Summary
En Agrobacterium-basert injeksjonsprotokoll (agroinjection) presenteres for inokulering av foxtail mosaikkvirus og sukkerrør mosaikkvirus i maisplanter. Inokulering på denne måten fører til virusinfeksjon, virusindusert genaktivering av markørgener og viral overekspressering av GFP.
Abstract
Agrobacterium-baserte inokulasjonsmetoder er mye brukt til å introdusere virale vektorer i plantevev. Denne studien beskriver en protokoll for injeksjon av maisplanter nær meristematisk vev med Agrobacterium som bærer en viral vektor. Rekombinante foxtail mosaikkvirus (FoMV) kloner utviklet for genaktivering og genuttrykk ble brukt til å optimalisere denne metoden, og bruken ble utvidet til å omfatte et rekombinant sukkerrør mosaikkvirus (SCMV) konstruert for genuttrykk. Genfragmenter eller kodesekvenser av interesse settes inn i et modifisert, smittsomt viralt genom som har blitt klonet inn i den binære T-DNA-plasmidvektoren pCAMBIA1380. De resulterende plasmidkonstruksjonene forvandles til Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101. Maisplanter så unge som 4 dager gamle kan injiseres nær coleoptilar-noden med bakterier som er resuspendert i MgSO4-løsningen . Under infeksjon med Agrobacterium overføres T-DNA som bærer det virale genomet til maisceller, noe som muliggjør transkripsjon av det virale RNA-genomet. Når det rekombinante viruset replikerer og sprer seg systemisk over hele planten, kan virale symptomer og fenotypiske endringer som følge av silencing av målgenene lesjon etterligne 22 (les22) eller fytoendesaturase (pds) observeres på bladene, eller uttrykk for grønt fluorescerende protein (GFP) kan oppdages ved belysning med UV-lys eller fluorescensmikrokopi. For å oppdage viruset og vurdere integriteten til innsatsen samtidig, blir RNA ekstrahert fra bladene på det injiserte anlegget, og RT-PCR utføres ved hjelp av primere som flankerer flere kloningssted (MCS) som bærer den innsatte sekvensen. Denne protokollen har blitt brukt effektivt i flere mais genotyper og kan lett utvides til andre virale vektorer, og dermed tilby et tilgjengelig verktøy for viral vektor introduksjon i mais.
Introduction
Infeksiøse kloner av mange plantevirus er utviklet for virusindusert genaktivering (VIGS), genovertrykk (VOX), og senest virusaktivert genredigering (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Etter hvert som nye virale konstruksjoner utvikles, må metoder for å infisere plantevev med disse modifiserte virusene også vurderes. Nåværende metoder for å starte virusinfeksjoner i planter inkluderer partikkelbombardement, gni-inokulering av in vitro RNA-transkripsjoner eller DNA-kloner, vaskulær punktering inokulasjon eller Agrobacterium tumefaciens inokulasjon (agroinokulasjon)5,12,13,14,15,16,17 . Hver av disse inokulasjonsmetodene har iboende fordeler og ulemper, som inkluderer kostnader, behov for spesialisert utstyr og gjennomførbarhet innenfor et gitt plantevirussystem. Metoder som bruker infiltrasjon eller injeksjon av Agrobacterium stammer som inneholder binære T-DNA konstruksjoner designet for å levere rekombinante virus er foretrukket, fordi de er enkle og rimelige. Imidlertid mangler detaljerte agroinokulasjonsmetoder for monokotyledonøse arter som Zea mays (mais).
En av de første rapportene om agroinokulasjon for viruslevering ble publisert i 1986, da genomet av blomkålmosaikkvirus (CaMV) ble satt inn i en T-DNA-konstruksjon, og den resulterende Agrobacterium som bærer denne konstruksjonen ble gnidd inn i rognplanter18. Ytterligere metoder for agroinokulasjon har siden blitt utviklet. For eksempel, når det gjelder foxtail mosaikkvirus (FoMV), kan Nicotiana benthamiana brukes som en mellomliggende vert for å generere viruspartikler i blader som gir en inoculum kilde6. Gni inokulering av mais ved hjelp av infiserte N. benthamiana blader er effektiv, rask og enkel, men bruk av en mellomliggende vert fungerer ikke for alle mais-infiserende virus. Sugarcane mosaikkvirus (SCMV), for eksempel, kan ikke infisere N. benthamiana, som krever bruk av alternative inoculum kilder for vektorer avledet fra dette viruset. I 1988 ble Agrobacterium som inneholder mais stripe virus (MSV), et DNA-virus, introdusert i maisplanter ved injeksjon (agroinjection), som demonstrerer Agrobacterium-baserte inokulasjonsmetoder er også nyttige for monocots19. Til tross for denne tidlige suksessen med agroinjection, har få studier som bruker denne teknikken i mais blitt publisert, og etterlater åpne spørsmål om anvendelsen av denne metoden for RNA-virus og VIGS-, VOX- og VEdGE-vektorer20,21,22. Imidlertid er bred bruk av agroinjeksjon i monocot arter lovende, fordi denne generelle tilnærmingen har blitt brukt i orkidé, ris og hvete23,24,25,26,27,28.
Denne protokollen ble optimalisert for FoMV og Agrobacterium stamme GV3101 og har også blitt brukt på en SCMV vektor. FoMV er et potexvirus med et bredt vertsområde som inkluderer 56 monokot- og dikotarter29. FoMV har en 6,2 kilobase (kb) positiv sans, enkeltstrenget RNA-genom som koder fem forskjellige proteiner fra fem åpne leserammer (ORFer) 30,31,32,33,34,35. FoMV ble tidligere utviklet til både en VIGS- og VOX-vektor for mais ved å inkorporere en smittsom klone på en T-DNA-plasmid ryggrad6,36,37. Det virale genomet ble modifisert for VIGS-applikasjoner ved å legge til et kloningssted (MCS1*) umiddelbart nedstrøms for frakkproteinet (CP) (figur 1A)36. For VOX- og VEdGE-applikasjoner ble CP-promotoren duplisert og et annet kloningssted (MCS2) ble lagt til for å muliggjøre innsetting av sekvenser av interesse mellom ORF 4 og CP (figur 1B)6. FoMV-vektoren som inneholder både MCS1 og MCS2 uten innsatser, er FoMV tom vektor (FoMV-EV) (figur 1).
SCMV er et ikke-relatert virus som er utviklet for VOX i mais38. Det er medlem av Potyviridae-familien, hvorav flere medlemmer er konstruert for å uttrykke fremmede proteiner i planta39,40,41,42,43,44. Vertsutvalget for SCMV inkluderer mais, sorghum og sukkerrør45,46, noe som gjør det verdifullt for genfunksjonelle studier i disse store avlingsplantene36,38. SCMV har en positiv følelse, enkeltstrenget RNA genom på ca 10 kb i lengde47,48. For å lage SCMV VOX-vektoren ble det veletablerte P1/HCPro-krysset brukt som innsettingssted for heteroologe sekvenser38. Dette kloningsstedet etterfølges av sekvenskoding av et NIa-Pro protease spaltingssted, noe som fører til produksjon av proteiner uavhengig av SCMV polyprotein (figur 1C).
T-DNA-plasmider som bærer smittsomme cDNA av disse rekombinante virusene har blitt forvandlet til Agrobacterium stamme GV3101. GV3101 er en nopalin type stamme, som er kjent for å kunne overføre T-DNA til monokotyledonøse arter, inkludert mais26,28,49. I tillegg har tidligere agroinjeksjonsstudier brukt stammene C58 eller dets derivat GV3101, samt19,20,22,27.
Tre markørgener ble brukt i utviklingen av denne protokollen: to for genaktivering og ett for genuttrykk. Et 329 basepar (bp) fragment fra maisgenlesjonen etterligner 22 (les22, GRMZM2G044074) ble brukt til å konstruere silencingvektoren FoMV-LES22. Når les22 er taus i mais, vises små, runde flekker av nekrotiske celler langs vaskulaturen av blader som ekspanderer og samles i store områder av nekrotisk bladvev50. FoMV-PDS, som inneholder et fragment på 313 bp fra sorghum-genet fytoendesaturase (pds, LOC110436156, 96% sekvensidentitet til mais pds, GRMZM2G410515), induserer silencing av pds i mais, noe som resulterer i små striper av fotobleached celler langs vaskulaturen av bladene som forlenger over tid5. Den intakte kodesekvensen for grønt fluorescerende protein (GFP) ble brukt til å demonstrere proteinuttrykk for både FoMV (FoMV-GFP) og SCMV (SCMV-GFP). GFP-uttrykk i bladene er vanligvis mest påviselig ved 14 dager etter inokulasjon (DPI)6. Selv om det har vært tidligere studier som bruker agroinjeksjon av virale vektorer i mais, har disse forsøkene bare vist at agroinjeksjon kan lette virusinfeksjon fra en smittsom klone i maisplanter og ikke utvide til rekombinante virus designet for VIGS- eller VOX-applikasjoner19,20,21,22. Protokollen som presenteres her bygger på tidligere agroinjeksjonsmetoder, spesielt Grismley et al.19. Totalt sett er denne agroinjeksjonsmetoden kompatibel med VIGS- og VOX-vektorer, krever ikke spesialisert utstyr eller alternative verter som inokulumkilder, og reduserer den totale tiden og kostnadene som kreves for å sette opp og utføre inokulasjoner i forhold til andre vanlige metoder som krever biolistikk eller in vitro transkripsjon. Denne protokollen vil legge til rette for funksjonelle genomikkstudier i mais med applikasjoner som involverer VIGS, VOX og VEdGE.
Protocol
1. Plasmid konstruksjon
MERK: Denne protokollen kan brukes på andre virale vektorer eller Agrobacterium stammer, men dette kan påvirke den generelle suksessen av inokulering ved agroinjection. Utfør alltid bakteriell inokulering og plating trinn i en laminær strømningshette.
- BrennMV-silencing konstruksjon
MERK: Luria-Bertani (LB) media (Miller) brukes til alle medier med mindre annet er spesifisert. Flytende LB er laget ved å suspendere 25 g granulat i 1000 ml destillert vann og autoklavering i 15 minutter ved 121 °C. Solid LB media er tilsvarende laget med tillegg av 1,5% agar før autoklavering. Antibiotika tilsettes etter at LB er avkjølt til ~ 60 °C, og oppløsningen helles i 95 x 15 mm Petri-plater. De antibiotiske konsentrasjonene som skal brukes er som følger: rifampicin (rif) ved 25 μg/ml, gentamycin (gent) ved 50 μg/ml og kanamycin (kan) ved 50 μg/ml.- PCR forsterker fragmenter fra maisgenet for å bli stilnet (f.eks. les22 eller pds) ved hjelp av en fremoverprimer med et PacI-begrensningssted og en omvendt primer med et XbaI-begrensningssted. Dette vil muliggjøre ligasjon av genfragmentene i MCS1* av FoMV-pCAMBIA1380 binær vektor i antisense orientering.
MERK: Sett opp PCR ved hjelp av en dna-polymerase med høy kvalitet, fremover og bakoverprimere på 10 μM hver, plasmid DNA-mal og vann, etter DNA-polymerasespesifikasjonene. Forsterke i 35 sykluser, ved hjelp av en glødetemperatur i henhold til DNA-polymerase og primer smeltetemperatur (Tm), og en 30 s forlengelse per kilobase som skal forsterkes. - Utfør PCR-rensing ved hjelp av et PCR-rensesett i henhold til settspesifikasjonene.
- Fordøye det rensede PCR-produktet og FoMV-EV med begrensningsenzymene XbaI og PacI. Bruk 1 μg plasmid eller hele det rensede PCR-produktet, 2 μL 10x buffer, 1 μL restriksjonsenzym, og tilsett vann for å lage et 20 μL endelig reaksjonsvolum. Inkuber i henhold til enzymspesifikasjon.
- Ligate det fordøyde PCR-produktet og FoMV-EV sammen med T4 DNA-ligaer i henhold til produsentens protokoll.
- Forvandle den ligaterte plasmiden til DH5α kjemisk kompetente E. coli-celler ved hjelp av varmesjokkmetoden.
- Tine celler på is og tilsett 3 μL plasmid til røret. Inkuber på is i 30 min, deretter varmesjokk i 30 s ved 42 °C.
- Plasser på is i 5 min, tilsett 200 μL super optimal kjøttkraft med katabolsk undertrykkelse (SOC) og la E. coli-celler gjenopprette i SOC-medier i 1 time ved 37 °C med risting ved 225 o/min.
- Plate på kanamycin selektiv LB media og inkubere ved 37 °C over natten.
- Kontroller koloniene for nøyaktige kloner ved sangersekvensering ved hjelp av primerne FM-5840F og FM-6138R (supplerende tabell 1). Send inn 250 ng plasmid DNA til et anlegg som skal utføre Sanger-sekvensering. For dette eksperimentet ble prøver sendt til Iowa State University DNA Core Facility.
- Inokuler 2 ml flytende LB med den valgte kolonien og inkuber ved 37 °C over natten med risting ved 225 o/min. Trekk ut plasmid DNA fra nattkulturen gjennom et alkalisk lysis plasmid DNA-preparat52.
- Forvandle plasmid DNA til Agrobacterium stamme GV3101 celler ved hjelp av fryse-tine metoden. La 100 μL av kjemisk kompetente celler tine på is, tilsett 1-5 μL plasmid og inkuber på is i 30 minutter. Plasser i flytende nitrogen i 1 min, og inkuber deretter ved 37 °C i 3 minutter. Tilsett 1 ml SOC, la det komme seg i 2-3 timer ved 28 °C med risting, tallerken på rif, gent og kan selektiv LB-medier og inkubere ved 28 °C i 2 dager.
- Skjermkolonier for tilstedeværelse av innsats med koloni PCR. Velg en enkelt bakteriell koloni og bland den i 30 μL vann. Sett opp en PCR-reaksjon ved å legge til 12,5 μL polymerase master mix, 1,25 μL av hver 10 μM primer, FM-5840F og FM-6138R, 3 μL av bakteriell kolonifjæring, og vann til et sluttvolum på 25 μL. Syklus 35 ganger med en glødetemperatur på 64 °C og en forlengelsestid på 1 (min. 1 min for hver kb forsterket).
- Inokuler 2-5 ml flytende LB (rif, gent, kan) med riktig Agrobacterium koloni. La den vokse over natten ved 28 °C med risting ved 225 o/min.
- Bland nattkulturen med en 50% glyserolløsning 1:1. Oppbevars ved -80 °C for langtidsoppbevaring.
- PCR forsterker fragmenter fra maisgenet for å bli stilnet (f.eks. les22 eller pds) ved hjelp av en fremoverprimer med et PacI-begrensningssted og en omvendt primer med et XbaI-begrensningssted. Dette vil muliggjøre ligasjon av genfragmentene i MCS1* av FoMV-pCAMBIA1380 binær vektor i antisense orientering.
- FoMV-uttrykkskonstruksjon
- PCR forsterker kodingssekvensen av interesse, inkludert start og stopp codons (f.eks. GFP) som beskrevet i 1.1.1, og legger til et Bsu36I-begrensningssted på fremoverprimeren og et PspOMI-begrensningssted på den omvendte primeren for å muliggjøre retningskloning i forstandens orientering til MCS2.
- Utfør PCR-rensing ved hjelp av et PCR-rensesett i henhold til settets spesifikasjoner.
- Fordøye PCR-produktet og FoMV-EV med begrensningsenzymene Bsu36I og PspOMI, som beskrevet i 1.1.3.
- Ligate det fordøyde PCR-produktet og FoMV-EV sammen med T4 DNA-ligaer i henhold til produsentens protokoll.
- Forvandles til DH5α kjemisk kompetente E. coli-celler ved hjelp av varmesjokkmetoden som beskrevet i 1.1.5. Plate på kanamycin selektiv LB media og inkubere ved 37 °C over natten.
- Kontroller koloniene for nøyaktige kloner ved Sanger-sekvensering som beskrevet i 1.1.6 ved hjelp av primerne 5AmuS2 og 5AmuA2 (Supplerende tabell 1).
- Inokuler 2 ml flytende LB med den valgte kolonien og inkuber ved 37 °C over natten med risting ved 225 o/min. Trekk ut plasmid DNA fra nattkulturen gjennom et alkalisk lysis plasmid DNA-preparat52.
- Forvandle plasmid DNA til Agrobacterium stamme GV3101 kjemisk kompetente celler ved hjelp av fryse-tine metoden som beskrevet i 1.1.8. Plate på rif, gent, og kan selektiv LB media og inkubere ved 28 °C i 2 dager.
- Skjermkolonier for tilstedeværelse av innsats med koloni PCR ved hjelp av primerne 5AmuS2 og 5AmuA2.
- Inokuler 2-5 ml flytende LB (rif, gent, kan) med riktig Agrobacterium koloni. Rist over natten ved 225 o/min ved 28 °C.
- Bland nattkulturen med en 50% glyserolløsning 1:1. Oppbevars ved -80 °C for langtidsoppbevaring.
- Konstruksjon av SCMV-uttrykk
- PCR forsterker genet av interesse (f.eks. GFP) unntatt stop codon som beskrevet i 1.1.1, inkludert et PspOMI fordøyelsessted på fremoverprimeren og et SbfI fordøyelsessted på baksiden primer for å muliggjøre retningskloning inn i SCMV-pCAMBIA1380 binær vektor.
MERK: Innsatsen må klones i ramme med viral polyprotein. - Utfør PCR-rensing ved hjelp av et PCR-rensesett i henhold til settets spesifikasjoner.
- Fordøye PCR-produktet og SCMV-EV med begrensningen enzymer PspOMI og SbfI, som beskrevet i 1.1.3.
- Ligate det fordøyde PCR-produktet og SCMV-EV sammen med T4 DNA-ligaer i henhold til produsentens protokoll.
- Forvandle produktet til DH5α kjemisk kompetente E. coli-celler ved hjelp av varmesjokkmetoden som beskrevet i 1.1.5. Plate på kan selektiv LB media og inkubere ved 37 °C over natten.
- Skjermkolonier for nøyaktige kloner av Sanger-sekvensering som beskrevet i 1.1.6 ved hjelp av primerne SC-745F og HCProR1 (Supplerende tabell 1).
- Inokuler 2 ml flytende LB med den valgte kolonien og inkuber ved 37 °C over natten med risting ved 225 o/min. Trekk ut det plasmide DNA-et fra nattkulturen gjennom et alkalisk lysis plasmid DNA-preparat52.
- Forvandle det plasmide DNA-et til Agrobacterium-stammen GV3101 kjemisk kompetente celler ved hjelp av fryse-tine-metoden som beskrevet i 1.1.8. Plate på rif, gent, og kan selektiv LB media og inkubere ved 28 °C i 2 dager.
- Skjermkolonier for tilstedeværelse av innsats med koloni PCR med primerne SC-745F og HCProR1 som beskrevet i 1.1.9.
- Inokuler 2-5 ml flytende LB (rif, gent, kan) med riktig Agrobacterium koloni. Rist over natten ved 225 o/min ved 28 °C.
- Bland nattkulturen med en 50% glyserolløsning 1:1. Oppbevars ved -80 °C for langtidsoppbevaring.
- PCR forsterker genet av interesse (f.eks. GFP) unntatt stop codon som beskrevet i 1.1.1, inkludert et PspOMI fordøyelsessted på fremoverprimeren og et SbfI fordøyelsessted på baksiden primer for å muliggjøre retningskloning inn i SCMV-pCAMBIA1380 binær vektor.
2. Frøplante forberedelse
- Plante 1-2 maisfrø ('Golden Bantam' søte mais, FR1064, B73, etc.) i torvbasert voksende medium i små innsatser plassert inne i skuffer 4-7 dager før injeksjon. Plasser i et vekstkammer under 16 timer dager ved 25 °C og 8 h netter ved 22 °C (~185 fotosyntetisk aktiv stråling (PAR)) eller i et drivhus under 16 timer ved 22-25 °C og 8 h netter ved 22-25 °C( 350-400 PAR).
MERK: Følsomheten for Agrobacterium varierer mellom maisgenotyper, noe som påvirker suksessraten. I tillegg kan noen virale vektorer være uforenlige med visse mais genotyper. - Vann regelmessig og gjødsle en gang i uken med 15-5-15 flytende gjødsel på 330 deler per million (PPM).
3. Fremstilling av Agrobacterium
- En dag før injeksjonen, forberede LB flytende medier med riktig antibiotika (rif, gent, kan) og inokulere med Agrobacterium stammen bærer ønsket viral konstruksjon. Det anbefales å legge til 20 μL glyserolbestand i 50 ml LB, som skal gi nok bakteriekultur til å inokulere >100 planter og kan skaleres opp eller ned etter behov.
MERK: Forbered nok inokulum til å ha en endelig mengde bakteriell suspensjon på minst 1 ml ved en optisk tetthet på 600 nm (OD600) på 1,0 for hver 4-5 plante. - Rist ved 225 o/min ved 28 °C i 24 timer.
- Pelletsbakterier i 10 min ved 4000 x g ved romtemperatur. Kast supernatanten.
- Vask pelletsen grundig med 1 ml deionisert (DI) vann ved pipettering eller skånsom virvel.
- Gjenta trinn 3.3 til pelletsbakterier.
- Resuspend pellet i 1 ml 10 mM MgSO4 oppløsning ved pipettering eller skånsom virvel.
- Eventuelt, tilsett 200 μM acetosyringon til løsningen. Selv om det brukes ofte, forbedrer acetosyringon bare transformasjonsevnen til noen Agrobacterium-stammer . Forfatterne har ikke funnet ut at tilsetning av acetosyringon påvirker effektiviteten i denne protokollen (Supplerende tabell 2).
MERK: 10 mM MgSO4-oppløsning kan lages av en 1 M lagerløsning med en pH på 6,3 lagret ved romtemperatur. Løsningen vil sannsynligvis ikke kreve pH-justering.
- Eventuelt, tilsett 200 μM acetosyringon til løsningen. Selv om det brukes ofte, forbedrer acetosyringon bare transformasjonsevnen til noen Agrobacterium-stammer . Forfatterne har ikke funnet ut at tilsetning av acetosyringon påvirker effektiviteten i denne protokollen (Supplerende tabell 2).
- Mål OD600 av prøven med et spektrofotometer og fortynn til 1,0 OD600 med 10 mM MgSO4-oppløsning .
MERK: Dette er et trygt stoppested. Bakteriell suspensjon kan holdes ved romtemperatur i opptil 5 timer før injeksjon.
4. Injeksjon
MERK: Maisplanter fra 4-7 dager gamle kan brukes til injeksjon. Plantevekstraten påvirkes sterkt av vekstforhold, mengde PAR (dvs. høyere PAR i drivhus enn i vekstkammeret), og genotype, blant annet som kan være vanskelig å kontrollere under drivhusforhold. Planter kan injiseres så unge som 4 dager gamle når de er 2-3 cm høye uten blader utvidet og så gamle som 7 dager når det nederste avrundede spissbladet utvides. Suksessraten for denne inokulasjonsmetodene faller raskt når planter eldes utover 7 dager etter sådd. Injeksjonsstedet er det samme uansett alder på plantene.
- Bruk vernebriller, injiser bakteriell suspensjon i plantene 2-3 mm over coleoptilar-noden ved hjelp av en 25G x 5/8" nål festet til en 1 ml engangssprøyte.
MERK: Coleoptilar-noden er der kronerøtter til slutt vil danne seg. Dette er den laveste noden på anlegget. Vanligvis vil det være en fargeendring fra grønt til hvitt på og under noden. Injeksjonsstedet ligger like over meristem. Dissekering av noen få frøplanter på dette stadiet kan bidra til å visualisere plasseringen av meristem og følgelig riktig injeksjonssted. - Påfør forsiktig trykk på sprøyten til suspensjonen fyller opp coleoptilen eller er synlig i, avhengig av vekststadiet av plantene. Dette er ca. 100-200 μL suspensjon.
MERK: Hvis det er vanskelig å injisere suspensjonen i frøplanten, kan injeksjonsstedet være for lavt. Moderat trykk er alt som bør være nødvendig for å injisere suspensjonen. - Injiser alle frøplanter, skiftende sprøyter og nåler for hver konstruksjon.
5. Fortsatt plantepleie
- Transplanter de injiserte plantene til 13 x 13 x 15 cm eller større potter når de er 7-8 dager gamle.
- Opprettholde vekstforhold (16 t fotoperiod og gjødsling en gang i uken).
6. Bekreftelse av infeksjon (Fenotypisk og RT-PCR)
- Fenotypisk scorer planter mellom 14-21 DPI. Lesjoner fra silencing kontrollgenene lesjon etterligne 22 eller fytoen desaturase kan lett ses på bladene og er forskjellig fra FoMV symptomer. GFP-uttrykk kan påvises via fluorescerende mikroskopavbildning eller annen UV-lysavbildning.
MERK: Noen konstruksjoner/virale vektorer kan ta lengre tid å vise symptomer eller kan ikke vise noen symptomer i det hele tatt. Høye lysforhold øker fenotypene forårsaket av silencing lesjon etterligne 22 og fytoen desaturase. Lesjoner kan være mindre synlige eller fraværende hvis planter opprettholdes under lavere lysforhold som et vekstkammer, men den faktiske infeksjonsraten som bestemmes av RT-PCR, bør ikke påvirkes (tabell 1). - For å bekrefte infeksjon molekylært, prøveblad 6 mellom 14-21 DPI og ekstrakt total RNA ved hjelp av en fenol-kloroform ekstraksjon i henhold til produsentens instruksjon.
- Bruke den utpakkede RNA som en mal for å generere førstestrengs cDNA.
- Sett opp cDNA-reaksjonen med opptil 5 μg totalt RNA, 1 μL tilfeldige heksamerprimere, 1 μL oligo (dT)18 primere, 1 μL dNTPer, 1 μL omvendt transkripsjonase og vann for et sluttvolum på 14,5 μL.
- Bruk primere designet for viral konstruksjon og cDNA som mal, utfør PCR på hver prøve for å bekrefte virusinfeksjon og bestemme integriteten til genet eller genfragmentet av interesse som beskrevet i 1.1.1, bortsett fra redusere sykluser til 25 for FoMV og 30 for SCMV for å unngå falske positiver.
- For FoMV-silencingkonstruksjoner, bruk primere FM-5840F og FM-6138R for å forsterke over MCS1*, som inneholder maisgenfragmentet. For FoMV-uttrykkskonstruksjoner bruker du primere 5AmuS2 og 5AmuA2 til å forsterke på tvers av MCS2, som inneholder det innsatte genet.
- For SCMV-uttrykkskonstruksjoner bruker du primerne SC745-F og HCProR1 til å forsterke på tvers av MCS, som inneholder det innsatte genet (tilleggs figur 3).
- For et endogent kontrollgen, bruk primere ZmActS og ZmActA, som forsterker et mRNA-fragment av mais actin (GRMZM2G126010) eller primere ZmUbiF og ZmUbiR, som forsterker et mRNA-fragment av mais polyubiquitin (GRMZM2G409726_T01).
- Visualiser PCR-produktet på en 1% agarose gel som inneholder en nukleinsyreflekk for å bestemme tilstedeværelsen eller fraværet av virus og gen- eller genfragment.
Representative Results
Målet med denne studien var å utvikle en enkel protokoll for direkte innføring av rekombinante virus utviklet for genaktivering eller genuttrykk i maisplanter (figur 2). Virusvektorene som bærer innsatser er designet og klonet ved hjelp av standard molekylærbiologiske teknikker. Genfragmenter for silencing settes inn i MCS1* i FoMV-EV, og kodesekvenser for uttrykk settes inn i FoMV-EV på MCS2 eller SCMV-EV hos MCS. De resulterende plasmidene overføres til Agrobacterium-stammen GV3101. Deretter injiseres maisplanter innen en uke eller mindre etter planting. To uker etter injeksjon kan planter vurderes både fenotypisk og molekylært for virusinfeksjon, genaktivering og genuttrykk.
Maisplanter dyrkes i et torvbasert medium i 4-7 dager. På dette stadiet er skytingen apical meristem like over coleoptilar-noden (figur 3A). Etter at coleoptilen har utvidet seg 2-3 centimeter eller opptil 7 dager etter sådd, injiseres planter 2-3 mm over coleoptilar-noden (figur 3B-F). Omtrent 12 dager etter injeksjon vil planter begynne å vise silencing fenotyper på bladene sine, ofte observert i nærheten av vaskulært vev, og disse lesjonene er visuelt forskjellig fra FoMV virale mosaikk symptomer (Figur 4). Både tilstedeværelsen av FoMV og silencing av målgener kan påvises injiserte planter (figur 5). GFP-uttrykk kan påvises med 2 uker etter injeksjon under et fluorescerende mikroskop og er sterkest på blader 5-7 (figur 6). Når det observeres under et fluorescensavbildningssystem, kan GFP-uttrykk fra FoMV visualiseres som mange små, punktlige områder av fluorescens fordelt over blader i nærheten av vaskulært vev, mens GFP-uttrykk fra SCMV består av større flekker (figur 6, supplerende figur 1). Selv om viral mosaikk symptomer er ofte synlige på planter infisert med FoMV silencing konstruksjoner, planter injisert med GFP uttrykk konstruksjoner som er vellykket uttrykke GFP ofte ikke har disse symptomene. Som et resultat kan en plante uten synlige symptomer fortsatt være positiv for virus og GFP-uttrykk. I tillegg bør punktering av meristem under agroinjeksjonsprosedyren unngås, da dette kan forårsake morfologiske feil, men de resulterende plantene overlever og er ofte symptomatiske (figur 7).
Selv om denne protokollen opprinnelig ble utviklet ved hjelp av søt mais, kan flere mais innavlslinjer lykkes inokulert med FoMV genaktiveringskonstruksjoner ved hjelp av agroinjection. Fr1064 og B73 har for eksempel vanligvis høye forekomster av virusinfeksjon (tabell 2). Spesielt hadde Mo17, en linje med kjent genetisk resistens mot FoMV, en 0% infeksjonseffektivitet som forventet36,53. I tillegg påvirker konstruksjonen som brukes smitteeffektivitet (tabell 3). Når det gjelder FoMV, har FoMV-EV og FoMV-LES22 vanligvis den høyeste infeksjonseffektiviteten på henholdsvis 53% og 54%. FoMV-PDS har en litt lavere effektivitet på 38%, og FoMV-GFP er den laveste på 17%. SCMV-GFP har en infeksjonseffektivitet på 8%. Disse prosentene er gjennomsnitt over flere eksperimenter. individuelle eksperimenter kan ha høyere eller lavere infeksjonseffektivitet.
Figur 1: Skjematiske representasjoner av FoMV- og SCMV T-DNA-klonene som brukes til agroinjeksjon i mais. FoMV-vektoren inneholder to kloningssteder (MCS1* og MCS2). Den tomme vektoren, FoMV-EV, er 7 269 bp og inneholder ingen innsatser i noen av MCS-ene. (A) Genaktivering ved hjelp av FoMV-vektoren kan oppnås ved å sette inn genfragmenter i MCS1*, utpekt som sekvens av interesse (SOI), vanligvis i anti-sense orientering. (B) Genuttrykk ved hjelp av FoMV-vektoren kan oppnås ved å sette inn gen-ORFer i MCS2 i forstandens orientering, utpekt som SOI. (C) SCMV-vektoren ble konstruert for å ha en MCS mellom P1 og HCPro. Den tomme vektoren, SCMV-EV, er 11 015 bp og inneholder ingen innsatser i MCS. Gen-ORFer satt inn i MCS som er i ramme med SCMV polyprotein vil bli uttrykt som proteiner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk oppsummering av agroinjeksjonsprotokollen. (A) Klone SOI, enten en CDS eller et genfragment, til virusvektoren og forvandles til Agrobacterium-stammen GV3101. (B) Plante mais og vokse i 4-7 dager. (C) Vokse GV3101 i flytende kultur over natten ved 28 °C. (D) Forbered bakteriell injeksjonsvæske, suspensjon. (E) Injiser frøplanter 2-3 mm over coleoptilar-noden med 100-200 μL suspensjon. (F) Transplanter frøplanter når de er 7 dager gamle til større potter og vokser i 2-3 uker til det femte bladet er synlig. Fenotype om ønskelig. (G) Prøveblad 5 og trekk ut RNA. (H) Lage cDNA og gjennomføre PCR for å forsterke virus/SOI. (I) Kjør på gel for kvalitativ analyse for å bestemme tilstedeværelse/ fravær av virus og en avkortet eller intakt SOI. Denne figuren ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Agroinjection metode for å inokulere frøplanter like over coleoptile noden. (A) 4-5-dagers gamle planter. Coleoptile er fullt utvidet, og det første sanne bladet kan være delvis synlig, men er ikke unfurled. (B) 6-7-dagers gamle planter. Det første bladet kan utvides, men ingen krager vil være synlige. Det andre bladet vil også være synlig og kan begynne å løsne på dette stadiet. (C) Disseksjon av 6-7-dagers gamle planter som viser plasseringen av skytens apikale meristem i forhold til coleoptile-noden. (D) Injeksjon av 4-5-dagers gamle planter. (E) Injeksjon av 6-7-dagers gamle planter. (F) Injeksjon av 6-7-dagers gamle planter ved hjelp av en fargestoffløsning, som viser farget inokulum som kommer ut av plantens hore. (G) Nærbilde av injeksjonssted for 6-7-dagers gamle planter i forhold til coleoptile noden. (H) Nærbilde av en 6-7-dagers gammel plante etter injeksjon, som viser farget inoculum i plantens hore. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Symptomer på silencingkontrollgenene som brukes i agroinjeksjonsforsøkene. (A) Et blad fotografert ved 17 PPT etter at anlegget ble injisert med FoMV-LES22. FoMV-LES22 har en 329 bp innsats av 3 ' CDS av lesjonen etterligne 22 mais gen i antisense orientering. Silencing resulterer i akkumulering av en giftig metabolitt som igjen forårsaker nekrotiske lesjoner som først vises som striper langs vaskulaturen og vokser til større flekker som vist her. (B) Et blad fotografert ved 17 DPI etter at anlegget ble injisert med FoMV-PDS. FoMV-PDS har en 313 baseparinnsats av 3' CDS av sorghum fytoenavmeterturasegenet i antisensorientering. Silencing av pds i mais forårsaker en systemisk fotobleaching fenotype som starter som små, tynne striper langs vaskulaturen som vokser til lengre striper langs lengden av bladet som vist her. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: qRT-PCR av planter injisert med FoMV genaktiveringskonstruksjoner. Bekreftelse av systemisk FoMV-infeksjon og genaktivering indusert av FoMV-LES22- og FoMV-PDS-konstruksjonene levert via agroinjeksjon i søte maisplanter (Golden x Bantam). (A) Gelbildene viser RT-PCR-analyser som bekrefter tilstedeværelsen av FoMV-MCS1* tom vektor (315 bp amplicon) og FoMV-PDS (625 bp amplicon) i blad 6 av fem individuelle planter. PCR-primerne som brukes produserer en amplikon som spenner over MCS1*. Maisgenet actin (Zm-Actin) amlikon fungerer som referansegenet. Stolpediagrammet representerer de relative uttrykksverdiene qRT-PCR for pds-uttrykket i blad 6 etter 37 dager etter inokulering (PPT) ved agroinjeksjon med FoMV-MCS1* eller FoMV-PDS. Undertrykkelse av pds kan påvises i hver av de fem biologiske replikeringene (p = 0,003; post hoc Dunnetts test; feilfelt indikerer standardavvik (SD) av tre tekniske replikeringer). (B) Gelbildene viser RT-PCR-analyser som bekrefter tilstedeværelsen av FoMV-MCS1* (315 bp amplicon) i blad 6 av fem individuelle planter. FoMV-LES22 (625 bp amplicon) ble påvist i blad 6 vev (prøver FoMV-LES22 1-5, 38 DPI) og blad 4 (prøver FoMV-LES22 6-10, 20 DPI) for ti individuelle planter. Zm-Actin-amfinen fungerte som referansegen. Stolpediagrammet representerer qRT-PCR relative uttrykksverdier for les22-uttrykk i maisvev ved agroinjeksjon av FoMV-MCS1* eller FoMV-LES22 virale konstruksjoner. Les22 undertrykkelse skjer i 9 av 10 biologiske replikeringer (p = <0.0001; post hoc Dunnetts test; feilfelt indikerer SD for tre tekniske replikeringer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Fenotyper av ulike konstruksjoner som brukes i agroinjeksjonsforsøkene. Alle avbildede planter ble injisert da de var 6-7 dager gamle med Agrobacterium-stammen GV3101 som bærer de angitte konstruksjonene. Bilder ble tatt ved 16 PPT. (A) Bladsymptomer på pCAMBIA1380 (tom plasmid ryggrad), FoMV-EV, FoMV-GFP og SCMV-GFP i synlig lys, under FluorCam-klorofyllfilteret ved 250 μs eksponering, og under FluorCam GFP-filteret ved 10 ms eksponering. (B) Fluorescerende mikroskopibilder av bladene av mock-behandlet (injiseres kun med MgSO4-løsning ), FoMV-EV og FoMV-GFP injiserte planter. Kanalene DIC, DsRed og EGFP vises og ble begge tatt med 1500 ms eksponering. Skalalinjen er 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. Morfologiske effekter av injeksjon. Et eksempel på de mer alvorlige morfologiske effektene som kan oppstå fra direkte injeksjon i meristematisk vev. Denne skaden kan føre til "makulering" av bladene og splitting av stammen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Virus | Vekstforhold | Genotype | Infiserte planter | Totalt antall planter | % Infeksjon | Gj.snittlig % av infeksjon |
| FoMV-EV | Vekstkammeret | Søt mais | 22 | 23 | 96% | 97% |
| B73 | 18 | 18 | 100% | |||
| B104 | 20 | 21 | 95% | |||
| Drivhus | Søt mais | 20 | 23 | 87% | 89% | |
| B73 | 17 | 18 | 94% | |||
| B104 | 16 | 19 | 84% | |||
| SCMV-EV | Vekstkammeret | Søt mais | 14 | 21 | 67% | 47% |
| B73 | 5 | 18 | 28% | |||
| B104 | 10 | 21 | 48% | |||
| Drivhus | Søt mais | 14 | 23 | 61% | 49% | |
| B73 | 0 | 19 | 0% | |||
| B104 | 19 | 22 | 86% |
Tabell 1: Effekt av drivhus- og vekstkammerforhold på agroinjeksjonsinokulasjonseffektivitet. Frø ble spiret under identiske vekstforhold. Germinerte frøplanter ble agroinjisert og halvparten av dem ble flyttet til et vekstkammer (25 ° C 16 h dagslys / 22C 8 h natt; 185 PAR) og den andre halvparten ble flyttet til et drivhus (22-25 ° C 16 h dagslys / 22-25 ° C 8 t natt; 350-400 PAR). Denne tabellen rapporterer infeksjonsraten i prosent, beregnet ut fra antall planter bekreftet av RT-PCR for å bli smittet med det respektive viruset delt på det totale antallet agroinjiserte planter. Det er ingen statistisk forskjell i infeksjonseffektivitet mellom vekstkammer og drivhusforhold (FoMV to tailed t-test p = 0,08; SCMV to tailed t-test p = 0,96).
| Maize Genotype | FoMV-EV | FoMV-LES22 | Kombinert total | ||||
| Infisert | Total | % infisert | Infisert | Total | % infisert | % infisert | |
| Søt mais | 18 | 23 | 78% | 15 | 23 | 65% | 72% |
| MO47 | 7 | 22 | 32% | 1 | 21 | 5% | 19% |
| K55 | 1 | 15 | 7% | 3 | 17 | 18% | 13% |
| W64A | 10 | 22 | 45% | 8 | 20 | 40% | 43% |
| MO17 | 0 | 16 | 0% | 0 | 13 | 0% | 0% |
| B73 | 10 | 18 | 56% | 7 | 17 | 41% | 49% |
| B101 | 12 | 21 | 57% | 8 | 24 | 33% | 44% |
| FR1064 | 4 | 4 | 100% | 4 | 4 | 100% | 100% |
| B104 | 10 | 22 | 45% | 5 | 21 | 24% | 35% |
| WCC22 | 2 | 7 | 29% | 4 | 6 | 67% | 46% |
| A188 | 0 | 3 | 0% | 4 | 6 | 67% | 44% |
Tabell 2: Infeksjonseffektivitet av FoMV-konstruksjoner på tvers av maisgenotyper. FoMV-EV og FoMV-LES22 ble agroinjisert i 11 genotyper av mais. Etter injeksjon ble plantene flyttet til drivhuset. Denne tabellen beskriver infeksjonshastigheten som en prosent, beregnet fra antall planter infisert med FoMV som bekreftet av RT-PCR delt på totalt antall agroinjiserte planter. Den kombinerte totale infeksjonshastigheten viser gjennomsnittlig infeksjonsrate for hver genotype for begge FoMV-konstruksjonene som er testet.
| Plantestadium | 4-5 dagers gamle planter | 6-7 dagers gamle planter | Kombinert total | ||||
| Symptomatisk | Totalt antall planter | % infisert | Symptomatisk | Totalt antall planter | % infisert | % infisert | |
| FoMV-EV | 42 | 72 | 58% | 80 | 170 | 47% | 53 % (A) |
| FoMV-PDS | 65 | 157 | 41% | 66 | 184 | 36% | 39 % (B C) |
| FoMV-LES22 | 115 | 195 | 59% | 144 | 292 | 49% | 54 % (B) |
| FoMV-GFP | 16 | 103 | 16% | 37 | 217 | 17% | 16% (F) |
| SCMV-GFP | 10 | 95 | 11% | 5 | 82 | 6% | 8% (F) |
Tabell 3: Oppsummering av injeksjonsforsøk. Denne tabellen representerer et sammendrag av injeksjonsforsøkene utført fra august 2017 til august 2018 på Golden Bantam søte maisplanter. Planter ble vurdert for virussymptomer (FoMV-EV), silencing symptomer (pds og les22) eller GFP fluorescens (GFP) gjennom visuell (FoMV-EV, FoMV-PDS, og FoMV-LES22) eller FluorCam (FoMV-GFP og SCMV-GFP) screening. Resultatene vises individuelt for 4-5 dager gamle planter og 6-7 dager gamle planter, samt et sammendrag på tvers av alle plantealderer. Det er ingen signifikant forskjell mellom 4-5 dager gamle planter og 6-7 dager gamle planter (Enveis ANOVA, F = 0,6513). Det er en forskjell mellom viral konstruksjon (Onaway ANOVA, F = <0.0001), med bokstavene som representerer Tukey-Kramer HSD som forbinder brevrapport.
Supplerende tabell 1: Tabell som viser alle primernavn og -sekvenser som brukes i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 2: Acetosyringone test. (A) Innledende acetosyringontest, sammenligning av symptomer på mock, FoMV-EV og FoMV-LES22 injiserte planter mellom inokulasjonssuspensjoner med 200 μM acetosyringon (+) eller uten acetosyringon (-). (B) Sammenligning av infeksjonsratene for FoMV-LES22 som bestemt av RT-PCR mellom inokulasjonssuspensjoner uten acetosyringon (-), med 200 μM acetosyringon (+), og tillegg 20 μM acetosyringon til bakteriekulturen 4 timer før resuspensjon i buffer sammen med tilsetning av 200 uM acetosyringon til den endelige suspensjonen (++). Totalt sett var det ingen signifikant forskjell mellom aceotysyringonbehandlinger (Oneway ANOVA, f = 0,5452). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende figur 1: Fluorescensavbildning og molekylær validering av agroinjisert SCMV og uttrykk for heterologiske proteiner i mais. Mais ble agroinjisert med en modifisert SCMV-konstruksjon som inneholder både CDS-er av GFP og nano luciferase (NLuc). (A) Fluorcam-avbildning ble brukt til screening og påvisning av GFP. Venstre er en mock injisert plante og høyre er SCMV-NLucGFP injisert anlegg. (B) Bladproteinekstrakter ble separert av SDS-PAGE og evaluert for tilstedeværelse av NLuc, GFP og SCMV-frakkprotein (CP) av in-gel luciferaseanalyse eller immunoblot som angitt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Agrobacterium er et viktig verktøy som letter mange molekylærbiologiske teknikker i planterelatert forskning. Denne studien gir en agroinjeksjonsprotokoll for inokulerende FoMV- og SCMV-virusvektorer direkte i maisvev for VIGS- og VOX-applikasjoner. Hovedmålet er å øke enkelheten og nytten av virusbaserte teknologier for forskning på monokotavlingsanlegg. Selv om direkte agroinokulasjon av mais har blitt rapportert for noen få virus, er forfatterne ikke klar over en detaljert protokoll, og det er ingen eksempler på VIGS- og VOX-applikasjoner i disse studiene19,22.
Det har blitt rapportert, og ble bekreftet under utviklingen av denne protokollen, at injeksjonsstedet er en nøkkelfaktor for vellykket lansering av en systemisk virusinfeksjon via agroinjection19. Konsekvent injisering av den anbefalte plasseringen på anlegget antas å være den største variabelen, fordi den nøyaktige posisjonen til meristem i maisplanter er praktisk talt uoppdagelig for øyet. For å minimere mellommenneskelig variasjon anbefales det å dissekere noen maisplanter ned til meristem for bedre å visualisere plasseringen (figur 3C). Meristems posisjon i forhold til coleoptilar-noden skal være omtrent den samme for planter i alderen 4-7 dager. I tillegg gir praktisering av injeksjon med farget væske en lett synlig demonstrasjon av hvordan "inoculum" fyller bladhylsen, og fordi injeksjonsstedet er merket med fargestoff, kan nøyaktigheten av injeksjonsstedet bekreftes (figur 3G, H). Meristematisk vev er mest utsatt for agroinjeksjon, men injisering av Agrobacterium suspensjoner direkte i dette vevet resulterer i uønskede morfologiske effekter (Figur 6)19. Planter med skadede meristems overlever, men de resulterende feilene er uønskede, og dermed bør direkte injeksjon av dette vevet unngås.
Det er flere variabler som kan påvirke vellykket lansering av en systemisk virusinfeksjon via agroinjeksjon fordi tre komplekse biologiske systemer (plante-, virus- og Agrobacterium-stamme) må samhandle i koordinering. Dette komplekse samspillet kan hjelpes av de raskt delte cellene i den meristematiske regionen, noe som gjør det til et ideelt sted for agroinokulasjon19. Agrobacteriumstammen må kunne infisere celler i plantevevet for å levere T-DNA som bærer det virale genomet, og anlegget må være utsatt for viruset for å initiere viral replikasjon og systemisk infeksjon. Maisgenotyper varierer i deres følsomhet for virus (f.eks. Mo17 er resistent mot FoMV) eller Agrobacterium stammer, men flertallet som ble testet synes å være utsatt for både FoMV og SCMV (Tabell 1 og Tabell 2)53. For eksempel kan innavlslinjen FR1064 og den søte maissorten Golden Bantam være spesielt utsatt for både GV3101 Agrobacterium og FoMV-baserte vektorer.
Bladnummeret som er samplet og tidspunktet for prøvetaking for RT-PCR er avgjørende for nøyaktig vurdering av virusinfeksjon. I eksemplene som vises her, ble bladnummeret bestemt ved å starte ved det første avrundede bladet (kjent som "tommelbladet") og telle oppover. Bladene ble samplet når de ble utvidet og neste blad hadde begynt å dukke opp. Hvilke blader som er optimale for prøvetaking, kan imidlertid variere basert på virusarter som brukes, vekstforhold og maisgenotype. Derfor anbefales et første tidskurseksperiment når du bruker denne protokollen på et nytt virussystem for å optimalisere prøvetakingsstrategien med hensyn til blader og timing.
Den spesifikke konstruksjonen som brukes, påvirker effektiviteten til denne protokollen betydelig. For eksempel produserer de tomme vektorene, FoMV-EV og SCMV-EV, og FoMV-PDS og FoMV-LES22, som begge inneholder små innsatser (henholdsvis 313 bp og 329 bp), vanligvis de høyeste prosentandelene av planter med virussymptomer i disse eksperimentene (tabell 1 og tabell 2). Rekombinante virus som bærer større innsatser av GFP ORF (720 bp) i FoMV-GFP og SCMV-GFP, hadde imidlertid mye lavere infeksjonsrater sammenlignet med planter injisert med de tomme vektor- eller genaktiveringskonstruksjonene. Denne trenden kan skyldes de negative virkningene på viral kondisjon forårsaket av økende mengder eksogent genetisk materiale i det virale genomet. Flere studier har vist at innsettingsstabiliteten til plantens virale vektorer i stor grad er avhengig av innsatsstørrelse og sekvens36,54,55,56,57. I tillegg var det en merkbar forskjell i prosentandel av planter som blir smittet etter inokulering med enten FoMV eller SCMV tom vektor, noe som tyder på at ytterligere arbeid er nødvendig for å optimalisere denne protokollen for SCMV (tabell 1). Disse resultatene indikerer at noe feilsøking kan være nødvendig når du utvikler en konstruksjon, fordi både sekvensen og lengden på fragmentet kan påvirke effektiviteten.
Totalt sett har denne studien vist at agroinjeksjon av maisplanter er en effektiv inokulasjonsmetode for to forskjellige RNA-plantevirus, flere vektorkonfigurasjoner og 11 genotyper mais. Dette arbeidet med FoMV og SCMV, sammen med tidligere arbeider som bruker injeksjon med maisklorittvirus (MCMV) eller MSV, indikerer at agroinjeksjon er egnet for inokulerende maisplanter med smittsomme kloner av både RNA- og DNA-virus19,20,21,22. I tillegg viser dette arbeidet videre at agroinjeksjon er en levedyktig metode for VIGS- og VOX-vektorer og kan brukes på planter så unge som fire dager gamle (tabell 3). Protokollen som presenteres her forventes å bli lett tilpasset av maisbiologer for å lette forskning i funksjonelle genomikkstudier som involverer forbigående genaktivering (VIGS) og overekspression (VOX). Agroinjection har også kapasitet til å legge til rette for virusbaserte genredigeringsmetoder (VEdGE) som ellers ville være begrenset av avhengighet av plantetransformasjon, noe som potensielt kan forbedre redigeringseffektiviteten samt tilgjengelighet58,59,60. Gitt riktig Agrobacterium stamme, mais genotyper, og virale vektorer er gjennomtenkt kombinert, inokulering av agroinjection forventes å bli et verdifullt verktøy for forbigående genfunksjonsanalyser i mais.
Disclosures
Forskerne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Iowa State University er en del av et team som støtter DARPA's Insect Allies program HR0011-17-2-0053. Dette arbeidet ble også støttet av Iowa State University Plant Sciences Institute, Iowa State University Crop Bioengineering Center, USDA NIFA Hatch prosjektnummer 3808 og State of Iowa Funds. K.L.H. ble også delvis støttet av Iowa State University Predictive Plant Phenomics graduate training program finansiert av National Science Foundation (DGE #1545453) og av Agricultural and Food Research Initiative grant no. 2019-07318 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Finansiører hadde ingen rolle i utformingen av studiet og innsamling, analyse og tolkning av data og skriftlig manuskriptet. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis fundernes synspunkter.
Vi takker Nick Lauter (USDA-ARS, Ames, IA) for frø av mais innavl linjer, Christian F. Montes-Serey (Iowa State University) for å gjøre FoMV-GFP klone, og Tyler Austin (Iowa State University) for teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
| 15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
| 1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
| 25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
| 28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
| 37°C Incubator | For E. coli | ||
| Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
| Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
| Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
| cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
| DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
| DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
| EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
| Ethanol | For RNA extraction | ||
| Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
| Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
| Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
| FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
| Fluorescence Microscope | |||
| Gel Electrophoresis Box | |||
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
| Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
| Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
| Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
| Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
| Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
| Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
| Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
| MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
| PacI | New England Biolabs | R0547 | |
| Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
| Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
| pH Meter | |||
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
| Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
| PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
| Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
| Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
| SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
| Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
| Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
| Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
| Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Thermocycler | For PCR | ||
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
| Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
| Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| XbaI | New England Biolabs | R0145 |
References
- Zaidi, S. E. A., Mansoor, S. Viral vectors for plant genome engineering. Frontiers in Plant Science. 8, 539 (2017).
- Kant, R., Dasgupta, I. Gene silencing approaches through virus-based vectors: speeding up functional genomics in monocots. Plant Molecular Biology. 100, 3-18 (2019).
- Hu, J., et al. A barley stripe mosaic virus-based guide RNA delivery system for targeted mutagenesis in wheat and maize. Molecular Plant Pathology. 20 (10), 1463-1474 (2019).
- Pasin, F., Menzel, W., Daròs, J. A. Harnessed viruses in the age of metagenomics and synthetic biology: an update on infectious clone assembly and biotechnologies of plant viruses. Plant Biotechnology Journal. 17 (6), 1010-1026 (2019).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B. Plant virus vectors 3.0: Transitioning into synthetic genomics. Annual Review of Phytopathology. 57 (1), 211-230 (2019).
- Mei, Y., et al. Protein expression and gene editing in monocots using foxtail mosaic virus vectors. Plant Direct. 3 (11), 00181 (2019).
- Ruiz, M. T., Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell. 10 (6), 937-946 (1998).
- Bekele, D., Tesfaye, K., Fikre, A. Applications of virus induced gene silencing (VIGS) in plant functional genomics studies. Journal of Plant Biochemistry & Physiology. 07 (01), 1000229 (2019).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Jackson, A. O. Plant virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annual Review of Phytopathology. 34 (1), 299-323 (1996).
- Holzberg, S., Brosio, P., Gross, C., Pogue, G. P. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. Plant Journal. 30 (3), 315-327 (2002).
- Wang, R., et al. An efficient virus-induced gene silencing vector for maize functional genomics research. Plant Journal. 86 (1), 102-115 (2016).
- Redinbaugh, M. G., et al. Transmission of viral RNA and DNA to maize kernels by vascular puncture inoculation. Journal of Virological Methods. 98 (2), 135-143 (2001).
- Scholthof, H. B. The capsid protein gene of tomato bushy stunt virus is dispensable for systemic movement and can be replaced for localized expression of foreign genes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6 (3), 309 (1993).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Kikkert, M., Jackson, A. O. Tomato bushy stunt virus spread is regulated by two nested genes that function in cell-to-cell movement and host-dependent systemic invasion. Virology. 213 (2), 425-438 (1995).
- Scholthof, H. B. Rapid delivery of foreign genes into plants by direct rub-inoculation with intact plasmid dna of a tomato bushy stunt virus gene vector. Journal of Virology. 73 (9), 7823-7829 (1999).
- Zhang, J., et al. Vacuum and co-cultivation agroinfiltration of (germinated) seeds results in tobacco rattle virus (TRV) mediated whole-plant virus-induced gene silencing (VIGS) in wheat and maize. Frontiers in Plant Science. 8, 393 (2017).
- Vaghchhipawala, Z., Rojas, C. M., Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Agroinoculation and agroinfiltration: simple tools for complex gene function analyses. Methods in Molecular Biology. 678, Clifton, N.J. 65-76 (2011).
- Grimsley, N., Hohn, B., Hohn, T., Walden, R. "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83 (10), 3282-3286 (1986).
- Grimsley, N. H., Ramos, C., Hein, T., Hohn, B. Merisfematic tissues of maize plants are most suscepnsle to agroinfection with maize streak virus. Bio/Technology. 6 (2), 185-189 (1988).
- Martin, D. P., Rybicki, E. P. Improved efficiency of Zea mays agroinoculation with Maize streak virus. Plant Disease. 84 (10), 1096 (2000).
- Martin, D. P., Willment, J. A., Rybicki, E. P. Evaluation of maize streak virus pathogenicity in differentially resistant Zea mays genotypes. Phytopathology. 89 (8), 695-700 (1999).
- Wang, Q., et al. Further characterization of Maize chlorotic mottle virus and its synergistic interaction with Sugarcane mosaic virus in maize. Scientific Reports. 7, 39960 (2017).
- Hsieh, M. H., et al. Optimizing virus-induced gene silencing efficiency with Cymbidium mosaic virus in Phalaenopsis flower. Plant Science. 201-202 (1), 25-41 (2013).
- Hsieh, M. H., et al. Virus-induced gene silencing unravels multiple transcription factors involved in floral growth and development in Phalaenopsis orchids. Journal of Experimental Botany. 64 (12), 3869-3884 (2013).
- Zenna, N. S., et al. Genetic analysis of tolerance to rice tungro bacilliform virus in rice (Oryza sativa L.) through agroinoculation. Journal of Phytopathology. 154 (4), 197-203 (2006).
- Marks, M. S., Kemp, J. M., Woolston, C. J., Dale, P. J. Agroinfection of wheat: A comparison of Agrobacterium strains. Plant Science. 63 (2), 247-256 (1989).
- Dasgupta, I., et al. Rice tungro bacilliform virus DNA independently infects rice after Agrobacterium-mediated transfer. Journal of General Virology. 72 (6), 1215-1221 (1991).
- Boulton, M. I., Buchholz, W. G., Marks, M. S., Markham, P. G., Davies, J. W. Specificity of Agrobacterium-mediated delivery of maize streak virus DNA to members of the Gramineae. Plant Molecular Biology. 12 (1), 31-40 (1989).
- Paulsen, A. Q. Purification and properties of foxtail mosaic virus. Phytopathology. 77 (11), 1346 (1977).
- Bancroft, J. B., Rouleau, M., Johnston, R., Prins, L., Mackie, G. A. The entire nucleotide sequence of foxtail mosaic virus RNA. Journal of General Virology. 72 (9), 2173-2181 (1991).
- Bruun-Rasmussen, M., Madsen, C. T., Johansen, E., Albrechtsen, M. Revised sequence of foxtail mosaic virus reveals a triple gene block structure similar to potato virus X. Archives of Virology. 153 (1), 223-226 (2008).
- Rouleau, M., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Partial purification and characterization of foxtail mosaic potexvirus RNA-dependent RNA polymerase. Virology. 197 (2), 695-703 (1993).
- Rouleau, M., Smith, R. J., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein. Virology. 204 (1), 254-265 (1994).
- Samuels, T. D., et al. Subcellular targeting and interactions among the potato virus X TGB proteins. Virology. 367 (2), 375-389 (2007).
- Cho, S. Y., Kim, K. H. Identification of the capsid protein-binding region of the SL1(+) RNA located at the 5' region of the potato virus X genome. Plant Pathology Journal. 28 (1), 75-80 (2012).
- Mei, Y., Zhang, C., Kernodle, B. M., Hill, J. H., Whitham, S. A. A foxtail mosaic virus vector for virus-induced gene silencing in maize. Plant Physiology. 171 (2), 760-772 (2016).
- Bouton, C., et al. Foxtail mosaic virus: A viral vector for protein expression in cereals. Plant Physiology. 177 (4), 1352-1367 (2018).
- Mei, Y., Liu, G., Zhang, C., Hill, J. H., Whitham, S. A. A sugarcane mosaic virus vector for gene expression in maize. Plant Direct. 3 (8), 00158 (2019).
- Gal-On, A., Meiri, E., Huet, H., Hua, W. J., Raccah, B., Gaba, V. Particle bombardment drastically increases the infectivity of cloned DNA of zucchini yellow mosaic potyvirus. Journal of General Virology. 76 (12), (1995).
- Gao, R., et al. Construction of an infectious cDNA clone and gene expression vector of Tobacco vein banding mosaic virus (genus Potyvirus). Virus Research. 169 (1), 276-281 (2012).
- López-Moya, J. J., García, J. A. Construction of a stable and highly infectious intron-containing cDNA clone of plum pox potyvirus and its use to infect plants by particle bombardment. Virus Research. 68 (2), (2000).
- Choi, I. R., French, R., Hein, G. L., Stenger, D. C. Fully biologically active in vitro transcripts of the eriophyid mite-transmitted wheat streak mosaic tritimovirus. Phytopathology. 89 (12), (1999).
- Kim, K. S., et al. Infectivity of in vitro transcripts of Johnsongrass mosaic potyvirus full-length cDNA clones in maize and sorghum. Archives of Virology. 148 (3), 563-574 (2003).
- Stewart, L. R., Bouchard, R., Redinbaugh, M. G., Meulia, T. Complete sequence and development of a full-length infectious clone of an Ohio isolate of Maize dwarf mosaic virus (MDMV). Virus Research. 165 (2), 219-224 (2012).
- Wylie, S. J., et al. ICTV virus taxonomy profile: Potyviridae. Journal of General Virology. 98 (3), 352-354 (2017).
- Shukla, D. D. taxonomy of potyviruses infecting maize, sorghum, and sugarcane in Australia and the United States as determined by reactivities of polyclonal antibodies directed towards virus-specific N-termini of coat proteins. Phytopathology. 79 (2), 223 (1989).
- Shukla, D. D., Ward, C. W. Amino Acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group. Journal of General Virology. 69 (11), 2703-2710 (1988).
- Chung, B. Y. W., Miller, W. A., Atkins, J. F., Firth, A. E. An overlapping essential gene in the Potyviridae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (15), 5897-5902 (2008).
- Jarchow, E., Grimsley, N. H., Hohn, B. virF, the host-range-determining virulence gene of Agrobacterium tumefaciens, affects T-DNA transfer to Zea mays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (23), 10426-10430 (1991).
- Hu, G., Yalpani, N., Briggs, S. P., Johal, G. S. A porphyrin pathway impairment is responsible for the phenotype of a dominant disease lesion mimic mutant of maize. The Plant Cell. 10 (7), 1095 (2007).
- Qin, G., et al. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis. Cell Research. 17 (5), 471-482 (2007).
- Jones, P. Isolation of plasmid DNA from E. coli. Encyclopedia of Life Sciences. , (2003).
- Ji, Q., Yang, B., Lee, M., Chen, Y., Lübberstedt, T. Mapping of quantitative trait loci/locus conferring resistance to foxtail mosaic virus in maize using the intermated B73-×-Mo17 population. Plant Breeding. 129 (6), 721-723 (2010).
- Pacak, A., et al. The brome mosaic virus-based recombination vector triggers a limited gene silencing response depending on the orientation of the inserted sequence. Archives of Virology. 155 (2), 169-179 (2010).
- Miché, L., Battistoni, F., Gemmer, S., Belghazi, M., Reinhold-Hurek, B. Host-dependent expression of Rhizobium leguminosarum bv. viciae hydrogenase is controlled at transcriptional and post-transcriptional levels in legume nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (5), 1323-1331 (2018).
- Yamagishi, M., Masuta, C., Suzuki, M., Netsu, O. Peanut stunt virus-induced gene silencing in white lupin (lupinus albus). Plant Biotechnology. 32 (3), 181-191 (2015).
- Avesani, L., et al. Stability of Potato virus X expression vectors is related to insert size: Implications for replication models and risk assessment. Transgenic Research. 16 (5), 587-597 (2007).
- Ali, Z., et al. Efficient virus-mediated genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (8), 1288-1291 (2015).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B., Mirkov, T. E. Multiplexed gene editing and protein overexpression using a tobacco mosaic virus viral vector. Plant Physiology. 175 (1), 23-35 (2017).
- Ali, Z., Eid, A., Ali, S., Mahfouz, M. M. Pea early-browning virus-mediated genome editing via the CRISPR/Cas9 system in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis. Virus Research. 244, 333-337 (2018).
