कोशिकाओं वाले नमूनों से संबंधित है, जिसमें एक होले कार्बन समर्थन फिल्म है जिसे डुबकी ठंड या उच्च दबाव ठंड द्वारा विट्रीप किया गया है। इस प्रोटोकॉल में माना गया है कि क्रायोसिम में इमेजिंग के लिए रुचि के स्थानों को मैप करने के लिए पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंस और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नमूनों को पहले से ही इमेज किया गया है। पूरे प्रोटोकॉल के अवलोकन के लिए चित्रा 1 देखें।
1. क्रायो-स्टेज की तैयारी
- किसी भी मानक वैज्ञानिक शुष्ककागज पोंछे के साथ लाइन में खड़ा एक कीप के माध्यम से एलएन 2 पारित करके बर्फ मुक्त तरल नाइट्रोजन (एलएन2) तैयार करें।
नोट: एलएन2 के जलने का कारण बनता है, इसलिए इसे संभालते समय क्रायो-सुरक्षात्मक दस्ताने और चश्मे सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। इस तरह के तरल पदार्थ ऑक्सीजन को विस्थापित कर सकते हैं और तेजी से घुटन का कारण बन सकते हैं और इसे ठीक से हवादार क्षेत्र में संभाला जाना चाहिए। - दबाव वाली हवा के साथ क्रायो-स्टेज से सतह की धूल हटाएं। इसका उपयोग करने से पहले दबाव वाले वायु कंटेनर से तरल को निष्कासित करें।
- सुनिश्चित करें कि नमूना-लोडिंग कारतूस उपयुक्त चैम्बरेड नमूना धारक के साथ मौजूद है (जांच करें कि पिछले प्रयोग से नमूना धारक में कोई ग्रिड नहीं बचा है)(चित्रा 2)।
- क्रायो-चरण के बाहरी देवर से ढक्कन निकालें, और लगभग 1/4 पूर्ण होने तक फ़िल्टर किए गए एलएन2 डालें। अधिक डालने से पहले प्रारंभिक उबलते कम होने तक प्रतीक्षा करें; पोत को लगभग 2/3 पूर्णतक भरें। ढक्कन को ध्यान से बदलें, हैंडलर और स्टेज/ऑप्टिक्स से दूर नोजल की ओर इशारा करते हुए एलएन2 आउटलेट से बाहर फोड़े ।
- एक बार एलएन2 आउटलेट से बाहर आना बंद कर दिया है, क्रायो मंच पर मंच देवर पर आउटलेट पाइप जगह है ।
- प्लग-इन स्टेज के पावर सोर्स में, और यूएसबी केबल को क्रायो-स्टेज से कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि गर्म नमूना कक्ष ढक्कन में खामियों को दूर किया गया है। बाहरी देवर में मंच पर प्लग करें।
नोट: बाहरी देवर में प्लग नहीं जब तक आउटलेट पाइप क्रायो-स्टेज पर मंच देवर पर तैनात किया गया है । यदि एलएन2 ओवरफ्लो (या इसे बहने से रोकने के लिए), ~ 10 एस के लिए यूएसबी केबल को बाहर निकालें, तो इसे संतुलन बनाने की अनुमति दें, और सेंसर को फिर से सक्रिय करने के लिए यूएसबी केबल को फिर से कनेक्ट करें। - एलएन2 को स्टेज देवर में डिलीवर करने के बाद, एलएन2 को सैंपल चैंबर में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए क्रायो-स्टेज पर रिलीज बटन दबाएं।
नोट: प्रणाली उपेक्षित मत छोड़ो, जबकि एलएन2 चैंबर भर रहा है । - छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले सिस्टम को ठंडा और स्थिर करने की अनुमति देने के लिए ~ 30-45 मिनट की प्रतीक्षा करें। समय-समय पर बाहरी देवर की जांच करें, और फ़िल्टर किए गए एलएन 2 के साथ टॉप-अप करेंयदि यह एक चौथाई से कम भरा है (लगभग हर घंटे)।
2. नमूना भंडारण बॉक्स का क्रायो-चरण में स्थानांतरित करना
नोट: नमूना भंडारण बॉक्स, धारक, और फ़िल्टर एलएन2 के अंदर किसी भी उपकरण (जैसे, संदंश) के सुझावों को विसर्जित करें ताकि नमूना कक्ष के अंदर किसी भी ठंडी सतहों या किसी भी वस्तु को छूने से पहले उन्हें ठंडा किया जा सके। जैविक नमूनों को संभालते समय प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनें।
- सुनिश्चित करें कि विट्रीफाइड नमूने क्रायो-संगत कंटेनर में हैं, और उन्हें माइक्रोस्कोप में लाएं। नमूना कक्ष में प्रकाश चालू करने के लिए क्रायो-स्टेज पर संबंधित बटन दबाएं।
- नमूना हस्तांतरण कैसेट की दो प्लेटों को खोलने के लिए कैसेट उपकरण पर हेक्स कुंजी का उपयोग करें। प्लेटों को खोलें जो दो प्लेटों के बीच ग्रिड में छोड़ने के लिए पर्याप्त है, लेकिन ग्रिड को दूसरी तरफ से गिरने से रोकने के लिए अधिकतम खुली स्थिति में खोलने से बचें।
- एलएन 2 से नमूना ग्रिड बॉक्स को उठाने के लिएलंबेसंदंश का उपयोग करें, इसे चालू करें जहां पायदान चरण के अंदर भंडारण की स्थिति के साथ संरेखित होता है, और इसे चरण पर रखें। सही नमूना स्थिति के लिए भंडारण बॉक्स ढक्कन खोलने के लिए उपयुक्त डिवाइस (जैसे, एक पेचकश) का उपयोग करें।
- उल्टे संदंश (या किसी भी ठीक टिप सर्जिकल संदंश) का उपयोग करना, नमूना धारक से TEM ग्रिड को हटा दें, इसे एलएन 2 के अंदर विसर्जित करें, और स्थानांतरण प्रक्रिया केदौरानएलएन 2 के करीब रखतेहुए नमूना हस्तांतरण कैसेट में इसे स्थिति में छोड़ दें। सुनिश्चित करें कि कार्बन फिल्म पक्ष रखा गया है ताकि यह अंततः नमूना पुल पर उद्देश्य का सामना करना पड़ जाएगा ।
- कैसेट उपकरण पर हेक्स कुंजी का उपयोग कर नमूना कारतूस बंद करें। किसी भी शेष नमूनों के साथ भंडारण बॉक्स को बंद करें और हटा दें।
- कैसेट उपकरण पर चुंबक बिंदु का उपयोग करने के लिए उठाने और नमूना पुल पर ग्रिड युक्त कारतूस माउंट। स्थानांतरण प्रक्रिया के दौरान इसे डूबे/एलएन2 के करीब रखें । सुनिश्चित करें कि अभिविन्यास पुल के लिए उपयुक्त है (दो मैग्नेट पुल पर मैग्नेट के साथ संपर्क करेंगे)। पुल के पोजिशनिंग पिन के भीतर कैसेट फ्लैट रखें, और यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे से नज करें कि यह तय हो।
नोट: बाद में केंद्रित आयन बीम मिलिंग के लिए तैयार किए गए काटा ग्रिडों के लिए एक नमूना कैसेट भी बीमलाइन बी 24 में क्रायोसिम सुविधा पर उपलब्ध है।
3. स्टेज डॉकिंग और फोकसिंग
- क्रायो-स्टेज ढक्कन खोलने को इमेजिंग स्थिति में ले जाएं, और नमूना कक्ष प्रकाश को बंद कर दें। उद्देश्य लेंस के तहत संरेखित करने के लिए प्रकाशिकी की ओर मंच स्लाइड। धीरे-धीरे लीवर का उपयोग करके उद्देश्य को स्थिति में छोड़ दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह क्रायो-चरण के ढक्कन के भीतर रहता है, लेकिन इसे छूता नहीं है।
नोट: सुनिश्चित करें कि बाहरी देवर का आउटलेट पाइप डेटा संग्रह के दौरान किसी भी बिंदु पर क्रायो-स्टेज पर मंच देवर को नहीं छूता है। - एक अपारदर्शी काले पर्दे के साथ मंच और प्रकाशिकी को कवर करें। क्रायोसिम पीसी(चित्रा 3 और चित्रा 4)पर नियंत्रण सॉफ्टवेयर कॉकपिट शुरू करें।
- प्रत्येक कैमरे के लिए रीडआउट मोड बटन पर क्लिक करें, और इसे एमएचईटी 3 मेगाहर्ट्जपर सेट करें। जांच करें कि प्रत्येक कैमरे का तापमान -80 डिग्री सेल्सियस है, और कैमरा प्रशंसक बंद है।
- परावर्तित कैमरे को चालू करें। लाइट्सके तहत, परिवेश (एक्सपोजर 20 एमएस) चुनें, और लिंकमके तहत, कंडेनसरपर क्लिक करें। वीडियो मोड बटन पर क्लिक करें।
- मोज़ेक दृश्य खिड़की में, ग्रिड की रूपरेखा देखने के लिए ज़ूम आउट (माउस स्क्रॉल) करें। अगर इसे देखा नहीं जा सकता है तो खोजें मंच पर क्लिक करें । सर्कल के बीच में डबल-लेफ्ट-क्लिक करके ग्रिड को केंद्र में रखें।
- जब तक ग्रिड समर्थन फिल्म (या किसी अन्य प्रासंगिक नमूना सुविधा) ध्यान में है, ऊपर और नीचे कुंजी का उपयोग करने के लिए क्रायो चरण ऊपर और नीचे ले जाने के लिए, और संख्यात्मक पैड पर 9 और 3 चाबियां का उपयोग करने के लिए जेड कदम बदलने के लिए (यह प्रारंभिक ध्यान केंद्रित करने के लिए 20 μm सेट) ध्यान में है ध्यान केंद्रित ।
नोट: यदि उपयोगकर्ता z में यात्रा से बाहर चलाता है, तो क्रायो-स्टेज के नीचे पहिया का उपयोग करके चरण को मैन्युअल रूप से ऊपर या नीचे ले जाया जा सकता है। इसे एक समय में एक पायदान से चालू करें, और जांच करें कि नमूना देखने की सीमा के भीतर है या नहीं। ध्यान देने में फिर से बदलाव करें यदि ध्यान खराब हो जाता है।
4. ब्राइटफील्ड मोज़ेक अधिग्रहण
- एक बार जब चरण केंद्रित हो जाता है, तो वीडियो मोडबंद कर दें, और एक दृश्यमान प्रकाश मोज़ेक एकत्र करें (केंद्र से बाहरी सर्पिल दृश्यमान प्रकाश छवियों की टाइल्स का उत्पादन करने के लिए मोज़ेक दृश्य में रन मोज़ेक पर क्लिक करें)। यदि ग्रिड तुला है, ग्रिड पर विभिन्न पदों की कोशिश (मोज़ेक दृश्यके भीतर डबल बाएं क्लिक करें), फिर से ध्यान केंद्रित, और भाग पच्चीकारी पर क्लिक करें फिर से आंशिक मोज़ेक इकट्ठा करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, पच्चीकारी (चित्रा 3)के शीर्ष पर एक केंद्रित छवि में ड्रॉप-इन।
- सेव पच्चीकारीपर क्लिक करके देखें बचाओ । इसे एक छोटा फाइलनाम दें जिसमें स्टोरेज बॉक्स और संबंधित ग्रिड नंबर पर जानकारी दी गई है (एक टाइमटाम्प स्वचालित रूप से फ़ाइल नाम से संलग्न हो जाएगा)।
5. ब्याज के क्षेत्रों की पहचान
- किसी भी पिछले फ्लोरेसेंस "मानचित्र" छवियों के साथ ब्राइटफील्ड मोज़ेक का निरीक्षण करें जहां कोशिकाओं या ब्याज की जैविक विशेषताएं पहले स्थित हैं। जांच करें कि क्या वे क्षेत्र उपयुक्त फ्लोरेसेंस का उत्पादन करते हैं।
- सक्रिय होने पर परिवेश प्रकाश और कंडेनसर के साथ-साथ वीडियो मोड को बंद कर दें। आवश्यक उत्तेजन लेजर (405, 488, 561, या 647) चालू करें, और 50 एमएस एक्सपोजर समय के लिए शुरू में 50 मिलियनW पर इसी कैमरा और फ़िल्टरचुनें।
नोट: फ्लोरेसेंस सिग्नल के आधार पर इन कैमरा और फ़िल्टर सेटिंग्स को बढ़ाएं/घटाएं। - एक छवि को स्नैप करने के लिए 0 दबाें और * ऑटो-कंट्रास्ट करें। वैकल्पिक रूप से, छवि के नीचे स्लाइडर का उपयोग करके इसके विपरीत को मैन्युअल रूप से समायोजित करें।
नोट: कमरे के लिए हस्ताक्षर पर लेजर पर स्विच करें । - एक बार उपयुक्त फ्लोरेसेंस के साथ जैविक रूप से दिलचस्प कोशिकाएं पाई गई हैं, मोज़ेक दृश्यमें मार्क साइट बटन का उपयोग करके उनकी स्थिति को चिह्नित करें।
नोट: ये चिह्नित साइटें संलग्न सूची में दिखाई देंगी और निर्देशांक पर डबल-क्लिक करके एक्सेस की जा सकती हैं। किसी चिह्नित साइट पर लौटते समय, डबल-क्लिक करने से पहले क्षेत्र में ज़ूम करें। - छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले सभी संभावित साइटों को चिह्नित करना जारी रखें। चिह्नित साइटों के साथ पच्चीकारी को फिर से बचाएं; फाइल करने के लिए सेव साइट्सपर क्लिक करें .
- स्टिचम सॉफ्टवेयर (बीमलाइन बी 24 में विकसित इनहाउस) का उपयोग करके मोज़ेक छवियों को एक साथ सिलाई करने के लिए, .txt मोज़ेक फ़ाइल को विस्तार .bat के साथ स्टिचम फ़ाइल में खींचें और छोड़ दें और एक ही फ़ोल्डर में मोज़ेक टाइल्स की संयुक्त झगड़ा छवि को बचाएं। चिह्नित साइटों के साथ एक छवि को बचाने के लिए, मोज़ेक.txt फ़ाइल और मार्कर को खींचें और छोड़ दें.txt एक ही समय में आइकन में फ़ाइल करें।
नोट: परियोजना की जरूरतों के खिलाफ शेष डेटा संग्रह (उदाहरण के लिए, यदि सहसंबद्ध इमेजिंग किया जाएगा, तो देखें कि पार्टनर-इमेजिंग मोडलिट्यूल के साथ कितनी छवियां ली जा सकती हैं, और क्रायोसिम इमेजिंग के लिए उचित संख्या में साइटों का चयन करें)। इसके अलावा, यदि बाहरी देवर को एलएन2 के साथ रिफिलिंग की आवश्यकता होती है, तो क्रायो-चरण प्रणाली स्थिति बदल जाएगी, और चिह्नित साइटें समान स्थानों पर वापस नहीं आएंगी; इसलिए चित्रित होने वाली साइटों की संख्या चुनते समय इस पर विचार करें।
- स्टिचम सॉफ्टवेयर (बीमलाइन बी 24 में विकसित इनहाउस) का उपयोग करके मोज़ेक छवियों को एक साथ सिलाई करने के लिए, .txt मोज़ेक फ़ाइल को विस्तार .bat के साथ स्टिचम फ़ाइल में खींचें और छोड़ दें और एक ही फ़ोल्डर में मोज़ेक टाइल्स की संयुक्त झगड़ा छवि को बचाएं। चिह्नित साइटों के साथ एक छवि को बचाने के लिए, मोज़ेक.txt फ़ाइल और मार्कर को खींचें और छोड़ दें.txt एक ही समय में आइकन में फ़ाइल करें।
- सक्रिय होने पर परिवेश प्रकाश और कंडेनसर के साथ-साथ वीडियो मोड को बंद कर दें। आवश्यक उत्तेजन लेजर (405, 488, 561, या 647) चालू करें, और 50 एमएस एक्सपोजर समय के लिए शुरू में 50 मिलियनW पर इसी कैमरा और फ़िल्टरचुनें।
6. डेटा संग्रह रणनीति
- फ्लोरेसेंस इमेज (कैमरा व्यू विंडो के नीचे) में डायनेमिक रेंज में गिनती के आधार पर लेजर एक्सपोजर टाइम सेट करें। चुनें कि कौन सा फ़िल्टर लागू करना है, और प्रत्येक लेजर को अलग-अलग चालू करने के लिए प्रत्येक तरंगदैर्ध्य के लिए इन सेटिंग्स को अनुकूलित करें।
नोट: हालांकि 10,000-20,000 मायने रखता है इष्टतम हैं, कम मायने रखता है स्वीकार्य है अगर वहां एक अच्छा विपरीत है । आदर्श रूप से, प्रत्येक छवि स्टैक का अधिग्रहण करने से पहले फ़िल्टर सेटिंग्स की जांच करें क्योंकि ग्रिड के विभिन्न क्षेत्रों में कोशिकाओं में चर फ्लोरेसेंस का स्तर हो सकता है।
7. डेटा संग्रह
- उन्हें चालू करने के लिए दोनों कैमरों पर क्लिक करें। चिह्नित साइटों में से एक पर लौटें, और फिर से वांछित गहराई पर ध्यान केंद्रित करें। एक बार ब्याज के क्षेत्र में ध्यान केंद्रित करने में, मैक्रो स्टेज में XY विंडो में ऊपर की ओर ध्यान केंद्रित(↑ कुंजी) से बाहर निकलने के लिए जेड स्टैक की ऊंचाई का चयन करने के लिए, और सेव टॉपपर क्लिक करें। फोकस से नीचे की ओर जाएं(↓ कुंजी), सेव बॉटम पर क्लिक करें और फिर केंद्र में जाएं,और जांच करें कि छवि अभी भी ध्यान में है।
नोट: नमूना ऊंचाई खिड़की में दिखाया जाएगा। - कॉकपिट विंडो में एसएलएम (स्थानिक प्रकाश मॉड्यूलर) पर सही क्लिक करें, और सुनिश्चित करें कि कोण 0.41 पर सेट है। कॉकपिट खिड़की में, एकल साइट प्रयोग काचयन करें ।
नोट: एसएलएम पर क्लिक न करें; कॉकपिट स्वचालित रूप से छवि अधिग्रहण के दौरान इसे चालू कर देगा ।- ड्रॉपडाउन सूची से, संरचित रोशनीका चयन करें। स्टैक ऊंचाई को बदलें ताकि यह जेड-ऊंचाई + 1 माइक्रोन के बराबर हो।
नोट: 1 माइक्रोन के अलावा जेड में पूरे नमूने का कब्जा सुनिश्चित करता है और पुनर्निर्माण कलाकृतियों को कम करता है। - ऊपरी पंक्ति (परावर्तित कैमरे के लिए) में 405 एनएम और 488 एनएम लेजर के लिए एक्सपोजर समय (एमएस) दर्ज करें और निचली पंक्ति में 561 एनएम और 647 एनएम लेजर (संचारित कैमरे के लिए) के लिए एक्सपोजर समय।
नोट: एक्सपोजर समय के लिए मान पहले पर तय किए गए मूल्यों से मेल खाने चाहिए और मुख्य कॉकपिट विंडो में दिखाया गया है। - इनपुट एक फ़ाइल नाम (नामकरण सम्मेलन: बॉक्स number_grid area_filters_FL) (FL (फ्लोरेसेंस) या बीएफ (ब्राइटफील्ड) किस प्रकार की इमेजिंग की जा रही है) के आधार पर। पिछली फ़ाइलों को ओवरराइट किए बिना तारीख और समय वाली एक नई फ़ाइल का उत्पादन करने के लिए अपडेट पर क्लिक करें। फिर, स्टार्टपर क्लिक करें।
- ड्रॉपडाउन सूची से, संरचित रोशनीका चयन करें। स्टैक ऊंचाई को बदलें ताकि यह जेड-ऊंचाई + 1 माइक्रोन के बराबर हो।
- डेटा एकत्र किए जाने के दौरान कैमरा व्यू देखें। यदि कोई जाय विस्थापन है तो छवियों को फिर से लें। यदि एलएन 2 देवर छवि अधिग्रहण केदौरान क्रायो-चरण को फिर से भर देता है, तो कॉकपिट सॉफ्टवेयर में गर्भपात बटन पर क्लिक करके प्रक्रिया को निरस्त करें।
- एक बार जब बाहरी देवर चरण देवर को रिफिलिंग समाप्त कर देता है, तो प्रयोग दोहराएं क्योंकि रिफिल नमूना को लंबवत रूप से विस्थापित करता है। छवि को फिर से जेड में केंद्रित करने के लिए फिर से ध्यान केंद्रित करें, और एकल साइट प्रयोगको दोहराएं। लेजर और आवश्यक फिल्टर के सभी संयोजनों के लिए एकल साइट प्रयोग दोहराएं।
नोट: रिफिलिंग खत्म करने में लगभग 30 एस-1 मिनट लगते हैं। एक ग्रिड की इमेजिंग के दौरान, रिफिलिंग ~ 4-8x होगी।
- एक बार जब बाहरी देवर चरण देवर को रिफिलिंग समाप्त कर देता है, तो प्रयोग दोहराएं क्योंकि रिफिल नमूना को लंबवत रूप से विस्थापित करता है। छवि को फिर से जेड में केंद्रित करने के लिए फिर से ध्यान केंद्रित करें, और एकल साइट प्रयोगको दोहराएं। लेजर और आवश्यक फिल्टर के सभी संयोजनों के लिए एकल साइट प्रयोग दोहराएं।
- प्रत्येक स्थिति में, दृश्य प्रकाश का उपयोग करके एक जेड स्टैक एकत्र करें।
- लेजर बंद करें, और परिवेश प्रकाश और कंडेनसरपर स्विचकरें। एकल साइट प्रयोग केतहत, जेड-स्टैकका चयन करें, परिवेश प्रकाश को 20 एमएस एक्सपोजर में सेट करें, और जेड ऊंचाई को ऊपर रखें।
- ग्रिड पर चिह्नित सभी साइटों के लिए 7.2 से 7.4 चरणों को दोहराएं।
- दूसरे नमूने में जाने से पहले, डिलीट टाइल्स पर क्लिक करके पच्चीकारी को हटा दें।
- उन्हें हटाने के लिए सभी टाइल्स के चारों ओर एक वर्ग ड्रा। उन सभी को सूची में चुनकर और फिर चयनित साइटोंको हटाकर मार्कर को हटाएं ।
- ग्रिड को बदलने के लिए आगे बढ़ने से पहले परिवेश प्रकाश और कंडेनसर बंद कर दें। उद्देश्य के तहत मंच को अनडॉक करने और ग्रिड को बदलने के लिए रिवर्स में धारा 4 में चरणों का पालन करें।
8. इमेजिंग के बाद
- इमेजिंग समाप्त होने के बाद, मंच को अनडॉक करें, और सभी नमूनों को हटा दें। नमूना चैंबर लाइट बंद कर दें। बाहरी देवर को अनप्लग करें, और किसी भी शेष एलएन2 को एक और क्रायो-संगत कंटेनर में डिकंट करें, जिससे देवर को सामान्य तापमान पर सुरक्षित रूप से लौटने की अनुमति दी जा सके।
- क्रायो-स्टेज पर ढक्कन प्लग रखो। जब तक सेंकना करने के लिए विकल्प का इंतजार-बाहर क्रायो मंच प्रदर्शन उपलब्ध हो जाता है के बाद कोई और अधिक LN2 मंच देवर में रहता है । हीटिंग मोड में प्रवेश करने के लिए बेक-आउट बटन दबाएं, और बर्फ बनने से बचने के लिए क्रायो-स्टेज से किसी भी नमी को हटा दें।
9. पुनर्निर्माण
- पुनर्निर्माण के लिए उचित वर्कस्टेशन में कच्चे सिम डेटा फ़ाइलों को स्थानांतरित करें। चैनल-विशिष्ट ऑप्टिकल ट्रांसफर फ़ंक्शन (ओटीएफएस) (मल्टी-फ्लोरोसेंट मोतियों बिंदु प्रसार कार्यों से गणना) और के 0 कोण(0.29278, -1.8028, 2.3786) का उपयोग करके प्रोसेसिंग टास्क बिल्डर विंडो के माध्यम से बैचों में प्रसंस्करण चलाएं 0.004 के सभी चैनलों के लिए एक निरंतर वीनर फिल्टर और 200 का ऑफसेट।
- अतिरिक्त विकल्प पैनल में, यह सुनिश्चित करें कि अन्य विकल्पों को अनियंत्रित रखकर नकारात्मक तीव्रता को त्याग दिया जाता है। सर छवियों को "प्रोसेस्ड" नाम के फोल्डर मेंसहेजें।
नोट: वाणिज्यिक सिम पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर आमतौर पर खंगाला सिम डेटा का उत्पादन और फ़ाइल नाम बरकरार रखती है, लेकिन अंत में SIR.dv appends । एक लॉग फ़ाइल भी बनाई गई है जिसमें पुनर्निर्माण की सफलता पर प्रसंस्करण प्रोटोकॉल, चरण और सांख्यिकीय जानकारी शामिल है।
10. रंगीन बदलाव सुधार
- रंगीन बदलाव के लिए सही करने के लिए सॉफ्टवेयर क्रोमेग्नन7 डाउनलोड करें।
- रंगीन बदलाव संदर्भ मैट्रिक्स का उपयोग करें जो एकत्र किए गए डेटा (बीमलाइन द्वारा प्रदान किए गए) के फ्लोरेसेंस तरंगदैर्ध्य से मेल खाती है।
नोट: संदर्भ फ़ाइल एक 'क्रोमाग्नॉन.csv फ़ाइल है, जिसमें संरेखण पैरामीटर शामिल हैं और बहु-फ्लोरोसेंट नैनोकणों का उपयोग करके अंशांकन छवियों से प्राप्त किया गया है। इसका उपयोग एक बार में कई डेटा सेट को बैच-प्रोसेस करने के लिए किया जा सकता है।- उपयुक्त संदर्भ फ़ाइल चुनें जो नमूना इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले लेजर वेवलेंथ और फ़िल्टर से मेल खाती है, और इसे संदर्भ क्षेत्र में जोड़ती है। स्रोत क्षेत्र में गठबंधन करने के लिए पुनर्निर्मित सर डेटा जोड़ें, और रनपर क्लिक करें ।
- जांच करें कि फ्लोरेसेंस सिग्नल अब छवियों में गठबंधन किया गया है। बैच-प्रोसेसिंग के लिए, स्रोत क्षेत्र में गठबंधन करने के लिए सभी सर छवियों और संदर्भ क्षेत्र में संदर्भ फ़ाइल को रखें, और सभी को दबाएं।
Representative Results
U2OS कोशिकाओं वाले एक नमूने को हरे माइक्रोटुबुल साइटोस्केलेटन डाई और लाल माइटोकॉन्ड्रिया डाई के मिश्रण से दाग दिया गया था, जिसके परिणामस्वरूप साइटोस्केलेटन (हरा) और माइटोकॉन्ड्रिया (लाल) के माइक्रोट्यूबुल घटक का धुंधला हो गया था। बाद में इमेजिंग ने कोशिका के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया के स्थानीयकरण के साथ-साथ माइक्रोट्यूबुल्स की व्यवस्था को दिखाया, जो संरचनात्मक ढांचे को उजागर करता है जो वे नाभिक जैसे ऑर्गेनेल्स के आसपास साइटोस्केलेटन की कोशिका और असेंबली को प्रदान करते हैं। क्रायोसिम में संकल्प मानक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(चित्र 5)की तुलना में काफी अधिक है। चित्रा 6 दर्शाता है कि कैसे फ्लोरोसेंट "नक्शा" एक पारंपरिक epifluorescence माइक्रोस्कोप से इमेजिंग के लिए ब्याज के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और ग्रिड पर एक स्थान से इसी क्रायोसिम-खंगाला छवि ।
चित्रा 1:क्रायोसिम इमेजिंग प्रोटोकॉल के चरणों को दिखाने वाला फ्लो चार्ट। संक्षिप्त नाम: क्रायोसिम = क्रायो-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:क्रायो-स्टेज। (A)क्रायो-स्टेज सेटअप । (ख)उल्टे संदंश द्वारा आयोजित एक नमूना ग्रिड। (ग)क्रायो-स्टेज के घटक। कनेक्शन बंदरगाहों को नारंगी रंगों के अनुरूप रंगों के साथ लेबल किया जाता है: बिजली की आपूर्ति, पीला: गर्म चरण ढक्कन, नीला: बाहरी देवर, हरा: पीसी से कनेक्शन। संक्षिप्त रूप: पीसी = व्यक्तिगत कंप्यूटर; एलएन2 = तरल नाइट्रोजन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:कॉकपिट सॉफ्टवेयर पैनलों के दृश्य। (A)मुख्य पैनल,(B)मैक्रो स्टेज XY,(C)मोज़ेक व्यू,(D)कैमरा व्यू । संक्षिप्त नाम: एसएलएम = स्थानिक प्रकाश मॉड्यूलर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:कॉकपिट सॉफ्टवेयर पैनलों के दृश्य। (A)Z स्टैक एकल साइट प्रयोग । (ख)एसआई सिंगल साइट एक्सपेरिमेंट। (ग)इमेज एक्विजिशन के दौरान इस्तेमाल किए जाने वाले कॉकपिट सॉफ्टवेयर के लिए कीबोर्ड शॉर्टकट । (घ)क्रायोसिम माइक्रोस्कोप डायमंड लाइट सोर्स सिंक्रोट्रॉन में बीमलाइन बी24 पर ऑन-साइट है । संक्षिप्त नाम: क्रायोसिम = क्रायो-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 5:क्रायोसिम का संकल्प। (ए)जांच के तहत ग्रिड का मोज़ेक दृश्य। (ख)ब्याज के क्षेत्र (एओआई) की ब्राइटफील्ड छवि। (C)इसके(डी)सिम छवि की तुलना में छद्म-वाइडफील्ड छवि संकल्प में वृद्धि को दिखाती है । सफेद तीर सिम पुनर्निर्माण कलाकृतियों को इंगित करता है। (ई)मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट मैप सिमचेक2द्वारा उत्पन्न कच्चे डेटा के संबंधित मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट-टू-शोर अनुपात (एमसीएनआर) मूल्यों की रंगीन जानकारी के साथ पुनर्निर्मित छवि की पिक्सेल तीव्रता जानकारी को मिलाकर । उज्ज्वल और अंधेरे क्षेत्र क्रमशः उच्च और निम्न विपरीत दिखाते हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन। क्रायोसिम इमेजिंग सेटिंग्स: उत्तेजन/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य: 488/525 एनएम, 50 एमडब्ल्यू लेजर पावर, 50 एमएस एक्सपोजर टाइम और 647/655 एनएम, 20 एमडब्ल्यू लेजर पावर, 5 एमएस एक्सपोजर टाइम। संक्षिप्त नाम: क्रायोसिम = क्रायो-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 6:एक पारंपरिक epifluorescence नक्शे से फ्लोरोरेसेंस नक्शे में ग्रिड पर एक स्थान से क्रायोसिम में छवि पुनर्निर्माण। (A, B)एक पारंपरिक epifluorescence माइक्रोस्कोप के साथ उत्पन्न ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस छवि नक्शे का ओवरले। इस नक्शे का उपयोग क्रायोसिम में बाद में छवि के लिए ब्याज के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए किया जाता है। (ग)(बी)में दिखाए गए स्थान पर प्राप्त खंगाला गया क्रायोसिम छवि । संक्षिप्त नाम: क्रायोसिम = क्रायो-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
क्रायोजेनिक तापमान पर 3डी सिम इमेजिंग विट्रीफाइड जैविक सामग्री के लिए अन्य एसआर इमेजिंग तकनीकों पर कई फायदे हैं। यह अन्य एसआर तरीकों की तुलना में प्रति जेड टुकड़ा काफी कम छवियों की आवश्यकता है, कम विकिरण और vitrified नमूनों के लिए बर्फ क्रिस्टल गठन की एक कम संभावना में जिसके परिणामस्वरूप। यह पूरी कोशिकाओं को छवि देने में भी सक्षम है और समारोह के साथ संरचना से मेल खाने के लिए एक्स-रे टोमोग्राफी के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। दिलचस्प बात यह है कि सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोफोरस और फ्लोरेसेंस टैग कमरे के तापमान की तुलना में क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत कम ब्लीच करते हैं। हालांकि, कमरे के तापमान पर सबसे आम फ्लोरोफोरस की उच्च क्वांटम उपज (कुछ मामलों में 80% से अधिक) को देखते हुए, फोटॉनों में पाया गया पूर्ण लाभ क्वांटम उपज में परिवर्तन के कारण नहीं है, बल्कि जटिल ब्लीचिंग प्रक्रियाओं में कमी के कारण है। क्रायोजेनिक तापमान पर फ्लोरोफोरस की उपज के बारे में अधिक जानकारी 8में पाई जा सकती है ।
यह महत्वपूर्ण है कि क्रायोसिम में पहुंचने वाले नमूनों को एक ग्रिड "मानचित्र" का उत्पादन करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र क्षमता के साथ एक पारंपरिक क्रायोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रीमैप किया गया है जिसमें आगे इमेजिंग(चित्रा 5)के लिए सभी संभावित एओआई को हाइलाइट करना शामिल है। क्रायोसिम में पहुंच समय एक प्रतिस्पर्धी प्रक्रिया के माध्यम से आवंटित किया जाता है जिसमें एक प्रस्ताव प्रस्तुत करना शामिल है, जिसे बाद में तकनीक व्यवहार्यता और जैव चिकित्सा प्रभाव के लिए मूल्यांकन किया जाता है। उपकरण पर समय, इसलिए, हमेशा "प्रीमियम पर" होता है, और प्रीमैप्ड ग्रिड आवंटन के सबसे कुशल उपयोग की अनुमति देते हैं। यह भी आवश्यक है कि नमूना को विशेष रूप से नमूना धारक से इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर नमूना हस्तांतरण के दौरान, बर्फ क्रिस्टल के गठन और बाद में नमूना क्षति को कम करने के लिए विट्रीफाइड रखा जाता है। नमूना सबसे अच्छा सिम छवियों का उत्पादन करने के लिए अच्छी गुणवत्ता का होना चाहिए। एक अच्छी तरह से तैयार नमूना निम्नलिखित विशेषताओं की विशेषता होगी: (क) इसमें कोई आइस क्रिस्टल संदूषण नहीं होगा, (ख) ग्रिड का उपयोग एक खोजक ग्रिड होगा, (ग) वाहक सपाट होगा, (घ) ग्रिड जाल और सब्सट्रेट सतह ऑटो-फ्लोरोसेंट नहीं होगी, और (ई) समर्थन झिल्ली में कोई ब्रेक नहीं होगा। इन आवश्यकताओं को सावधानीपूर्वक नमूना हैंडलिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और यह सुनिश्चित करना कि नमूने हमेशा विट्रीपिफाइड रहें।
यह पहले से जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रस्तावित नमूना फ्लोरोफोरस क्रायोसिम माइक्रोस्कोप में पर्याप्त संकेत देगा या नहीं। SPEKCheck9 जैसे उपकरण इष्टतम फ्लोरोफोर और फ़िल्टर संयोजनों को चुनने में सहायता कर सकते हैं। यदि कच्चे डेटा संग्रह या पुनर्निर्माण प्रक्रिया के साथ मुद्दे हैं, तो पुनर्निर्माण के बाद छवियों में कलाकृतियां दिखाई दे सकती हैं। विभिन्न कलाकृतियों के उदाहरणों को डेमरले एट अल द्वारा प्रलेखित किया गया है।10 इमेज रिकंस्ट्रक्शन पैरामीटर्स की समीक्षा सॉफ्टWoआरएक्स लॉग फाइल में की जा सकती है यदि पुनर्निर्माण सारांश फ़ाइल खोलकर पुनर्निर्माण इष्टतम नहीं है। किसी दिए गए चैनल में कोणों में लगातार लाइन अंतर होना चाहिए और अपेक्षाकृत सुसंगत आयाम होना चाहिए। 30% से अधिक की भिन्नता और मूल्यों को काफी ऊपर 1 (यदि मनका आकार मुआवजा लागू किया जाता है) की अधिक बारीकी से जांच की जानी चाहिए और विफल पुनर्निर्माण का संकेत मिलने की संभावना है। इसके अलावा, फिजी में सिमचेक2 सॉफ्टवेयर का उपयोग इमेजिंग या पुनर्निर्माण पैरामीटर सेटिंग्स में त्रुटियों के कारण का निदान करने के लिए कच्चे और पुनर्निर्मित डेटा पर विभिन्न जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। सिम-चेक और इसके मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट मैप से यह व्याख्या करके पुनर्निर्मित डेटा की गुणवत्ता के आकलन में भी सहायता मिल सकती है कि छवि के कौन से क्षेत्र वास्तविक संरचनाएं बनाम कलाकृतियों होने की संभावना है।
परमाणु क्षेत्र के भीतर कम मॉड्यूलेशन कंट्रास्ट (डार्क कलर द्वारा दिखाया गया है, चित्रा 5Eमें) का मतलब है कि यह क्षेत्र पुनर्निर्माण कलाकृतियों के लिए अतिसंवेदनशील होने जा रहा है, इसलिए इसका मतलब है कि नाभिक में दिखाए गए हैश पैटर्न को एक कलाकृतियों के रूप में वर्गीकृत(चित्रा 5D)किया जा सकता है। मजबूत फ्लोरेसेंस सिग्नल क्षेत्रों में प्रसंस्कृत डेटा में देशी संरचनाओं को सही ढंग से प्रतिबिंबित करने की अधिक संभावना है। कमजोर संकेत के क्षेत्रों में जहां फ्लोरोफोरस को व्यापक क्षेत्रों में वितरित किया जाता है, जैसे कि एक वेसिकल की कुल सतह, यह संभावना है कि वास्तविक संकेत प्रसंस्करण कलाकृतियों के साथ मौजूद है, और उस डेटा की व्याख्या में देखभाल की जानी चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए पूरी दूरी के खंगाले गए डेटा के निरीक्षण के बाद कोई अजीब कलाकृतियां नहीं हैं, और यह कि पृष्ठभूमि आम तौर पर गॉसियन होती है और शून्य के पास केंद्रित होती है, डेटा आम तौर पर शून्य पर काटा जाता है, या मोडल मूल्य-पृष्ठभूमि सिग्नल का शिखर- शून्य के पास होना चाहिए। यह सुनिश्चित करता है कि प्रदर्शित छवि की गतिशील रेंज नकारात्मक पृष्ठभूमि कलाकृतियों का प्रभुत्व नहीं है। जब एक कमजोर संकेत की उम्मीद है, तो सुविधाओं का विश्लेषण करने और यह सुनिश्चित करने में अतिरिक्त सावधानी बरती जानी चाहिए कि वे पुनर्निर्माण कलाकृतियों के बजाय वास्तविक संरचनाएं हैं।
इमेजिंग सिस्टम की कुछ सीमाएं हैं। क्योंकि नमूना चरण सपाट है, चर मोटाई या ग्रिड वाले नमूने जो फ्लैट नहीं हैं, इमेजिंग के लिए आदर्श विषय नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, यदि नरम एक्स-रे टोमोग्राफी का उपयोग करके सहसंबद्ध इमेजिंग की जाएगी, तो ग्रिड सीमाओं के पास की कोशिकाओं को चित्रित नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि ये झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण के दौरान एक्स-रे माइक्रोस्कोप में दिखाई नहीं देंगे। अंत में, डुबकी ठंड से पहले नमूने के ब्लॉटिंग की मात्रा इमेजिंग गुणवत्ता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है; बहुत कम ब्लॉटिंग के नमूने में परिणाम होते हैं जो बहुत मोटे होते हैं, उच्च पृष्ठभूमि शोर के साथ उप-तापीय सिम छवियां देते हैं, जबकि बहुत अधिक ब्लॉटिंग कोशिकाओं को गलत बनने का कारण बन सकता है और इसलिए घटना लेजर बीम से गर्मी के नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है। संक्षेप में, क्रायोसिम एक निकट-देशी चरण में 3 डी में जैविक नमूनों इमेजिंग के लिए एक शक्तिशाली फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी उपकरण है और कई क्षेत्रों में व्यापक अनुप्रयोग हैं।
Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।
Acknowledgments
इस परियोजना को यूरोपीय आयोग क्षितिज 2020 iNEXT-डिस्कवरी परियोजना से धन प्राप्त हुआ है। I.M Dobbie वेलकम ट्रस्ट (107457/Z/15/Z) से धन स्वीकार करते हैं । यह काम डायमंड लाइट सोर्स, इंस्ट्रूमेंट बी24 (प्रस्ताव BI25512) के समर्थन से किया गया था। माइक्रोन में कर्मचारियों और हमारे सभी उत्कृष्ट उपयोगकर्ताओं और सहयोगियों के लिए हमारा धन्यवाद हमें क्रायोसिम और इसकी सहसंबद्ध क्षमता स्थापित करने में मदद करने के लिए।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto grids | FEI | ||
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
| BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
| Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
| cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
| Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
| cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
| Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
| Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
| Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
| SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
| StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
| TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |
References
- Schermelleh, L., et al.
- Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Kounatidis, I., et al. 3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182 (2), 515-530 (2020).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H.
- Phillips, M. A., et al. CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging. Optica. 7 (7), 802 (2020).
- Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8, 7583 (2018).
- Kaufmann, R., Hagen, C., Grünewald, K. Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).
- Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource. Wellcome Open Research. 3, 92 (2018).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
