Summary
En Agrobacterium-baseret injektion (agroinjection) protokol præsenteres til podning af foxtail mosaikvirus og sukkerrør mosaik viruscloner i majsplanter. Podning på denne måde fører til virusinfektion, virusinduceret genhæmning af markørgener og viral overekspression af GFP.
Abstract
Agrobacterium-baserede podningsmetoder anvendes i vid udstrækning til at indføre virale vektorer i plantevæv. Denne undersøgelse beskriver en protokol til injektion af majsplanter nær meristematisk væv med Agrobacterium , der bærer en viral vektor. Rekombinante foxtail mosaikvirus (FoMV) kloner konstrueret til genhæmning og genekspression blev brugt til at optimere denne metode, og dens anvendelse blev udvidet til at omfatte en rekombinant sukkerrør mosaikvirus (SCMV) konstrueret til genekspression. Genfragmenter eller kodende sekvenser af interesse indsættes i et modificeret, infektiøst viralt genom, der er blevet klonet i den binære T-DNA-plasmidvektor pCAMBIA1380. De resulterende plasmidkonstruktioner omdannes til Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101. Majsplanter så unge som 4 dage gamle kan injiceres nær coleoptilar knuden med bakterier resuspended i MgSO4 opløsning. Under infektion med Agrobacterium overføres T-DNA'et, der bærer det virale genom, til majsceller, hvilket muliggør transkription af det virale RNA-genom. Da den rekombinante virus replikerer og systematisk spredes gennem hele planten, kan virale symptomer og fænotypiske ændringer som følge af hæmning af målgenernes læsion efterligne 22 (les22) eller phytoendesaturase (pds) observeres på bladene, eller ekspression af grønt fluorescerende protein (GFP) kan detekteres ved belysning med UV-lys eller fluorescensmikroskopi. For at detektere viruset og vurdere insertets integritet samtidigt ekstraheres RNA fra bladene på den injicerede plante, og RT-PCR udføres ved hjælp af primere, der flankerer det multiple kloningssted (MCS), der bærer den indsatte sekvens. Denne protokol er blevet anvendt effektivt i flere majsgenotyper og kan let udvides til andre virale vektorer og tilbyder derved et tilgængeligt værktøj til introduktion af viral vektor i majs.
Introduction
Infektiøse kloner af mange plantevira er blevet konstrueret til virusinduceret genhæmning (VIGS), genoverekspression (VOX) og senest virusaktiveret genredigering (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Efterhånden som nye virale konstruktioner udvikles, skal metoder til med succes at inficere plantevæv med disse modificerede vira også overvejes. Nuværende metoder til at lancere virusinfektioner i planter omfatter partikelbombardement, rub-podning af in vitro RNA-transkripter eller DNA-kloner, vaskulær punkteringspodning eller Agrobacterium tumefaciens podning (agroinokulation)5,12,13,14,15,16,17 . Hver af disse podningsmetoder har iboende fordele og ulemper, som omfatter omkostninger, behov for specialudstyr og gennemførlighed inden for et givet plantevirussystem. Metoder, der anvender infiltration eller injektion af Agrobacterium-stammer, der indeholder binære T-DNA-konstruktioner designet til at levere rekombinante vira, foretrækkes, fordi de er enkle og billige. Der mangler imidlertid detaljerede agroinokuleringsmetoder for monocotyledonøse arter som Zea mays (majs).
En af de første rapporter om agroinokulering til viruslevering blev offentliggjort i 1986, da genomet af blomkålmosaikvirus (CaMV) blev indsat i en T-DNA-konstruktion, og den resulterende Agrobacterium, der bærer denne konstruktion, blev rub-podet på majroeplanter18. Yderligere metoder til agroinokulering er siden blevet udviklet. I tilfælde af foxtail mosaikvirus (FoMV) kan Nicotiana benthamiana f.eks. bruges som mellemvært til at generere viruspartikler i blade, der giver en inokulumkilde6. Rub podning af majs ved hjælp af inficerede N. benthamiana blade er effektiv, hurtig og enkel, men brugen af en mellemliggende vært virker ikke for alle majsinficerende vira. Sukkerrørmosaikvirus (SCMV) kan for eksempel ikke inficere N. benthamiana, hvilket kræver anvendelse af alternative inokulumkilder til vektorer afledt af denne virus. I 1988 blev Agrobacterium indeholdende majsstribevirus (MSV), en DNA-virus, indført i majsplanter ved injektion (agroinjektion), hvilket demonstrerede, at Agrobacterium-baserede podningsmetoder også er nyttige til monocots19. På trods af denne tidlige succes med agroinjektion er der kun offentliggjort få undersøgelser, der anvender denne teknik i majs, hvilket efterlader åbne spørgsmål om anvendeligheden af denne metode til RNA-vira og VIGS-, VOX- og VEdGE-vektorer20,21,22. Imidlertid er bred anvendelse af agroinjektion i monocot-arter lovende, fordi denne generelle tilgang er blevet brugt i orkidé, ris og hvede23,24,25,26,27,28.
Denne protokol blev optimeret til FoMV og Agrobacterium stamme GV3101 og er også blevet anvendt på en SCMV-vektor. FoMV er et potexvirus med et bredt værtsområde, der omfatter 56 monocot- og dicotarter29. FoMV har et 6,2 kilobase (kb) positivt sans, enkeltstrenget RNA-genom, der koder for fem forskellige proteiner fra fem åbne læserammer (ORF'er)30,31,32,33,34,35. FoMV blev tidligere udviklet til både en VIGS- og VOX-vektor til majs ved at inkorporere en infektiøs klon på en T-DNA-plasmidrygrad6,36,37. Det virale genom blev modificeret til VIGS-applikationer ved at tilføje et kloningssted (MCS1*) umiddelbart nedstrøms for pelsproteinet (CP) (figur 1A)36. For VOX- og VEdGE-applikationer blev CP-promotoren duplikeret, og et andet kloningssted (MCS2) blev tilføjet for at muliggøre indsættelse af sekvenser af interesse mellem ORF 4 og CP (figur 1B)6. FoMV-vektoren, der indeholder både MCS1 og MCS2 uden skær, er FoMV tom vektor (FoMV-EV) (figur 1).
SCMV er en ikke-relateret virus, der er udviklet til VOX i majs38. Det er medlem af Potyviridae-familien, hvoraf flere medlemmer er blevet konstrueret til at udtrykke fremmede proteiner i planta39,40,41,42,43,44. Værtsområdet for SCMV omfatter majs, sorghum og sukkerrør45,46, hvilket gør det værdifuldt for genfunktionelle undersøgelser i disse store afgrødeplanter36,38. SCMV har et positivt sense, enkeltstrenget RNA-genom på ca. 10 kb i længden47,48. For at skabe SCMV VOX-vektoren blev det veletablerede P1/HCPro-kryds brugt som indsættelsessted for heterologe sekvenser38. Dette kloningssted efterfølges af sekvens, der koder for et NIa-Pro proteasespaltningssted, hvilket fører til produktion af proteiner, der er uafhængige af SCMV-polyproteinet (figur 1C).
T-DNA-plasmider, der bærer infektiøst cDNA af disse rekombinante vira, er blevet omdannet til Agrobacterium-stamme GV3101. GV3101 er en nopalin type stamme, som er velkendt for at kunne overføre T-DNA til monocotyledonous arter, herunder majs26,28,49. Derudover har tidligere agroinjektionsundersøgelser brugt stammerne C58 eller dets derivat GV3101 samt19,20,22,27.
Tre markørgener blev anvendt i udviklingen af denne protokol: to til genhæmning og en til genekspression. Et 329 basepar (bp) fragment fra majsgenlæsionen efterligner 22 (les22, GRMZM2G044074) blev brugt til at konstruere dæmpningsvektoren FoMV-LES22. Når les22 er tavs i majs, vises små, runde pletter af nekrotiske celler langs vaskulaturen af blade, der udvider sig og samler sig i store områder af nekrotisk bladvæv50. FoMV-PDS, der indeholder et 313 bp fragment fra sorghumgenet phytoen desaturase (pds, LOC110436156, 96% sekvensidentitet til majs pds, GRMZM2G410515), inducerer dæmpning af pds i majs, hvilket resulterer i små striber af fotoblegede celler langs vaskulaturen af bladene, der forlænges over tid51. Den intakte kodningssekvens for grønt fluorescerende protein (GFP) blev brugt til at demonstrere proteinekspression for både FoMV (FoMV-GFP) og SCMV (SCMV-GFP). GFP-ekspression i bladene er typisk mest påviselig 14 dage efter podning (DPI)6. Selvom der har været tidligere undersøgelser, der anvender agroinjektion af virale vektorer i majs, har disse eksperimenter kun vist, at agroinjektion kan lette virusinfektion fra en infektiøs klon i majsplanter og ikke udvides til rekombinante vira designet til VIGS- eller VOX-applikationer19,20,21,22. Protokollen, der præsenteres her, bygger på tidligere agroinjektionsmetoder, især Grismley et al.19. Samlet set er denne agroinjektionsmetode kompatibel med VIGS- og VOX-vektorer, kræver ikke specialudstyr eller alternative værter som inokulumkilder og reducerer den samlede tid og de omkostninger, der kræves for at oprette og udføre podninger i forhold til andre almindelige metoder, der kræver bioletik eller in vitro-transkription. Denne protokol vil lette funktionelle genomforskninger i majs med applikationer, der involverer VIGS, VOX og VEdGE.
Protocol
1. Plasmid konstruktion
BEMÆRK: Denne protokol kan anvendes på andre virale vektorer eller Agrobacterium-stammer , men dette kan påvirke den samlede succes med podning ved agroinjektion. Udfør altid bakterielle podnings- og pletteringstrin i en laminær strømningshætte.
- FoMV-lyddæmpningskonstruktion
BEMÆRK: Luria-Bertani (LB) medier (Miller) bruges til alle medier, medmindre andet er angivet. Flydende LB fremstilles ved at suspendere 25 g granulat i 1.000 ml destilleret vand og autoklavere i 15 minutter ved 121 °C. Solid LB-medier fremstilles ligeledes med tilsætning af 1,5% agar før autoklavering. Antibiotika tilsættes, efter at LB er afkølet til ~60 °C, og opløsningen hældes i 95 x 15 mm Petri-plader. De antibiotikakoncentrationer, der skal anvendes, er som følger: rifampicin (rif) ved 25 μg/ml, gentamycin (gent) ved 50 μg/ml og kanamycin (kan) ved 50 μg/ml.- PCR forstærker fragmenter fra majsgenet, der skal dæmpes (f.eks. les22 eller pds) ved hjælp af en fremadrettet primer med et PacI-begrænsningssted og en omvendt primer med et XbaI-begrænsningssted. Dette vil muliggøre ligering af genfragmenterne i MCS1* af FoMV-pCAMBIA1380 binær vektor i antisense-orienteringen.
BEMÆRK: Opsæt PCR ved hjælp af en HIGH-fidelity DNA-polymerase, fremadgående og omvendte primere ved 10 μM hver, plasmid-DNA-skabelon og vand efter DNA-polymerasespecifikationerne. Forstærk i 35 cyklusser ved hjælp af en udglødningstemperatur i henhold til DNA-polymerasen og primersmeltetemperaturen (Tm) og en 30 s forlængelse pr. Kilobase, der skal amplificeres. - Udfør PCR-rensning ved hjælp af et PCR-rensningssæt i henhold til kitspecifikationerne.
- Fordøje det rensede PCR-produkt og FoMV-EV med restriktionsenzymerne XbaI og PacI. Brug 1 μg plasmid eller hele det rensede PCR-produkt, 2 μL 10x buffer, 1 μL restriktionsenzym, og tilsæt vand for at lave et 20 μL endeligt reaktionsvolumen. Inkuber i henhold til enzymspecifikation.
- Ligate det fordøjede PCR-produkt og FoMV-EV sammen med T4 DNA-ligase i henhold til producentens protokol.
- Omdan det ligerede plasmid til DH5α kemisk kompetente E. coli-celler ved hjælp af varmechokmetoden.
- Tø celler på is og tilsæt 3 μL plasmid til røret. Inkuber på is i 30 minutter, og opvarm derefter stød i 30 s ved 42 ° C.
- Læg på is i 5 minutter, tilsæt 200 μL super optimal bouillon med katabolisk undertrykkelse (SOC) og lad E. coli-celler komme sig i SOC-medier i 1 time ved 37 ° C med omrystning ved 225 o / min.
- Plade på kanamycin selektive LB-medier og inkuber ved 37 °C natten over.
- Kontroller kolonierne for nøjagtige kloner ved Sanger-sekventering ved hjælp af primerne FM-5840F og FM-6138R (supplerende tabel 1). Indsend 250 ng plasmid-DNA til en facilitet, der udfører Sanger-sekventering. Til dette eksperiment blev prøver sendt til Iowa State University DNA Core Facility.
- Inokuler 2 ml flydende LB med den valgte koloni og inkuber ved 37 °C natten over med rystelser ved 225 o / min. Uddrag plasmid-DNA fra natten over-kulturen gennem et alkalisk lysisplasmid-DNA-præparat52.
- Transformer plasmid-DNA til Agrobacterium-stamme GV3101-celler ved hjælp af fryse-optøningsmetoden. Lad 100 μL kemisk kompetente celler tø op på is, tilsæt 1-5 μL plasmid og inkuber på is i 30 minutter. Anbring i flydende nitrogen i 1 min., og inkuber derefter ved 37 °C i 3 min. Tilsæt 1 ml SOC, lad det komme sig i 2-3 timer ved 28 °C med omrystning, plade på rif, gent og kan selektive LB-medier og inkuber ved 28 °C i 2 dage.
- Skærmkolonier for tilstedeværelsen af indsats med koloni PCR. Vælg en enkelt bakteriekoloni og bland den i 30 μL vand. Der opstilles en PCR-reaktion ved at tilsætte 12,5 μL polymerasemasterblanding, 1,25 μL af hver 10 μM-primer, FM-5840F og FM-6138R, 3 μL af bakteriekolonisuspensionen og vand til et slutvolumen på 25 μL. Cyklus 35 gange med en udglødningstemperatur på 64 °C og en forlængelsestid på 1 min (1 min for hver kb amplificeret).
- Inokuler 2-5 ml flydende LB (rif, gent, kan) med den korrekte Agrobacterium koloni. Lad det vokse natten over ved 28 °C med rystelser ved 225 o/min.
- Bland overnatningskulturen med en 50% glycerolopløsning 1:1. Opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring.
- PCR forstærker fragmenter fra majsgenet, der skal dæmpes (f.eks. les22 eller pds) ved hjælp af en fremadrettet primer med et PacI-begrænsningssted og en omvendt primer med et XbaI-begrænsningssted. Dette vil muliggøre ligering af genfragmenterne i MCS1* af FoMV-pCAMBIA1380 binær vektor i antisense-orienteringen.
- FoMV udtryk konstruktion
- PCR forstærker kodningssekvensen af interesse, herunder start- og stopkodoner (f.eks. GFP) som beskrevet i 1.1.1, og tilføjer et Bsu36I-begrænsningssted på den forreste primer og et PspOMI-begrænsningssted på den omvendte primer for at muliggøre retningsbestemt kloning i forstandsorienteringen til MCS2.
- Udfør PCR-rensning ved hjælp af et PCR-rensningssæt i henhold til kittets specifikationer.
- Sammendrag PCR-produktet og FoMV-EV med restriktionsenzymerne Bsu36I og PspOMI som beskrevet i 1.1.3.
- Ligate det fordøjede PCR-produkt og FoMV-EV sammen med T4 DNA-ligase i henhold til producentens protokol.
- Omdannes til DH5α kemisk kompetente E. coli-celler ved hjælp af varmechokmetoden som beskrevet i 1.1.5. Plade på kanamycin selektive LB-medier og inkuber ved 37 °C natten over.
- Kontroller kolonierne for nøjagtige kloner ved Sanger-sekventering som beskrevet i 1.1.6 ved hjælp af primerne 5AmuS2 og 5AmuA2 (supplerende tabel 1).
- Inokuler 2 ml flydende LB med den valgte koloni og inkuber ved 37 °C natten over med omrystning ved 225 o/min. Uddrag plasmid-DNA fra natten over-kulturen gennem et alkalisk lysisplasmid-DNA-præparat52.
- Plasmid-DNA omdannes til Agrobacterium-stamme GV3101 kemisk kompetente celler ved hjælp af fryse-optøningsmetoden som beskrevet i 1.1.8. Plade på rif, gent og kan selektive LB medier og inkubere ved 28 °C i 2 dage.
- Skærmkolonier for tilstedeværelse af indsats med koloni PCR ved hjælp af primerne 5AmuS2 og 5AmuA2.
- Inokuler 2-5 ml flydende LB (rif, gent, kan) med den korrekte Agrobacterium koloni. Ryst natten over ved 225 o / min ved 28 ° C.
- Bland overnatningskulturen med en 50% glycerolopløsning 1:1. Opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring.
- SCMV udtryk konstruktion
- PCR forstærker genet af interesse (f.eks. GFP) eksklusive stopkodonet som beskrevet i 1.1.1, herunder et PspOMI-fordøjelsessted på den fremadrettede primer og et SbfI-fordøjelsessted på den omvendte primer for at muliggøre retningsbestemt kloning i den binære vektor SCMV-pCAMBIA1380.
BEMÆRK: Insert skal klones i ramme med det virale polyprotein. - Udfør PCR-rensning ved hjælp af et PCR-rensningssæt i henhold til kittets specifikationer.
- Sammendrag PCR-produktet og SCMV-EV med restriktionsenzymerne PspOMI og SbfI som beskrevet i 1.1.3.
- Ligate det fordøjede PCR-produkt og SCMV-EV sammen med T4 DNA-ligase i henhold til producentens protokol.
- Produktet omdannes til DH5α kemisk kompetente E. coli-celler ved hjælp af varmechokmetoden som beskrevet i 1.1.5. Plade på kan selektive LB medier og inkubere ved 37 °C natten over.
- Skærmkolonier for nøjagtige kloner ved Sanger-sekventering som beskrevet i 1.1.6 ved hjælp af primerne SC-745F og HCProR1 (supplerende tabel 1).
- Inokuler 2 ml flydende LB med den valgte koloni og inkuber ved 37 °C natten over med rystelser ved 225 o / min. Uddrag plasmid-DNA'et fra den overnattende kultur gennem et alkalisk lysisplasmid-DNA-præparat52.
- Plasmid-DNA'et omdannes til Agrobacterium-stamme GV3101 kemisk kompetente celler ved hjælp af fryse-optøningsmetoden som beskrevet i 1.1.8. Plade på rif, gent og kan selektive LB medier og inkubere ved 28 °C i 2 dage.
- Screene kolonier for tilstedeværelse af indsats med koloni PCR med primerne SC-745F og HCProR1 som beskrevet i 1.1.9.
- Inokuler 2-5 ml flydende LB (rif, gent, kan) med den korrekte Agrobacterium koloni. Ryst natten over ved 225 o / min ved 28 ° C.
- Bland overnatningskulturen med en 50% glycerolopløsning 1:1. Opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring.
- PCR forstærker genet af interesse (f.eks. GFP) eksklusive stopkodonet som beskrevet i 1.1.1, herunder et PspOMI-fordøjelsessted på den fremadrettede primer og et SbfI-fordøjelsessted på den omvendte primer for at muliggøre retningsbestemt kloning i den binære vektor SCMV-pCAMBIA1380.
2. Forberedelse af frøplanter
- Plant 1-2 majsfrø (»Golden Bantam«-sukkermajs, FR1064, B73 osv.) i tørvebaseret vækstmedium i små skær anbragt i bakker 4-7 dage før injektion. Anbring i et vækstkammer under 16 timer dage ved 25 ° C og 8 timer nætter ved 22 ° C (~ 185 fotosyntetisk aktiv stråling (PAR)) eller i et drivhus under 16 timer dage ved 22-25 ° C og 8 timer nætter ved 22-25 ° C (350-400 PAR).
BEMÆRK: Følsomheden over for Agrobacterium varierer mellem majsgenotyper, hvilket påvirker succesraten. Derudover kan nogle virale vektorer være uforenelige med visse majsgenotyper. - Vand regelmæssigt og gød en gang om ugen med 15-5-15 flydende gødning ved 330 dele pr. Million (PPM).
3. Fremstilling af Agrobacterium
- En dag før injektionen skal du forberede LB flydende medier med det passende antibiotikum (rif, gent, kan) og inokulere med Agrobacterium-stammen , der bærer den ønskede virale konstruktion. Det anbefales at tilsætte 20 μL glycerolbestand i 50 ml LB, hvilket skal give tilstrækkelig bakteriekultur til at inokulere >100 planter og kan skaleres op eller ned efter behov.
BEMÆRK: Forbered nok inokulum til at have en endelig mængde bakteriel suspension på mindst 1 ml ved en optisk densitet på 600 nm (OD600) på 1,0 for hver 4-5 planter. - Ryst ved 225 o / min ved 28 ° C i 24 timer.
- Pelletsbakterier i 10 min ved 4.000 x g ved stuetemperatur. Kassér supernatanten.
- Vask pillen grundigt med 1 ml deioniseret (DI) vand ved pipettering eller blid hvirvel.
- Gentag trin 3.3 for at pille bakterier.
- Resuspend pillen i 1 ml 10 mM MgSO4-opløsning ved pipettering eller skånsom hvirvel.
- Tilsæt eventuelt 200 μM acetosyringon til opløsningen. Selvom det er almindeligt anvendt, forbedrer acetosyringon kun transformationsevnen hos nogle Agrobacterium-stammer . Forfatterne har ikke fundet ud af, at tilsætningen af acetosyringon påvirker effektiviteten i denne protokol (supplerende tabel 2).
BEMÆRK: 10 mM MgSO4-opløsning kan fremstilles af en 1 M stamopløsning med en pH på 6,3 opbevaret ved stuetemperatur. Opløsningen vil sandsynligvis ikke kræve pH-justering.
- Tilsæt eventuelt 200 μM acetosyringon til opløsningen. Selvom det er almindeligt anvendt, forbedrer acetosyringon kun transformationsevnen hos nogle Agrobacterium-stammer . Forfatterne har ikke fundet ud af, at tilsætningen af acetosyringon påvirker effektiviteten i denne protokol (supplerende tabel 2).
- OD600 af prøven måles med et spektrofotometer og fortyndes til 1,0 OD600 med 10 mM MgSO4-opløsning.
BEMÆRK: Dette er et sikkert stoppested. Bakteriel suspension kan opbevares ved stuetemperatur i op til 5 timer før injektion.
4. Injektion
BEMÆRK: Majsplanter fra 4-7 dage gamle kan bruges til injektion. Frøplantevæksten påvirkes i høj grad af vækstbetingelser, mængden af PAR (dvs. højere PAR i drivhuset end i vækstkammeret) og genotype, blandt andet, der kan være vanskelig at kontrollere under drivhusforhold. Planter kan injiceres så unge som 4 dage gamle, når de er 2-3 cm høje uden blade udvidet og så gamle som 7 dage, når det nederste afrundede blad udvides. Succesraten for disse podningsmetoder falder hurtigt, når planterne ældes mere end 7 dage efter såning. Injektionsstedet er det samme, uanset plantens alder.
- Iført sikkerhedsbriller skal du injicere bakteriesuspensionen i kimplanterne 2-3 mm over coleoptilar-knuden ved hjælp af en 25G x 5/8 "nål fastgjort til en 1 ml engangssprøjte.
BEMÆRK: Den coleoptilar knude er, hvor krone rødder til sidst vil danne. Dette er den laveste knude på planten. Typisk vil der ske en farveændring fra grøn til hvid ved og under knuden. Injektionsstedet er lige over meristemet. Dissekering af et par frøplanter på dette stadium kan hjælpe med at visualisere placeringen af meristemet og dermed det rette injektionssted. - Påfør blidt tryk på sprøjten, indtil suspensionen fylder koleoptilen eller er synlig i hvirvlen, afhængigt af plantens vækststadium. Dette er ca. 100-200 μL suspension.
BEMÆRK: Hvis det er svært at injicere suspensionen i frøplanten, kan injektionsstedet være for lavt. Moderat tryk er alt, hvad der skal være nødvendigt for at injicere suspensionen. - Injicer alle frøplanter, skift sprøjter og nåle til hver konstruktion.
5. Fortsat plantepleje
- Transplanter de injicerede frøplanter til 13 x 13 x 15 cm eller større potter, når de er 7-8 dage gamle.
- Oprethold vækstbetingelser (16 timers fotoperiode og befrugtning en gang om ugen).
6. Bekræftelse af infektion (fænotypisk og RT-PCR)
- Fænotypisk score planter mellem 14-21 DPI. Læsioner fra hæmning af kontrolgenernes læsion efterligner 22 eller phytoen desaturase kan let ses på bladene og adskiller sig fra FoMV symptomer. GFP-ekspression kan detekteres via fluorescerende mikroskopbilleddannelse eller anden UV-lysbilleddannelse.
BEMÆRK: Nogle konstruktioner / virale vektorer kan tage længere tid at vise symptomer eller måske slet ikke vise nogen symptomer. Høje lysforhold øger i høj grad fænotyperne forårsaget af hæmning af læsion efterligner 22 og phytoen desaturase. Læsioner kan være mindre synlige eller fraværende, hvis planter opretholdes under lavere lysforhold såsom et vækstkammer, men den faktiske infektionshastighed som bestemt af RT-PCR bør ikke påvirkes (tabel 1). - For at bekræfte infektion molekylært, prøveblad 6 mellem 14-21 DPI og ekstrahere total RNA ved anvendelse af en phenol-chloroformekstraktion i henhold til producentens instruktion.
- Brug af det ekstraherede RNA som en skabelon til at generere førstestrengs cDNA.
- CDNA-reaktionen opstilles med op til 5 μg total RNA, 1 μL tilfældige hexamerprimere, 1 μL oligo (dT)18 primere, 1 μL dNTP'er, 1 μL omvendt transkriptase og vand til et endeligt volumen på 14,5 μL.
- Brug primere designet til den virale konstruktion og cDNA som skabelon til at udføre PCR på hver prøve for at bekræfte virusinfektion og bestemme integriteten af genet eller genfragmentet af interesse som beskrevet i 1.1.1, undtagen reducere cyklusser til 25 for FoMV og 30 for SCMV for at undgå falske positiver.
- Til FoMV-dæmpningskonstruktioner skal du bruge primere FM-5840F og FM-6138R til at forstærke på tværs af MCS1*, som indeholder majsgenfragmentet. Til FoMV-ekspressionskonstruktioner skal du bruge primerne 5AmuS2 og 5AmuA2 til at forstærke på tværs af MCS2, som indeholder det indsatte gen.
- Til SCMV-ekspressionskonstruktioner skal du bruge primere SC745-F og HCProR1 til at forstærke på tværs af MCS, som indeholder det indsatte gen (supplerende figur 3).
- For et endogent kontrolgen skal du bruge primere ZmActS og ZmActA, som forstærker et mRNA-fragment af majsaktin (GRMZM2G126010) eller primere ZmUbiF og ZmUbiR, som forstærker et mRNA-fragment af majspolyubiquitin (GRMZM2G409726_T01).
- Visualiser PCR-produktet på en 1% agarosegel indeholdende en nukleinsyreplet for at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af virus og gen eller genfragment.
Representative Results
Målet med denne undersøgelse var at udvikle en simpel protokol til direkte introduktion af rekombinante vira konstrueret til genhæmning eller genekspression i majsplanter (figur 2). Virusvektorerne, der bærer indsatser, er designet og klonet ved hjælp af standard molekylærbiologiske teknikker. Genfragmenter til dæmpning indsættes i MCS1* i FoMV-EV, og kodningssekvenser til ekspression indsættes i FoMV-EV ved MCS2 eller SCMV-EV ved MCS. De resulterende plasmider overføres til Agrobacterium stamme GV3101. Derefter injiceres majsplanter inden for en uge eller mindre efter plantningen. To uger efter injektion kan planter vurderes både fænotypisk og molekylært for virusinfektion, genhæmning og genekspression.
Majsplanter dyrkes i et tørvbaseret medium i 4-7 dage. På dette stadium er det skud apikale meristem lige over coleoptilar knuden (figur 3A). Efter at coleoptilen har strakt sig 2-3 centimeter eller op til 7 dage efter såning, injiceres planter 2-3 mm over coleoptilar knuden (figur 3B-F). Ca. 12 dage efter injektion vil planter begynde at vise dæmpende fænotyper på deres blade, der almindeligvis observeres nær vaskulært væv, og disse læsioner er visuelt forskellige fra FoMV virale mosaiksymptomer (figur 4). Både tilstedeværelsen af FoMV og hæmningen af målgener kan påvises i injicerede planter (figur 5). GFP-ekspression kan detekteres 2 uger efter injektion under et fluorescerende mikroskop og er stærkest på blade 5-7 (figur 6). Når det observeres under et fluorescensbilleddannelsessystem, kan GFP-ekspression fra FoMV visualiseres som mange små, punkterede områder af fluorescens fordelt på blade nær vaskulært væv, mens GFP-ekspression fra SCMV består af større pletter (figur 6, supplerende figur 1). Selvom virale mosaiksymptomer ofte er synlige på planter, der er inficeret med FoMV-hæmmende konstruktioner, har planter injiceret med GFP-ekspressionskonstruktioner, der med succes udtrykker GFP, ofte ikke disse symptomer. Som følge heraf kan en plante uden synlige symptomer stadig være positiv for virus og GFP-ekspression. Derudover bør punktering af meristemet under agroinjektionsproceduren undgås, da dette kan forårsage morfologiske defekter, men de resulterende planter overlever og er ofte symptomatiske (figur 7).
Selvom denne protokol oprindeligt blev udviklet ved hjælp af sød majs, kan flere majs indavlede linjer med succes podes med FoMV genhæmningskonstruktioner ved hjælp af agroinjektion. For eksempel har FR1064 og B73 typisk høje virusinfektionsrater (tabel 2). Især Mo17, en linje med kendt genetisk resistens over for FoMV, havde en infektionseffektivitet på 0% som forventet36,53. Derudover påvirker den anvendte konstruktion infektionseffektiviteten (tabel 3). For FoMV har FoMV-EV og FoMV-LES22 typisk den højeste infektionseffektivitet på henholdsvis 53 % og 54 %. FoMV-PDS har en lidt lavere effektivitet på 38%, og FoMV-GFP er den laveste på 17%. SCMV-GFP har en infektionseffektivitet på 8%. Disse procentsatser er gennemsnit over flere eksperimenter; individuelle eksperimenter kan have højere eller lavere infektionseffektivitet.
Figur 1: Skematiske gengivelser af FoMV- og SCMV T-DNA-kloner, der anvendes til agroinjektion i majs. FoMV-vektoren indeholder to flere kloningssteder (MCS1* og MCS2). Den tomme vektor, FoMV-EV, er 7.269 bp og indeholder ingen indsatser i nogen af MCS' frekvenser. (A) Genhæmning ved hjælp af FoMV-vektoren kan opnås ved at indsætte genfragmenter i MCS1*, betegnet som sekvens af interesse (SOI), typisk i anti-sense-orienteringen. (B) Genekspression ved hjælp af FoMV-vektoren kan opnås ved at indsætte gen-ORF'er i MCS2 i den betydningsretning, der betegnes som SOI. (C) SCMV-vektoren blev konstrueret til at have en MCS mellem P1 og HCPro. Den tomme vektor, SCMV-EV, er 11.015 bp og indeholder ingen indsatser i MCS. Gen-ORF'er indsat i MCS, der er i ramme med SCMV-polyproteinet, udtrykkes som proteiner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk resumé af agroinjektionsprotokollen. (A) Klon SOI, enten et CDS- eller genfragment, til den virale vektor og omdannes til Agrobacterium-stamme GV3101. B) Plant majs og dyrk i 4-7 dage. (C) GV3101 dyrkes i flydende kultur natten over ved 28 °C. (D) Der forberedes bakteriesuspension til injektion. (E) Injicer kimplanter 2-3 mm over coleoptilar knuden med 100-200 μL suspension. (F) Transplanter kimplanter, når de er 7 dage gamle, til større potter og vokse i 2-3 uger, indtil det 5. blad er synligt. Fænotype, hvis det ønskes. (G) Prøveblad 5 og ekstrakt RNA. (H) Lav cDNA og udfør PCR for at forstærke virus / SOI. (I) Køres på gel til kvalitativ analyse for at bestemme tilstedeværelse/fravær af virus og en afkortet eller intakt SOI. Denne figur blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Agroinjektionsmetode til podning af kimplanter lige over coleoptile knuden. (A) 4-5 dage gamle planter. Coleoptilen er fuldt udvidet, og det første ægte blad kan være delvist synligt, men udfoldes ikke. B) 6-7 dage gamle planter. Det første blad kan udvides, men ingen kraver vil være synlige. Det andet blad vil også være synligt og kan begynde at folde sig ud på dette stadium. (C) Dissektion af 6-7 dage gamle planter, der viser placeringen af det apikale meristem i forhold til den coleoptile knude. (D) Injektion af 4-5 dage gamle planter. (E) Injektion af 6-7 dage gamle planter. (F) Injektion af 6-7 dage gamle planter ved hjælp af en farvestofopløsning, der viser farvet inokulum, der kommer ud af plantens hvirvel. (G) Nærbillede af injektionsstedet for 6-7 dage gamle planter i forhold til den koleoptile knude. (H) Nærbillede af en 6-7 dage gammel plante efter injektion, der viser farvet inokulum i plantens hvirvel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Symptomer på de hæmmende kontrolgener, der anvendes i agroinjektionsforsøgene. (A) Et blad fotograferet ved 17 DPI, efter at planten blev injiceret med FoMV-LES22. FoMV-LES22 bærer en 329 bp indsats af 3' CDS af læsionen efterligner 22 majsgenet i antisense orientering. Dæmpning resulterer i akkumulering af en giftig metabolit, som igen forårsager de nekrotiske læsioner, der først vises som striber langs vaskulaturen og vokser til større pletter som vist her. (B) Et blad fotograferet ved 17 DPI, efter at planten blev injiceret med FoMV-PDS. FoMV-PDS bærer en 313 baseparindsats af 3'CDS af sorghum phytoen-desaturase-genet i antisense-orienteringen. Dæmpning af pds i majs forårsager en systemisk fotoblegningsfænotype, der starter som små, tynde striber langs vaskulaturen, der vokser til længere striber langs bladets længde som vist her. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: qRT-PCR af planter injiceret med FoMV genhæmningskonstruktioner. Bekræftelse af systemisk FoMV-infektion og genhæmning induceret af FoMV-LES22- og FoMV-PDS-konstruktionerne leveret via agroinjektion i sukkermajsplanter (Golden x Bantam). (A) Gelbillederne viser RT-PCR-analyser, der bekræfter tilstedeværelsen af FoMV-MCS1* tom vektor (315 bp amplicon) og FoMV-PDS (625 bp amplicon) i blad 6 af fem individuelle planter. De anvendte PCR-primere producerer en amplicon, der spænder over MCS1*. Majsgenet actin (Zm-Actin) amplicon tjener som referencegen. Søjlediagrammet repræsenterer qRT-PCR relative ekspressionsværdier for pds-ekspression i blad 6 37 dage efter podning (DPI) ved agroinjektion med FoMV-MCS1* eller FoMV-PDS. Undertrykkelse af pds kan påvises i hver af de fem biologiske replikater (p = 0,003; post hoc Dunnetts test; fejlbjælker angiver standardafvigelse (SD) for tre tekniske replikater). (B) Gelbillederne viser RT-PCR-analyser, der bekræfter tilstedeværelsen af FoMV-MCS1* (315 bp amplicon) i blad 6 af fem individuelle planter. FoMV-LES22 (625 bp amplicon) blev påvist i blad 6 væv (prøver FoMV-LES22 1-5, 38 DPI) og blad 4 (prøver FoMV-LES22 6-10, 20 DPI) for ti individuelle planter. Zm-Actin-ampliconen fungerede som referencegenet. Søjlediagrammet repræsenterer qRT-PCR relative ekspressionsværdier for les22-ekspression i majsvæv ved agroinjektion af FoMV-MCS1* eller FoMV-LES22 virale konstruktioner. Les22-undertrykkelse forekommer i 9 af 10 biologiske replikater (p = <0,0001; post hoc Dunnetts test; fejlbjælker angiver SD for tre tekniske replikater). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6. Fænotyper af forskellige konstruktioner, der anvendes i agroinjektionsforsøgene. Alle afbildede planter blev injiceret, da de var 6-7 dage gamle med Agrobacterium stamme GV3101 med de angivne konstruktioner. Billeder blev taget ved 16 DPI. (A) Bladsymptomer på pCAMBIA1380 (tom plasmidrygrad), FoMV-EV, FoMV-GFP og SCMV-GFP i synligt lys, under FluorCam-klorofylfilteret ved 250 μs eksponering og under FluorCam GFP-filteret ved 10 ms eksponering. B) Fluorescerende mikroskopibilleder af bladene af mock-behandlede (kun injiceret med MgSO4-opløsning ), FoMV-EV og FoMV-GFP-injicerede planter. DIC-, DsRed- og EGFP-kanalerne vises og blev hver taget ved 1500 ms eksponering. Skalabjælken er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Morfologiske virkninger af injektion. Et eksempel på de mere alvorlige morfologiske virkninger, der kan opstå ved direkte injektion i meristematisk væv. Denne skade kan resultere i "makulering" af bladene og opdeling af stammen. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Virus | Vækstbetingelser | Genotype | # Inficerede planter | Samlet antal planter | % Infektion | Gns. % af infektion |
| FoMV-EV | Vækstkammeret | Majs | 22 | 23 | 96% | 97% |
| B73 | 18 | 18 | 100% | |||
| B104 | 20 | 21 | 95% | |||
| Drivhus | Majs | 20 | 23 | 87% | 89% | |
| B73 | 17 | 18 | 94% | |||
| B104 | 16 | 19 | 84% | |||
| SCMV-EV | Vækstkammeret | Majs | 14 | 21 | 67% | 47% |
| B73 | 5 | 18 | 28% | |||
| B104 | 10 | 21 | 48% | |||
| Drivhus | Majs | 14 | 23 | 61% | 49% | |
| B73 | 0 | 19 | 0% | |||
| B104 | 19 | 22 | 86% |
Tabel 1: Effekt af drivhus- og vækstkammerforhold på agroinjektionsokulationseffektiviteten. Frøene blev spiret under identiske vækstbetingelser. Germinerede frøplanter blev agroinjected, og halvdelen af dem blev flyttet til et vækstkammer (25 ° C 16 timer dagslys / 22C 8 timer nat; 185 PAR), og den anden halvdel blev flyttet til et drivhus (22-25 ° C 16 timer dagslys / 22-25 ° C 8 timer nat; 350-400 PAR). Denne tabel rapporterer infektionshastigheden i procent beregnet ud fra antallet af planter, der er bekræftet af RT-PCR for at være inficeret med den respektive virus divideret med det samlede antal agroinjekterede planter. Der er ingen statistisk forskel i infektionseffektivitet mellem vækstkammer og drivhusforhold (FoMV to tailed t-test p = 0,08; SCMV tohalet t-test p = 0,96).
| Genotype af majs | FoMV-EV | FoMV-LES22 | Samlet total | ||||
| Inficeret | Total | % Inficeret | Inficeret | Total | % Inficeret | % Inficeret | |
| Majs | 18 | 23 | 78% | 15 | 23 | 65% | 72% |
| MO47 | 7 | 22 | 32% | 1 | 21 | 5% | 19% |
| K55 | 1 | 15 | 7% | 3 | 17 | 18% | 13% |
| W64A | 10 | 22 | 45% | 8 | 20 | 40% | 43% |
| MO17 | 0 | 16 | 0% | 0 | 13 | 0% | 0% |
| B73 | 10 | 18 | 56% | 7 | 17 | 41% | 49% |
| B101 | 12 | 21 | 57% | 8 | 24 | 33% | 44% |
| FR1064 | 4 | 4 | 100% | 4 | 4 | 100% | 100% |
| B104 | 10 | 22 | 45% | 5 | 21 | 24% | 35% |
| WCC22 | 2 | 7 | 29% | 4 | 6 | 67% | 46% |
| A188 | 0 | 3 | 0% | 4 | 6 | 67% | 44% |
Tabel 2: Infektionseffektivitet af FoMV-konstruktioner på tværs af majsgenotyper. FoMV-EV og FoMV-LES22 blev agroinjiceret i 11 genotyper majs. Efter injektion blev frøplanterne flyttet til drivhuset. Denne tabel beskriver infektionshastigheden som en procent, beregnet ud fra antallet af planter inficeret med FoMV som bekræftet af RT-PCR divideret med det samlede antal agroinjekerede planter. Den samlede samlede infektionshastighed viser de gennemsnitlige infektionsrater for hver genotype for begge testede FoMV-konstruktioner.
| Plante fase | 4-5 dage gamle planter | 6-7 dage gamle planter | Samlet total | ||||
| Symptomatisk | Planter i alt | % Inficeret | Symptomatisk | Planter i alt | % Inficeret | % Inficeret | |
| FoMV-EV | 42 | 72 | 58% | 80 | 170 | 47% | 53% (A) |
| FoMV-PDS | 65 | 157 | 41% | 66 | 184 | 36% | 39% (B C) |
| FoMV-LES22 | 115 | 195 | 59% | 144 | 292 | 49% | 54% (A B) |
| FoMV-GFP | 16 | 103 | 16% | 37 | 217 | 17% | 16% (C) |
| SCMV-GFP | 10 | 95 | 11% | 5 | 82 | 6% | 8% (C) |
Tabel 3: Resumé af injektionsforsøg. Denne tabel repræsenterer et resumé af injektionsforsøgene udført fra august 2017 til august 2018 på Golden Bantam søde majsplanter. Planter blev vurderet for virale symptomer (FoMV-EV), dæmpningssymptomer (pds og les22) eller GFP fluorescens (GFP) gennem visuel (FoMV-EV, FoMV-PDS og FoMV-LES22) eller FluorCam (FoMV-GFP og SCMV-GFP) screening. Resultaterne vises individuelt for 4-5 dage gamle planter og 6-7 dage gamle planter samt et resumé på tværs af alle plantealdre. Der findes ingen signifikant forskel mellem 4-5 dage gamle planter og 6-7 dage gamle planter (Envejs ANOVA, F = 0,6513). Der findes en forskel mellem viral konstruktion (Onaway ANOVA, F = <0.0001), hvor bogstaverne repræsenterer Tukey-Kramer HSD-forbindelsesbrevrapporten.
Supplerende tabel 1: Tabel med alle primernavne og sekvenser, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: Acetosyringon test. (A) Indledende acetosyringontest, der sammenligner antallet af symptomer på mock, FoMV-EV og FoMV-LES22 injicerede planter mellem podningssuspensioner med 200 μM acetosyringon (+) eller uden acetosyringron (-). (B) Sammenligning af infektionsraterne for FoMV-LES22 som bestemt ved RT-PCR mellem podningssuspensioner uden acetosyringon (-), med 200 μM acetosyringon (+) og tilsætning af 20 μM acetosyringon til bakteriekulturen 4 timer før resuspension i buffer sammen med tilsætning af 200 uM acetosyringon til den endelige suspension (++). Samlet set var der ingen signifikant forskel fundet mellem aceotysyringonbehandlinger (Oneway ANOVA, f = 0,5452). Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende figur 1: Fluorescensbilleddannelse og molekylær validering af agroinjiceret SCMV og ekspression af heterologe proteiner i majs. Majs blev agroinjiceret med en modificeret SCMV-konstruktion, der indeholdt både CDS'er af GFP og nano luciferase (NLuc). (A) Fluorcam-billeddannelse blev anvendt til screening og påvisning af GFP. Den venstre er en mock injiceret plante og den højre er SCMV-NLucGFP injiceret plante. (B) Bladproteinekstrakter blev adskilt af SDS-PAGE og evalueret for tilstedeværelsen af NLuc-, GFP- og SCMV-pelsprotein (CP) ved in-gel luciferase-assay eller immunoblot som angivet. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Agrobacterium er et vigtigt værktøj, der letter adskillige molekylærbiologiske teknikker i planterelateret forskning. Denne undersøgelse giver en agroinjektionsprotokol til inokulering af FoMV- og SCMV-virale vektorer direkte i majsvæv til VIGS- og VOX-applikationer. Hovedmålet er at øge letheden og nytten af virusbaserede teknologier til forskning i monocot afgrødeplanter. Selv om der er rapporteret om direkte agroinokulering af majs for nogle få vira, er forfatterne ikke bekendt med en detaljeret protokol, og der er ingen eksempler på VIGS- og VOX-applikationer i disse undersøgelser19,22.
Det er blevet rapporteret og blev bekræftet under udviklingen af denne protokol, at injektionsstedet er en nøglefaktor for en vellykket lancering af en systemisk virusinfektion via agroinjektion19. Konsekvent injektion af den anbefalede placering på planten antages at være den største variabel, fordi meristemets nøjagtige position i majsplanter næsten ikke kan detekteres af øjet. For at minimere interpersonel variation anbefales det at dissekere et par majsplanter ned til meristemet for bedre at visualisere dets placering (figur 3C). Meristemets position i forhold til coleoptilar knuden skal være nogenlunde den samme for planter i alderen 4-7 dage gamle. Derudover giver praktisering af injektion med en farvet væske en let synlig demonstration af, hvordan "inokulumet" fylder bladhvirvelen, og fordi injektionsstedet er markeret med farvestof, kan nøjagtigheden af injektionsstedet bekræftes (figur 3G,H). Meristematisk væv er de mest modtagelige for agroinjektion, men injektion af Agrobacterium-suspensioner direkte i dette væv resulterer i uønskede morfologiske virkninger (figur 6)19. Planter med beskadigede meristemer overlever, men de resulterende defekter er uønskede, og derfor bør direkte injektion af dette væv undgås.
Der er flere variabler, der kan påvirke den vellykkede lancering af en systemisk virusinfektion via agroinjektion, fordi tre komplekse biologiske systemer (plante-, virus- og Agrobacterium-stamme) skal interagere i koordination. Dette komplekse samspil kan hjælpes på hjælp af de hurtigt delende celler i det meristematiske område, hvilket gør det til et ideelt sted for agroinokulering19. Agrobacterium-stammen skal kunne inficere celler i plantevævet for at levere det T-DNA, der bærer det virale genom, og planten skal være modtagelig for virussen for at kunne igangsætte viral replikation og systemisk infektion. Majsgenotyper adskiller sig i deres modtagelighed for vira (f.eks. Mo17 er resistent over for FoMV) eller Agrobacterium-stammer, men de fleste, der blev testet, synes at være modtagelige for både FoMV og SCMV (tabel 1 og tabel 2)53. For eksempel kan den indavlede linje FR1064 og sødmajssorten Golden Bantam være særligt modtagelige for både GV3101 Agrobacterium og FoMV-baserede vektorer.
Bladnummeret og tidspunktet for prøveudtagning for RT-PCR er afgørende for nøjagtig vurdering af virusinfektion. I de eksempler, der er vist her, blev bladtallet bestemt ved at starte ved det første afrundede blad (almindeligvis kendt som "tommelfingerbladet") og tælle opad. Bladene blev samplet, når de var udvidet, og det næste blad var begyndt at dukke op. Hvilke blade der er optimale til prøveudtagning, kan dog variere afhængigt af de anvendte virusarter, vækstbetingelser og majsgenotype. Derfor anbefales et indledende tidskursuseksperiment, når denne protokol anvendes på et nyt virussystem for at optimere prøveudtagningsstrategien med hensyn til blade og timing.
Den specifikke konstruktion, der anvendes, påvirker effektiviteten af denne protokol betydeligt. For eksempel producerer de tomme vektorer, FoMV-EV og SCMV-EV og FoMV-PDS og FoMV-LES22, som begge indeholder små skær (henholdsvis 313 bp og 329 bp), typisk de højeste procentdele af planter med virale symptomer i disse forsøg (tabel 1 og tabel 2). Rekombinante vira, der bærer større skær af GFP ORF (720 bp) i FoMV-GFP og SCMV-GFP, havde imidlertid meget lavere infektionshastigheder sammenlignet med planter injiceret med de tomme vektor- eller genhæmningskonstruktioner. Denne tendens kan skyldes de negative virkninger på viral fitness forårsaget af stigende mængder eksogent genetisk materiale i det virale genom. Flere undersøgelser har vist, at insertstabiliteten af plantevirale vektorer i høj grad afhænger af insertstørrelse og sekvens36,54,55,56,57. Derudover var der en bemærkelsesværdig forskel i procentdelen af planter, der bliver inficeret efter podning med enten FoMV eller SCMV tom vektor, hvilket tyder på, at der er behov for yderligere arbejde for at optimere denne protokol til SCMV (tabel 1). Disse resultater indikerer, at der kan være behov for en vis fejlfinding, når man udvikler en konstruktion, fordi fragmentets sekvens og længde begge kan påvirke effektiviteten.
Samlet set har denne undersøgelse vist, at agroinjektion af majsplanter er en effektiv podningsmetode til to forskellige RNA-plantevira, flere vektorkonfigurationer og 11 genotyper af majs. Dette arbejde med FoMV og SCMV, parret med tidligere værker, der anvender injektion med majs chlorotic mottle virus (MCMV) eller MSV, indikerer, at agroinjektion er egnet til podning af majsplanter med infektiøse kloner af både RNA- og DNA-vira19,20,21,22. Derudover viser dette arbejde yderligere, at agroinjektion er en levedygtig metode til VIGS- og VOX-vektorer og kan anvendes på planter så unge som fire dage gamle (tabel 3). Den protokol, der præsenteres her, forventes let at blive tilpasset af majsbiologer for at lette forskning i funktionelle genomiske undersøgelser, der involverer forbigående genhæmning (VIGS) og overekspression (VOX). Agroinjektion har også kapacitet til at lette virusbaserede genredigeringsmetoder (VEdGE), der ellers ville være begrænset af afhængighed af plantetransformation, hvilket potentielt forbedrer redigeringseffektiviteten samt tilgængeligheden58,59,60. I betragtning af at den relevante Agrobacterium-stamme, majsgenotyper og virale vektorer er omhyggeligt kombineret, forventes podning ved agroinjektion at blive et værdifuldt redskab til forbigående genfunktionsanalyser i majs.
Disclosures
Forskerne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Iowa State University er en del af et team, der støtter DARPAs Insect Allies-program HR0011-17-2-0053. Dette arbejde blev også støttet af Iowa State University Plant Sciences Institute, Iowa State University Crop Bioengineering Center, USDA NIFA Hatch projektnummer 3808 og State of Iowa Funds. KLH blev også delvist støttet af Iowa State University Predictive Plant Phenomics kandidatuddannelsesprogram finansieret af National Science Foundation (DGE #1545453) og af Agricultural and Food Research Initiative tilskud nr. 2019-07318 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Finansiererne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelsen og indsamlingen, analysen og fortolkningen af data og i at skrive manuskriptet. Eventuelle meninger, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis finansieringskildernes synspunkter.
Vi takker Nick Lauter (USDA-ARS, Ames, IA) for frø af majs indavlede linjer, Christian F. Montes-Serey (Iowa State University) for at gøre FoMV-GFP klonen og Tyler Austin (Iowa State University) for teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
| 15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
| 1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
| 25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
| 28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
| 37°C Incubator | For E. coli | ||
| Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
| Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
| Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
| cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
| DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
| DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
| EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
| Ethanol | For RNA extraction | ||
| Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
| Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
| Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
| FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
| Fluorescence Microscope | |||
| Gel Electrophoresis Box | |||
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
| Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
| Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
| Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
| Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
| Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
| Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
| Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
| MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
| PacI | New England Biolabs | R0547 | |
| Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
| Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
| pH Meter | |||
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
| Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
| PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
| Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
| Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
| SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
| Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
| Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
| Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
| Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Thermocycler | For PCR | ||
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
| Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
| Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| XbaI | New England Biolabs | R0145 |
References
- Zaidi, S. E. A., Mansoor, S. Viral vectors for plant genome engineering. Frontiers in Plant Science. 8, 539 (2017).
- Kant, R., Dasgupta, I. Gene silencing approaches through virus-based vectors: speeding up functional genomics in monocots. Plant Molecular Biology. 100, 3-18 (2019).
- Hu, J., et al. A barley stripe mosaic virus-based guide RNA delivery system for targeted mutagenesis in wheat and maize. Molecular Plant Pathology. 20 (10), 1463-1474 (2019).
- Pasin, F., Menzel, W., Daròs, J. A. Harnessed viruses in the age of metagenomics and synthetic biology: an update on infectious clone assembly and biotechnologies of plant viruses. Plant Biotechnology Journal. 17 (6), 1010-1026 (2019).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B. Plant virus vectors 3.0: Transitioning into synthetic genomics. Annual Review of Phytopathology. 57 (1), 211-230 (2019).
- Mei, Y., et al. Protein expression and gene editing in monocots using foxtail mosaic virus vectors. Plant Direct. 3 (11), 00181 (2019).
- Ruiz, M. T., Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell. 10 (6), 937-946 (1998).
- Bekele, D., Tesfaye, K., Fikre, A. Applications of virus induced gene silencing (VIGS) in plant functional genomics studies. Journal of Plant Biochemistry & Physiology. 07 (01), 1000229 (2019).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Jackson, A. O. Plant virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annual Review of Phytopathology. 34 (1), 299-323 (1996).
- Holzberg, S., Brosio, P., Gross, C., Pogue, G. P. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. Plant Journal. 30 (3), 315-327 (2002).
- Wang, R., et al. An efficient virus-induced gene silencing vector for maize functional genomics research. Plant Journal. 86 (1), 102-115 (2016).
- Redinbaugh, M. G., et al. Transmission of viral RNA and DNA to maize kernels by vascular puncture inoculation. Journal of Virological Methods. 98 (2), 135-143 (2001).
- Scholthof, H. B. The capsid protein gene of tomato bushy stunt virus is dispensable for systemic movement and can be replaced for localized expression of foreign genes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6 (3), 309 (1993).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Kikkert, M., Jackson, A. O. Tomato bushy stunt virus spread is regulated by two nested genes that function in cell-to-cell movement and host-dependent systemic invasion. Virology. 213 (2), 425-438 (1995).
- Scholthof, H. B. Rapid delivery of foreign genes into plants by direct rub-inoculation with intact plasmid dna of a tomato bushy stunt virus gene vector. Journal of Virology. 73 (9), 7823-7829 (1999).
- Zhang, J., et al. Vacuum and co-cultivation agroinfiltration of (germinated) seeds results in tobacco rattle virus (TRV) mediated whole-plant virus-induced gene silencing (VIGS) in wheat and maize. Frontiers in Plant Science. 8, 393 (2017).
- Vaghchhipawala, Z., Rojas, C. M., Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Agroinoculation and agroinfiltration: simple tools for complex gene function analyses. Methods in Molecular Biology. 678, Clifton, N.J. 65-76 (2011).
- Grimsley, N., Hohn, B., Hohn, T., Walden, R. "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83 (10), 3282-3286 (1986).
- Grimsley, N. H., Ramos, C., Hein, T., Hohn, B. Merisfematic tissues of maize plants are most suscepnsle to agroinfection with maize streak virus. Bio/Technology. 6 (2), 185-189 (1988).
- Martin, D. P., Rybicki, E. P. Improved efficiency of Zea mays agroinoculation with Maize streak virus. Plant Disease. 84 (10), 1096 (2000).
- Martin, D. P., Willment, J. A., Rybicki, E. P. Evaluation of maize streak virus pathogenicity in differentially resistant Zea mays genotypes. Phytopathology. 89 (8), 695-700 (1999).
- Wang, Q., et al. Further characterization of Maize chlorotic mottle virus and its synergistic interaction with Sugarcane mosaic virus in maize. Scientific Reports. 7, 39960 (2017).
- Hsieh, M. H., et al. Optimizing virus-induced gene silencing efficiency with Cymbidium mosaic virus in Phalaenopsis flower. Plant Science. 201-202 (1), 25-41 (2013).
- Hsieh, M. H., et al. Virus-induced gene silencing unravels multiple transcription factors involved in floral growth and development in Phalaenopsis orchids. Journal of Experimental Botany. 64 (12), 3869-3884 (2013).
- Zenna, N. S., et al. Genetic analysis of tolerance to rice tungro bacilliform virus in rice (Oryza sativa L.) through agroinoculation. Journal of Phytopathology. 154 (4), 197-203 (2006).
- Marks, M. S., Kemp, J. M., Woolston, C. J., Dale, P. J. Agroinfection of wheat: A comparison of Agrobacterium strains. Plant Science. 63 (2), 247-256 (1989).
- Dasgupta, I., et al. Rice tungro bacilliform virus DNA independently infects rice after Agrobacterium-mediated transfer. Journal of General Virology. 72 (6), 1215-1221 (1991).
- Boulton, M. I., Buchholz, W. G., Marks, M. S., Markham, P. G., Davies, J. W. Specificity of Agrobacterium-mediated delivery of maize streak virus DNA to members of the Gramineae. Plant Molecular Biology. 12 (1), 31-40 (1989).
- Paulsen, A. Q. Purification and properties of foxtail mosaic virus. Phytopathology. 77 (11), 1346 (1977).
- Bancroft, J. B., Rouleau, M., Johnston, R., Prins, L., Mackie, G. A. The entire nucleotide sequence of foxtail mosaic virus RNA. Journal of General Virology. 72 (9), 2173-2181 (1991).
- Bruun-Rasmussen, M., Madsen, C. T., Johansen, E., Albrechtsen, M. Revised sequence of foxtail mosaic virus reveals a triple gene block structure similar to potato virus X. Archives of Virology. 153 (1), 223-226 (2008).
- Rouleau, M., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Partial purification and characterization of foxtail mosaic potexvirus RNA-dependent RNA polymerase. Virology. 197 (2), 695-703 (1993).
- Rouleau, M., Smith, R. J., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein. Virology. 204 (1), 254-265 (1994).
- Samuels, T. D., et al. Subcellular targeting and interactions among the potato virus X TGB proteins. Virology. 367 (2), 375-389 (2007).
- Cho, S. Y., Kim, K. H. Identification of the capsid protein-binding region of the SL1(+) RNA located at the 5' region of the potato virus X genome. Plant Pathology Journal. 28 (1), 75-80 (2012).
- Mei, Y., Zhang, C., Kernodle, B. M., Hill, J. H., Whitham, S. A. A foxtail mosaic virus vector for virus-induced gene silencing in maize. Plant Physiology. 171 (2), 760-772 (2016).
- Bouton, C., et al. Foxtail mosaic virus: A viral vector for protein expression in cereals. Plant Physiology. 177 (4), 1352-1367 (2018).
- Mei, Y., Liu, G., Zhang, C., Hill, J. H., Whitham, S. A. A sugarcane mosaic virus vector for gene expression in maize. Plant Direct. 3 (8), 00158 (2019).
- Gal-On, A., Meiri, E., Huet, H., Hua, W. J., Raccah, B., Gaba, V. Particle bombardment drastically increases the infectivity of cloned DNA of zucchini yellow mosaic potyvirus. Journal of General Virology. 76 (12), (1995).
- Gao, R., et al. Construction of an infectious cDNA clone and gene expression vector of Tobacco vein banding mosaic virus (genus Potyvirus). Virus Research. 169 (1), 276-281 (2012).
- López-Moya, J. J., García, J. A. Construction of a stable and highly infectious intron-containing cDNA clone of plum pox potyvirus and its use to infect plants by particle bombardment. Virus Research. 68 (2), (2000).
- Choi, I. R., French, R., Hein, G. L., Stenger, D. C. Fully biologically active in vitro transcripts of the eriophyid mite-transmitted wheat streak mosaic tritimovirus. Phytopathology. 89 (12), (1999).
- Kim, K. S., et al. Infectivity of in vitro transcripts of Johnsongrass mosaic potyvirus full-length cDNA clones in maize and sorghum. Archives of Virology. 148 (3), 563-574 (2003).
- Stewart, L. R., Bouchard, R., Redinbaugh, M. G., Meulia, T. Complete sequence and development of a full-length infectious clone of an Ohio isolate of Maize dwarf mosaic virus (MDMV). Virus Research. 165 (2), 219-224 (2012).
- Wylie, S. J., et al. ICTV virus taxonomy profile: Potyviridae. Journal of General Virology. 98 (3), 352-354 (2017).
- Shukla, D. D. taxonomy of potyviruses infecting maize, sorghum, and sugarcane in Australia and the United States as determined by reactivities of polyclonal antibodies directed towards virus-specific N-termini of coat proteins. Phytopathology. 79 (2), 223 (1989).
- Shukla, D. D., Ward, C. W. Amino Acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group. Journal of General Virology. 69 (11), 2703-2710 (1988).
- Chung, B. Y. W., Miller, W. A., Atkins, J. F., Firth, A. E. An overlapping essential gene in the Potyviridae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (15), 5897-5902 (2008).
- Jarchow, E., Grimsley, N. H., Hohn, B. virF, the host-range-determining virulence gene of Agrobacterium tumefaciens, affects T-DNA transfer to Zea mays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (23), 10426-10430 (1991).
- Hu, G., Yalpani, N., Briggs, S. P., Johal, G. S. A porphyrin pathway impairment is responsible for the phenotype of a dominant disease lesion mimic mutant of maize. The Plant Cell. 10 (7), 1095 (2007).
- Qin, G., et al. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis. Cell Research. 17 (5), 471-482 (2007).
- Jones, P. Isolation of plasmid DNA from E. coli. Encyclopedia of Life Sciences. , (2003).
- Ji, Q., Yang, B., Lee, M., Chen, Y., Lübberstedt, T. Mapping of quantitative trait loci/locus conferring resistance to foxtail mosaic virus in maize using the intermated B73-×-Mo17 population. Plant Breeding. 129 (6), 721-723 (2010).
- Pacak, A., et al. The brome mosaic virus-based recombination vector triggers a limited gene silencing response depending on the orientation of the inserted sequence. Archives of Virology. 155 (2), 169-179 (2010).
- Miché, L., Battistoni, F., Gemmer, S., Belghazi, M., Reinhold-Hurek, B. Host-dependent expression of Rhizobium leguminosarum bv. viciae hydrogenase is controlled at transcriptional and post-transcriptional levels in legume nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (5), 1323-1331 (2018).
- Yamagishi, M., Masuta, C., Suzuki, M., Netsu, O. Peanut stunt virus-induced gene silencing in white lupin (lupinus albus). Plant Biotechnology. 32 (3), 181-191 (2015).
- Avesani, L., et al. Stability of Potato virus X expression vectors is related to insert size: Implications for replication models and risk assessment. Transgenic Research. 16 (5), 587-597 (2007).
- Ali, Z., et al. Efficient virus-mediated genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (8), 1288-1291 (2015).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B., Mirkov, T. E. Multiplexed gene editing and protein overexpression using a tobacco mosaic virus viral vector. Plant Physiology. 175 (1), 23-35 (2017).
- Ali, Z., Eid, A., Ali, S., Mahfouz, M. M. Pea early-browning virus-mediated genome editing via the CRISPR/Cas9 system in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis. Virus Research. 244, 333-337 (2018).
