Kryo-struktureret belysning Mikroskopisk dataindsamling fra kryogent bevarede celler

Summary

Denne protokol viser, hvordan man billede biologiske cryo-konserverede prøver ved hjælp af kryo-struktureret belysning mikroskopi. Vi demonstrerer metoden ved at billeddanne cytoskeleton af U2OS-celler.

Abstract

Tredimensionel (3D) struktureret belysningsmikroskopi (SIM) tillader billeddannelse af fluorescerende mærkede cellulære strukturer ved højere opløsning end konventionel fluorescensmikroskopi. Denne superopløsningsteknik gør det muligt at visualisere molekylære processer i hele celler og har potentiale til at blive brugt sammen med elektronmikroskopi og røntgentomografi til at korrelere strukturel og funktionel information. Et SIM-mikroskop til kryogent bevarede prøver (cryoSIM) er for nylig blevet bestilt på den korrelative kryo-imaging beamline B24 på den britiske synkrotron.

Det blev designet specielt til 3D-billeddannelse af biologiske prøver ved kryogene temperaturer på en måde, der er kompatibel med efterfølgende billeddannelse af de samme prøver ved røntgenmikroskopimetoder som kryoblød røntgentomografi. Denne videoartikel indeholder detaljerede metoder og protokoller til vellykket billeddannelse ved hjælp af cryoSIM. Ud over instruktioner om driften af cryoSIM mikroskop, anbefalinger er blevet medtaget vedrørende valg af prøver, fluorophores, og parameterindstillinger. Protokollen er demonstreret i U2OS celleprøver, hvis mitokondrier og tubulin er blevet fluorescerende mærket.

Introduction

SR billeddannelse teknikker er blevet bredt tilgængelige for biologer i løbet af de sidste ti^{år 1}. De tillader høj opløsning billeddannelse af fluorescerende mærkede prøver ud over diffraktion grænse. Det har dog været udfordrende at tilpasse SR-mikroskopimetoder til at arbejde med prøver ved kryogene temperaturer². Dette ville være en fordel for korrelativ billeddannelse i kombination med elektron eller røntgentomografi. For nylig er SIM blevet tilpasset til brug med kryogene prøver og har med succes vist sig at muliggøre korrelative undersøgelser af biologiske celler i forbindelse med blød røntgentomografi (SXT)³ på den korrelative kryobilledstrålelinje B24 på Diamond Light Source Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM kan fordoble opløsningen af konventionel bredfeltmikroskopi ved at belyse prøven med stribede lysmønstre (Moiré frynser) i tre vinkler og i fem faser. Interferensen mellem disse lysmønstre og prøven fluorescens kan bruges til beregningsmæssigt at afdække ekstra oplysninger om sub-diffraktion strukturer^4,5.

Der er flere fordele ved SIM i forhold til andre SR-teknikker til kryogene applikationer. For det første kan det fungere uden specielt designede blinkende fluorophorer; konventionelle fluorophorer kan anvendes, hvilket giver adgang til en bredere vifte af potentielle fluorescerende mærkningsmidler⁶. Derudover kræver det kun 15 billeder pr. z skive (i 3D; 9 billeder til 2D), mens andre SR-metoder tager ca. 1000 billeder pr. skive, hvilket øger chancen for, at prøven opvarmes og dermed øger risikoen for dannelse af iskrystal, hvilket kan forårsage genstande. Endelig kan denne teknik billede tykkere biologiske prøver på over 10 μm, så hele celler, der skal afbildes i deres nær-native state⁶. CryoSIM er bygget ved hjælp af standard optiske komponenter og med open-access software til billedbehandling, hvilket gør det nemt at dokumentere og duplikere, hvis det ønskes⁶. CryoSIM har en 100x/0.9 numerisk blænde mål (se tabellen over materialer); yderligere oplysninger om dens optiske komponenter, designparametre og ydeevne er blevet beskrevet af Phillips et al.⁶ Her viser denne protokol, hvordan man bruger cryoSIM-mikroskopet, herunder hvordan man indlæser og losser prøver på kryogenstadiet, hvordan man indsamler data om mikroskopet, og hvordan man rekonstruerer SIM-billederne.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol vedrører prøver, der indeholder celler, der dyrkes eller deponeres på transmissionselektronmikroskopi (TEM) 3 mm flade guldgitre med en holey carbon support film, der er blevet vitrified ved frysning af dyk eller højtryksfrysning. Denne protokol forudsætter, at prøver allerede er blevet afbildet ved hjælp af en konventionel epifluorescence og brightfield mikroskop til at kortlægge steder af interesse for billeddannelse i cryoSIM. Se figur 1 for at få en oversigt over hele protokollen.

1. Forberedelse af kryo-scenen

1. Forbered isfrit flydende nitrogen (LN₂) ved at passere LN₂ gennem en tragt foret med standard videnskabelige tørre papirservietter.
   BEMÆRK: Da LN₂ forårsager forbrændinger, skal du bære passende personlige værnemidler, herunder kryobeskyttende handsker og beskyttelsesbriller, når du håndterer det. Sådanne væsker kan fortrænge ilt og forårsage hurtig kvælning og bør håndteres i et korrekt ventileret område.
2. Fjern overfladestøv fra kryostadiet med trykluft. Udvis væske fra den trykluftbeholder, før du bruger den.
3. Sørg for, at prøveindlæsningspatronen er på plads med den relevante prøveholder med kamre (kontroller, at der ikke er noget gitter tilbage i prøveholderen fra et tidligere eksperiment) (Figur 2).
4. Fjern låget fra kryostadiets ydre dewar, og hæld filtreret LN_2, indtil den er ca. 1/4^th fuld. Vent til den første kogning aftager, før du hælder mere; fylde fartøjet til ca. 2/3^rd fuld. Udskift låget forsigtigt, og ret dysen væk fra håndtereren og scenen/optik, mens LN₂ koger ud fra stikkontakten.
5. Når LN_{2 er} holdt op med at komme ud af stikkontakten, skal du placere udløbsrøret over scenen dewar på cryo-scenen.
6. Plug-in strømkilden på scenen, og tilslut USB-kablet til kryo-scenen. Sørg for, at det opvarmede prøvekammerlåg er tilsluttet. Sæt den eksterne dewar til scenen.
   BEMÆRK: Sæt ikke den eksterne dewar i, før udløbsrøret er placeret over scenen dewar på kryo-scenen. Hvis LN₂ flyder over (eller forhindrer det i at løbe over), skal du trække USB-kablet ud i ~10 s, lade det ekvilibrere og tilslutte USB-kablet igen for at genaktivere sensoren.
7. Når LN₂ er blevet leveret ind på scenen dewar, skal du trykke på udløserknappen på kryo-scenen for at tillade LN₂ at komme ind i prøvekammeret.
   BEMÆRK: Lad ikke systemet være uden opsyn, mens LN₂ fylder kammeret.
8. Vent i ~ 30-45 minutter for at gøre det muligt for systemet at køle og stabilisere, før du begynder billedopsamling. Kontroller jævnligt den eksterne dewar, og fyld op med filtreret LN_2, hvis den er mindre end en fjerdedel fuld (ca. hver time).

2. Overførsel af prøveopbevaringsboksen til kryostadiet

BEMÆRK: Sænk prøveopbevaringsboksen, holderen og spidsen af instrumenter (f.eks. sammenklapper) inde i filtreret LN₂ for at afkøle dem, før du rører ved kolde overflader såsom prøven eller genstande inde i prøvekammeret. Brug en laboratoriefrakke og handsker ved håndtering af biologiske prøver.

1. Sørg for, at vitrified prøver er i en kryokompatibel beholder, og bring dem til mikroskopet. Tryk på den tilsvarende knap på kryostadiet for at tænde lyset i prøvekammeret.
2. Brug hex-tasten på kassetteværktøjet til at åbne de to plader på prøveoverførselskassetten. Åbn pladerne bredt nok til at falde i gitteret mellem de to plader, men undgå at åbne til den maksimale åbne position for at forhindre gitteret falder gennem den anden side.
3. Brug lange sammenkrøpper til at løfte prøvegitterboksen ud af LN₂, drej den, hvor hakket flugter med placeringen af opbevaringspositionen inde i scenen, og placer den på scenen. Brug den relevante enhed (f.eks. en skruetrækker) til at åbne låget på opbevaringsboksen til den korrekte prøveposition.
4. Brug omvendte sammenkr vil (eller eventuelle finspids kirurgiske sammenkr vil) fjerne TEM-gitteret fra prøveholderen, nedsænke det i LN₂og sætte det på plads i prøveoverførselskassetten, holde tæt på LN₂ under overførselsprocessen. Sørg for, at kulstoffilmsiden er placeret, så den i sidste ende vil stå over for målet på prøvebroen.
5. Luk prøvepatronen ved hjælp af hex-tasten på kassetteværktøjet. Luk og fjern opbevaringsboksen sammen med eventuelle resterende prøver.
6. Brug magnetpunktet på kassetteværktøjet til at løfte og montere patronen, der indeholder gitteret, på prøvebroen. Hold det nedsænket / tæt på LN₂ under overførselsprocessen. Sørg for, at retningen er passende for broen (de to magneter kommer i kontakt med magneterne på broen). Placer kassetten fladt i broens positioneringsstifter, og skub forsigtigt for at sikre, at den er fastgjort.
   BEMÆRK: En prøvekassette til klippede gitre, der er forberedt til efterfølgende fokuseret ionstrålefræsning, fås også på CryoSIM-anlægget ved beamline B24.

3. Scene docking og fokusering

1. Flyt kryostadiets lågåbning til billeddannelsespositionen, og sluk for prøvekammerlyset. Skub scenen mod optik for at justere den under objektivobjektivet. Smid forsigtigt målet på plads ved hjælp af håndtaget, så det hviler inden for låget på kryostadiet, men ikke rører det.
   BEMÆRK: Sørg for, at den eksterne Dewars udløbsrør ikke rører scenen dewar på kryo-scenen på noget tidspunkt under dataindsamlingen.
2. Dæk scenen og optik med et uigennemsigtigt sort gardin. Start kontrolsoftwaren Cockpit på cryoSIM-pc'en (Figur 3 og Figur 4).
3. Klik på knappen Udlæsningstilstand for hvert kamera, og indstil den til CONV 3 MHz. Kontroller, at temperaturen på hvert kamera er -80 °C, og kameraventilatoren er slukket.
4. Tænd for det reflekterede kamera. Under Lysskal du vælge omgivende (eksponering 20 ms), og klik på kondensatorunder Linkam. Klik på knappen Videotilstand.
5. Zoom ud (muserulle) i vinduet Mosaikvisning for at se gitterdispositionen. Klik på Find scenen, hvis det ikke kan ses. Centrer gitteret ved at dobbeltklikke midt i cirklen.
6. Fokuser prøven, indtil gitterstøttefilmen (eller en anden relevant prøvefunktion) er i fokus, ved hjælp af op- og nedtasterne til at flytte kryostadiet op og ned og bruge 9 og 3 tasterne på den numeriske pad til at ændre z-trinet (indstil det til 20 μm til indledende fokusering).
   BEMÆRK: Hvis brugeren løber tør for rejse i z, kan scenen manuelt flyttes op eller ned ved hjælp af hjulet under kryostadiet. Drej den med et hak ad gangen, og kontroller, om prøven er inden for synsintervallet. Ændre retningen igen, hvis fokus forværres.

4. Brightfield mosaik erhvervelse

1. Når scenen er centreret, skal du slukke for videotilstandog indsamle en synlig lysmosaik (klik på Kør mosaik i mosaikvisningen for at producere fliser af synlige lysbilleder, der spiral udad fra midten). Hvis gitteret er bøjet, kan du prøve forskellige positioner på gitteret (dobbeltklik til venstre i Mosaikvisning), fokusere igen og klikke på Kør mosaik igen for at indsamle delvise mosaikker. Alternativt drop-in et fokuseret billede på toppen af mosaikken (Figur 3).
2. Gem visningen ved at klikke på Gem mosaik. Giv det et kort filnavn, der indeholder oplysninger om lagerboksen og det respektive gitternummer (et tidsstempel føjes automatisk til filnavnet).

5. Identifikation af interesseområder

1. Undersøg brightfield mosaik sammen med eventuelle tidligere fluorescens "kort" billeder for, hvor celler eller biologiske træk af interesse tidligere har været placeret. Kontroller, om disse områder giver passende fluorescens.
   1. Sluk for det omgivende lys og kondensatoren samt videotilstanden, hvis den er aktiv. Tænd for den nødvendige excitationslaser (405, 488, 561 eller 647), og vælg det tilsvarende kamera og filter, i første omgang ved 50 mW , i 50 ms eksponeringstid.
      BEMÆRK: Forøg/reducer disse kamera- og filterindstillinger afhængigt af fluorescenssignalet.
   2. Tryk på 0 for at fastgøre et billede og * for automatisk kontrast. Du kan også justere kontrasten manuelt ved hjælp af skyderen nederst i billedet.
      BEMÆRK: Tænd laseren på skiltet til rummet.
   3. Når biologisk interessante celler med passende fluorescens er fundet, markere deres positioner ved hjælp af Mark site knappen i Mosaic visning.
      BEMÆRK: Disse markerede websteder vises på den vedlagte liste og kan tilgås ved at dobbeltklikke på koordinaterne. Når du vender tilbage til et markeret websted, skal du zoome ind på området, før du dobbeltklikker.
   4. Fortsæt med at markere alle potentielle websteder, før du begynder at få billede. Gem mosaikken igen med de markerede steder; Klik på Gem websteder for at arkivere.
      1. For at sy mosaikbillederne sammen ved hjælp af StitchM-softwaren (udviklet internt på beamline B24) skal du trække og slippe .txt mosaikfilen ind i StitchM-filen med udvidelse .bat og gemme det kombinerede tiff-billede af mosaikfliserne i samme mappe. Hvis du vil gemme et billede med de markerede websteder, skal du trække og slippe mosaikken.txt fil og markører.txt fil ind i ikonet på samme tid.
         BEMÆRK: Afvej dataindsamlingen mod projektets behov (f.eks. hvis der vil blive foretaget korrelativ billeddannelse, skal du kontrollere, hvor mange billeder der kan tages med partnerbilleddannelsens modalitet, og vælg det passende antal steder til kryoSIM-billeddannelse). Hvis den eksterne dewar kræver genopfyldning med LN₂ , vil kryostadiets system desuden ændre position, og de markerede steder vil sandsynligvis ikke vende tilbage til de samme steder; derfor overveje dette, når du vælger antallet af websteder, der skal afbildes.

6. Dataindsamlingsstrategi

1. Indstil lasereksponeringstiden baseret på optællingerne i det dynamiske område i fluorescensbilledet (nederst i kameraets visningsvindue). Vælg, hvilket filter der skal anvendes, og optimer disse indstillinger for hver bølgelængde af excitationslys, der skal bruges, og tænd hver laser separat.
   BEMÆRK: Selvom 10.000-20.000 tæller er optimale, er lavere optællinger acceptable, hvis der er en god kontrast. Ideelt set skal du kontrollere filterindstillingerne, før hver billedstak er anskaffet, fordi celler på forskellige områder af gitteret kan have variable fluorescensniveauer.

7. Dataindsamling

1. Klik på begge kameraer for at tænde dem. Gå tilbage til et af de markerede websteder, og fokuser på den ønskede dybde igen. Når du er i fokus i et interesseområde, skal du flytte ud af fokus opad(↑ -tasten) i XY-vinduet i makrostadiet for at vælge højden på den z-stak, der skal anskaffes, og klik på Gem øverst. Flyt ud af fokus nedad (↓ tasten), klik på Gem nederst og derefter på Gå til midten, og kontroller, at billedet stadig er i fokus.
   BEMÆRK: Prøvehøjden vises i vinduet.
2. Højreklik på slm (rumlig lysmodulator) i Cockpit-vinduet, og sørg for, at vinklen er indstillet til 0,41. Vælg Enkeltsideeksperimenti cockpitvinduet .
   BEMÆRK: Klik ikke på slm på; Cockpittet tændes automatisk under billedopsamling.
   1. Vælg Struktureret belysningpå rullelisten . Rediger stakhøjden, så den er lig med z-højden + 1 μm.
      BEMÆRK: Tilsætning af 1 μm sikrer, at hele prøven opsamles i z og minimerer rekonstruktionsgenstande.
   2. Angiv eksponeringstiderne (ms) for laserne på 405 nm og 488 nm i den øverste række (for det reflekterede kamera) og eksponeringstiderne for laserne på 561 nm og 647 nm i den nederste række (for det transmitterede kamera).
      BEMÆRK: Værdierne for eksponeringstiden skal svare til de værdier, der tidligere er angivet og vist i cockpitvinduet.
   3. Indtast et filnavn (navngivningskonvention: number_grid area_filters_FL) (FL (fluorescens) eller BF (brightfield), afhængigt af hvilken type billeddannelse der udføres). Klik på Opdater for at producere en ny fil, der indeholder dato og klokkeslæt uden at overskrive tidligere filer. Klik derefter på Start.
3. Kontroller kameravisningen, mens der indsamles data. Tag billederne igen, hvis der er xy-forskydning. Hvis LN₂ dewar genopfylder kryo-scenen under billedopsamling, skal du afbryde processen ved at klikke på abortknappen i Cockpit-softwaren.
   1. Når den eksterne dewar er færdig med at genopfylde scenen dewar, gentage eksperimentet, fordi refill fortrænger prøven lodret. Fokuser billedet igen for at centrere det i z, og gentag eksperimentet Med et enkelt websted. Gentag single-site eksperimentet for alle kombinationer af lasere og filtre, der er nødvendige.
      BEMÆRK: Det tager ca. 30 s-1 minut at afslutte genopfyldning. Under billeddannelsen af et gitter vil genopfyldning ske ~ 4-8x.
4. På hver position skal du samle en z-stak ved hjælp af synligt lys.
   1. Sluk for laserne, og tænd for omgivende lys og kondensator. Under Enkelt-site eksperiment, skal du vælge Z-stack, indstille Ambient lys til 20 ms eksponering, og holde z højde som ovenfor.
5. Gentag trin 7.2 til 7.4 for alle steder, der er markeret på gitteret.
6. Før du flytter til et andet eksempel, skal du slette mosaikken ved at klikke på Slet felter.
   1. Tegn en firkant omkring alle fliserne for at slette dem. Slet mærkerne også ved at markere dem alle på listen og derefter klikke på Slet markerede websteder.
7. Sluk for det omgivende lys og kondensatoren, før du fortsætter med at ændre gitteret. Følg trinnene i afsnit 4 i omvendt rækkefølge for at fradocke fasen under målsætningen og ændre gitteret.

8. Efter billeddannelse

1. Når billeddannelsen er færdig, skal du fradocke stadiet og fjerne alle prøverne. Sluk for prøvekammerlampen. Tag stikket ud af den eksterne dewar, og dekanter eventuelle resterende LN₂ i en anden kryokompatibel beholder, så dewar til sikkert at vende tilbage til en normal temperatur.
2. Sæt låget på kryo-scenen. Vent, indtil muligheden for at bage ud kryo-fase display bliver tilgængelig efter ikke mere LN₂ forbliver i scenen dewar. Tryk på bake-out-knappen for at komme ind i opvarmningstilstanden, og fjern fugt fra kryostadiet for at undgå isdannelse.

9. Genopbygning

1. Overfør rå SIM-datafiler til den relevante arbejdsstation til genopbygning. Kør behandling i batches gennem vinduet Processing Task Builder ved hjælp af kanalspecifikke optiske overførselsfunktioner (OTFS) (beregnet ud fra multi-fluorescerende perler punktspredningsfunktioner) og K₀ vinkler (0,29278, -1,8028, 2,3786) med et konstant Wiener-filter for alle kanaler på 0,004 og en biasforskydning på 200.
2. I panelet Yderligere indstillinger skal du sikre dig, at negative intensiteter kasseres ved at holde andre indstillinger umarkeret. Gem SIR-billederne i en mappe med navnet "behandlet".
   BEMÆRK: Kommerciel SIM-rekonstruktionssoftware producerer normalt rekonstruerede SIM-data og bevarer filnavnet, men tilføjer SIR.dv i slutningen. Der oprettes også en logfil, der indeholder behandlingsprotokollen, trinene og de statistiske oplysninger om genopbygningssucces.

10. Kromatisk skiftkorrektion

1. Download softwaren Chromagnon⁷ for at rette op på det kromatiske skift.
2. Brug den kromatiske skiftreferencematrix, der svarer til fluorescensbølgelængderne i de indsamlede data (leveret af beamline).
   BEMÆRK: Referencefilen er en 'chromagnon.csv'-fil, som indeholder justeringsparametrene og er opnået ved kalibreringsbilleder ved hjælp af multi-fluorescerende nanopartikler. Det kan bruges til batch-proces flere datasæt på én gang.
   1. Vælg den relevante referencefil, der svarer til den laserbølgelængde og det filter, der bruges til billedbehandling af prøven, og føj den til referencefeltet. Tilføj de rekonstruerede SIR-data, der skal justeres i kildefeltet, og klik på Kør.
   2. Kontroller, at fluorescenssignalet nu er justeret i billederne. Hvis batchafvikling skal placeres i kildefeltet og referencefilen i referencefeltet, skal du placere alle SIR-afbildninger, der skal justeres, i kildefeltet og referencefilen, og trykke på Kør alle.

Representative Results

En prøve indeholdende U2OS celler blev farves med en blanding af grøn microtubule cytoskeleton farvestof og rød mitokondrier farvestof, hvilket resulterer i farvning af microtubule komponent cytoskeleton (grøn) og mitokondrier (rød). Efterfølgende billeddannelse viste lokalisering af mitokondrier i cellen samt placeringen af mikrotubulerne, der fremhæver de strukturelle rammer, de giver til cellen og samlingen af cytoskeleton omkring organeller som kernen. Opløsningen i cryoSIM er betydeligt højere end i standard epifluorescencemikroskopi (Figur 5). Figur 6 viser, hvordan det fluorescerende "kort" fra et konventionelt epifluorescencemikroskop kan bruges til at lokalisere områder af interesse for billeddannelse og det tilsvarende kryoSIM-rekonstruerede billede fra et sted på nettet.

Figur 1: Rutediagram, der viser faserne i cryoSIM-billedbehandlingsprotokollen. Forkortelse: cryoSIM = Kryo-struktureret belysningsmikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Kryostadiet. (A) Kryo-fase setuppet. (B) Et prøvegitter, der er vist med omvendte sammentakkerne. (C) Komponenter i kryo-scenen. Tilslutningsportene er mærket, med farverne svarende til orange: strømforsyning, gul: opvarmet scenelåg, blå: ekstern dewar, grøn: forbindelse til PC. Forkortelser: PC = personlig computer; LN₂ = flydende nitrogen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Visninger af cockpitsoftwarepanelerne. (A) Hovedpanel, (B) makrotrin XY, (C) mosaikvisning, (D)kameravisninger. Forkortelse: SLM = rumlig lysmodulator. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Visninger af Cockpit softwarepaneler. (A) Z stak enkelt sted eksperiment. (B) SI enkelt sted eksperiment. (C) Tastaturgenveje til cockpitsoftwaren, der bruges under billedopsamlingen. (D) CryoSIM mikroskopet er på stedet ved beamline B24 på Diamond Light Source synkrotron. Forkortelse: cryoSIM = Kryo-struktureret belysningsmikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Opløsning af cryoSIM. (A) Mosaikbillede af et gitter, der undersøges. (B) Brightfield billede af et interesseområde (AOI). (C) Pseudo-widefield-billede sammenlignet med dets (D) SIM-billede, der viser stigningen i opløsningen. Den hvide pil angiver SIM-rekonstruktionsgenstande. (E) Graduering kontrast kort kombinerer pixel intensitet oplysninger om den rekonstruerede billede med farveoplysninger af de respektive graduering kontrast-til-støj-forhold (MCNR) værdier af de rå data, der genereres af SIMCheck². De lyse og mørke områder viser henholdsvis høj og lav kontrast. Skalalinje = 10 μm. CryoSIM billeddannelse indstillinger: excitation / emission bølgelængder: 488/525 nm, 50 mW laser effekt, 50 ms eksponeringstid og 647/655 nm, 20 mW laser effekt, 5 ms eksponeringstid. Forkortelse: cryoSIM = Kryo-struktureret belysningsmikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Billederekonstruktion i cryoSIM fra et sted på nettet i et fluorescenskort fra et konventionelt epifluorescencekort. (A,B) Overlejring af lysfelt- og fluorescensbilledkort genereret med et konventionelt epifluorescencemikroskop. Dette kort bruges til at lokalisere områder af interesse for efterfølgende at afbilde i cryoSIM. (C) Det rekonstruerede cryoSIM-billede, der er opnået på det sted, der er vist i (B). Forkortelse: cryoSIM = Kryo-struktureret belysningsmikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

3D SIM ved kryogene temperaturer har mange fordele i forhold til andre SR-billeddannelsesteknikker til billeddannelses vitrified biologisk materiale. Det kræver betydeligt færre billeder pr. z-skive sammenlignet med andre SR-metoder, hvilket resulterer i mindre bestråling og en lavere chance for iskrystaldannelse for vitrified prøver. Det er også i stand til at afbilde hele celler og kan korreleres med røntgentomografi for at matche struktur med funktion. Interessant nok bleges de fleste kommercielt tilgængelige fluorophorer og fluorescensmærker mindre under kryogene forhold end ved stuetemperatur. Men i betragtning af det høje kvanteudbytte af de mest almindelige fluorophorer ved stuetemperatur (mere end 80% i nogle tilfælde) skyldes den absolutte gevinst, der opdages i fotoner, ikke ændringer i kvanteudbyttet, men på grund af en reduktion i de komplekse blegningsprocesser. Mere information om udbyttet af fluorophorer ved kryogene temperaturer kan findes i ⁸.

Det er afgørende, at prøver, der ankommer til cryoSIM, er blevet forkortet ved hjælp af et konventionelt kryofluorescencemikroskop med brightfield evne til at producere et gitter "kort", der omfatter fremhævning af alle potentielle AOIs til yderligere billeddannelse (Figur 5). Adgangstiden på cryoSIM tildeles via en konkurrenceproces, der indebærer indsendelse af et forslag, som efterfølgende evalueres for teknikmæssig gennemførlighed og biomedicinsk virkning. Tid på udstyret er derfor altid "til en præmie", og forudtilsluttet net giver mulighed for den mest effektive udnyttelse af en tildeling. Det er også vigtigt, at prøven holdes vitrified, navnlig under prøveoverførsel fra prøveindehaveren til billeddannelsesplatformen, for at minimere dannelsen af iskrystaller og efterfølgende prøveskader. Prøven skal være af god kvalitet til at producere de bedste SIM-billeder. En velforberedt prøve vil være karakteriseret ved følgende funktioner: (a) det vil ikke have nogen iskrystal forurening, (b) det anvendte gitter vil være en finder gitter, (c) luftfartsselskabet vil være flad, (d) gitternet og substrat overflade vil ikke være auto-fluorescerende, og (e) der vil ikke være nogen pauser i støttemembranen. Disse forudsætninger kan opnås ved omhyggelig prøvehåndtering og sikre, at prøverne altid forbliver vitrified.

Det er vigtigt på forhånd at kontrollere, om foreslåede prøveflufluoriorter vil give tilstrækkeligt signal i kryoSIM-mikroskopet. Værktøjer som SPEKCheck⁹ kan hjælpe med at vælge de optimale fluorophore og filterkombinationer. Hvis der er problemer med den rå dataindsamling eller genopbygningsprocessen, kan genstande vises på billederne efter rekonstruktionen. Eksempler på forskellige genstande er dokumenteret af Demmerle et al.¹⁰ Billedrekonstruktionsparametrene kan gennemgås i SoftWoRx-logfilen, hvis rekonstruktionen ikke er optimal ved at åbne rekonstruktionsoversigtsfilen. Der bør være konsekvent linjeafstand på tværs af vinkler i en given kanal og relativt konsekvent amplitud. Variation på mere end 30 % og værdier, der ligger betydeligt over 1 (hvis der anvendes kompensation for perlestørrelse) bør undersøges nærmere og vil sandsynligvis indikere mislykkede rekonstruktioner. Derudover kan SIMcheck^2-softwaren i Fiji også bruges til at udføre forskellige kontroller af de rå og rekonstruerede data for at diagnosticere årsagen til fejl i billed- eller rekonstruktionsparameterindstillingerne. SIM-check og dets gradueringskontrastkort kan også hjælpe med at vurdere kvaliteten af rekonstruerede data ved at fortolke, hvilke områder af et billede der sandsynligvis vil være reelle strukturer versus artefakter.

Lav graduering kontrast (vist ved mørk farve, i figur 5E) inden for det nukleare område betyder, at denne region vil være mere modtagelige for genopbygning artefakter, derfor indebærer, at hash mønstre vist i kernen kunne klassificeres (Figur 5D) som en artefakt. Stærke fluorescens signalområder er mere tilbøjelige til præcist at afspejle indfødte strukturer i de behandlede data. I områder med svagt signal, hvor fluorophorer er fordelt over bredere områder, såsom den samlede overflade af en vesikel, er det sandsynligt, at der er et reelt signal side om side med behandling af artefakter, og der bør udvises forsigtighed ved fortolkningen af disse data. Efter inspektion af hele spektret rekonstruerede data for at sikre, at der ikke er nogen mærkelige artefakter, og at baggrunden er generelt Gaussian og centreret nær nul, er dataene generelt klippet på nul, eller den modale værdi-toppen af baggrunden signal-bør være meget tæt på nul. Dette sikrer, at det viste billedes dynamiske område ikke domineres af negative baggrundsartefakter. Når der forventes et svagere signal, bør der udvises ekstra omhu i at analysere funktionerne og sikre, at de er reelle strukturer snarere end genopbygningsgenstande.

Der er nogle begrænsninger i billedbehandlingssystemet. Da prøvestadiet er fladt, er prøver med variabel tykkelse eller gitre, der ikke er flade, ikke ideelle emner til billeddannelse. Derudover, hvis korrelativ billeddannelse vil ske ved hjælp af blød X-ray tomografi, celler i nærheden af gitter grænser bør ikke afbildes, da disse ikke vil være synlige i X-ray mikroskop under tilt serien erhvervelse. Endelig har mængden af blotting af prøven før frysning af dyk en betydelig indvirkning på billedkvaliteten. for lidt blotting resulterer i prøver, der er for tykke, hvilket giver suboptimale SIM-billeder med høj baggrundsstøj, mens for meget blotting kan forårsage celler til at blive misformet og derfor mere modtagelige for varmeskader fra hændelsen laserstråle. Sammenfattende er cryoSIM et kraftfuldt fluorescensmikroskopiværktøj til billeddannelse af biologiske prøver i 3D i et næsten indfødt stadium og har vidtrækkende applikationer på mange områder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auto grids	FEI
Autogrids	Thermo Fisher Scientific	1036173
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye	Sigma-Aldrich	SCT142
Cockpit Software	Oxford University		https://github.com/MicronOxford/cockpit
cryo compatible polyurethane container	Jena bioscience	CC-FD-800
Cryo TEM grid storage box	Thermo Fisher Scientific	Model#AutoGrid
cryo-SIM microscope	Custom made	N/A	Custom made, see following reference for the design:  Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.
Cryostage system	Linkam Scientific Instruments	CMS196
Fine tip surgical forceps	Ted Pella	38125
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426
Python Microscope Software	Oxford University		https://www.python-microscope.org/
Scientific dry paper wipes	Kimberly-Clark 7551	2
SIM Reconstruction Software	softWoRx, GE Healthcare	Version  6.5.2
StitchM Software	Diamond Light Source		https://github.com/DiamondLightSource/StitchM
TEM grids for samples	Quantifoil Micro Tools	G200F1