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Biology

पुनः संयोजक Foxtail मोज़ेक वायरस और गन्ना मोज़ेक वायरस संक्रामक क्लोन के साथ इंजेक्शन द्वारा मक्का रोपाई के प्रत्यक्ष Agroinoculation

Published: February 27, 2021 doi: 10.3791/62277
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Iowa State University
* These authors contributed equally

Summary

एक Agrobacterium आधारित इंजेक्शन (agroinjection) प्रोटोकॉल foxtail मोज़ेक वायरस और गन्ना मोज़ेक virusclones मक्का रोपाई में टीका लगाने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। इस तरह से टीकाकरण वायरल संक्रमण, मार्कर जीन के वायरस-प्रेरित जीन मौन, और जीएफपी के वायरल ओवरएक्सप्रेशन की ओर जाता है।

Abstract

एग्रोबैक्टीरियम-आधारित इनोक्यूलेशन दृष्टिकोण का व्यापक रूप से पौधे के ऊतकों में वायरल वैक्टर पेश करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस अध्ययन में एक वायरल वेक्टर ले जाने वाले एग्रोबैक्टीरियम के साथ मेरिस्टेमेटिक ऊतक के पास मक्का के अंकुरों के इंजेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण दिया गया है। जीन मौन और जीन अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर पुनः संयोजक फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस (FoMV) क्लोन का उपयोग इस विधि को अनुकूलित करने के लिए किया गया था, और जीन अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर एक पुनः संयोजक गन्ना मोज़ेक वायरस (SCMV) को शामिल करने के लिए इसके उपयोग का विस्तार किया गया था। जीन के टुकड़े या ब्याज के कोडिंग अनुक्रमों को एक संशोधित, संक्रामक वायरल जीनोम में डाला जाता है जिसे बाइनरी टी-डीएनए प्लास्मिड वेक्टर pCAMBIA1380 में क्लोन किया गया है। परिणामस्वरूप प्लास्मिड निर्माणों Agrobacterium tumefaciens तनाव GV3101 में परिवर्तित कर रहे हैं. 4 दिन पुराने के रूप में युवा के रूप में मक्का रोपाई MgSO4 समाधान में resuspended बैक्टीरिया के साथ coleoptilar नोड के पास इंजेक्ट किया जा सकता है। एग्रोबैक्टीरियम के साथ संक्रमण के दौरान, वायरल जीनोम को ले जाने वाले टी-डीएनए को मक्का की कोशिकाओं में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिससे वायरल आरएनए जीनोम के प्रतिलेखन की अनुमति मिलती है। जैसा कि पुनः संयोजक वायरस प्रतिकृति और व्यवस्थित रूप से पूरे पौधे में फैलता है, वायरल लक्षण और फेनोटाइपिक परिवर्तन लक्ष्य जीन घाव की नकल 22 (les22) या phytoene desaturase (पीडीएस) के मौन के परिणामस्वरूप पत्तियों पर देखा जा सकता है, या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की अभिव्यक्ति यूवी प्रकाश या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ रोशनी पर पता लगाया जा सकता है। वायरस का पता लगाने और एक साथ सम्मिलित करने की अखंडता का आकलन करने के लिए, आरएनए को इंजेक्ट किए गए पौधे की पत्तियों से निकाला जाता है और आरटी-पीसीआर को कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) को सम्मिलित अनुक्रम को ले जाने वाले प्राइमरों का उपयोग करके आयोजित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कई मक्का जीनोटाइप में प्रभावी ढंग से किया गया है और आसानी से अन्य वायरल वैक्टरों में विस्तारित किया जा सकता है, जिससे मक्का में वायरल वेक्टर परिचय के लिए एक सुलभ उपकरण की पेशकश की जा सकती है।

Introduction

कई पौधों के वायरस के संक्रामक क्लोन को वायरस-प्रेरित जीन साइलेंसिंग (VIGS), जीन ओवरएक्सप्रेशन (VOX), और हाल ही में, वायरस-सक्षम जीन संपादन (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 के लिए इंजीनियर किया गया है . जैसा कि नए वायरल निर्माण विकसित किए जाते हैं, इन संशोधित वायरस के साथ पौधे के ऊतकों को सफलतापूर्वक संक्रमित करने के तरीकों पर भी विचार किया जाना चाहिए। पौधों में वायरस संक्रमण शुरू करने के वर्तमान तरीकों में कण बमबारी, इन विट्रो आरएनए टेपों या डीएनए क्लोनों का रगड़-टीका, संवहनी पंचर इनोक्यूलेशन, या एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमफेसिएन्स इनोक्यूलेशन (एग्रोइनोकुलेशन) 5,12,13,14,15,16,17 शामिल हैं . इन टीकाकरण विधियों में से प्रत्येक के अंतर्निहित फायदे और नुकसान हैं, जिनमें लागत, विशेष उपकरणों की आवश्यकता और किसी दिए गए पौधे-वायरस प्रणाली के भीतर व्यवहार्यता शामिल है। पुनः संयोजक वायरस को वितरित करने के लिए डिज़ाइन किए गए बाइनरी टी-डीएनए निर्माणों वाले एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों की घुसपैठ या इंजेक्शन का उपयोग करने वाले तरीकों को प्राथमिकता दी जाती है, क्योंकि वे सरल और सस्ती हैं। हालांकि, ज़ीया मेस (मक्का) जैसे मोनोकोटिलेडोनस प्रजातियों के लिए विस्तृत कृषि-इनोकुलेशन विधियों की कमी है।

वायरस वितरण के लिए एग्रोइनोकुलेशन की पहली रिपोर्टों में से एक 1986 में प्रकाशित हुई थी, जब फूलगोभी मोज़ेक वायरस (सीएएमवी) के जीनोम को टी-डीएनए निर्माण में डाला गया था, और इस निर्माण को ले जाने वाले परिणामी एग्रोबैक्टीरियम को शलजम संयंत्रों पर रगड़ दिया गया था। कृषि-इनोकुलेशन के लिए अतिरिक्त तरीके तब से विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, फॉक्सटेल मोज़ेक वायरस (FoMV) के मामले में, Nicotiana benthamiana का उपयोग पत्तियों में वायरस कणों को उत्पन्न करने के लिए एक मध्यवर्ती मेजबान के रूप में किया जा सकता है जो एक इनोकुलम स्रोत 6 प्रदान करते हैं। संक्रमित एन बेंथामियाना पत्तियों का उपयोग करके मक्का का रगड़ टीका कुशल, तेज और सरल है, लेकिन एक मध्यवर्ती मेजबान का उपयोग सभी मक्का-संक्रमित वायरस के लिए काम नहीं करता है। उदाहरण के लिए, गन्ना मोज़ेक वायरस (एससीएमवी) एन बेंथामियाना को संक्रमित नहीं कर सकता है, इस वायरस से व्युत्पन्न वैक्टर के लिए वैकल्पिक इनोकुलम स्रोतों के उपयोग की आवश्यकता होती है। 1988 में, एग्रोबैक्टीरियम जिसमें मक्का लकीर वायरस (एमएसवी), एक डीएनए वायरस है, को इंजेक्शन (एग्रोइंजेक्शन) द्वारा मक्का के अंकुरों में पेश किया गया था, एग्रोबैक्टीरियम-आधारित टीकाकरण विधियों का प्रदर्शन भी मोनोकॉट्स 19 के लिए उपयोगी है। Agroinjection के साथ इस प्रारंभिक सफलता के बावजूद, मक्का में इस तकनीक का उपयोग करने वाले कुछ अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं, जिससे आरएनए वायरस और VIGS, VOX, और VEdGE वैक्टर 20,21,22 के लिए इस विधि की प्रयोज्यता के बारे में खुले प्रश्न छोड़ दिए गए हैं। हालांकि, मोनोकोट प्रजातियों में कृषि इंजेक्शन का व्यापक उपयोग आशाजनक है, क्योंकि इस सामान्य दृष्टिकोण का उपयोग आर्किड, चावल और गेहूं 23,24,25,26,27,28 में किया गया है।

इस प्रोटोकॉल को FoMV और Agrobacterium स्ट्रेन GV3101 के लिए अनुकूलित किया गया था और इसे एक SCMV वेक्टर पर भी लागू किया गया है। FoMV एक विस्तृत मेजबान रेंज के साथ एक potexvirus है जिसमें 56 मोनोकोट और डिकोट प्रजातियां शामिल हैं29। FoMV में 6.2 किलोबेस (केबी) सकारात्मक भावना, एकल-फंसे हुए आरएनए जीनोम है जो पांच खुले रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) 30,31,32,33,34,35 से पांच अलग-अलग प्रोटीनों को एन्कोड करता है। FoMV को पहले एक टी-डीएनए प्लास्मिड बैकबोन 6,36,37 पर एक संक्रामक क्लोन को शामिल करके मक्का के लिए एक VIGS और VOX वेक्टर दोनों में विकसित किया गया था। वायरल जीनोम को एक क्लोनिंग साइट (MCS1*) को कोट प्रोटीन (CP) (चित्रा 1A) 36 के तुरंत डाउनस्ट्रीम में जोड़कर VIGS अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया गया था। VOX और VEdGE अनुप्रयोगों के लिए, CP प्रमोटर को डुप्लिकेट किया गया था और ORF 4 और CP (चित्रा 1B)6 के बीच ब्याज के अनुक्रमों के सम्मिलन को सक्षम करने के लिए एक दूसरी क्लोनिंग साइट (MCS2) को जोड़ा गया था। FoMV वेक्टर जिसमें MCS1 और MCS2 दोनों शामिल नहीं हैं, FoMV खाली वेक्टर (FoMV-EV) (चित्रा 1) है।

SCMV एक असंबंधित वायरस है जिसे मक्का 38 में VOX के लिए विकसित किया गया है। यह Potyviridae परिवार का एक सदस्य है, जिसमें से कई सदस्यों को planta39,40,41,42,43,44 में विदेशी प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है। एससीएमवी की मेजबान सीमा में मक्का, ज्वार और गन्ना 45,46 शामिल हैं, जो इन प्रमुख फसल पौधों में जीन कार्यात्मक अध्ययन के लिए मूल्यवान बनाता है36,38। एससीएमवी में एक सकारात्मक भावना है, लंबाई में लगभग 10 केबी का एकल-फंसे हुए आरएनए जीनोम 47,48। SCMV VOX वेक्टर बनाने के लिए, अच्छी तरह से स्थापित P1 / HCPro जंक्शन का उपयोग हेटरोलॉगस अनुक्रम38 के लिए एक सम्मिलन साइट के रूप में किया गया था। इस क्लोनिंग साइट के बाद एक एनआईए-प्रो प्रोटीज क्लीवेज साइट को एन्कोडिंग करने का अनुक्रम किया जाता है, जिससे एससीएमवी पॉलीप्रोटीन (चित्रा 1 सी) से स्वतंत्र प्रोटीन का उत्पादन होता है।

इन पुनः संयोजक वायरस के संक्रामक cDNA ले जाने वाले टी-डीएनए प्लास्मिड को एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन जीवी 3101 में बदल दिया गया है। जीवी 3101 एक नोपालिन प्रकार का तनाव है, जो टी-डीएनए को मोनोकोटिलेडोनस प्रजातियों में स्थानांतरित करने में सक्षम होने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है, जिसमें मक्का 26,28,49 शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, पिछले कृषि इंजेक्शन अध्ययनों ने उपभेदों C58 या इसके व्युत्पन्न GV3101, साथ ही साथ 19,20,22,27 का उपयोग किया है।

इस प्रोटोकॉल के विकास में तीन मार्कर जीन का उपयोग किया गया था: दो जीन मौन के लिए और एक जीन अभिव्यक्ति के लिए। मक्का जीन घाव से एक 329 बेस-पेयर (बीपी) टुकड़ा 22 (les22, GRMZM2G044074) का उपयोग मौन वेक्टर FoMV-LES22 के निर्माण के लिए किया गया था। जब les22 मक्का में चुप हो जाता है, तो नेक्रोटिक कोशिकाओं के छोटे, गोल पैच पत्तियों के वास्कुलचर के साथ दिखाई देते हैं जो नेक्रोटिक पत्ती ऊतक 50 के बड़े क्षेत्रों में फैलते हैं और इकट्ठा होते हैं। FoMV-PDS, ज्वार जीन phytoene desaturase (PDS, LOC110436156, मक्का pds, GRMZM2G410515 के लिए 96% अनुक्रम पहचान) से एक 313 बीपी टुकड़ा युक्त, मक्का में पीडीएस के मौन को प्रेरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप पत्तियों के वास्कुलचर के साथ फोटोब्लीच्ड कोशिकाओं की छोटी लकीरें होती हैं जो समय 51 के साथ लंबी होती हैं। ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के लिए बरकरार कोडिंग अनुक्रम का उपयोग FoMV (FoMV-GFP) और SCMV (SCMV-GFP) दोनों के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करने के लिए किया गया था। पत्तियों में जीएफपी अभिव्यक्ति आमतौर पर 14 दिनों के बाद इनोक्यूलेशन (डीपीआई) 6 पर सबसे अधिक पता लगाने योग्य होती है। यद्यपि मक्का में वायरल वैक्टर के एग्रोइंजेक्शन का उपयोग करने वाले पिछले अध्ययन किए गए हैं, इन प्रयोगों से केवल यह पता चला है कि एग्रोइंजेक्शन मक्का के रोपाई में एक संक्रामक क्लोन से वायरल संक्रमण की सुविधा प्रदान कर सकता है और VIGS या VOX अनुप्रयोगों के लिए डिज़ाइन किए गए पुनः संयोजक वायरस तक विस्तार नहीं करता है19,20,21,22। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पिछले कृषि इंजेक्शन विधियों, विशेष रूप से Grismley et al.19 पर बनाता है। कुल मिलाकर, यह कृषि इंजेक्शन विधि VIGS और VOX वैक्टर के साथ संगत है, इनोकुलम स्रोतों के रूप में विशेष उपकरण या वैकल्पिक मेजबानों की आवश्यकता नहीं होती है, और अन्य सामान्य तरीकों के सापेक्ष इनोक्यूलेशन स्थापित करने और प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक समग्र समय और लागत को कम कर देता है जिन्हें बायोलिस्टिक्स या इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल VIGS, VOX, और VEdGE से जुड़े अनुप्रयोगों के साथ मक्का में कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगा।

Protocol

1. प्लास्मिड निर्माण

नोट: इस प्रोटोकॉल को अन्य वायरल वैक्टर या एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों पर लागू किया जा सकता है, लेकिन यह एग्रोइंजेक्शन द्वारा टीकाकरण की समग्र सफलता को प्रभावित कर सकता है। हमेशा एक लैमिनर प्रवाह हुड में बैक्टीरियल इनोक्यूलेशन और चढ़ाना चरणों का प्रदर्शन करें।

  1. FoMV मौन निर्माण
    नोट: लुरिया-Bertani (एलबी) मीडिया (मिलर) सभी मीडिया के लिए उपयोग किया जाता है जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट नहीं किया जाता है। तरल एलबी आसुत पानी के 1,000 मिलीलीटर में 25 ग्राम दानों को निलंबित करके और 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ऑटोक्लेविंग करके बनाया जाता है। ठोस एलबी मीडिया इसी तरह autoclaving से पहले 1.5% अगर के अलावा के साथ बनाया गया है. एलबी को ~ 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के बाद एंटीबायोटिकदवाओं को जोड़ा जाता है, और समाधान को 95 x 15 मिमी पेट्री प्लेटों में डाला जाता है। उपयोग करने के लिए एंटीबायोटिक सांद्रता इस प्रकार है: 25 μg / mL पर rifampicin (rif), 50 μg / mL पर gentamycin (gent), और 50 μg / mL पर kanamycin (kan) ।
    1. PCR मक्का जीन से टुकड़ों को शांत करने के लिए बढ़ाता है (उदाहरण के लिए, les22 या PDS) एक PacI प्रतिबंध साइट के साथ एक आगे प्राइमर और एक XbaI प्रतिबंध साइट के साथ एक रिवर्स प्राइमर का उपयोग करके। यह एंटीसेंस अभिविन्यास में FoMV-pCAMBIA1380 बाइनरी वेक्टर के MCS1 * में जीन टुकड़ों के बंधाव को सक्षम करेगा।
      नोट: डीएनए पोलीमरेज़ विनिर्देशों के बाद 10 μM प्रत्येक, प्लास्मिड डीएनए टेम्पलेट, और पानी पर एक उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़, आगे और रिवर्स प्राइमर का उपयोग करके पीसीआर सेट करें। डीएनए पोलीमरेज़ और प्राइमर पिघलने के तापमान (टीएम) के अनुसार एक एनीलिंग तापमान का उपयोग करके 35 चक्रों के लिए बढ़ाएं, और प्रति किलोबेस 30 एस एक्सटेंशन को प्रवर्धित किया जाना है।
    2. किट विनिर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पीसीआर शुद्धिकरण करें।
    3. शुद्ध PCR उत्पाद और FoMV-EV को प्रतिबंध एंजाइम XbaI और PACI के साथ पचाएं। प्लास्मिड के 1 μg या शुद्ध PCR उत्पाद के सभी, 10x बफर के 2 μL, प्रतिबंध एंजाइम के 1 μL का उपयोग करें, और 20 μL अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा बनाने के लिए पानी जोड़ें। एंजाइम विनिर्देश के अनुसार इनक्यूबेट करें।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार T4 डीएनए लिगाज़ के साथ पचे हुए पीसीआर उत्पाद और FoMV-EV को एक साथ लिगेट करें।
    5. गर्मी सदमे विधि का उपयोग कर DH5α रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं में ligated प्लास्मिड को बदलने.
      1. बर्फ पर कोशिकाओं को पिघलाएं और ट्यूब में प्लास्मिड के 3 μL जोड़ें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें, फिर 42 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए गर्मी का झटका।
      2. 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें, कैटाबोलिक दमन (एसओसी) के साथ 200 μL सुपर इष्टतम शोरबा जोड़ें और ई कोलाई कोशिकाओं को 225 आरपीएम पर मिलाने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एसओसी मीडिया में ठीक होने की अनुमति दें।
      3. Kanamycin चयनात्मक एलबी मीडिया पर प्लेट और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    6. प्राइमर FM-5840F और FM-6138R (पूरक तालिका 1) का उपयोग करके Sanger अनुक्रमण द्वारा सटीक क्लोन के लिए उपनिवेशों की जाँच करें। प्लास्मिड डीएनए के 250 एनजी को एक सुविधा में सबमिट करें जो सेंगर अनुक्रमण करेगा। इस प्रयोग के लिए नमूनों को आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी डीएनए कोर फैसिलिटी को भेजा गया था।
    7. चुने हुए कॉलोनी के साथ तरल एलबी के 2 मिलीलीटर को संक्रमित करें और 225 आरपीएम पर मिलाने के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक क्षारीय लाइसिस प्लास्मिड डीएनए तैयारी 52 के माध्यम से रातोंरात संस्कृति से प्लास्मिड डीएनए निकालें।
    8. फ्रीज-पिघलने की विधि का उपयोग करके प्लास्मिड डीएनए को एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन जीवी 3101 कोशिकाओं में बदलें। रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं के 100 μL को बर्फ पर पिघलने की अनुमति दें, प्लास्मिड के 1-5 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 1 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में रखें, फिर 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। SOC के 1 mL जोड़ें, मिलाते हुए, rif, gent, और kan चयनात्मक LB मीडिया पर प्लेट और 2 दिनों के लिए 28 °C पर incubate के साथ 28 °C पर 2-3 ज के लिए ठीक करने की अनुमति दें।
    9. कॉलोनी पीसीआर के साथ सम्मिलित करने की उपस्थिति के लिए स्क्रीन कॉलोनियों। एक एकल जीवाणु कॉलोनी चुनें और इसे 30 μL पानी में मिलाएं। पोलीमरेज़ मास्टर मिक्स के 12.5 μL, प्रत्येक 10 μM प्राइमर के 1.25 μL, FM-5840F और FM-6138R, बैक्टीरियल कॉलोनी निलंबन के 3 μL, और 25 μL की अंतिम मात्रा में पानी जोड़कर एक PCR प्रतिक्रिया सेट करें। 64 °C के एनीलिंग तापमान और 1 मिनट के विस्तार समय के साथ 35 बार चक्र (प्रत्येक kb प्रवर्धित के लिए 1 मिनट)।
    10. सही Agrobacterium कॉलोनी के साथ तरल एलबी (rif, gent, kan) के 2-5 मिलीलीटर इनोक्यूलेशन। इसे 225 आरपीएम पर मिलाने के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें।
    11. एक 50% ग्लिसरॉल समाधान 1: 1 के साथ रात भर की संस्कृति मिश्रण। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. FoMV अभिव्यक्ति निर्माण
    1. PCR 1.1.1 में वर्णित के रूप में शुरू और रोक कोडोन (जैसे, GFP) सहित ब्याज के कोडिंग अनुक्रम को बढ़ाता है, आगे प्राइमर पर Bsu36I प्रतिबंध साइट और रिवर्स प्राइमर पर एक PspOMI प्रतिबंध साइट जोड़कर MCS2 में अर्थ अभिविन्यास में दिशात्मक क्लोनिंग को सक्षम करने के लिए।
    2. किट के विनिर्देशों के अनुसार पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पीसीआर शुद्धिकरण करें।
    3. पीसीआर उत्पाद और प्रतिबंध एंजाइमों Bsu36I और PspOMI के साथ FoMV-EV को पचाएं, जैसा कि 1.1.3 में वर्णित है।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार T4 डीएनए लिगाज़ के साथ पचे हुए पीसीआर उत्पाद और FoMV-EV को एक साथ लिगेट करें।
    5. DH5α रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं में परिवर्तित गर्मी सदमे विधि का उपयोग कर के रूप में 1.1.5 में वर्णित है. Kanamycin चयनात्मक एलबी मीडिया पर प्लेट और रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    6. सेंगर अनुक्रमण द्वारा सटीक क्लोन के लिए उपनिवेशों की जांच करें जैसा कि प्राइमर 5AmuS2 और 5AmuA2 (पूरक तालिका 1) का उपयोग करके 1.1.6 में वर्णित है।
    7. चुने हुए कॉलोनी के साथ तरल एलबी के 2 मिलीलीटर को संक्रमित करें और 225 आरपीएम पर मिलाने के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक क्षारीय लाइसिस प्लास्मिड डीएनए तैयारी 52 के माध्यम से रातोंरात संस्कृति से प्लास्मिड डीएनए निकालें।
    8. प्लास्मिड डीएनए को एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन जीवी 3101 रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं में परिवर्तित करें, जैसा कि 1.1.8 में वर्णित फ्रीज-थाव विधि का उपयोग किया गया है। रिफ, जेंट, और कान चयनात्मक एलबी मीडिया पर प्लेट और 2 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    9. प्राइमर 5AmuS2 और 5AmuA2 का उपयोग करके कॉलोनी पीसीआर के साथ सम्मिलित करने की उपस्थिति के लिए स्क्रीन कॉलोनियों।
    10. सही Agrobacterium कॉलोनी के साथ 2-5 mL तरल LB (rif, gent, kan) को संक्रमित करें। 28 डिग्री सेल्सियस पर 225 आरपीएम पर रात भर हिलाएं।
    11. एक 50% ग्लिसरॉल समाधान 1: 1 के साथ रात भर की संस्कृति मिश्रण। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. SCMV अभिव्यक्ति निर्माण
    1. PCR ब्याज के जीन (जैसे, GFP) को 1.1.1 में वर्णित के रूप में स्टॉप कोडोन को छोड़कर बढ़ाता है, जिसमें आगे प्राइमर पर एक PspOMI पाचन साइट और रिवर्स प्राइमर पर एक SbfI पाचन साइट शामिल है ताकि SCMV-pCAMBIA1380 बाइनरी वेक्टर में दिशात्मक क्लोनिंग को सक्षम किया जा सके।
      नोट:: सम्मिलित करें वायरल polyprotein के साथ फ़्रेम में क्लोन किया जाना चाहिए।
    2. किट के विनिर्देशों के अनुसार पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पीसीआर शुद्धिकरण करें।
    3. पीसीआर उत्पाद और प्रतिबंध एंजाइम PspOMI और SbfI के साथ SCMV-EV को पचाएं, जैसा कि 1.1.3 में वर्णित है।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार टी 4 डीएनए लिगाज़ के साथ पचाए गए पीसीआर उत्पाद और एससीएमवी-ईवी को एक साथ लिगेट करें।
    5. 1.1.5 में वर्णित गर्मी सदमे विधि का उपयोग करके DH5α रासायनिक रूप से सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं में उत्पाद को बदलें। कान चयनात्मक एलबी मीडिया पर प्लेट और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. सेंगर अनुक्रमण द्वारा सटीक क्लोन के लिए स्क्रीन उपनिवेशों के रूप में प्राइमर SC-745F और HCProR1 (पूरक तालिका 1) का उपयोग करके 1.1.6 में वर्णित है।
    7. चुने हुए कॉलोनी के साथ तरल एलबी के 2 मिलीलीटर को संक्रमित करें और 225 आरपीएम पर मिलाने के साथ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक क्षारीय लाइसिस प्लास्मिड डीएनए तैयारी 52 के माध्यम से रातोंरात संस्कृति से प्लास्मिड डीएनए निकालें।
    8. प्लास्मिड डीएनए को एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन जीवी 3101 रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं में बदलें, जैसा कि 1.1.8 में वर्णित फ्रीज-थाव विधि का उपयोग किया गया है। रिफ, जेंट, और कान चयनात्मक एलबी मीडिया पर प्लेट और 2 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    9. प्राइमर SC-745F और HCProR1 के साथ कॉलोनी PCR के साथ सम्मिलित करने की उपस्थिति के लिए स्क्रीन कॉलोनियों के रूप में 1.1.9 में वर्णित है।
    10. सही Agrobacterium कॉलोनी के साथ तरल एलबी (rif, gent, kan) के 2-5 मिलीलीटर इनोक्यूलेशन। 28 डिग्री सेल्सियस पर 225 आरपीएम पर रात भर हिलाएं।
    11. एक 50% ग्लिसरॉल समाधान 1: 1 के साथ रात भर की संस्कृति मिश्रण। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. अंकुर की तैयारी

  1. इंजेक्शन से 4-7 दिन पहले ट्रे के अंदर रखे गए छोटे आवेषण में पीट-आधारित बढ़ते माध्यम में 1-2 मक्का के बीज ('गोल्डन बैंटम' स्वीट कॉर्न, FR1064, B73, आदि) पौधे लगाएं। 25 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के दिनों के तहत एक विकास कक्ष में रखें और 22 डिग्री सेल्सियस (~ 185 प्रकाश संश्लेषक रूप से सक्रिय विकिरण (PAR)) पर 8 घंटे की रातों में या 22-25 डिग्री सेल्सियस (350-400 PAR) पर 16 घंटे के तहत ग्रीनहाउस में 16 घंटे के तहत एक ग्रीनहाउस में रखें।
    नोट: एग्रोबैक्टीरियम के लिए संवेदनशीलता मक्का जीनोटाइप के बीच भिन्न होती है, जो सफलता की दर को प्रभावित करती है। इसके अतिरिक्त, कुछ वायरल वैक्टर कुछ मक्का जीनोटाइप के साथ असंगत हो सकते हैं।
  2. नियमित रूप से पानी और सप्ताह में एक बार 330 भागों प्रति मिलियन (पीपीएम) पर 15-5-15 तरल उर्वरक के साथ निषेचित करें।

3. Agrobacterium की तैयारी

  1. इंजेक्शन से एक दिन पहले, उचित एंटीबायोटिक (रिफ, जेंट, कान) के साथ एलबी तरल मीडिया तैयार करें और वांछित वायरल निर्माण को ले जाने वाले एग्रोबैक्टीरियम तनाव के साथ टीका लगाएं। एलबी के 50 मिलीलीटर में ग्लिसरॉल स्टॉक के 20 μL को जोड़ने की सिफारिश की जाती है, जो >100 पौधों को टीका लगाने के लिए पर्याप्त जीवाणु संस्कृति उत्पन्न करना चाहिए और आवश्यकतानुसार ऊपर या नीचे स्केल किया जा सकता है।
    नोट: प्रत्येक 4-5 पौधों के लिए 1.0 के 600 एनएम (OD600) के ऑप्टिकल घनत्व पर कम से कम 1 मिलीलीटर के जीवाणु निलंबन की अंतिम मात्रा रखने के लिए पर्याप्त इनोकुलम तैयार करें।
  2. 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर 225 आरपीएम पर हिलाएं।
  3. कमरे के तापमान पर 4,000 x g पर 10 मिनट के लिए गोली बैक्टीरिया। supernatant को छोड़ दें।
  4. पेलेट को 1 मिलीलीटर विआयनीकृत (डीआई) पानी के साथ पिपेटिंग या कोमल भंवर द्वारा अच्छी तरह से धोएं।
  5. गोली बैक्टीरिया के लिए चरण 3.3 दोहराएँ।
  6. पिपेटिंग या कोमल भंवर द्वारा 10 mM MgSO4 समाधान के 1 mL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, समाधान के लिए 200 μM acetosyringone जोड़ें। हालांकि आमतौर पर उपयोग किया जाता है, एसिटोसाइरिंगोन केवल कुछ एग्रोबैक्टीरियम उपभेदों की परिवर्तन क्षमता को बढ़ाता है। लेखकों ने यह नहीं पाया है कि एसिटोसाइरिंगोन के अलावा इस प्रोटोकॉल में दक्षता को प्रभावित करता है (पूरक तालिका 2)।
      नोट: 10 mM MgSO4 समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहीत 6.3 के पीएच के साथ एक 1 एम स्टॉक समाधान से बनाया जा सकता है। समाधान संभवतः पीएच समायोजन की आवश्यकता नहीं होगी।
  7. एक spectrophotometer के साथ नमूने के OD600 को मापने और 10 mM MgSO4 समाधान के साथ 1.0 OD600 करने के लिए पतला।
    नोट:: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है। बैक्टीरियल निलंबन को इंजेक्शन से पहले 5 घंटे तक कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है।

4. इंजेक्शन

नोट: 4-7 दिनों की उम्र से मक्का रोपाई इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंकुर विकास दर विकास की स्थिति, PAR की मात्रा (यानी, विकास कक्ष की तुलना में ग्रीनहाउस में उच्च PAR) और जीनोटाइप, अन्य चीजों के बीच बहुत प्रभावित होती है जिन्हें ग्रीनहाउस स्थितियों में नियंत्रित करना मुश्किल हो सकता है। पौधों को 4 दिन की उम्र के रूप में युवा के रूप में इंजेक्ट किया जा सकता है जब वे 2-3 सेमी लंबे होते हैं, जिसमें कोई पत्तियां विस्तारित नहीं होती हैं और 7 दिनों तक पुरानी होती हैं जब सबसे निचले गोल-टिप पत्ती का विस्तार किया जाता है। इस टीकाकरण विधियों की सफलता दर तेजी से गिरती है क्योंकि बुवाई के 7 दिनों के बाद पौधों की उम्र बढ़ जाती है। इंजेक्शन साइट एक ही है कोई फर्क नहीं पड़ता कि रोपाई की उम्र क्या है।

  1. सुरक्षा चश्मे पहने हुए, 1 एमएल डिस्पोजेबल सिरिंज से जुड़ी 25 जी एक्स 5/8 "सुई का उपयोग करके कोलिओप्टिलर नोड के ऊपर 2-3 मिमी रोपाई में बैक्टीरियल निलंबन को इंजेक्ट करें।
    नोट: coleoptilar नोड है जहां मुकुट जड़ें अंततः फार्म होगा। यह संयंत्र पर सबसे कम नोड है। आमतौर पर, नोड पर और नीचे हरे से सफेद में एक रंग परिवर्तन होगा। इंजेक्शन स्थान सिर्फ meristem के ऊपर है. इस स्तर पर कुछ रोपाई को विच्छेदन करने से मेरिस्टेम के स्थान और परिणामस्वरूप उचित इंजेक्शन साइट की कल्पना करने में मदद मिल सकती है।
  2. सिरिंज पर कोमल दबाव लागू करें जब तक कि निलंबन कोलिओप्टाइल को भर नहीं देता है या पौधों के विकास चरण के आधार पर, वर्ल में दिखाई देता है। यह निलंबन के लगभग 100-200 μL है।
    नोट:: यदि अंकुर में निलंबन इंजेक्ट करना मुश्किल है, तो इंजेक्शन साइट बहुत कम हो सकती है। मध्यम दबाव वह सब है जो निलंबन को इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक होना चाहिए।
  3. सभी रोपाई इंजेक्ट करें, प्रत्येक निर्माण के लिए सिरिंज और सुइयों को बदलें।

5. निरंतर संयंत्र की देखभाल

  1. इंजेक्ट किए गए रोपाई को 13 x 13 x 15 सेमी या बड़े बर्तनों में ट्रांसप्लांट करें जब वे 7-8 दिन पुराने हों।
  2. विकास की स्थिति बनाए रखें (16 ज photoperiod और प्रति सप्ताह एक बार निषेचन)।

6. संक्रमण की पुष्टि (फेनोटाइपिक रूप से और आरटी-पीसीआर)

  1. फेनोटाइपिक रूप से 14-21 डीपीआई के बीच पौधों को स्कोर करते हैं। नियंत्रण जीन घाव 22 या phytoene desaturase नकल चुप करने से घावों आसानी से पत्तियों पर देखा जा सकता है और FoMV लक्षणों से अलग हैं. जीएफपी अभिव्यक्ति को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप इमेजिंग या अन्य यूवी प्रकाश इमेजिंग के माध्यम से पता लगाया जा सकता है।
    नोट: कुछ निर्माणों /वायरल वैक्टर लक्षणों को दिखाने में अधिक समय लग सकता है या कोई भी लक्षण नहीं दिखा सकता है। उच्च प्रकाश की स्थिति बहुत घाव की नकल 22 और phytoene desaturase चुप करने के कारण फेनोटाइप ्स में वृद्धि. घाव कम दिखाई दे सकते हैं या अनुपस्थित हो सकते हैं यदि पौधों को कम प्रकाश की स्थिति में बनाए रखा जाता है जैसे कि विकास कक्ष, हालांकि आरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित वास्तविक संक्रमण दर को प्रभावित नहीं किया जाना चाहिए (तालिका 1)।
  2. आणविक रूप से संक्रमण की पुष्टि करने के लिए, नमूना पत्ती 6 14-21 डीपीआई के बीच और निर्माता के निर्देश के अनुसार एक फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण का उपयोग करके कुल आरएनए निकालें।
  3. पहले स्ट्रैंड cDNA उत्पन्न करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में निकाले गए आरएनए का उपयोग करना।
    1. कुल आरएनए के 5 μg तक, यादृच्छिक हेक्सामर प्राइमर के 1 μL, ओलिगो (dT) 18 प्राइमर के 1 μL, dNTPs के 1 μL, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के 1 μL और 14.5 μL की अंतिम मात्रा के लिए पानी के साथ cDNA प्रतिक्रिया सेट करें।
  4. वायरल निर्माण के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमरों और एक टेम्पलेट के रूप में सीडीएनए का उपयोग करते हुए, वायरल संक्रमण की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक नमूने पर पीसीआर प्रदर्शन करें और 1.1.1 में वर्णित जीन या जीन के जीन टुकड़े की अखंडता को निर्धारित करें, सिवाय इसके कि एफओएमवी के लिए 25 और एससीएमवी के लिए 30 तक चक्रों को कम करने के लिए झूठी सकारात्मकता से बचें।
    1. FoMV मौन निर्माणों के लिए, MCS1* में बढ़ाने के लिए प्राइमरों FM-5840F और FM-6138R का उपयोग करें, जिसमें मक्का जीन टुकड़ा होता है। FoMV अभिव्यक्ति के निर्माण के लिए, MCS2, जिसमें सम्मिलित जीन होता है, में बढ़ाने के लिए प्राइमर 5AmuS2 और 5AmuA2 का उपयोग करें।
    2. SCMV अभिव्यक्ति निर्माणों के लिए, MCS में बढ़ाने के लिए प्राइमर SC745-F और HCProR1 का उपयोग करें, जिसमें सम्मिलित जीन (पूरक चित्रा 3) शामिल है।
    3. एक अंतर्जात नियंत्रण जीन के लिए, प्राइमर ZmActS और ZmActA का उपयोग करें, जो मक्का एक्टिन (GRMZM2G126010) या प्राइमर ZmUbiF और ZmUbiR के एक mRNA टुकड़े को बढ़ाता है, जो मक्का polyubiquitin (GRMZM2G409726_T01) के एक mRNA टुकड़े को बढ़ाता है।
  5. वायरस और जीन या जीन टुकड़े की उपस्थिति या अनुपस्थिति को निर्धारित करने के लिए एक न्यूक्लिक एसिड दाग युक्त एक 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद की कल्पना करें।

Representative Results

इस अध्ययन का लक्ष्य मक्का के अंकुरों में जीन साइलेंसिंग या जीन अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर पुनः संयोजक वायरस को सीधे पेश करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल विकसित करना था (चित्रा 2)। आवेषण ले जाने वाले वायरस वैक्टर को मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग करके डिज़ाइन और क्लोन किया जाता है। मौन के लिए जीन के टुकड़े को FoMV-EV में MCS1* में डाला जाता है और अभिव्यक्ति के लिए कोडिंग अनुक्रमों को MCS2 या MCS में SCMV-EV में FoMV-EV में डाला जाता है। परिणामी प्लास्मिड को एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन जीवी 3101 में स्थानांतरित कर दिया जाता है। बाद में, रोपण के बाद एक सप्ताह या उससे कम समय के भीतर मक्का की रोपाई को इंजेक्ट किया जाता है। इंजेक्शन के दो सप्ताह बाद, पौधों को वायरल संक्रमण, जीन मौन और जीन अभिव्यक्ति के लिए फेनोटाइपिक और आणविक रूप से दोनों का मूल्यांकन किया जा सकता है।

मक्के के पौधों को पीट-आधारित माध्यम में 4-7 दिनों के लिए उगाया जाता है। इस स्तर पर, शूट एपिकल मेरिस्टेम कोलियोप्टिलर नोड (चित्रा 3 ए) के ठीक ऊपर है। कोलिओप्टाइल ने बुवाई के बाद 7 दिनों तक 2-3 सेंटीमीटर या ऊपर विस्तारित होने के बाद, पौधों को कोलियोप्टिलर नोड (चित्रा 3 बी-एफ) के ऊपर 2-3 मिमी इंजेक्ट किया जाता है। इंजेक्शन के लगभग 12 दिनों के बाद, पौधे अपनी पत्तियों पर फेनोटाइप्स को शांत करना शुरू कर देंगे, आमतौर पर संवहनी ऊतक के पास मनाया जाता है, और ये घाव FoMV वायरल मोज़ेक लक्षणों (चित्रा 4) से नेत्रहीन रूप से अलग होते हैं। FoMV की उपस्थिति और लक्ष्य जीन की चुप्पी दोनों इंजेक्ट किए गए पौधों में पता लगाने योग्य है (चित्रा 5)। जीएफपी अभिव्यक्ति को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत इंजेक्शन के बाद 2 सप्ताह तक पता लगाया जा सकता है और पत्तियों पर सबसे मजबूत है 5-7 (चित्रा 6)। जब एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली के तहत मनाया जाता है, तो FoMV से GFP अभिव्यक्ति को संवहनी ऊतक के पास पत्तियों में वितरित प्रतिदीप्ति के कई छोटे, पंक्टेट क्षेत्रों के रूप में देखा जा सकता है, जबकि SCMV से GFP अभिव्यक्ति में बड़े पैच होते हैं (चित्रा 6, पूरक चित्रा 1)। हालांकि वायरल मोज़ेक के लक्षण अक्सर FoMV के साथ संक्रमित पौधों पर दिखाई देते हैं, लेकिन GFP अभिव्यक्ति निर्माणों के साथ इंजेक्ट किए गए पौधे जो सफलतापूर्वक GFP व्यक्त कर रहे हैं, उनमें अक्सर ये लक्षण नहीं होते हैं। नतीजतन, बिना किसी दृश्य लक्षण के एक संयंत्र अभी भी वायरस और जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक हो सकता है। इसके अतिरिक्त, agroinjection प्रक्रिया के दौरान meristem puncturing से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह रूपात्मक दोष पैदा कर सकता है, लेकिन परिणामस्वरूप पौधे जीवित रहते हैं और अक्सर रोगसूचक होते हैं (चित्रा 7)।

यद्यपि यह प्रोटोकॉल मूल रूप से स्वीट कॉर्न का उपयोग करके विकसित किया गया था, कई मक्का इनब्रीड लाइनों को एग्रोइंजेक्शन का उपयोग करके FoMV जीन साइलेंसिंग निर्माणों के साथ सफलतापूर्वक संक्रमित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, FR1064 और B73 में आमतौर पर वायरल संक्रमण की उच्च दर होती है (तालिका 2)। विशेष रूप से, Mo17, FoMV के लिए ज्ञात आनुवंशिक प्रतिरोध के साथ एक रेखा, उम्मीद के अनुसार 0% संक्रमण दक्षता थी36,53। इसके अतिरिक्त, उपयोग किया गया निर्माण संक्रमण दक्षता को प्रभावित करता है (तालिका 3)। FoMV के मामले में, FoMV-EV और FoMV-LES22 में आमतौर पर क्रमशः 53% और 54% पर उच्चतम संक्रमण क्षमता होती है। FoMV-PDS में 38% पर थोड़ी कम दक्षता है, और FoMV-GFP 17% पर सबसे कम है। SCMV-GFP में 8% की संक्रमण दक्षता है। ये प्रतिशत कई प्रयोगों पर औसत हैं; अलग-अलग प्रयोगों में उच्च या निम्न संक्रमण क्षमता हो सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: मक्का में कृषि इंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले FoMV और SCMV T-DNA क्लोनों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। FoMV वेक्टर में दो एकाधिक क्लोनिंग साइटें (MCS1* और MCS2) होती हैं। खाली वेक्टर, FoMV-EV, 7,269 bp है और इसमें या तो MCS में कोई आवेषण नहीं है। (ए) एफओएमवी वेक्टर का उपयोग करके जीन मौन को एमसीएस 1 * में जीन के टुकड़े डालकर प्राप्त किया जा सकता है, जिसे ब्याज के अनुक्रम (एसओआई) के रूप में नामित किया जाता है, आमतौर पर एंटी-सेंस ओरिएंटेशन में। (बी) एफओएमवी वेक्टर का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को एमसीएस 2 में जीन ओआरएफ को सम्मिलित करके पूरा किया जा सकता है, जिसे एसओआई के रूप में नामित किया गया है। (C) SCMV वेक्टर को P1 और HCPro के बीच एक MCS रखने के लिए इंजीनियर किया गया था। खाली वेक्टर, SCMV-EV, 11,015 bp है और इसमें MCS में कोई आवेषण नहीं है। MCS में डाले गए जीन ORFs जो SCMV polyprotein के साथ फ्रेम में हैं, उन्हें प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जाएगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: agroinjection प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध सारांश. (A) क्लोन SOI, या तो एक CDS या जीन टुकड़ा, वायरल वेक्टर में और Agrobacterium तनाव GV3101 में परिवर्तित। (बी) मक्का का पौधा लगाएं और 4-7 दिनों के लिए उगाएं। (C) 28 °C पर रात भर तरल संस्कृति में GV3101 बढ़ो (D) इंजेक्शन के लिए जीवाणु निलंबन तैयार करें। (ई) निलंबन के 100-200 μL के साथ coleoptilar नोड के ऊपर 2-3 मिमी रोपाई इंजेक्ट करें। (एफ) प्रत्यारोपण रोपाई जब वे बड़े बर्तनों के लिए 7 दिन पुराने होते हैं और 2-3 सप्ताह तक बढ़ते हैं जब तक कि 5 वीं पत्ती दिखाई नहीं देती है। फेनोटाइप यदि वांछित हो। (जी) नमूना पत्ती 5 और आरएनए निकालें। (ज) सीडीएनए बनाएं और वायरस/एसओआई को बढ़ाने के लिए पीसीआर का संचालन करें। (I) वायरस की उपस्थिति / अनुपस्थिति और एक छोटा या बरकरार एसओआई निर्धारित करने के लिए गुणात्मक विश्लेषण के लिए जेल पर भागो। यह आंकड़ा BioRender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: coleoptile नोड के ठीक ऊपर रोपाई को टीका लगाने की Agroinjection विधि. (A) 4-5-दिन पुराने पौधों. कोलियोप्टाइल पूरी तरह से विस्तारित है, और पहला सच्चा पत्ता आंशिक रूप से दिखाई दे सकता है, लेकिन फहराया नहीं जाता है। (बी) 6-7-दिन पुराने पौधे। पहले पत्ते का विस्तार किया जा सकता है लेकिन कोई कॉलर दिखाई नहीं देगा। दूसरा पत्ता भी दिखाई देगा और इस स्तर पर फहराना शुरू कर सकता है। (सी) 6-7-दिन पुराने पौधों का विच्छेदन जो कोलोप्टाइल नोड के संबंध में शूट एपिकल मेरिस्टेम के स्थान को दर्शाता है। (d) 4-5-दिन पुराने पौधों का इंजेक्शन। (ई) 6-7-दिन पुराने पौधों का इंजेक्शन। (एफ) एक डाई समाधान का उपयोग करके 6-7-दिन के पुराने पौधों का इंजेक्शन, रोपाई के whorl से बाहर आने वाले रंगे हुए इनोकुलम को दिखाता है। (जी) कोलियोप्टाइल नोड के संबंध में 6-7-दिन पुराने पौधों के इंजेक्शन साइट का क्लोज-अप। (एच) एक 6-7-दिन पुराने पौधे के बाद इंजेक्शन का क्लोज-अप, पौधे के whorl में रंगे हुए इनोकुलम को दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: कृषि इंजेक्शन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले मौन नियंत्रण जीन के लक्षण। (A) FoMV-LES22 के साथ पौधे को इंजेक्ट किए जाने के बाद 17 DPI पर फोटो खिंचवाने वाला एक पत्ता। FoMV-LES22 एंटीसेंस अभिविन्यास में 22 मक्का जीन की नकल घाव के 3 'सीडीएस के 329 बीपी डालने वहन करता है। मौन एक विषाक्त मेटाबोलाइट के संचय में परिणाम होता है जो बदले में परिगलित घावों का कारण बनता है जो पहले वास्कुलचर के साथ लकीरों के रूप में दिखाई देते हैं और यहां दिखाए गए अनुसार बड़े पैच में बढ़ते हैं। (ख) संयंत्र को एफओएमवी-पीडीएस के साथ इंजेक्ट किए जाने के बाद 17 डीपीआई पर फोटो खिंचवाई गई एक पत्ती। FoMV-PDS एंटीसेंस अभिविन्यास में ज्वार phytoene desaturase जीन के 3 'CDS के एक 313 आधार जोड़ी सम्मिलित करता है। मक्का में पीडीएस के मौन एक प्रणालीगत फोटोब्लीचिंग फेनोटाइप का कारण बनता है जो वास्कुलचर के साथ छोटी, पतली लकीरों के रूप में शुरू होता है जो पत्ती की लंबाई के साथ लंबी लकीरों में बढ़ता है जैसा कि यहां दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: FoMV जीन मौन निर्माणों के साथ इंजेक्ट किए गए पौधों के qRT-PCR। प्रणालीगत FoMV संक्रमण की पुष्टि और FoMV-LES22 और FoMV-PDS द्वारा प्रेरित जीन मौन मीठे मकई पौधों (गोल्डन एक्स Bantam) में agroinjection के माध्यम से वितरित निर्माणों. (ए) जेल छवियां आरटी-पीसीआर विश्लेषण दिखाती हैं जो पांच अलग-अलग पौधों में से 6 पत्ती में FoMV-MCS1* खाली वेक्टर (315 bp amplicon) और FoMV-PDS (625 bp amplicon) की उपस्थिति की पुष्टि करती हैं। पीसीआर प्राइमरों का उपयोग एक एम्प्लिकॉन का उत्पादन करता है जो एमसीएस 1 * को फैलाता है। मक्का जीन एक्टिन (Zm-Actin) amplicon संदर्भ जीन के रूप में कार्य करता है। बार ग्राफ FoMV-MCS1* या FoMV-PDS के साथ agroinjection द्वारा 37 दिनों के बाद इनोक्यूलेशन (DPI) पर पत्ती 6 में PDS अभिव्यक्ति के लिए qRT-PCR सापेक्ष अभिव्यक्ति मानों का प्रतिनिधित्व करता है। पीडीएस का दमन पांच जैविक प्रतिकृतियों में से प्रत्येक में पता लगाने योग्य है (पी = 0.003; पोस्ट हॉक डननेट का परीक्षण; त्रुटि सलाखों तीन तकनीकी प्रतिकृतियों के मानक विचलन (एसडी) को इंगित करते हैं)। (बी) जेल छवियां आरटी-पीसीआर विश्लेषण दिखाती हैं जो पांच व्यक्तिगत पौधों में से 6 की पत्ती में FoMV-MCS1* (315 bp amplicon) की उपस्थिति की पुष्टि करती हैं। FoMV-LES22 (625 bp amplicon) दस अलग-अलग पौधों के लिए पत्ती 6 ऊतक (नमूने FoMV-LES22 1-5, 38 DPI) और पत्ती 4 (नमूने FoMV-LES22 6-10, 20 DPI) में पाया गया था। Zm-Actin amplicon संदर्भ जीन के रूप में कार्य किया। बार ग्राफ FoMV-MCS1* या FoMV-LES22 वायरल निर्माणों के agroinjection द्वारा मक्का के ऊतकों में les22 अभिव्यक्ति के लिए qRT-PCR सापेक्ष अभिव्यक्ति मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है। Les22 दमन 10 जैविक प्रतिकृतियों में से 9 में होता है (p = <0.0001; पोस्ट हॉक Dunnett का परीक्षण; त्रुटि सलाखों तीन तकनीकी प्रतिकृतियों के लिए एसडी का संकेत देते हैं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6. Agroinjection प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न निर्माणों के फेनोटाइप। सभी छविवाले पौधों को इंजेक्ट किया गया था जब वे 6-7 दिन पुराने थे , जिसमें एग्रोबैक्टीरियम स्ट्रेन जीवी 3101 संकेतित निर्माणों को ले जाया गया था। चित्र 16 डीपीआई पर लिया गया था। (ए) PCAMBIA1380 (खाली प्लास्मिड बैकबोन), FoMV-EV, FoMV-GFP, और SCMV-GFP के पत्ती के लक्षण दृश्यमान प्रकाश में, 250 μs एक्सपोजर पर FluorCam क्लोरोफिल फ़िल्टर के तहत, और 10 ms एक्सपोजर पर FluorCam GFP फ़िल्टर के तहत। (बी) नकली उपचारित (केवल MgSO4 समाधान के साथ इंजेक्ट किया गया), FoMV-EV, और FoMV-GFP इंजेक्ट किए गए पौधों की पत्तियों की फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियां। DIC, DsRed, और EGFP चैनल दिखाए जाते हैं और प्रत्येक को 1500 ms एक्सपोजर पर लिया गया था। स्केल बार 200 μm है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7. इंजेक्शन के रूपात्मक प्रभाव। अधिक गंभीर रूपात्मक प्रभावों का एक उदाहरण जो मेरिस्टेमेटिक ऊतक में प्रत्यक्ष इंजेक्शन से हो सकता है। इस चोट के परिणामस्वरूप पत्तियों के "श्रेडिंग" और तने का विभाजन हो सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वायरस विकास की स्थिति जीनोटाइप # संक्रमित पौधों पौधों के कुल # % संक्रमण संक्रमण का औसत %
FoMV-EV विकास कक्ष स्वीट कॉर्न 22 23 96% 97%
B73 18 18 100%
B104 20 21 95%
ग्रीनहाउस स्वीट कॉर्न 20 23 87% 89%
B73 17 18 94%
B104 16 19 84%
SCMV-EV विकास कक्ष स्वीट कॉर्न 14 21 67% 47%
B73 5 18 28%
B104 10 21 48%
ग्रीनहाउस स्वीट कॉर्न 14 23 61% 49%
B73 0 19 0%
B104 19 22 86%

तालिका 1: कृषि इंजेक्शन टीकाकरण दक्षता पर ग्रीनहाउस और विकास कक्ष की स्थिति का प्रभाव। बीज समान विकास परिस्थितियों में अंकुरित किए गए थे। अंकुरित रोपाई को कृषि इंजेक्ट किया गया था और उनमें से आधे को एक विकास कक्ष (25 डिग्री सेल्सियस 16 घंटे के उजाले / 22 सी 8 घंटे रात; 185 PAR) में ले जाया गया था और दूसरे आधे को ग्रीनहाउस (22-25 डिग्री सेल्सियस 16 घंटे दिन के उजाले / 22-25 डिग्री सेल्सियस 8 घंटे की रात; 350-400 PAR) में ले जाया गया था। यह तालिका संक्रमण की दर को प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट करती है, जिसकी गणना आरटी-पीसीआर द्वारा पुष्टि किए गए पौधों की संख्या से की जाती है, जो संबंधित वायरस से संक्रमित होने की पुष्टि करते हैं, जिन्हें कृषि इंजेक्ट किए गए पौधों की कुल संख्या से विभाजित किया जाता है। विकास कक्ष और ग्रीनहाउस स्थितियों के बीच संक्रमण क्षमता में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं है (FoMV दो पूंछ टी-टेस्ट पी = 0.08; SCMV दो पूंछ टी परीक्षण p = 0.96).

मक्का जीनोटाइप FoMV-EV FoMV-LES22 संयुक्त कुल
संक्रमित कुल % संक्रमित संक्रमित कुल % संक्रमित % संक्रमित
स्वीट कॉर्न 18 23 78% 15 23 65% 72%
MO47 7 22 32% 1 21 5% 19%
K55 1 15 7% 3 17 18% 13%
W64A 10 22 45% 8 20 40% 43%
MO17 0 16 0% 0 13 0% 0%
B73 10 18 56% 7 17 41% 49%
B101 12 21 57% 8 24 33% 44%
FR1064 4 4 100% 4 4 100% 100%
B104 10 22 45% 5 21 24% 35%
WCC22 2 7 29% 4 6 67% 46%
A188 0 3 0% 4 6 67% 44%

तालिका 2: एफओएमवी की संक्रमण दक्षता मक्का जीनोटाइप में निर्माण करती है। FoMV-EV और FoMV-LES22 को मक्का के 11 जीनोटाइप में शामिल किया गया था। इंजेक्शन के बाद, रोपाई को ग्रीनहाउस में ले जाया गया था। यह तालिका एक प्रतिशत के रूप में संक्रमण की दर का विवरण देती है, जिसकी गणना FoMV से संक्रमित पौधों की संख्या से की जाती है, जैसा कि आरटी-पीसीआर द्वारा पुष्टि की गई है, जिसे कृषि इंजेक्ट किए गए पौधों की कुल संख्या से विभाजित किया गया है। संक्रमण की संयुक्त कुल दर परीक्षण किए गए दोनों FoMV निर्माणों के लिए प्रत्येक जीनोटाइप के संक्रमण की औसत दर को दर्शाती है।

संयंत्र चरण 4-5 दिन पुराने पौधे 6-7 दिन पुराने पौधे संयुक्त कुल
लाक्षणिक कुल संयंत्रों % संक्रमित लाक्षणिक कुल संयंत्रों % संक्रमित % संक्रमित
FoMV-EV 42 72 58% 80 170 47% 53% (A)
FoMV-PDS 65 157 41% 66 184 36% 39% (B C)
FoMV-LES22 115 195 59% 144 292 49% 54% (A B)
FoMV-GFP 16 103 16% 37 217 17% 16% (C)
SCMV-GFP 10 95 11% 5 82 6% 8% (C)

तालिका 3: इंजेक्शन प्रयोगों का सारांश। यह तालिका अगस्त 2017 से अगस्त 2018 तक गोल्डन बैंटम स्वीट कॉर्न रोपाई पर किए गए इंजेक्शन प्रयोगों के सारांश का प्रतिनिधित्व करती है। पौधों का मूल्यांकन वायरल लक्षणों (FoMV-EV), लक्षणों (PDS और les22) या GFP प्रतिदीप्ति (GFP) को दृश्य (FoMV-EV, FoMV-PDS, और FoMV-LES22) या FluorCam (FoMV-GFP और SCMV-GFP) स्क्रीनिंग के माध्यम से शांत करने के लिए किया गया था। परिणाम 4-5 दिन पुराने पौधों और 6-7 दिन पुराने पौधों के लिए व्यक्तिगत रूप से दिखाए जाते हैं, साथ ही साथ सभी पौधों की उम्र में एक सारांश भी दिखाया जाता है। 4-5 दिन पुराने पौधों और 6-7 दिन पुराने पौधों (वन-वे एनोवा, एफ = 0.6513) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया है। वायरल निर्माण (Onaway ANOVA, F = <0.0001) के बीच एक अंतर पाया जाता है, जिसमें तुकी-क्रेमर HSD कनेक्टिंग लेटर्स रिपोर्ट का प्रतिनिधित्व करने वाले अक्षर होते हैं।

पूरक तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी प्राइमर नामों और अनुक्रमों को सूचीबद्ध करने वाली तालिका। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: एसिटोसिरिंगोन परीक्षण। (ए) प्रारंभिक एसिटोसाइरिंगोन परीक्षण, मॉक, एफओएमवी-ईवी, और एफओएमवी-एलईएस 22 इंजेक्शन वाले पौधों के लक्षणों की दरों की तुलना 200 μM एसिटोसाइरिंगोन (+) के साथ टीकाकरण निलंबन के बीच या एसिटोसाइरिंगोन (-) के बिना। (बी) एफओएमवी-एलईएस 22 के संक्रमण की दरों की तुलना के रूप में एसिटोसाइरिंगोन (-), 200 μM एसिटोसाइरिंगोन (+) के बिना टीकाकरण निलंबन के बीच आरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया है, और 200 यूएम एसिटोसाइरिंगोन को अंतिम निलंबन (++) में 200 यूएम एसिटोसिरिंगोन के अलावा बफर में पुन: निलंबन से 4 घंटे पहले जीवाणु संस्कृति में एसिटोसाइरिंगोन के 20 μM के अलावा। कुल मिलाकर, aceotysyringone उपचार (Oneway ANOVA, f = 0.5452) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया था। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: प्रतिदीप्ति इमेजिंग और agroinjected SCMV के आणविक सत्यापन और मक्का में heterologous प्रोटीन की अभिव्यक्ति. मक्का को एक संशोधित एससीएमवी निर्माण के साथ एग्रोइंजेक्टेड किया गया था जिसमें जीएफपी और नैनो लूसिफेरस (एनएलयूसी) दोनों के सीडीएस शामिल थे। (ए) फ्लोरकैम इमेजिंग का उपयोग जीएफपी की स्क्रीनिंग और पता लगाने के लिए किया गया था। बाईं ओर एक नकली इंजेक्शन संयंत्र है और दाईं ओर SCMV-NLucGFP इंजेक्शन संयंत्र है। (बी) पत्ती प्रोटीन अर्क एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया था और NLuc, GFP, और SCMV कोट प्रोटीन (सीपी) की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया गया था- जेल लूसिफेरस परख या immunoblot के रूप में संकेत के रूप में. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

Agrobacterium एक आवश्यक उपकरण है जो पौधों से संबंधित अनुसंधान में कई आणविक जीव विज्ञान तकनीकों की सुविधा प्रदान करता है। यह अध्ययन VIGS और VOX अनुप्रयोगों के लिए सीधे मक्का के ऊतकों में FoMV और SCMV वायरल वैक्टर को संक्रमित करने के लिए एक agroinjection प्रोटोकॉल प्रदान करता है। मुख्य लक्ष्य मोनोकोट फसल पौधों में अनुसंधान के लिए वायरस-आधारित प्रौद्योगिकियों की आसानी और उपयोगिता को बढ़ाना है। हालांकि कुछ वायरसों के लिए मक्का के प्रत्यक्ष कृषि-आयनीकरण की सूचना दी गई है, लेखकों को एक विस्तृत प्रोटोकॉल के बारे में पता नहीं है, और उन अध्ययनों में VIGS और VOX अनुप्रयोगों का कोई उदाहरण नहीं है19,22।

यह बताया गया है, और इस प्रोटोकॉल को विकसित करते समय पुष्टि की गई थी, कि इंजेक्शन स्थान agroinjection19 के माध्यम से एक प्रणालीगत वायरल संक्रमण को सफलतापूर्वक लॉन्च करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। लगातार पौधे पर अनुशंसित स्थान को इंजेक्ट करना सबसे बड़ा चर माना जाता है, क्योंकि मक्का के अंकुरों में मेरिस्टेम की सटीक स्थिति आंखों द्वारा लगभग अज्ञात है। पारस्परिक भिन्नता को कम करने के लिए, मेरिस्टेम के नीचे कुछ मक्का रोपाई को विच्छेदन करने के लिए इसके स्थान (चित्रा 3 सी) को बेहतर ढंग से कल्पना करने की सिफारिश की जाती है। कोलियोप्टिलर नोड के संबंध में मेरिस्टेम की स्थिति 4-7 दिनों की आयु के पौधों के लिए लगभग समान होनी चाहिए। इसके अतिरिक्त, एक रंगे हुए तरल के साथ इंजेक्शन का अभ्यास करना एक आसानी से दिखाई देने वाला प्रदर्शन प्रदान करता है कि "इनोकुलम" पत्ती को कैसे भरता है, और क्योंकि इंजेक्शन साइट को डाई के साथ चिह्नित किया जाता है, इंजेक्शन साइट की सटीकता की पुष्टि की जा सकती है (चित्रा 3 जी, एच)। मेरिस्टेमेटिक ऊतक कृषि इंजेक्शन के लिए सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं, लेकिन इस ऊतक में सीधे एग्रोबैक्टीरियम निलंबन को इंजेक्ट करने के परिणामस्वरूप अवांछनीय रूपात्मक प्रभाव होते हैं (चित्रा 6)19। क्षतिग्रस्त मेरिस्टेम वाले पौधे जीवित रहते हैं, लेकिन परिणामस्वरूप दोष अवांछनीय होते हैं, और इस प्रकार, इस ऊतक के प्रत्यक्ष इंजेक्शन से बचा जाना चाहिए।

ऐसे कई चर हैं जो एग्रोइंजेक्शन के माध्यम से एक प्रणालीगत वायरल संक्रमण के सफल प्रक्षेपण को प्रभावित कर सकते हैं क्योंकि तीन जटिल जैविक प्रणालियों (पौधे, वायरस और एग्रोबैक्टीरियम तनाव) को समन्वय में बातचीत करनी चाहिए। इस जटिल इंटरप्ले को मेरिस्टेमेटिक क्षेत्र की तेजी से विभाजित कोशिकाओं द्वारा सहायता प्रदान की जा सकती है, जिससे यह कृषि-इनोकुलेशन 19 के लिए एक आदर्श स्थान बन जाता है। एग्रोबैक्टीरियम तनाव को वायरल जीनोम को ले जाने वाले टी-डीएनए को वितरित करने के लिए पौधे के ऊतकों की कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम होना चाहिए, और वायरल प्रतिकृति और प्रणालीगत संक्रमण शुरू करने के लिए पौधे को वायरस के लिए अतिसंवेदनशील होना चाहिए। मक्का जीनोटाइप वायरस के प्रति उनकी संवेदनशीलता में भिन्न होते हैं (उदाहरण के लिए, Mo17 FoMV के लिए प्रतिरोधी है) या Agrobacterium उपभेदों, लेकिन अधिकांश जो परीक्षण किए गए थे, वे FoMV और SCMV (तालिका 1 और तालिका 2) दोनों के लिए अतिसंवेदनशील प्रतीत होते हैं। उदाहरण के लिए, इनब्रीड लाइन FR1064 और स्वीट कॉर्न किस्म गोल्डन बैंटम विशेष रूप से GV3101 Agrobacterium और FoMV-आधारित वैक्टर दोनों के लिए अतिसंवेदनशील हो सकती है।

वायरल संक्रमण के सटीक मूल्यांकन के लिए नमूना लीफ नंबर और आरटी-पीसीआर के लिए नमूने का समय महत्वपूर्ण है। यहां दिखाए गए उदाहरणों में, पत्ती की संख्या पहले गोल पत्ते (आमतौर पर "अंगूठे की पत्ती" के रूप में जाना जाता है) से शुरू करके और ऊपर की ओर गिनती करके निर्धारित की गई थी। पत्तियों का नमूना लिया गया था जब वे विस्तारित किए गए थे और अगली पत्ती उभरने लगी थी। हालांकि, जो पत्तियां नमूने के लिए इष्टतम हैं, वे उपयोग की जाने वाली वायरस प्रजातियों, विकास की स्थिति और मक्का जीनोटाइप के आधार पर भिन्न हो सकती हैं। इसलिए, पत्तियों और समय के संबंध में नमूना रणनीति को अनुकूलित करने के लिए एक नए वायरस सिस्टम पर इस प्रोटोकॉल को लागू करते समय एक प्रारंभिक समय पाठ्यक्रम प्रयोग की सिफारिश की जाती है।

उपयोग किया गया विशिष्ट निर्माण इस प्रोटोकॉल की दक्षता को काफी प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, खाली वैक्टर, FoMV-EV और SCMV-EV, और FoMV-PDS और FoMV-LES22, जिनमें दोनों छोटे आवेषण (क्रमशः 313 bp और 329 bp) होते हैं, आमतौर पर इन प्रयोगों में वायरल लक्षणों वाले पौधों के उच्चतम प्रतिशत का उत्पादन करते हैं (तालिका 1 और तालिका 2)। हालांकि, FoMV-GFP और SCMV-GFP में GFP ORF (720 bp) के बड़े आवेषण को ले जाने वाले पुनः संयोजक वायरस, खाली वेक्टर या जीन साइलेंसिंग निर्माणों के साथ इंजेक्ट किए गए पौधों की तुलना में बहुत कम संक्रमण दर थी। यह प्रवृत्ति वायरल जीनोम में बहिर्जात आनुवंशिक सामग्री की बढ़ती मात्रा के कारण वायरल फिटनेस पर नकारात्मक प्रभावों के कारण हो सकती है। कई अध्ययनों से पता चला है कि पौधे वायरल वैक्टर की सम्मिलित स्थिरता काफी हद तक सम्मिलित आकार और अनुक्रम 36,54,55,56,57 पर निर्भर करती है। इसके अतिरिक्त, उन पौधों के प्रतिशत में एक उल्लेखनीय अंतर था जो या तो FoMV या SCMV खाली वेक्टर के साथ टीकाकरण के बाद संक्रमित हो जाते हैं, यह सुझाव देते हुए कि SCMV (तालिका 1) के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त काम की आवश्यकता है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एक निर्माण विकसित करते समय कुछ समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि खंड का अनुक्रम और लंबाई दोनों दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं।

कुल मिलाकर, इस अध्ययन से पता चला है कि मक्का के अंकुरों का एग्रोइंजेक्शन दो अलग-अलग आरएनए प्लांट वायरस, कई वेक्टर कॉन्फ़िगरेशन और मक्का के 11 जीनोटाइप के लिए एक प्रभावी टीकाकरण विधि है। FoMV और SCMV के साथ यह काम, मक्का क्लोरोटिक मोटल वायरस (MCMV) या MSV के साथ इंजेक्शन का उपयोग करने वाले पिछले कार्यों के साथ जोड़ा गया है, यह इंगित करता है कि agroinjection आरएनए और डीएनए वायरस दोनों के संक्रामक क्लोन के साथ मक्का रोपाई को टीका लगाने के लिए उपयुक्त है19,20,21,22। इसके अतिरिक्त, यह काम आगे दिखाता है कि एग्रोइंजेक्शन VIGS और VOX वैक्टर के लिए एक व्यवहार्य विधि है और इसे चार दिनों के रूप में युवा पौधों पर लागू किया जा सकता है (तालिका 3)। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को मक्का जीवविज्ञानियों द्वारा आसानी से अनुकूलित किए जाने की उम्मीद है ताकि कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययनों में अनुसंधान की सुविधा के लिए क्षणिक जीन साइलेंसिंग (वीआईजीएस) और ओवरएक्सप्रेशन (VOX) शामिल हो। Agroinjection में वायरस-आधारित जीन संपादन दृष्टिकोण (VEdGE) को सुविधाजनक बनाने की क्षमता भी है जो अन्यथा पौधे के परिवर्तन पर निर्भरता से सीमित होगी, संभावित रूप से संपादन दक्षता के साथ-साथ पहुंच में सुधार 58,59,60। उचित एग्रोबैक्टीरियम तनाव को देखते हुए, मक्का जीनोटाइप, और वायरल वैक्टर को सोच-समझकर जोड़ा जाता है, एग्रोइंजेक्शन द्वारा टीकाकरण मक्का में क्षणिक जीन फ़ंक्शन विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनने की उम्मीद है।

Disclosures

शोधकर्ताओं के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी DARPA के कीट सहयोगियों के कार्यक्रम HR0011-17-2-0053 का समर्थन करने वाली एक टीम का हिस्सा है। इस काम को आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी प्लांट साइंसेज इंस्टीट्यूट, आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी क्रॉप बायोइंजीनियरिंग सेंटर, यूएसडीए निफा हैच प्रोजेक्ट नंबर 3808 और आयोवा फंड्स के राज्य द्वारा भी समर्थित किया गया था। केएलएच को आंशिक रूप से आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी प्रेडिक्टिव प्लांट फेनोमिक्स स्नातक प्रशिक्षण कार्यक्रम द्वारा राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (डीजीई # 1545453) द्वारा वित्त पोषित और यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर से कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल अनुदान संख्या 2019-07318 द्वारा भी आंशिक रूप से समर्थित किया गया था। अध्ययन और संग्रह, विश्लेषण और डेटा की व्याख्या के डिजाइन और पांडुलिपि लिखने में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी। इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, और निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि फंडर्स के विचारों को प्रतिबिंबित करें।

हम निक Lauter (USDA-ARS, एम्स, IA) मक्का inbred लाइनों के बीज के लिए धन्यवाद, क्रिश्चियन एफ मोंटेस-Serey (आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी) FoMV-GFP क्लोन बनाने के लिए, और टायलर ऑस्टिन (आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी) तकनीकी सहायता के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringes Fisher Scientific 14955450 alternatively, BD 309659
15 mL Falcon Tubes Corning Science 352059
1kb+ Ladder ThermoFisher Scientific 10787018 For assessing sizes of PCR products
25G x 5/8" PrecisionGlide Needles Becton, Dickinson and Company (BD) 305122
28°C Incubator For Agrobacterium
37°C Incubator For E. coli
Acetosyringone MilliporeSigma D134406 Optional
Agar MilliporeSigma A4800
Agarose GeneMate E-3120 For making gels to check for virus/insert stability
Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock
Bsu36I New England Biolabs R0524
cDNA Kit ThermoFisher Scientific K1672 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase
Chloroform Fisher Scientific C298 For RNA extraction
Cuvettes Fisher Scientific 14955127 1.5 mL
D-(+)-Glucose MilliporeSigma G7528 Alkaline Lysis
DH5alpha Competent E. coli Cells New England Biolabs C2987
DNA Ligase ThermoFisher Scientific K1422 Rapid DNA Ligation Kit
EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) Fisher Scientific S311 Alkaline Lysis
Ethanol For RNA extraction
Fertilizer Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate
Flat Inserts T.O. Plastics 715357C For germinating seeds in trays
Flats T.O. Plastics 710245C For germinating seeds in trays
FluorCam Photon Systems Instruments To assess maize plants for GFP expression before microscope
Fluorescence Microscope
Gel Electrophoresis Box
Gentamycin Sulfate Fisher Scientific BP918
Glacial Acetate Fisher Scientific A38 Alkaline Lysis
Glycerol Fisher Scientific G33-500 For saving frozen stocks of bacteria
Go-Taq, 2X Promega M7123
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144 for pHing solutions
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827 For RNA extraction
Kanamycin, Monosulfate Fisher Scientific BP906
Large Pots Kordlok SQL0550 5x5x4" or bigger.  For transplanting seedlings.
Luria Bertani (LB) Broth, Miller Himedia M1245
Magnesium Sulfate Heptahydrate Amresco 662
Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed American Meadows, West Coast Seeds
Maize Inbred Seed Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers.
Maxima H Minus Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific EP0753
MilliQ Elga Purelab Ultra
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit New England Biolabs T1030
PacI New England Biolabs R0547
Peters Excel 15-5-15 Fertilizer ICL Specialty Fertilizers G99140
Petri Dish, 95 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875714G
pH Meter
Potassium Acetate Fisher Scientific P171 Alkaline Lysis
Primers Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT
PspOMI New England Biolabs R0653
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491
Rifampicin EMD Millipore Corp 557303
Rnase A ThermoFisher Scientific 12091021 Alkaline Lysis
SbfI New England Biolabs R0642
Scale For weighing chemicals for media or buffers
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) Fisher Scientific BP166 Alkaline Lysis
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318 Alkaline Lysis
Soil Substrate SunGro Horticulture SS#1-F1P Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient
Spectrophotometer For measuring OD600
Sybr Safe, 10,000X Invitrogen S33102 For making gels to check for virus/insert stability
Thermocycler For PCR
Tris Base Fisher Scientific BP154 Alkaline Lysis
Trizol Ambion 15596018 For RNA extraction
Weigh Paper For weighing chemicals for media or buffers
XbaI New England Biolabs R0145

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जीव विज्ञान अंक 168 agroinoculation VIGS VOX मक्का वायरल वेक्टर FoMV SCMV
पुनः संयोजक Foxtail मोज़ेक वायरस और गन्ना मोज़ेक वायरस संक्रामक क्लोन के साथ इंजेक्शन द्वारा मक्का रोपाई के प्रत्यक्ष Agroinoculation
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Beernink, B. M., Holan, K. L., Lappe, R. R., Whitham, S. A. Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones. J. Vis. Exp. (168), e62277, doi:10.3791/62277 (2021).

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