Summary
En Agrobacterium-baserad injektion (agroinjection) protokoll presenteras för inokulering av foxtail mosaikvirus och sockerrör mosaik viruskloner i majs plantor. Inokulering på detta sätt leder till virusinfektion, virusinducerad gendämpning av markörgener och viral överuttryck av GFP.
Abstract
Agrobacterium-baserade inokuleringsmetoder används ofta för att införa virusvektorer i växtvävnader. Denna studie beskriver ett protokoll för injektion av majsplantor nära meristematisk vävnad med Agrobacterium som bär en virusvektor. Rekombinanta foxtail mosaikvirus (FoMV) kloner konstruerade för gen ljuddämpning och genuttryck användes för att optimera denna metod, och dess användning utvidgades till att omfatta en rekombinant sockerrör mosaik virus (SCMV) konstruerad för genuttryck. Genfragment eller kodningssekvenser av intresse sätts in i ett modifierat, infektiöst virusgenom som har klonats i den binära T-DNA-plasmidvektorn pCAMBIA1380. De resulterande plasmidkonstruktionerna omvandlas till Agrobacterium tumefaciens stam GV3101. Majsplantor så unga som 4 dagar gamla kan injiceras nära coleoptilar noden med bakterier resuspended i MgSO4 lösning. Under infektion med Agrobacterium överförs T-DNA som bär virusgenomet till majsceller, vilket möjliggör transkription av det virala RNA-genomet. Eftersom det rekombinanta viruset replikerar och systemiskt sprider sig över hela växten kan virussymtom och fenotypiska förändringar till följd av ljuddämpning av målgenernas lesion efterlikna 22 (les22) eller fytoendesavantidas (pds) observeras på bladen, eller uttryck av grönt fluorescerande protein (GFP) kan detekteras vid belysning med UV-ljus eller fluorescensmikroskopi. För att upptäcka viruset och bedöma skärets integritet samtidigt extraheras RNA från bladen på den injicerade växten och RT-PCR utförs med hjälp av primers som flankerar den flera kloningsplatsen (MCS) som bär den infogade sekvensen. Detta protokoll har använts effektivt i flera majsgenotyper och kan lätt utökas till andra virusvektorer, vilket erbjuder ett tillgängligt verktyg för virusvektorintroduktion i majs.
Introduction
Infektiösa kloner av många växtvirus har konstruerats för virusinducerad gendämpning (VIGS), genöveruttryck (VOX) och senast virusaktiverad genredigering (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . När nya viruskonstruktioner utvecklas måste metoder för att framgångsrikt infektera växtvävnader med dessa modifierade virus också övervägas. Nuvarande metoder för att starta virusinfektioner i växter inkluderar partikelbeskjutning, gnidning-inokulering av in vitro-RNA-transkript eller DNA-kloner, kärlpunktionsinymulering eller Agrobacterium tumefaciens inokulering (agroinokulation)5,12,13,14,15,16,17 . Var och en av dessa inokuleringsmetoder har inneboende fördelar och nackdelar, som inkluderar kostnad, behov av specialiserad utrustning och genomförbarhet inom ett visst växtvirussystem. Metoder som använder infiltration eller injektion av Agrobacterium stammar som innehåller binära T-DNA konstruktioner utformade för att leverera rekombinanta virus är att föredra, eftersom de är enkla och billiga. Detaljerade agroinokuleringsmetoder för monocotyledonösa arter som Zea mays (majs) saknas dock.
En av de första rapporterna om agroinoculation för virus leverans publicerades 1986, när genomet av blomkål mosaikvirus (CaMV) sattes in i en T-DNA konstruktion, och den resulterande Agrobacterium som bär denna konstruktion var gnid-inokuleras på rova växter18. Ytterligare metoder för agroinopulering har sedan dess utvecklats. Till exempel, när det gäller foxtailmosaikvirus (FoMV), kan Nicotiana benthamiana användas som en mellanliggande värd för att generera viruspartiklar i löv som ger en inokulatkälla6. Gnugga inokulering av majs med infekterade N. benthamianablad är effektiv, snabb och enkel, men användningen av en mellanliggande värd fungerar inte för alla majsinfekterande virus. Sockerrör mosaikvirus (SCMV), till exempel, kan inte infektera N. benthamiana, vilket kräver användning av alternativa inokulatkällor för vektorer som härrör från detta virus. År 1988 introducerades Agrobacterium som innehåller majsstreckvirus (MSV), ett DNA-virus, i majsplantor genom injektion (agroinjection), vilket visar att Agrobacterium-baserade inokuleringsmetoder också är användbara för monokots19. Trots denna tidiga framgång med agroinjection har få studier som använder denna teknik i majs publicerats, vilket lämnar öppna frågor om tillämpligheten av denna metod för RNA-virus och VIGS, VOX och VEdGE vektorer20,21,22. Bred användning av agroinjection i monokot arter är dock lovande, eftersom denna allmänna metod har använts i orkidé, ris och vete23,24,25,26,27,28.
Detta protokoll optimerades för FoMV och Agrobacterium stam GV3101 och har också tillämpats på en SCMV vektor. FoMV är ett potexvirus med ett brett värdområde som inkluderar 56 monocot- och dicotarter29. FoMV har en 6,2 kilobase (kb) positiv känsla, enkelsträngad RNA-genom som kodar fem olika proteiner från fem öppna läsramar (ORFs)30,31,32,33,34,35. FoMV utvecklades tidigare till både en VIGS och VOX vektor för majs genom att införliva en infektiös klon på en T-DNA plasmid ryggrad6,36,37. Virusgenomet modifierades för VIGS-tillämpningar genom att man omedelbart lade till ett kloningsställe (MCS1*) nedströms pälsproteinet (CP) (figur 1A)36. För VOX- och VEdGE-applikationer duplicerades CP-promotorn och en andra kloningsplats (MCS2) lades till för att möjliggöra införande av sekvenser av intresse mellan ORF 4 och CP (figur 1B)6. FoMV-vektorn som innehåller både MCS1 och MCS2 utan skär är FoMV tom vektor (FoMV-EV) (bild 1).
SCMV är ett icke-relaterat virus som har utvecklats för VOX i majs38. Det är en medlem av Potyviridae-familjen, av vilken flera medlemmar har konstruerats för att uttrycka främmande proteiner i planta39,40,41,42,43,44. Värdsortimentet av SCMV inkluderar majs, sorghum och sockerrör45,46, vilket gör det värdefullt för genfunktionella studier i dessa stora grödor36,38. SCMV har en positiv känsla, enkelsträngat RNA-genom på cirka 10 kb i längd47,48. För att skapa SCMV VOX vektorn, den väletablerade P1/HCPro korsningen användes som en insättning plats för heterologa sekvenser38. Denna kloningsplats följs av sekvenskodning av en NIa-Pro proteas klyvning plats, vilket leder till produktion av proteiner oberoende av SCMV polyprotein (figur 1C).
T-DNA-plasmider som transporterar infektiöst cDNA av dessa rekombinanta virus har omvandlats till Agrobacterium stam GV3101. GV3101 är en nopaline typ stam, som är välkända för att kunna överföra T-DNA till monocotyledonous arter, inklusive majs26,28,49. Dessutom har tidigare agroinjection studier använt stammarna C58 eller dess derivat GV3101, samt19,20,22,27.
Tre markör gener användes i utvecklingen av detta protokoll: två för gen ljuddämpning och en för gen uttryck. Ett 329 bas-par (bp) fragment från majs gen lesion efterlikna 22 (les22, GRMZM2G044074) användes för att konstruera ljuddämma vektor FoMV-LES22. När les22 tystas i majs uppträder små, runda fläckar av nekrotiska celler längs kärlet av löv som expanderar och sammanförs till stora områden av nekrotisk bladvävnad50. FoMV-PDS, som innehåller ett 313 bp fragment från sorghum genen phytoene desaturase (pds, LOC110436156, 96% sekvens identitet till majs pds, GRMZM2G410515), inducerar tystande av pds i majs, vilket resulterar i små strimmor av fotobleached celler längs vasculature av bladen som förlängs över tiden51. Den intakta kodningssekvensen för grönt fluorescerande protein (GFP) användes för att påvisa proteinuttryck för både FoMV (FoMV-GFP) och SCMV (SCMV-GFP). GFP-uttryck i bladen är vanligtvis mest detekterbart vid 14 dagar efter inokulering (DPI)6. Även om det har gjorts tidigare studier med hjälp av agroinjection av virusvektorer i majs, har dessa experiment bara visat att agroinutjektion kan underlätta virusinfektion från en infektiös klon i majsplantor och expanderar inte till rekombinanta virus avsedda för VIGS- eller VOX-applikationer19,20,21,22. Protokollet som presenteras här bygger på tidigare agroinjection metoder, särskilt Grismley et al.19. Sammantaget är denna agroinjection-metod kompatibel med VIGS- och VOX-vektorer, kräver inte specialiserad utrustning eller alternativa värdar som inokulatkällor och minskar den totala tid och kostnad som krävs för att ställa in och utföra inokulering i förhållande till andra vanliga metoder som kräver biolistik eller in vitro-transkription. Detta protokoll kommer att underlätta funktionella genomikstudier i majs med tillämpningar som involverar VIGS, VOX och VEdGE.
Protocol
1. Plasmid konstruktion
OBS: Detta protokoll kan tillämpas på andra virusvektorer eller Agrobacterium stammar, men detta kan påverka den övergripande framgången för inokulering genom agroinjektion. Utför alltid bakteriell inokulering och pläteringssteg i en laminär flödeshuv.
- FoMV ljuddämpning konstruktion
OBS: Luria-Bertani (LB) media (Miller) används för alla medier om inget annat anges. Flytande LB tillverkas genom att 25 g granulat suspenderas till 1 000 ml destillerat vatten och autoklavering i 15 minuter vid 121 °C. Solid LB-media tillverkas på samma sätt med tillsats av 1,5% agar före autoklavering. Antibiotika tillsätts efter att LB kylts till ~60 °C, och lösningen hälls i 95 x 15 mm Petriplattor. De antibiotikakoncentrationer som ska användas är följande: rifampicin (rif) vid 25 μg/mL, gentamycin (gent) vid 50 μg/mL och kanamycin (kan) vid 50 μg/mL.- PCR förstärker fragment från majsgenen som ska tystas (t.ex. les22 eller pds) med hjälp av en främre primer med en PacI-begränsningsplats och en omvänd primer med en XbaI-begränsningsplats. Detta kommer att möjliggöra ligatur av genfragmenten i MCS1 * av FoMV-pCAMBIA1380 binära vektorn i antisense orienteringen.
OBS: Ställ in PCR med hjälp av ett DNA-polymeras med hög återgivning, framåt- och bakåtprimrar vid 10 μM vardera, plasmid-DNA-mall och vatten, enligt DNA-polymerasspecifikationerna. Förstärk i 35 cykler, med hjälp av en glödgningstemperatur enligt DNA-polymeras- och primersmältningstemperaturen (Tm), och en 30 s förlängning per kilobas som ska förstärkas. - Utför PCR-rening med ett PCR-reningskit enligt satsens specifikationer.
- Smält den renade PCR-produkten och FoMV-EV med restriktionsenzymerna XbaI och PacI. Använd 1 μg plasmid eller hela den renade PCR-produkten, 2 μL 10x buffert, 1 μL restriktionsenzym och tillsätt vatten för att göra en slutlig reaktionsvolym på 20 μL. Inkubera enligt enzymspecifikationen.
- Liga den smälta PCR-produkten och FoMV-EV tillsammans med T4 DNA-ligase enligt tillverkarens protokoll.
- Omvandla den ligerade plasmiden till DH5α kemiskt kompetenta E. coli-celler med hjälp av värmechockmetoden.
- Tina celler på is och tillsätt 3 μL plasmid till röret. Inkubera på is i 30 minuter och värm sedan i 30 s vid 42 °C.
- Placera på is i 5 min, tillsätt 200 μL superoptimal buljong med katabolt förtryck (SOC) och låt E. coli-celler återhämta sig i SOC-media i 1 h vid 37 °C med skakningar vid 225 varv/min.
- Platta på kanamycin selektiv LB media och inkubera vid 37 °C över natten.
- Kontrollera kolonierna för exakta kloner genom Sanger sekvensering med primers FM-5840F och FM-6138R (Kompletterande tabell 1). Skicka 250 ng plasmid-DNA till en anläggning som utför Sanger-sekvensering. För detta experiment skickades prover till Iowa State University DNA Core Facility.
- Inokulera 2 ml flytande LB med vald koloni och inkubera vid 37 °C över natten med skakning vid 225 varv/min. Extrahera plasmid-DNA från den över natten odlade genom en alkalisk lysplasmid DNA-beredning52.
- Omvandla plasmid-DNA till Agrobacteriumstammen GV3101-celler med hjälp av frys-tina-metoden. Låt 100 μL kemiskt kompetenta celler tina på is, tillsätt 1-5 μL plasmid och inkubera på is i 30 minuter. Placera i flytande kväve i 1 min och inkubera sedan vid 37 °C i 3 min. Tillsätt 1 ml SOC, låt det återvinnas i 2-3 h vid 28 °C med skakningar, platta på rif, gent och kan selektiv LB-media och inkubera vid 28 °C i 2 dagar.
- Skärmkolonier för närvaro av skär med koloni PCR. Välj en enda bakteriekoloni och blanda den i 30 μL vatten. Ställ in en PCR-reaktion genom att tillsätta 12,5 μL polymeras master mix, 1,25 μL av varje 10 μM primer, FM-5840F och FM-6138R, 3 μL av bakteriekolonifjädringen och vatten till en slutlig volym på 25 μL. Cykel 35 gånger med en glödgningstemperatur på 64 °C och en förlängningstid på 1 min).
- Inokulera 2-5 ml flytande LB (rif, gent, kan) med rätt Agrobacterium koloni. Låt den växa över natten vid 28 °C med skakningar vid 225 varv/min.
- Blanda nattkulturen med en 50% glycerollösning 1:1. Förvara vid -80 °C för långtidsförvaring.
- PCR förstärker fragment från majsgenen som ska tystas (t.ex. les22 eller pds) med hjälp av en främre primer med en PacI-begränsningsplats och en omvänd primer med en XbaI-begränsningsplats. Detta kommer att möjliggöra ligatur av genfragmenten i MCS1 * av FoMV-pCAMBIA1380 binära vektorn i antisense orienteringen.
- FoMV uttryck konstruktion
- PCR förstärker kodningssekvensen av intresse, inklusive start- och stopp-kodoner (t.ex. GFP) enligt beskrivningen i 1.1.1, och lägger till en Bsu36I-begränsningsplats på den främre primern och en PspOMI-begränsningsplats på den omvända primern för att möjliggöra riktad kloning i bemärkelsens orientering i MCS2.
- Utför PCR-rening med ett PCR-reningskit enligt satsens specifikationer.
- Smält PCR-produkten och FoMV-EV med restriktionsenzymerna Bsu36I och PspOMI, enligt beskrivningen i 1.1.3.
- Liga den smälta PCR-produkten och FoMV-EV tillsammans med T4 DNA-ligase enligt tillverkarens protokoll.
- Omvandla till DH5α kemiskt kompetenta E. coli-celler med hjälp av värmestötsmetoden enligt beskrivningen i 1.1.5. Platta på kanamycin selektiv LB media och inkubera vid 37 °C över natten.
- Kontrollera kolonierna för exakta kloner genom Sanger-sekvensering enligt beskrivningen i 1.1.6 med hjälp av primersna 5AmuS2 och 5AmuA2 (Kompletterande tabell 1).
- Inokulera 2 ml flytande LB med vald koloni och inkubera vid 37 °C över natten med skakning vid 225 VARV/min. Extrahera plasmid-DNA från den över natten odlade genom en alkalisk lysplasmid DNA-beredning52.
- Omvandla plasmid-DNA till Agrobacteriumstam GV3101 kemiskt kompetenta celler med hjälp av frys-tina-metoden enligt beskrivningen i 1.1.8. Platta på rif, gent och kan selektiva LB-medier och inkubera vid 28 °C i 2 dagar.
- Skärmkolonier för förekomst av skär med koloni PCR med hjälp av primersna 5AmuS2 och 5AmuA2.
- Inokulera 2-5 ml flytande LB (rif, gent, kan) med rätt Agrobacterium koloni. Skaka över natten vid 225 varv/min vid 28 °C.
- Blanda nattkulturen med en 50% glycerollösning 1:1. Förvara vid -80 °C för långtidsförvaring.
- Konstruktion av SCMV-uttryck
- PCR förstärker den av intressegenen (t.ex. GFP) exklusive stoppkodonet enligt beskrivningen i 1.1.1, inklusive en PspOMI-matsmältningsplats på den främre primern och en SbfI-rötningsplats på den omvända primern för att möjliggöra riktad kloning i den binära vektorn SCMV-pCAMBIA1380.
OBS: Insatsen måste klonas i ramen med det virala polyproteinet. - Utför PCR-rening med ett PCR-reningskit enligt satsens specifikationer.
- Smält PCR-produkten och SCMV-EV med restriktionsenzymerna PspOMI och SbfI, enligt beskrivningen i 1.1.3.
- Liga den smälta PCR-produkten och SCMV-EV tillsammans med T4 DNA-ligase enligt tillverkarens protokoll.
- Omvandla produkten till DH5α kemiskt kompetenta E. coli-celler med hjälp av värmestötsmetoden enligt beskrivningen i 1.1.5. Platta på kan selektiva LB-medier och inkubera vid 37 °C över natten.
- Skärmkolonier för exakta kloner genom Sanger-sekvensering enligt beskrivningen i 1.1.6 med primers SC-745F och HCProR1 (Kompletterande tabell 1).
- Inokulera 2 ml flytande LB med vald koloni och inkubera vid 37 °C över natten med skakning vid 225 varv/min. Extrahera plasmid-DNA från den över natten odlade genom en alkalisk lysplasmid DNA-förberedelse52.
- Omvandla plasmid-DNA till Agrobacteriumstam GV3101 kemiskt kompetenta celler med hjälp av frys-tina-metoden enligt beskrivningen i 1.1.8. Platta på rif, gent och kan selektiva LB-medier och inkubera vid 28 °C i 2 dagar.
- Skärmkolonier för förekomst av skär med koloni PCR med primers SC-745F och HCProR1 enligt beskrivningen i 1.1.9.
- Inokulera 2-5 ml flytande LB (rif, gent, kan) med rätt Agrobacterium koloni. Skaka över natten vid 225 varv/min vid 28 °C.
- Blanda nattkulturen med en 50% glycerollösning 1:1. Förvara vid -80 °C för långtidsförvaring.
- PCR förstärker den av intressegenen (t.ex. GFP) exklusive stoppkodonet enligt beskrivningen i 1.1.1, inklusive en PspOMI-matsmältningsplats på den främre primern och en SbfI-rötningsplats på den omvända primern för att möjliggöra riktad kloning i den binära vektorn SCMV-pCAMBIA1380.
2. Plantberedning
- Plantera 1-2 majsfrön ("Golden Bantam" söt majs, FR1064, B73, etc.) i torvbaserat odlingsmedium i små insatser placerade inuti brickor 4-7 dagar före injektion. Placera i en tillväxtkammare under 16 timmar dagar vid 25 °C och 8 h nätter vid 22 °C (~ 185 fotosyntetiskt aktiv strålning (PAR)) eller i ett växthus under 16 h dagar vid 22-25 °C och 8 h nätter vid 22-25 °C (350-400 PAR).
OBS: Mottagligheten för Agrobacterium varierar mellan majsgenotyper, vilket påverkar framgångsgraden. Dessutom kan vissa virala vektorer vara oförenliga med vissa majsgenotyper. - Vattna regelbundet och gödsla en gång i veckan med 15-5-15 flytande gödningsmedel vid 330 delar per miljon (PPM).
3. Beredning av Agrobacterium
- En dag före injektionen, förbered LB flytande medier med lämpligt antibiotikum (rif, gent, kan) och inokulera med Agrobacterium stam som bär önskad viral konstruktion. Det rekommenderas att tillsätta 20 μL glycerol bestånd i 50 ml LB, vilket bör ge tillräckligt med bakteriekultur för att inokulera >100 växter och kan skalas upp eller ner efter behov.
OBS: Förbered tillräckligt inokulat för att ha en slutlig mängd bakteriell suspension på minst 1 ml vid en optisk densitet på 600 nm (OD600) på 1,0 för varje 4-5-växt. - Skaka vid 225 varv/min vid 28 °C i 24 timmar.
- Pelletbakterier i 10 min vid 4 000 x g vid rumstemperatur. Kasta supernatanten.
- Tvätta pelleten noggrant med 1 ml avjoniserat (DI) vatten genom pipettering eller skonsam virvel.
- Upprepa steg 3.3 till pelletbakterier.
- Återanvänd pelleten i 1 ml mgSO4-lösning på 10 mM genom pipettering eller skonsam virvel.
- Lägg eventuellt till 200 μM acetosyringone till lösningen. Även om det ofta används, acetosyringone förbättrar bara omvandlingsförmågan hos vissa Agrobacterium stammar. Författarna har inte funnit att tillägget av acetosyringone påverkar effektiviteten i detta protokoll (kompletterande tabell 2).
OBS: 10 mM MgSO4-lösning kan tillverkas av en 1 M lagerlösning med ett pH på 6,3 lagrade i rumstemperatur. Lösningen kommer sannolikt inte att kräva pH-justering.
- Lägg eventuellt till 200 μM acetosyringone till lösningen. Även om det ofta används, acetosyringone förbättrar bara omvandlingsförmågan hos vissa Agrobacterium stammar. Författarna har inte funnit att tillägget av acetosyringone påverkar effektiviteten i detta protokoll (kompletterande tabell 2).
- Mät OD600 av provet med en spektrofotometer och späd till 1,0 OD600 med 10 mM MgSO4-lösning .
OBS: Detta är en säker stopppunkt. Bakteriesuspension kan hållas i rumstemperatur i upp till 5 timmar före injektion.
4. Injektion
OBS: Majsplantor från 4-7 dagar kan användas för injektion. Planttillväxten påverkas i hög grad av tillväxtförhållanden, par (dvs. högre par i växthus än i tillväxtkammare) och genotyp, bland annat som kan vara svåra att kontrollera i växthusförhållanden. Växter kan injiceras så unga som 4 dagar gamla när de är 2-3 cm långa utan några blad expanderade och så gamla som 7 dagar när det nedre rundade spetsbladet expanderas. Framgångsgraden för denna inokuleringsmetoder sjunker snabbt när växter åldras bortom 7 dagar efter sådd. Injektionsstället är detsamma oavsett plantornas ålder.
- Bär skyddsglasögon, injicera bakteriefjädringen i plantorna 2-3 mm ovanför coleoptilar noden med en 25G x 5/8 " nål fäst vid en 1 ml engångsspruta.
OBS: Den coleoptilar noden är där kronrötter så småningom kommer att bildas. Detta är den lägsta noden på anläggningen. Vanligtvis kommer det att ske en färgförändring från grönt till vitt vid och under noden. Injektionsstället är precis ovanför meristem. Dissekera några plantor i detta skede kan hjälpa till med att visualisera meristemens placering och följaktligen rätt injektionsställe. - Applicera försiktigt tryck på sprutan tills suspensionen fyller upp coleoptilen eller är synlig i virveln, beroende på plantornas tillväxtstadium. Detta är ungefär 100-200 μL suspension.
OBS: Om det är svårt att injicera suspensionen i plantan kan injektionsstället vara för lågt. Måttligt tryck är allt som bör behövas för att injicera suspensionen. - Injicera alla plantor, byt sprutor och nålar för varje konstruktion.
5. Fortsatt växtvård
- Transplantera de injicerade plantorna till 13 x 13 x 15 cm eller större krukor när de är 7-8 dagar gamla.
- Bibehåll tillväxtförhållandena (16 h fotoperiod och gödsling en gång i veckan).
6. Bekräftelse av infektion (fenotypiskt och RT-PCR)
- Fenotypiskt poäng växter mellan 14-21 DPI. Skador från tysta kontroll gener lesion efterliknar 22 eller phytoene desaturase kan lätt ses på bladen och skiljer sig från FoMV symtom. GFP-uttryck kan detekteras via fluorescerande mikroskopavbildning eller annan UV-ljusavbildning.
OBS: Vissa konstruktioner/virusvektorer kan ta längre tid att visa symtom eller kanske inte visar några symtom alls. Höga ljus villkor ökar kraftigt fenotyper orsakas av tysta lesion efterliknar 22 och phytoene desaturase. Lesioner kan vara mindre synliga eller frånvarande om växter upprätthålls i lägre ljusförhållanden såsom en tillväxtkammare, men den faktiska infektionshastigheten enligt RT-PCR bör inte påverkas (tabell 1). - För att bekräfta infektion molekylärt, provblad 6 mellan 14-21 DPI och extrahera totalt RNA med hjälp av en fenol-kloroform extraktion enligt tillverkarens instruktioner.
- Använda det extraherade RNA som mall för att generera första-strand cDNA.
- Ställ in cDNA-reaktionen med upp till 5 μg totalt RNA, 1 μL slumpmässiga hexamerprimrar, 1 μL oligo (dT)18 primers, 1 μL dNTPs, 1 μL omvänd transkriptas och vatten för en slutlig volym på 14,5 μL.
- Använd primers utformade för den virala konstruktionen och cDNA som mall, utför PCR på varje prov för att bekräfta virusinfektion och bestämma integriteten hos genen eller genfragmentet av intresse enligt beskrivningen i 1.1.1, förutom att minska cyklerna till 25 för FoMV och 30 för SCMV för att undvika falska positiva identifieringar.
- För FoMV-ljuddämpningskonstruktioner, använd primers FM-5840F och FM-6138R för att förstärka över MCS1*, som innehåller majsgenfragmentet. För FoMV-uttryckskonstruktioner, använd primers 5AmuS2 och 5AmuA2 för att förstärka över MCS2, som innehåller den infogade genen.
- För SCMV-uttryckskonstruktioner använder du primers SC745-F och HCProR1 för att förstärka över MCS, som innehåller den infogade genen (kompletterande figur 3).
- För en endogen kontrollgen, använd primers ZmActS och ZmActA, som förstärker ett mRNA-fragment av majsaktin (GRMZM2G126010) eller primers ZmUbiF och ZmUbiR, som förstärker ett mRNA-fragment av majspolyubquitin (GRMZM2G409726_T01).
- Visualisera PCR-produkten på en 1% agarose gel som innehåller en nukleinsyra fläck för att bestämma förekomsten eller frånvaron av virus och gen eller genfragment.
Representative Results
Målet med denna studie var att utveckla ett enkelt protokoll för direkt införande av rekombinanta virus konstruerade för gendämpning eller genuttryck i majsplantor (figur 2). Virusvektorerna som bär skär är utformade och klonade med hjälp av vanliga molekylärbiologiska tekniker. Genfragment för ljuddämpning sätts in i MCS1* i FoMV-EV och kodningssekvenser för uttryck sätts in i FoMV-EV på MCS2 eller SCMV-EV på MCS. De resulterande plasmiderna överförs till Agrobacterium stam GV3101. Därefter injiceras majsplantor inom en vecka eller mindre efter plantering. Två veckor efter injektion, växter kan bedömas både fenotypiskt och molekylärt för viral infektion, gen ljuddämning och genuttryck.
Majsplantor odlas i ett torvbaserat medium i 4-7 dagar. I detta skede är den pikala meristem strax ovanför den coleoptilar noden (figur 3A). Efter att coleoptilen har förlängts 2-3 centimeter eller upp till 7 dagar efter sådd injiceras växter 2-3 mm ovanför coleoptilarnoden (figur 3B-F). Ungefär 12 dagar efter injektionen kommer växter att börja visa tysta fenotyper på sina löv, vanligtvis observerade nära kärlvävnad, och dessa skador är visuellt åtskilda från FoMV viral mosaiksymtom (figur 4). Både förekomsten av FoMV och ljuddämpningen av målgener kan påvisas i injicerade växter (figur 5). GFP-uttryck kan detekteras 2 veckor efter injektion under ett fluorescerande mikroskop och är starkast på bladen 5-7 (figur 6). När GFP-uttryck från FoMV observeras under ett fluorescensavbildningssystem kan det visualiseras som många små, punktliga fluorescensområden fördelade över blad nära kärlvävnad medan GFP-uttryck från SCMV består av större fläckar (figur 6, kompletterande figur 1). Även om virala mosaiksymtom ofta är synliga på växter infekterade med FoMV-ljuddämpningskonstruktioner, har växter som injiceras med GFP-uttryckskonstruktioner som framgångsrikt uttrycker GFP ofta inte dessa symtom. Som ett resultat kan en växt utan synliga symtom fortfarande vara positiv för virus och GFP-uttryck. Dessutom bör punktering av meristem under agroinjektionsförfarandet undvikas eftersom detta kan orsaka morfologiska defekter, men de resulterande växterna överlever och är ofta symptomatiska (figur 7).
Även om detta protokoll ursprungligen utvecklades med hjälp av söt majs, kan flera majs inavlade linjer framgångsrikt inokuleras med FoMV gen ljuddäskning konstruktioner med hjälp av agroinjection. Till exempel har FR1064 och B73 vanligtvis höga nivåer av virusinfektion (tabell 2). Noterbart är att Mo17, en linje med känd genetisk resistens mot FoMV, hade en 0% infektionseffektivitet som förväntat36,53. Dessutom påverkar den konstruktion som används infektionseffektiviteten (tabell 3). När det gäller FoMV har FoMV-EV och FoMV-LES22 vanligtvis de högsta infektionseffektiviteten på 53% respektive 54%. FoMV-PDS har en något lägre effektivitet på 38%, och FoMV-GFP är den lägsta på 17%. SCMV-GFP har en infektionseffektivitet på 8%. Dessa procentsatser är medelvärden över flera experiment; enskilda experiment kan ha högre eller lägre infektionseffektivitet.
Figur 1: Schematiska framställningar av FoMV- och SCMV T-DNA-kloner som används för agroinjektion i majs. FoMV-vektorn innehåller två flera kloningsplatser (MCS1* och MCS2). Den tomma vektorn, FoMV-EV, är 7 269 bp och innehåller inga skär i någon av MCS. (A) Gendämpning med hjälp av FoMV-vektorn kan uppnås genom att föra in genfragment i MCS1*, betecknad som intressesekvens (SOI), vanligtvis i anti-sense-orienteringen. (B) Genuttryck med hjälp av FoMV-vektorn kan åstadkommas genom att föra in gen-ORFs i MCS2 i bemärkelsens orientering, betecknad som SOI. (C) SCMV-vektorn konstruerades för att ha en MCS mellan P1 och HCPro. Den tomma vektorn, SCMV-EV, är 11 015 bp och innehåller inga skär i MCS. Gen-ORFs som sätts in i MCS som är i ram med SCMV-polyproteinet kommer att uttryckas som proteiner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Schematisk sammanfattning av agroinjektionsprotokollet. (A) Klon SOI, antingen en CDS- eller genfragment, till virusvektorn och omvandlas till Agrobacteriumstammen GV3101. B) Växtmajs och odla i 4-7 dagar. (C) Odla GV3101 i flytande odling över natten vid 28 °C. (D) Förbered bakteriell suspension för injektion. E) Injicera plantor 2-3 mm över coleoptilarnoden med 100–200 μL suspension. (F) Transplantera plantor när de är 7 dagar gamla till större krukor och växa i 2-3 veckor tills det 5: e bladet är synligt. Fenotyp om så önskas. G) Provblad 5 och extrahera RNA. (H) Gör cDNA och utför PCR för att förstärka virus/SOI. (I) Kör på gel för kvalitativ analys för att bestämma förekomst/frånvaro av virus och en trunkerad eller intakt SOI. Denna siffra skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Agroinjektionsmetod för inokuring av plantor strax ovanför coleoptile-noden. Coleoptilen är helt expanderad, och det första sanna bladet kan vara delvis synligt, men är inte omöblerat. B) 6-7-dagars gamla växter. Det första bladet kan expanderas men inga kragen kommer att vara synliga. Det andra bladet kommer också att vara synligt och kan börja utvecklas i detta skede. C) Dissekering av 6-7-dagars gamla växter som visar platsen för den täppt apikala meristem i förhållande till coleoptile noden. (D) Injektion av 4-5-dagars gamla växter. (E) Injektion av 6-7-dagars gamla växter. F) Injektion av 6-7-dagars gamla växter med hjälp av en färglösning, som visar färgat inokulat som kommer ut ur plantans virvel. G) Närbild av injektionsstället för 6-7-dagars gamla växter i förhållande till coleoptile noden. (H) Närbild av en 6-7-dagars gammal växt efter injektion, som visar färgat inokulat i växtens virvel. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Symtom på de ljuddävande kontrollgener som används i agroinjektionsexperimenten. FoMV-LES22 bär en 329 bp infoga av 3' CDS av lesion efterliknar 22 majs genen i antisense orientering. Ljuddämpning resulterar i ackumulering av en giftig metabolit som i sin tur orsakar de nekrotiska lesioner som först uppträder som strimmor längs vaskulatur och växer till större fläckar som visas här. B) Ett blad som fotograferats vid 17 DPI efter att växten injicerats med FoMV-PDS. FoMV-PDS bär en 313 bas par infoga av 3 ' CDS av sorghum phytoene desaturase genen i antisense orientering. Tystande av pds i majs orsakar en systemisk fotobleaching fenotyp som börjar som små, tunna strimmor längs vaskulatur som växer till längre strimmor längs bladets längd som visas här. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: qRT-PCR av växter som injicerats med FoMV gendämpning konstruktioner. Bekräftelse av systemisk FoMV-infektion och gendämpning inducerad av FoMV-LES22 och FoMV-PDS konstruktioner levereras via agroinjection i söta majs växter (Golden x Bantam). (A) Gelbilderna visar RT-PCR-analyser som bekräftar förekomsten av FoMV-MCS1* tom vektor (315 bp amplicon) och FoMV-PDS (625 bp amplicon) i blad 6 av fem enskilda växter. Pcr-primersna som används producerar en amplicon som spänner över MCS1*. Majsgenen actin (Zm-Actin) amplicon fungerar som referensgenen. Stapeldiagrammet representerar de relativa uttrycksvärdena qRT-PCR för pds-uttryck i blad 6 vid 37 dagars postinokulering (DPI) genom agroinjektion med FoMV-MCS1* eller FoMV-PDS. Undertryckande av pds kan detekteras i var och en av de fem biologiska replikaterna (p=0,003; post hoc Dunnetts test; felstaplar anger standardavvikelse (SD) för tre tekniska replikat). (B) Gelbilderna visar RT-PCR-analyser som bekräftar förekomsten av FoMV-MCS1* (315 bp amplicon) i blad 6 av fem enskilda växter. FoMV-LES22 (625 bp amplicon) upptäcktes i blad 6 vävnad (prover FoMV-LES22 1-5, 38 DPI) och blad 4 (prover FoMV-LES22 6-10, 20 DPI) för tio enskilda växter. Zm-Actin-amplicon fungerade som referensgenen. Stapeldiagrammet representerar qRT-PCR relativa uttrycksvärden för les22 uttryck i majsvävnader genom agroinjektion av FoMV-MCS1* eller FoMV-LES22 virala konstruktioner. Les22-undertryckande sker i 9 av 10 biologiska replikat (p=<0.0001; post hoc Dunnetts test; felstaplar anger SD för tre tekniska replikat). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6. Fenotyper av olika konstruktioner som används i agroinjection experiment. Alla avbildade växter injicerades när de var 6-7 dagar gamla med Agrobacterium stam GV3101 bär de angivna konstruktionerna. Bilderna togs vid 16 DPI. (A) Bladsymtom på pCAMBIA1380 (tom plasmidstomme), FoMV-EV, FoMV-GFP och SCMV-GFP i synligt ljus, under FluorCam klorofyllfilter vid 250 μs exponering och under FluorCam GFP-filtret vid 10 ms exponering. B) Fluorescerande mikroskopibilder av bladen av mockbehandlade (injicerade endast med MgSO4-lösning ), FoMV-EV och FoMV-GFP injicerade växter. DIC-, DSRed- och EGFP-kanalerna visas och togs varsin exponering vid 1500 ms. Skalstrecket är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Morfologiska effekter av injektion. Ett exempel på de allvarligare morfologiska effekterna som kan uppstå från direkt injektion i meristematisk vävnad. Denna skada kan resultera i "strimling" av bladen och delning av stammen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Virus | Tillväxtvillkor | Genotyp | # Infekterade växter | Totalt antal växter | % infektion | Genomsnittlig % av infektionen |
| FoMV-EV | Tillväxtkammare | Majs | 22 | 23 | 96% | 97% |
| B73 | 18 | 18 | 100% | |||
| B104 | 20 | 21 | 95% | |||
| Växthus | Majs | 20 | 23 | 87% | 89% | |
| B73 | 17 | 18 | 94% | |||
| B104 | 16 | 19 | 84% | |||
| SCMV-EV | Tillväxtkammare | Majs | 14 | 21 | 67% | 47% |
| B73 | 5 | 18 | 28% | |||
| B104 | 10 | 21 | 48% | |||
| Växthus | Majs | 14 | 23 | 61% | 49% | |
| B73 | 0 | 19 | 0% | |||
| B104 | 19 | 22 | 86% |
Tabell 1: Växthusets och tillväxtkammarens inverkan på agroinutjektionsinokuleringseffektiviteten. Frön groddes under identiska tillväxtförhållanden. Grominerade plantor agroinjected och hälften av dem flyttades till en tillväxtkammare (25 °C 16 h dagsljus / 22C 8 h natt; 185 PAR) och den andra hälften flyttades till ett växthus (22-25 °C 16 h dagsljus/22-25 °C 8 h natt; 350-400 PAR). I denna tabell rapporteras infektionshastigheten i procent, beräknad utifrån det antal växter som bekräftas av RT-PCR för att vara infekterade med respektive virus dividerat med det totala antalet agroinjected växter. Det finns ingen statistisk skillnad i infektionseffektivitet mellan tillväxtkammare och växthusförhållanden (FoMV två tailed t-test p=0,08; SCMV två tailed t-test p=0,96).
| Majs genotyp | FoMV-EV | FoMV-LES22 | Kombinerad totalsumma | ||||
| Smittad | Total | % infekterad | Smittad | Total | % infekterad | % infekterad | |
| Majs | 18 | 23 | 78% | 15 | 23 | 65% | 72% |
| MO47 | 7 | 22 | 32% | 1 | 21 | 5% | 19% |
| K55 | 1 | 15 | 7% | 3 | 17 | 18% | 13% |
| W64A | 10 | 22 | 45% | 8 | 20 | 40% | 43% |
| MO17 | 0 | 16 | 0% | 0 | 13 | 0% | 0% |
| B73 | 10 | 18 | 56% | 7 | 17 | 41% | 49% |
| B101 | 12 | 21 | 57% | 8 | 24 | 33% | 44% |
| FR1064 | 4 | 4 | 100% | 4 | 4 | 100% | 100% |
| B104 | 10 | 22 | 45% | 5 | 21 | 24% | 35% |
| WCC22 | 2 | 7 | 29% | 4 | 6 | 67% | 46% |
| A188 | 0 | 3 | 0% | 4 | 6 | 67% | 44% |
Tabell 2: Infektionseffektiviteten hos FoMV-konstruktioner över majsgenotyper. FoMV-EV och FoMV-LES22 agroin injicerades i 11 genotyper av majs. Efter injektion flyttades plantorna till växthuset. Denna tabell beskriver infektionshastigheten som en procent, beräknad från antalet växter infekterade med FoMV som bekräftas av RT-PCR dividerat med det totala antalet agroinjected växter. Den sammanlagda totala infektionshastigheten visar den genomsnittliga infektionsfrekvensen för varje genotyp för båda FoMV-konstruktionerna som testats.
| Växtstadium | 4-5 dagar gamla växter | 6-7 dagar gamla växter | Kombinerad totalsumma | ||||
| Symptomatisk | Totalt antal växter | % infekterad | Symptomatisk | Totalt antal växter | % infekterad | % infekterad | |
| FoMV-EV | 42 | 72 | 58% | 80 | 170 | 47% | 53% (A) |
| FoMV-PDS | 65 | 157 | 41% | 66 | 184 | 36% | 39% (B C) |
| FoMV-LES22 | 115 | 195 | 59% | 144 | 292 | 49% | 54% (A B) |
| FoMV-GFP | 16 | 103 | 16% | 37 | 217 | 17% | 16% (C) |
| SCMV-GFP | 10 | 95 | 11% | 5 | 82 | 6% | 8% (C) |
Tabell 3: Sammanfattning av injektionsexperiment. Denna tabell representerar en sammanfattning av de injektionsexperiment som utfördes från augusti 2017 till augusti 2018 på Golden Bantam söta majsplantor. Växter bedömdes för virala symtom (FoMV-EV), ljuddäppningssymtom (pds och les22) eller GFP fluorescence (GFP) genom visuell (FoMV-EV, FoMV-PDS och FoMV-LES22) eller FluorCam (FoMV-GFP och SCMV-GFP) screening. Resultaten visas individuellt för 4-5 dagar gamla växter och 6-7 dagar gamla växter, samt en sammanfattning över alla växt åldrar. Det finns ingen signifikant skillnad mellan 4-5 dagar gamla växter och 6-7 dagar gamla växter (EnkelriktadE ANOVA, F = 0,6513). Det finns en skillnad mellan viral konstruktion (Onaway ANOVA, F =<0.0001), med bokstäverna som representerar Tukey-Kramer HSD ansluta brev rapport.
Kompletterande tabell 1: Tabell med en förteckning över alla primernamn och sekvenser som används i det här protokollet. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell 2: Acetosyringone test. A) Inledande acetosyringonetest, där symtom på mock, FoMV-EV och FoMV-LES22 jämfördes med 200 μM acetosyringone (+) eller utan acetosyringone (-). B) Jämförelse av infektionsfrekvensen hos FoMV-LES22 enligt RT-PCR:s konstaterande mellan inokuleringsavstängningar utan acetosyringone (-), med 200 μM acetosyringone (+), och tillsats av 20 μM acetosyringone till bakteriekulturen 4 timmar före återpension i buffert tillsammans med tillägg av 200 uM acetosyrdon till den slutliga suspensionen (+). Sammantaget fanns det ingen signifikant skillnad mellan aceotyringonbehandlingar (Oneway ANOVA, f=0, 5452). Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande figur 1: Fluorescensavbildning och molekylär validering av agroininjected SCMV och uttryck av heterologa proteiner i majs. Majsen agroin injicerades med en modifierad SCMV konstruktion som innehåller både CDS av GFP och nano luciferas (NLuc). (A) Fluorcam imaging användes för screening och detektion av GFP. Den vänstra är en mock injicerad växt och höger är SCMV-NLucGFP injicerad växt. (B) Bladproteinextrakt separerades av SDS-PAGE och utvärderades för förekomst av NLuc, GFP och SCMV-pälsprotein (CP) med luciferasanalys i gel eller immunoblot enligt angiven. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Agrobakterier är ett viktigt verktyg som underlättar många molekylärbiologiska tekniker inom växtrelaterad forskning. Denna studie ger ett agroinjection protokoll för inokuculating FoMV och SCMV viral vektorer direkt i majs vävnader för VIGS och VOX applikationer. Huvudmålet är att öka enkelheten och nyttan av virusbaserad teknik för forskning i monokotgrödor. Även om direkt agroinoculation av majs har rapporterats för några virus, författarna är inte medvetna om ett detaljerat protokoll, och det finns inga exempel på VIGS och VOX applikationer i dessa studier19,22.
Det har rapporterats, och bekräftades under utvecklingen av detta protokoll, att injektion platsen är en nyckelfaktor för att framgångsrikt lansera en systemisk viral infektion via agroinjection19. Att konsekvent injicera den rekommenderade platsen på växten antas vara den största variabeln, eftersom meristemens exakta position i majsplantor är praktiskt taget oidentifierbar med ögat. För att minimera interpersonell variation rekommenderas dissekering av några majsplantor ner till meristem för att bättre visualisera dess plats (figur 3C). Meristems position i förhållande till coleoptilar noden bör vara ungefär densamma för växter i åldern 4-7 dagar gamla. Dessutom ger övningsinjektion med en färgad vätska en väl synlig demonstration av hur "inokulat" fyller bladvirveln, och eftersom injektionsstället är märkt med färg kan noggrannheten hos injektionsstället bekräftas (figur 3G, H). Meristematiska vävnader är de mest mottagliga för agroinjection, men att injicera Agrobacterium suspensioner direkt i denna vävnad resulterar i oönskade morfologiska effekter (figur 6)19. Växter med skadade meristemer överlever, men de resulterande defekterna är oönskade, och därför bör direkt injektion av denna vävnad undvikas.
Det finns flera variabler som kan påverka den framgångsrika lanseringen av en systemisk virusinfektion via agroinjection eftersom tre komplexa biologiska system (växt, virus och Agrobacterium stam) måste interagera i samordning. Detta komplexa samspel kan hjälpas av de snabbt dela cellerna i den meristematiska regionen, vilket gör det till en idealisk plats för agroinoculation19. Agrobacteriumstammen måste kunna infektera celler i växtvävnaderna för att leverera T-DNA som bär på virusgenomet, och växten måste vara mottaglig för viruset för att initiera virusreplikation och systemisk infektion. Majsgenotyper skiljer sig åt i sin mottaglighet för virus (t.ex. Mo17 är resistent mot FoMV) eller Agrobacterium-stammar, men majoriteten som testades verkar vara mottagliga för både FoMV och SCMV (tabell 1 och tabell 2)53. Till exempel kan inavlade linjen FR1064 och sötmajssorten Golden Bantam vara särskilt mottagliga för både GV3101 Agrobacterium och FoMV-baserade vektorer.
Bladnumret som provtas och tidpunkten för provtagning för RT-PCR är avgörande för korrekt bedömning av virusinfektion. I exemplen som visas här bestämdes bladnumret genom att börja vid det första rundade bladet (allmänt känt som "tumbladet") och räkna uppåt. Bladen provtogs när de expanderades och nästa blad hade börjat dyka upp. Vilka blad som är optimala för provtagning kan dock variera beroende på virusarter som används, tillväxtförhållanden och majsgenotyp. Därför rekommenderas ett första tidskursexperiment när du tillämpar detta protokoll på ett nytt virussystem för att optimera provtagningsstrategin med avseende på löv och timing.
Den specifika konstruktion som används påverkar avsevärt effektiviteten i detta protokoll. Till exempel producerar de tomma vektorerna FoMV-EV och SCMV-EV och FoMV-PDS och FoMV-LES22, som båda innehåller små skär (313 bp respektive 329 bp), vanligtvis de högsta procentandelarna växter med virussymtom i dessa experiment (tabellerna 1 och tabell 2). Rekombinanta virus som medförde större insatser av GFP ORF (720 bp) i FoMV-GFP och SCMV-GFP, hade dock mycket lägre infektionshastigheter jämfört med växter som injicerats med den tomma vektorn eller gendämpningskonstruktionerna. Denna trend kan bero på de negativa effekterna på viral kondition orsakad av ökande mängder exogent genetiskt material i virusgenomet. Flera studier har visat att skärstabiliteten hos växtvirusvektorer till stor del är beroende av skärstorlek och sekvens36,54,55,56,57. Dessutom fanns det en anmärkningsvärd skillnad i procent av växter som blir smittade efter inokulering med antingen FoMV eller SCMV tom vektor, vilket tyder på ytterligare arbete behövs för att optimera detta protokoll för SCMV (tabell 1). Dessa resultat indikerar att viss felsökning kan behövas när en konstruktion utvecklas, eftersom fragmentets sekvens och längd båda kan påverka effektiviteten.
Sammantaget har denna studie visat att agroinjection av majsplantor är en effektiv inokuleringsmetod för två olika RNA-växtvirus, flera vektorkonfigurationer och 11 genotyper av majs. Detta arbete med FoMV och SCMV, i kombination med tidigare arbeten som använder injektion med majsklorotiskt mottlevirus (MCMV) eller MSV, indikerar att agroinjection är lämplig för inokuring av majsplantor med infektiösa kloner av både RNA- och DNA-virus19,20,21,22. Dessutom visar detta arbete ytterligare att agroinjection är en livskraftig metod för VIGS- och VOX-vektorer och kan tillämpas på växter så unga som fyra dagar gamla (tabell 3). Protokollet som presenteras här förväntas lätt anpassas av majsbiologer för att underlätta forskning i funktionella genomikstudier som involverar övergående gendämpning (VIGS) och överuttryck (VOX). Agroinjection har också kapacitet att underlätta virusbaserade genredigeringsmetoder (VEdGE) som annars skulle begränsas av beroendet av växttransformation, vilket potentiellt förbättrar redigeringseffektiviteten och tillgängligheten58,59,60. Med tanke på lämplig agrobacteriumstam, majsgenotyper och virusvektorer kombineras eftertänksamt, förväntas inokulering genom agroinutjektion bli ett värdefullt verktyg för transienta genfunktionsanalyser i majs.
Disclosures
Forskarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Iowa State University är en del av ett team som stöder DARPA: s Insect Allies-program HR0011-17-2-0053. Detta arbete stöddes också av Iowa State University Plant Sciences Institute, Iowa State University Crop Bioengineering Center, USDA NIFA Hatch projektnummer 3808 och State of Iowa Funds. K.L.H. stöddes också delvis av Iowa State University Predictive Plant Phenomics forskarutbildningsprogram finansierat av National Science Foundation (DGE #1545453) och av Agricultural and Food Research Initiative grant no. 2019-07318 från USDA National Institute of Food and Agriculture. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien och insamlingen, analysen och tolkningen av data och i skrivandet av manuskriptet. Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis finansiärernas åsikter.
Vi tackar Nick Lauter (USDA-ARS, Ames, IA) för utsäde av majs inavlade linjer, Christian F. Montes-Serey (Iowa State University) för att ha gjort FoMV-GFP klonen och Tyler Austin (Iowa State University) för teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
| 15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
| 1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
| 25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
| 28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
| 37°C Incubator | For E. coli | ||
| Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
| Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
| Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
| cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
| DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
| DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
| EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
| Ethanol | For RNA extraction | ||
| Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
| Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
| Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
| FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
| Fluorescence Microscope | |||
| Gel Electrophoresis Box | |||
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
| Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
| Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
| Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
| Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
| Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
| Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
| Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
| MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
| PacI | New England Biolabs | R0547 | |
| Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
| Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
| pH Meter | |||
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
| Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
| PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
| Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
| Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
| SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
| Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
| Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
| Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
| Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Thermocycler | For PCR | ||
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
| Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
| Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| XbaI | New England Biolabs | R0145 |
References
- Zaidi, S. E. A., Mansoor, S. Viral vectors for plant genome engineering. Frontiers in Plant Science. 8, 539 (2017).
- Kant, R., Dasgupta, I. Gene silencing approaches through virus-based vectors: speeding up functional genomics in monocots. Plant Molecular Biology. 100, 3-18 (2019).
- Hu, J., et al. A barley stripe mosaic virus-based guide RNA delivery system for targeted mutagenesis in wheat and maize. Molecular Plant Pathology. 20 (10), 1463-1474 (2019).
- Pasin, F., Menzel, W., Daròs, J. A. Harnessed viruses in the age of metagenomics and synthetic biology: an update on infectious clone assembly and biotechnologies of plant viruses. Plant Biotechnology Journal. 17 (6), 1010-1026 (2019).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B. Plant virus vectors 3.0: Transitioning into synthetic genomics. Annual Review of Phytopathology. 57 (1), 211-230 (2019).
- Mei, Y., et al. Protein expression and gene editing in monocots using foxtail mosaic virus vectors. Plant Direct. 3 (11), 00181 (2019).
- Ruiz, M. T., Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell. 10 (6), 937-946 (1998).
- Bekele, D., Tesfaye, K., Fikre, A. Applications of virus induced gene silencing (VIGS) in plant functional genomics studies. Journal of Plant Biochemistry & Physiology. 07 (01), 1000229 (2019).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Jackson, A. O. Plant virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annual Review of Phytopathology. 34 (1), 299-323 (1996).
- Holzberg, S., Brosio, P., Gross, C., Pogue, G. P. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. Plant Journal. 30 (3), 315-327 (2002).
- Wang, R., et al. An efficient virus-induced gene silencing vector for maize functional genomics research. Plant Journal. 86 (1), 102-115 (2016).
- Redinbaugh, M. G., et al. Transmission of viral RNA and DNA to maize kernels by vascular puncture inoculation. Journal of Virological Methods. 98 (2), 135-143 (2001).
- Scholthof, H. B. The capsid protein gene of tomato bushy stunt virus is dispensable for systemic movement and can be replaced for localized expression of foreign genes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6 (3), 309 (1993).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Kikkert, M., Jackson, A. O. Tomato bushy stunt virus spread is regulated by two nested genes that function in cell-to-cell movement and host-dependent systemic invasion. Virology. 213 (2), 425-438 (1995).
- Scholthof, H. B. Rapid delivery of foreign genes into plants by direct rub-inoculation with intact plasmid dna of a tomato bushy stunt virus gene vector. Journal of Virology. 73 (9), 7823-7829 (1999).
- Zhang, J., et al. Vacuum and co-cultivation agroinfiltration of (germinated) seeds results in tobacco rattle virus (TRV) mediated whole-plant virus-induced gene silencing (VIGS) in wheat and maize. Frontiers in Plant Science. 8, 393 (2017).
- Vaghchhipawala, Z., Rojas, C. M., Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Agroinoculation and agroinfiltration: simple tools for complex gene function analyses. Methods in Molecular Biology. 678, Clifton, N.J. 65-76 (2011).
- Grimsley, N., Hohn, B., Hohn, T., Walden, R. "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83 (10), 3282-3286 (1986).
- Grimsley, N. H., Ramos, C., Hein, T., Hohn, B. Merisfematic tissues of maize plants are most suscepnsle to agroinfection with maize streak virus. Bio/Technology. 6 (2), 185-189 (1988).
- Martin, D. P., Rybicki, E. P. Improved efficiency of Zea mays agroinoculation with Maize streak virus. Plant Disease. 84 (10), 1096 (2000).
- Martin, D. P., Willment, J. A., Rybicki, E. P. Evaluation of maize streak virus pathogenicity in differentially resistant Zea mays genotypes. Phytopathology. 89 (8), 695-700 (1999).
- Wang, Q., et al. Further characterization of Maize chlorotic mottle virus and its synergistic interaction with Sugarcane mosaic virus in maize. Scientific Reports. 7, 39960 (2017).
- Hsieh, M. H., et al. Optimizing virus-induced gene silencing efficiency with Cymbidium mosaic virus in Phalaenopsis flower. Plant Science. 201-202 (1), 25-41 (2013).
- Hsieh, M. H., et al. Virus-induced gene silencing unravels multiple transcription factors involved in floral growth and development in Phalaenopsis orchids. Journal of Experimental Botany. 64 (12), 3869-3884 (2013).
- Zenna, N. S., et al. Genetic analysis of tolerance to rice tungro bacilliform virus in rice (Oryza sativa L.) through agroinoculation. Journal of Phytopathology. 154 (4), 197-203 (2006).
- Marks, M. S., Kemp, J. M., Woolston, C. J., Dale, P. J. Agroinfection of wheat: A comparison of Agrobacterium strains. Plant Science. 63 (2), 247-256 (1989).
- Dasgupta, I., et al. Rice tungro bacilliform virus DNA independently infects rice after Agrobacterium-mediated transfer. Journal of General Virology. 72 (6), 1215-1221 (1991).
- Boulton, M. I., Buchholz, W. G., Marks, M. S., Markham, P. G., Davies, J. W. Specificity of Agrobacterium-mediated delivery of maize streak virus DNA to members of the Gramineae. Plant Molecular Biology. 12 (1), 31-40 (1989).
- Paulsen, A. Q. Purification and properties of foxtail mosaic virus. Phytopathology. 77 (11), 1346 (1977).
- Bancroft, J. B., Rouleau, M., Johnston, R., Prins, L., Mackie, G. A. The entire nucleotide sequence of foxtail mosaic virus RNA. Journal of General Virology. 72 (9), 2173-2181 (1991).
- Bruun-Rasmussen, M., Madsen, C. T., Johansen, E., Albrechtsen, M. Revised sequence of foxtail mosaic virus reveals a triple gene block structure similar to potato virus X. Archives of Virology. 153 (1), 223-226 (2008).
- Rouleau, M., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Partial purification and characterization of foxtail mosaic potexvirus RNA-dependent RNA polymerase. Virology. 197 (2), 695-703 (1993).
- Rouleau, M., Smith, R. J., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein. Virology. 204 (1), 254-265 (1994).
- Samuels, T. D., et al. Subcellular targeting and interactions among the potato virus X TGB proteins. Virology. 367 (2), 375-389 (2007).
- Cho, S. Y., Kim, K. H. Identification of the capsid protein-binding region of the SL1(+) RNA located at the 5' region of the potato virus X genome. Plant Pathology Journal. 28 (1), 75-80 (2012).
- Mei, Y., Zhang, C., Kernodle, B. M., Hill, J. H., Whitham, S. A. A foxtail mosaic virus vector for virus-induced gene silencing in maize. Plant Physiology. 171 (2), 760-772 (2016).
- Bouton, C., et al. Foxtail mosaic virus: A viral vector for protein expression in cereals. Plant Physiology. 177 (4), 1352-1367 (2018).
- Mei, Y., Liu, G., Zhang, C., Hill, J. H., Whitham, S. A. A sugarcane mosaic virus vector for gene expression in maize. Plant Direct. 3 (8), 00158 (2019).
- Gal-On, A., Meiri, E., Huet, H., Hua, W. J., Raccah, B., Gaba, V. Particle bombardment drastically increases the infectivity of cloned DNA of zucchini yellow mosaic potyvirus. Journal of General Virology. 76 (12), (1995).
- Gao, R., et al. Construction of an infectious cDNA clone and gene expression vector of Tobacco vein banding mosaic virus (genus Potyvirus). Virus Research. 169 (1), 276-281 (2012).
- López-Moya, J. J., García, J. A. Construction of a stable and highly infectious intron-containing cDNA clone of plum pox potyvirus and its use to infect plants by particle bombardment. Virus Research. 68 (2), (2000).
- Choi, I. R., French, R., Hein, G. L., Stenger, D. C. Fully biologically active in vitro transcripts of the eriophyid mite-transmitted wheat streak mosaic tritimovirus. Phytopathology. 89 (12), (1999).
- Kim, K. S., et al. Infectivity of in vitro transcripts of Johnsongrass mosaic potyvirus full-length cDNA clones in maize and sorghum. Archives of Virology. 148 (3), 563-574 (2003).
- Stewart, L. R., Bouchard, R., Redinbaugh, M. G., Meulia, T. Complete sequence and development of a full-length infectious clone of an Ohio isolate of Maize dwarf mosaic virus (MDMV). Virus Research. 165 (2), 219-224 (2012).
- Wylie, S. J., et al. ICTV virus taxonomy profile: Potyviridae. Journal of General Virology. 98 (3), 352-354 (2017).
- Shukla, D. D. taxonomy of potyviruses infecting maize, sorghum, and sugarcane in Australia and the United States as determined by reactivities of polyclonal antibodies directed towards virus-specific N-termini of coat proteins. Phytopathology. 79 (2), 223 (1989).
- Shukla, D. D., Ward, C. W. Amino Acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group. Journal of General Virology. 69 (11), 2703-2710 (1988).
- Chung, B. Y. W., Miller, W. A., Atkins, J. F., Firth, A. E. An overlapping essential gene in the Potyviridae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (15), 5897-5902 (2008).
- Jarchow, E., Grimsley, N. H., Hohn, B. virF, the host-range-determining virulence gene of Agrobacterium tumefaciens, affects T-DNA transfer to Zea mays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (23), 10426-10430 (1991).
- Hu, G., Yalpani, N., Briggs, S. P., Johal, G. S. A porphyrin pathway impairment is responsible for the phenotype of a dominant disease lesion mimic mutant of maize. The Plant Cell. 10 (7), 1095 (2007).
- Qin, G., et al. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis. Cell Research. 17 (5), 471-482 (2007).
- Jones, P. Isolation of plasmid DNA from E. coli. Encyclopedia of Life Sciences. , (2003).
- Ji, Q., Yang, B., Lee, M., Chen, Y., Lübberstedt, T. Mapping of quantitative trait loci/locus conferring resistance to foxtail mosaic virus in maize using the intermated B73-×-Mo17 population. Plant Breeding. 129 (6), 721-723 (2010).
- Pacak, A., et al. The brome mosaic virus-based recombination vector triggers a limited gene silencing response depending on the orientation of the inserted sequence. Archives of Virology. 155 (2), 169-179 (2010).
- Miché, L., Battistoni, F., Gemmer, S., Belghazi, M., Reinhold-Hurek, B. Host-dependent expression of Rhizobium leguminosarum bv. viciae hydrogenase is controlled at transcriptional and post-transcriptional levels in legume nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (5), 1323-1331 (2018).
- Yamagishi, M., Masuta, C., Suzuki, M., Netsu, O. Peanut stunt virus-induced gene silencing in white lupin (lupinus albus). Plant Biotechnology. 32 (3), 181-191 (2015).
- Avesani, L., et al. Stability of Potato virus X expression vectors is related to insert size: Implications for replication models and risk assessment. Transgenic Research. 16 (5), 587-597 (2007).
- Ali, Z., et al. Efficient virus-mediated genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (8), 1288-1291 (2015).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B., Mirkov, T. E. Multiplexed gene editing and protein overexpression using a tobacco mosaic virus viral vector. Plant Physiology. 175 (1), 23-35 (2017).
- Ali, Z., Eid, A., Ali, S., Mahfouz, M. M. Pea early-browning virus-mediated genome editing via the CRISPR/Cas9 system in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis. Virus Research. 244, 333-337 (2018).
